JPS5843798A - ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬 - Google Patents
ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬Info
- Publication number
- JPS5843798A JPS5843798A JP14084281A JP14084281A JPS5843798A JP S5843798 A JPS5843798 A JP S5843798A JP 14084281 A JP14084281 A JP 14084281A JP 14084281 A JP14084281 A JP 14084281A JP S5843798 A JPS5843798 A JP S5843798A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kallikrein
- activity
- carrier
- urine
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明社ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬に係る
。
。
事態性高圧症の患者尿中カリクレイン排泄量が少軽いこ
とFiMargollt+s等(Lanc@t I 、
19711063〜1068 )Kよって報告されて
以来数多くの報告がなされて−るO1九、疫学的調査の
面からも高血圧症の家族素因をもつ者で鉱床中カリクレ
イン排泄量が低値を示し、逆に尿中カリクレイン排泄量
が低値を示す家系では高血圧症を発症する頻度が非常に
高いとの報告もある(ム& J、 Epid@m1o1
.1976、 104. 124〜130)。
とFiMargollt+s等(Lanc@t I 、
19711063〜1068 )Kよって報告されて
以来数多くの報告がなされて−るO1九、疫学的調査の
面からも高血圧症の家族素因をもつ者で鉱床中カリクレ
イン排泄量が低値を示し、逆に尿中カリクレイン排泄量
が低値を示す家系では高血圧症を発症する頻度が非常に
高いとの報告もある(ム& J、 Epid@m1o1
.1976、 104. 124〜130)。
また、尿中カリクレイン活性は腎機能の程度をも反映す
ることから、患者尿中のカリクレイン活性を測定するこ
とは、高血圧症の原因究明。
ることから、患者尿中のカリクレイン活性を測定するこ
とは、高血圧症の原因究明。
腎機能検査などの臨床検査に有益な情報を提供するもの
であると考えられる。
であると考えられる。
ヒト尿中カリクレインの活性測定法は現在までに数多く
の報告がなされて―るが、操作の繁雑さ、尿中阻害物質
の存在、基質特異性など間層点が多かった。近年合成基
質の開発に伴い多少改善されつつあるが、n部、 BA
BE、1部(N−α−P −to@yl −1ysin
* methyl enter ) e Pro −P
h* −Arg−Me^及び他のPro −Ph・−k
rg誘導体など現在使用されている合成基質で社2、ト
リプクン、キモトリプシン、プラスミン、α−トロンビ
ンなどによって氷解きれ、また、その基質自体が極めて
不安定であったり、尿中の阻害物質の影響を受けたりす
るなど正確なカリクレイン活性測定に用−るKはまだま
だ問題点が多い。ラジオイムノアッセイ、バイオアッセ
イを用−るKr!技術的な間難点、測定条件設定の困難
さ、設備上の問題点など障害が多く、日常検査0場に適
したものとは≠えなφ。
の報告がなされて―るが、操作の繁雑さ、尿中阻害物質
の存在、基質特異性など間層点が多かった。近年合成基
質の開発に伴い多少改善されつつあるが、n部、 BA
BE、1部(N−α−P −to@yl −1ysin
* methyl enter ) e Pro −P
h* −Arg−Me^及び他のPro −Ph・−k
rg誘導体など現在使用されている合成基質で社2、ト
リプクン、キモトリプシン、プラスミン、α−トロンビ
ンなどによって氷解きれ、また、その基質自体が極めて
不安定であったり、尿中の阻害物質の影響を受けたりす
るなど正確なカリクレイン活性測定に用−るKはまだま
だ問題点が多い。ラジオイムノアッセイ、バイオアッセ
イを用−るKr!技術的な間難点、測定条件設定の困難
さ、設備上の問題点など障害が多く、日常検査0場に適
したものとは≠えなφ。
本発明社抗原抗体反応の特異性を利用することにょシ、
従来法における欠陥を回避克服し、正確かつ簡便な尿中
カリ、フレインの活性測定を:: 可能とした。その要旨どするところ社、ポリスチレンロ
ッド、ペーパーディスク及びガラスピーズ勢0表面に抗
ヒト尿中カリクレインラビツ)IgGを結合させ、この
担体を用い尿中に排泄着させ、緩衝液によりこの相体を
十分に洗浄し、非特異的に結合した物質を除去した後、
活性測定系に担体を移し、抗原であるカリクレインの活
性を測定することを特徴とする。
従来法における欠陥を回避克服し、正確かつ簡便な尿中
カリ、フレインの活性測定を:: 可能とした。その要旨どするところ社、ポリスチレンロ
ッド、ペーパーディスク及びガラスピーズ勢0表面に抗
ヒト尿中カリクレインラビツ)IgGを結合させ、この
担体を用い尿中に排泄着させ、緩衝液によりこの相体を
十分に洗浄し、非特異的に結合した物質を除去した後、
活性測定系に担体を移し、抗原であるカリクレインの活
性を測定することを特徴とする。
さらに詳細に述べれば、本発f!J4I/iポリスチレ
ンロッド、ペーパーディスク及びガラスピーズ尋の表面
に抗ヒト尿中カリクレインラビット■ぎGを曽理的、化
学的に結合させ、この担体を用い尿中に排泄されたカリ
クレインを抗原抗体反応を利用し吸着させたのち、緩衝
液にてこの担体を十分に洗浄し、非特異的に結合し良物
質を除資し、その後そO担体をpH8,0付近の緩衝液
に移し、10 mM Pro −Ph@−ムrg −M
Cム基質を用いて酵素反応を37℃中にて行い、酸性に
することkより反応を停止し、螢光測定を行うことから
1、。ゎ65e、□えよ5、ヵ、〜イ2゜ヶの活性を合
成基質Pro−Ph・−Arg−Mcムを用−て測定で
きることを特徴とする。
ンロッド、ペーパーディスク及びガラスピーズ尋の表面
に抗ヒト尿中カリクレインラビット■ぎGを曽理的、化
学的に結合させ、この担体を用い尿中に排泄されたカリ
クレインを抗原抗体反応を利用し吸着させたのち、緩衝
液にてこの担体を十分に洗浄し、非特異的に結合し良物
質を除資し、その後そO担体をpH8,0付近の緩衝液
に移し、10 mM Pro −Ph@−ムrg −M
Cム基質を用いて酵素反応を37℃中にて行い、酸性に
することkより反応を停止し、螢光測定を行うことから
1、。ゎ65e、□えよ5、ヵ、〜イ2゜ヶの活性を合
成基質Pro−Ph・−Arg−Mcムを用−て測定で
きることを特徴とする。
本発明で使用するヒト尿中カリクレイン抗体結合担体と
してはポリスチレンロッド、ポリスチレンビーズ、ペー
パーディスク等が使用でき、特にポリスチレンが強−抗
体吸着能力を有しているので好まし一〇 以下に本発明の実施例について述べる。
してはポリスチレンロッド、ポリスチレンビーズ、ペー
パーディスク等が使用でき、特にポリスチレンが強−抗
体吸着能力を有しているので好まし一〇 以下に本発明の実施例について述べる。
実施例1
本測定法に用いる抗ヒト尿中カリクレインラビツ)Ig
Gは、正常男性層よりディースフ電気泳動的に均一にな
るまで精製を行ったカリクレインを抗原とし、ラビット
に対して免疫を行い、常法によりそのIgGllII分
を得た。
Gは、正常男性層よりディースフ電気泳動的に均一にな
るまで精製を行ったカリクレインを抗原とし、ラビット
に対して免疫を行い、常法によりそのIgGllII分
を得た。
ポリスチレンロッドは洗剤で十分に洗浄し、石用勢の方
法(J、 Bloehw、 1977、 81.15
57〜1566) K従って順次操作を行った。すな
わち、担体をラビットIgGを含んだ0.25Mリン酸
ナトリウム緩衝液* pH7,5(1〜2 W/st)
K室温で1晩浸し、さらに4℃にお−て1週間放置し
た後、同じ緩衝液で十分洗浄し、0.1M塩化ナトリウ
ム、0.1%アジ化ナトリウムと0.1%牛自清アルプ
ξンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7
,0(以下緩衝液にと―う)中に移し保存する。
法(J、 Bloehw、 1977、 81.15
57〜1566) K従って順次操作を行った。すな
わち、担体をラビットIgGを含んだ0.25Mリン酸
ナトリウム緩衝液* pH7,5(1〜2 W/st)
K室温で1晩浸し、さらに4℃にお−て1週間放置し
た後、同じ緩衝液で十分洗浄し、0.1M塩化ナトリウ
ム、0.1%アジ化ナトリウムと0.1%牛自清アルプ
ξンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7
,0(以下緩衝液にと―う)中に移し保存する。
上記の抗体結合ポリスチレンロッド1個を200Mの緩
衝液x中に浸し、10JLtの試料を添加して4℃にお
−てl晩振盪する。その後、1−5−の緩衝液KKより
2Ugi洗浄し、このロッドを0.2w1lの0.15
M塩化ナトリウムto−1%牛血清アルブミンを含″t
ro、IM)!jスー#i酸緩衝液pH8,0(以下反
応用緩衝液という)中に移し、syi、s分間のブレイ
ンキ晶ベージ璽ンの4110gの10 mM Pre
−Ph* −Arg −MCA溶液(10IIIMt/
1 d 、 DMaO,虫)を加え、37℃、60分間
の酵素反応を行い、2.5−の0.1M酢酸緩衝液、p
H45を加え、反応を停止し、生成されたツーamln
o −4−zaethyl @ewoirim 10
螢光を励起波長380 fm 。
衝液x中に浸し、10JLtの試料を添加して4℃にお
−てl晩振盪する。その後、1−5−の緩衝液KKより
2Ugi洗浄し、このロッドを0.2w1lの0.15
M塩化ナトリウムto−1%牛血清アルブミンを含″t
ro、IM)!jスー#i酸緩衝液pH8,0(以下反
応用緩衝液という)中に移し、syi、s分間のブレイ
ンキ晶ベージ璽ンの4110gの10 mM Pre
−Ph* −Arg −MCA溶液(10IIIMt/
1 d 、 DMaO,虫)を加え、37℃、60分間
の酵素反応を行い、2.5−の0.1M酢酸緩衝液、p
H45を加え、反応を停止し、生成されたツーamln
o −4−zaethyl @ewoirim 10
螢光を励起波長380 fm 。
螢光波長449mui(おいて測定すゐ。
本性によれば0.0S〜10fiU、〆一の範囲で尿中
カリクレイン活性を測定することが可能であった0また
、尿中Fr・・**による測定との相関性Fif−0,
725を示した。 Tlm cours@は37℃。
カリクレイン活性を測定することが可能であった0また
、尿中Fr・・**による測定との相関性Fif−0,
725を示した。 Tlm cours@は37℃。
90分間まで測定可能域であり、尿に対する用量相関も
20gtで直線性を示し、再現性もC0v、−8%と良
−値を示した。
20gtで直線性を示し、再現性もC0v、−8%と良
−値を示した。
実施例2
径2.のガラスピーズ20gを十分に水洗した後、15
0℃にて24時間乾燥する。その後、2%r−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン−アセトン溶液20−を加え
、45℃にて24時間還流する。次−でビーズを水洗後
、1%グルタルアルデヒド20dを加え、4℃にて24
時間振盪する。その後50mMリン酸緩衝液(pH17
,0) Kて洗浄後、同緩衝液20s/、実施例1に記
載と同様のラビット抗ヒト尿中カリクレインIgG14
Wを添加し、4℃、24時間振盪する。その後、50m
M酢酸緩衝液(pH5,0)で洗浄後、0.9%塩化ナ
トリウム、 O,OS%アジ化ナトナトリウム、3%
牛血清アルブミン及び0.6%トリトンX−405を含
む50mM)リス−塩酸緩衝液、 pH8,0(以下
緩衝液Tと―う)中に保存する。
0℃にて24時間乾燥する。その後、2%r−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン−アセトン溶液20−を加え
、45℃にて24時間還流する。次−でビーズを水洗後
、1%グルタルアルデヒド20dを加え、4℃にて24
時間振盪する。その後50mMリン酸緩衝液(pH17
,0) Kて洗浄後、同緩衝液20s/、実施例1に記
載と同様のラビット抗ヒト尿中カリクレインIgG14
Wを添加し、4℃、24時間振盪する。その後、50m
M酢酸緩衝液(pH5,0)で洗浄後、0.9%塩化ナ
トリウム、 O,OS%アジ化ナトナトリウム、3%
牛血清アルブミン及び0.6%トリトンX−405を含
む50mM)リス−塩酸緩衝液、 pH8,0(以下
緩衝液Tと―う)中に保存する。
上記の抗体結合ガラスピーズ1個を緩衝液T2O0g中
に浸し、そζに試料10gを添加して4℃において1晩
振盪する。その後この抗体結合ガラスピーズを0.9襲
塩化ナトリウムを含む50−トリス−塩酸緩衝液(pH
8,0)2−で3回洗浄する。この抗体結合ガラスピー
ズを0.2−の反応用緩衝液中へ移し、37℃、5分間
のプレイン今1ベージ冒ンの後、10gの10mMPr
o −Ph* −’ムrg −MCA港液を加え、37
C,60分間のWI−反応を行−12,5−00,1M
酢酸緩衝液。
に浸し、そζに試料10gを添加して4℃において1晩
振盪する。その後この抗体結合ガラスピーズを0.9襲
塩化ナトリウムを含む50−トリス−塩酸緩衝液(pH
8,0)2−で3回洗浄する。この抗体結合ガラスピー
ズを0.2−の反応用緩衝液中へ移し、37℃、5分間
のプレイン今1ベージ冒ンの後、10gの10mMPr
o −Ph* −’ムrg −MCA港液を加え、37
C,60分間のWI−反応を行−12,5−00,1M
酢酸緩衝液。
pH4,5を加え反応を停止し、生成された7 −am
in。
in。
−4−methyl @oumr1m−の螢光を励起波
長3i3Qym。
長3i3Qym。
螢光波長440鳩にお≠て測定する。
本性によれば0.05〜81U//dの範囲で尿中カリ
クレイン活性を11室することが可能であった。
クレイン活性を11室することが可能であった。
また、尿中Fr・・酵素による測定との相関性はデー0
.694を示した。 Tl鞠aaurs@1137℃、
90分間まで測定可能域であり、尿に対する用量相関も
2041で直―性を示し、再現性もC,V、−10,2
噂であった。
.694を示した。 Tl鞠aaurs@1137℃、
90分間まで測定可能域であり、尿に対する用量相関も
2041で直―性を示し、再現性もC,V、−10,2
噂であった。
実施例3
径6■にパンチした濾紙(東洋濾紙5No51ム)2り
を十分に水洗し、水8o−,ブロムシアン2Vを添加し
た後、IN NaOHテpH10,5Kll整しながら
、30分間反応させる。その後、5mM炭酸水素ナトリ
ウム溶液で洗浄後、さらに水洗する。この活性化ペーパ
ーディスクに6.1 M炭酸水素ナトリ°ウム溶液40
s/、実施例1に記載と同様のラビット抗ヒト尿中カリ
クレインIgG 14++yを添加し、4℃にて3時間
振盪する。その後、0.1M炭酸水素ナトリウムで洗浄
し、次いで0.1M炭酸水素ナトリウムに溶解した5o
−エタノールアミン40−を添加し%室温にて3時間振
盪する。その後%O−IM炭酸水素ナトリウム溶液、次
いで0.5M炭酸水素ナトリウム溶液にて十分洗浄後、
0.1M酢酸緩衝液(pH4,0)40mgを添加し、
室温にて30分間振盪する。以上のように調整したペー
パーディスクは緩衝液T中。
を十分に水洗し、水8o−,ブロムシアン2Vを添加し
た後、IN NaOHテpH10,5Kll整しながら
、30分間反応させる。その後、5mM炭酸水素ナトリ
ウム溶液で洗浄後、さらに水洗する。この活性化ペーパ
ーディスクに6.1 M炭酸水素ナトリ°ウム溶液40
s/、実施例1に記載と同様のラビット抗ヒト尿中カリ
クレインIgG 14++yを添加し、4℃にて3時間
振盪する。その後、0.1M炭酸水素ナトリウムで洗浄
し、次いで0.1M炭酸水素ナトリウムに溶解した5o
−エタノールアミン40−を添加し%室温にて3時間振
盪する。その後%O−IM炭酸水素ナトリウム溶液、次
いで0.5M炭酸水素ナトリウム溶液にて十分洗浄後、
0.1M酢酸緩衝液(pH4,0)40mgを添加し、
室温にて30分間振盪する。以上のように調整したペー
パーディスクは緩衝液T中。
4℃にて保存する・
上記の抗体結合ペーパーディスク1枚を緩衝液T2O0
1Lt中に浸し、そこへ試料10ILl−を添加して4
℃においてl晩振盪する。その後この抗体結合ペーパー
ディスクを0.9%塩化ナトリウムを含も50mM)リ
ス−塩酸緩衝液(pH8,0)2−で3回洗浄する。こ
の抗体結合ペーパーティスフを0.2−の反応用緩衝液
中へ移し、37℃。
1Lt中に浸し、そこへ試料10ILl−を添加して4
℃においてl晩振盪する。その後この抗体結合ペーパー
ディスクを0.9%塩化ナトリウムを含も50mM)リ
ス−塩酸緩衝液(pH8,0)2−で3回洗浄する。こ
の抗体結合ペーパーティスフを0.2−の反応用緩衝液
中へ移し、37℃。
5分子f5のブレインキ凰ベージ曹ンの後、10ILt
の10 mM Pro −Ph5−ムrg −MCA溶
液を加え、37℃。
の10 mM Pro −Ph5−ムrg −MCA溶
液を加え、37℃。
60分間の酵素反応を行い、2.5mgの0.1M酢酸
緩衝液、pH4,5を加え反応を停止し、生成された7
−amino −4−methyl 噛o−rinの
螢光を励起波長380語、螢光波長440 mにおいて
測定するO 本性によれば0.03〜16 yKU/s/の範匪で尿
中カリクレイン活性を測定することが可能であったO 特許出願人 杉 浦 衛
緩衝液、pH4,5を加え反応を停止し、生成された7
−amino −4−methyl 噛o−rinの
螢光を励起波長380語、螢光波長440 mにおいて
測定するO 本性によれば0.03〜16 yKU/s/の範匪で尿
中カリクレイン活性を測定することが可能であったO 特許出願人 杉 浦 衛
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、(イ)ヒト尿中カリクレイン抗体結合担体、及び←
)カリクレイン活性測定用合成基質との組み合せよシな
るヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬。 2、ヒト尿中カリクレイン抗体結合担体としてポリスチ
レンロッド、ガシスビーズ、ポリスチレンビーズ、ペー
パーティスフを用−る特許請求の範囲第1項記載のヒト
尿中カリクレインの活性測定用試薬。 3・合成基質としてPro −Phs −Arg −M
CA (L −Prolyl −L −pbvnyl
alanyl−レ−arginino −4−m@th
yl coumarin −7−amid@) を用
−る特許請求の範囲第1項記載のヒト尿中カリクレイン
の活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14084281A JPS5843798A (ja) | 1981-09-09 | 1981-09-09 | ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14084281A JPS5843798A (ja) | 1981-09-09 | 1981-09-09 | ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5843798A true JPS5843798A (ja) | 1983-03-14 |
Family
ID=15277977
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14084281A Pending JPS5843798A (ja) | 1981-09-09 | 1981-09-09 | ヒト尿中カリクレインの活性測定用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5843798A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63174199A (ja) * | 1987-01-13 | 1988-07-18 | 住友電気工業株式会社 | 車両認識方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5536759A (en) * | 1978-09-07 | 1980-03-14 | Ajinomoto Co Inc | Measuring method of kallikrein in human urine |
JPS5698656A (en) * | 1979-12-27 | 1981-08-08 | Merck Patent Gmbh | Immunological measurement method of enzyme |
-
1981
- 1981-09-09 JP JP14084281A patent/JPS5843798A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5536759A (en) * | 1978-09-07 | 1980-03-14 | Ajinomoto Co Inc | Measuring method of kallikrein in human urine |
JPS5698656A (en) * | 1979-12-27 | 1981-08-08 | Merck Patent Gmbh | Immunological measurement method of enzyme |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63174199A (ja) * | 1987-01-13 | 1988-07-18 | 住友電気工業株式会社 | 車両認識方法 |
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