CN109632444A - 液态25-羟基维生素d校准品稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液态25‑羟基维生素D校准品稀释液包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。本发明的主要创新之处在于：a)首次将7‑脱氢胆固醇应用于25‑羟基维生素D校准品稀释液，用于提升25‑羟基维生素D在液态有氧条件下的稳定性；b)校准品稀释液中的所有组分均是最优配方，给25‑羟基维生素D校准品的稳定性提供了有力保障，在2‑8℃条件下可稳定保存12个月；c)将液态25‑羟基维生素D校准品用于血清样品中25羟基维生素D的检测，检测时无需进行校准品复溶，且多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线。

Description

液态25-羟基维生素D校准品稀释液
技术领域
本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种稳定的液态25-羟基维生素D校准品稀释液。
背景技术
维生素D是一种类固醇激素，有两个主要类型：维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化甾醇），它们的结构很相似，只是侧链有差别。人体内的维生素D主要来源于皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变成维生素D3，此外还包括从鱼、肉等食物中摄取的维生素D3和膳食补充剂中的维生素D2。无论哪种形式的维生素D，在血液中均与结合蛋白结合后运输至肝脏，在肝脏中被转换成为25-羟基维生素D，而后在肾脏中被转化为1,25-双羟基维生素D，这是维生素D发挥作用的生物活性成分。但循环中的1,25-双羟基维生素D含量极少，半衰期仅有4h，而循环中的25-羟基维生素D含量是1,25-双羟基维生素D的1000倍，是维生素D在循环中的主要存在形式，半衰期3周，能够反映人体维生素D的真实水平，是反映个体维生素D状态的最佳指标。
维生素D及其代谢产物不溶于水，易溶于乙醇，且化学性质不稳定，容易在光照和湿热条件下发生分解。目前，国外体外诊断试剂生产企业研发的25-羟基维生素D校准品均为冻干品。冻干校准品存在以下缺点：生产工艺复杂，增加企业生产成本；使用前需要复溶，给操作带来不便；复溶过程中操作者操作误差可能对准确度带来影响，导致检测结果出现偏差；复溶后校准品不易保存。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液态25-羟基维生素D校准品稀释液，该校准品稀释液配方可用于配制稳定的液态25-羟基维生素D校准品，并用于检测人血清中25羟基维生素D含量。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。
所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇、胆固醇、胆汁酸、麦角固醇、β-谷固醇中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.01-100mmol/L。
所述环戊烷多氢菲类稳定剂优选采用7-脱氢胆固醇。
所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Taps缓冲液、Mops缓冲液中的一种或任意两种以上混合液，缓冲液浓度为20-200mmol/L。
所述防腐剂为Proclin 300、MIT、Bro、IPBC、NaN3中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.1%-0.5% w/v。
实际配制时，其配方为：PBS缓冲液20-500mmol/L，人血清白蛋白1%-10% w/v，Proclin 300 0.1%-0.5% w/v，7-脱氢胆固醇0.01-100mmol/L。
四组分优选配方为：PBS缓冲液100mmol/L，人血清白蛋白3% w/v，Proclin 3000.2% w/v，7-脱氢胆固醇2.0mmol/L。
本发明提供了一种易于生产、便于操作并且可以使液态校准品稳定保存的校准品稀释液配方。使用该稀释液配方制备的校准品，在生产时无需进行冻干工序，缩短了生产周期，降低了生产成本；用户在使用时可直接将校准品加入仪器，无需经过复溶环节，避免了复溶时带来的准确度偏差；使用后的校准品仍可以稳定保存。
本发明的主要创新之处在于：a)首次将7-脱氢胆固醇应用于25-羟基维生素D校准品稀释液，用于提升25-羟基维生素D在液态有氧条件下的稳定性；b)校准品稀释液中的所有组分均是最优配方，给25-羟基维生素D校准品的稳定性提供了有力保障，在2-8℃条件下可稳定保存12个月；c)将液态25-羟基维生素D校准品用于血清样品中25羟基维生素D的检测，检测时无需进行校准品复溶，且多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明实施例中所用的试剂和检测仪器均为本领域市售产品，所用检测方法均为本领域常规方法。
实施例1 配制液体25-羟基维生素D校准品稀释液
称取一定量的7-脱氢胆固醇，然后将其溶解于少量无水乙醇中，再称量一定比例的人血清白蛋白、Proclin 300，加入到100mmol/L PBS缓冲液中，搅拌30min，即配制成25-羟基维生素D校准品稀释液，其中含有人血清白蛋白3% w/v，Proclin 300 0.2% w/v，7-脱氢胆固醇2.0mmol/L。
实施例2 制备人血清样品中25羟基维生素D含量检测相关试剂
1、制备25-羟基维生素D系列校准品
取一定量的25羟基维生素D抗原，分别加入到实施例1制备的校准品稀释液中，配制成标示浓度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、140ng/ml 的一系列校准品，瓶盖颜色依次为白、黄、绿、蓝、红、紫、黑；
2、制备包被有抗25羟基维生素D抗体的磁微粒混悬液
根据使用量取适量的羧基磁微粒，用过量的EDC 和NHS 在酸性条件下进行活化，活化时间为30min，活化完成后，加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用PBS缓冲液洗涤两遍；加入适量的抗25羟基维生素D抗体，使其浓度为 22μg/mg磁微粒，在0.05M-0.1M的MES 缓冲液中（pH4.5-pH5.5）震荡反应1h；反应结束后加磁场，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1% 牛血清白蛋白（BSA）的0.01M 的PBS 缓冲液（pH7.6）进行封闭，反复封闭5次；封闭结束后，加入适量的封闭液以保存磁微粒，将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；
3、制备辣根过氧化物酶标记的25羟基维生素D
将25羟基维生素D衍生物上的羧基与辣根过氧化物酶（HRP）分子的氨基经EDC的作用缩合为酰胺化合物 ，透析后即得酶标25羟基维生素D；在标记好的溶液中，等比加入甘油-20℃保存备用；将标记好的酶标25羟基维生素D按照1:2000--1:5000 的比例加入到含有20%--50% 小牛血清和PC300 （0.15%-0.25%）的pH 7.4 Tris-NaCl缓冲液中，混合均匀，即得到该释放剂应用时使用的酶结合物；
4、配制人血清25羟基维生素D释放剂
称取十二烷基磺酸钠，然后将所述组分溶解于少量0.05M Tris-NaCl缓冲液中，再加入一定比例的二甲基亚砜和乙醇，加入0.05MTris-NaCl缓冲液定容，用浓盐酸调整pH值至7.0；
5、配制发光底物A 液、发光底物B 液及浓缩洗液
发光底物A 液由0.2M Tris-Hcl、0.15mM Luminol、0.59mM 羟基香豆素、0.35mM 没食子酸配制而成；发光底物B 液由0.85mM 氨基酸氧化酶、0.8% Tween 20、0.5mM DTPA、0.12mM 维生素C 配制而成；浓缩洗液由NaH2PO4·2H2O 4.06g, Na2HPO4·12H2O 62.32g,Tween 20 2-10ml , 蒸馏水 1000ml 配制而成。
实施例3 检测人血清样品中25羟基维生素D含量
采用实施例2制备的相关试剂对人血清样品中25羟基维生素D含量进行检测，其具体步骤为：
1、取出一定量的反应容器，编号。根据实验要求加入50μl 校准/质控品/临床血清；
2、摇匀磁微粒混悬液，每孔分别加入20μl；
3、每孔分别加入酶标记物50μ；
4、将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15 分钟；
5、使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤5 次；
6、洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开；
7、每孔加入发光底物A 和发光底物B 各50μl，振荡混匀后避光室温反应5 分钟；
8、化学发光检测仪检测发光强度；
9、采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为X 轴，以校准品发光强度对数值为Y轴，建立定标曲线。根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值。
实施例4 本发明配制的液体25-羟基维生素D校准品稀释液的性能考核
1、稳定性
对本发明校准品在2-8℃条件下实时放置12个月的稳定性进行考核，其稳定性考核结果如表1所示。
表1.液态校准品12个月实时放置的稳定性
表1结果表明：校准品信号值无明显变化，通过其校准曲线拟合得到的临床样本结果无明显变化。结果表明使用该校准品稀释液配方配制的液态25-羟基维生素D校准品可在2-8℃条件下稳定放置12个月。
2、重复性
分别准备6套液态校准品和冻干校准品，液态和冻干态校准品均为同一批，6位不同操作者分别使用液态校准品和冻干校准品进行定标，重复性考核结果如表2所示。
表2.本发明中所提及的液态校准品与冻干校准品重复性对比
表2结果表明：液态校准品重复性明显优于冻干校准品。

Claims (7)

1.一种液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：包含以下组分：缓冲液、蛋白质类稳定剂、防腐剂、环戊烷多氢菲类稳定剂。
2.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇、胆固醇、胆汁酸、麦角固醇、β-谷固醇中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.01-100mmol/L。
3.根据权利要求2所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述环戊烷多氢菲类稳定剂为7-脱氢胆固醇。
4.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Taps缓冲液、Mops缓冲液中的一种或任意两种以上混合液，缓冲液浓度为20-200mmol/L。
5.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：所述防腐剂为Proclin 300、MIT、Bro、IPBC、NaN3中的一种或任意两种以上混合物，其浓度为0.1%-0.5%w/v。
6.根据权利要求1所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：其组分为：PBS缓冲液20-500mmol/L，人血清白蛋白1%-10% w/v，Proclin 300 0.1%-0.5% w/v，7-脱氢胆固醇0.01-100mmol/L。
7.根据权利要求6所述的液态25-羟基维生素D校准品稀释液，其特征在于：其组分为：PBS缓冲液100mmol/L，人血清白蛋白3% w/v，Proclin 300 0.2% w/v，7-脱氢胆固醇2.0mmol/L。
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