KR20200128122A - 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키는 방법, 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 용액 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 단백질을 안정화시키는 방법으로서, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존시키는 공정을 포함하되, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈(haptoglobin), 헤모글로빈-합토글로빈(haemoglobin-haptoglobin) 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 혈액 단백질 등의 단백질을 안정화시키는 것이 가능하다. 본 발명은 추가로, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 안정화 용액, 및 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하기 위한 방법 및 키트(kit)를 제공한다.
Description
본 발명은 생체로부터 유래하는 검체(sample) 중에 포함된 단백질을 안정화시키는 방법, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 안정화 용액(stabilizing solution) 및 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하기 위한 방법 및 키트(kit)에 관한 것이다.
대변, 뇨, 타액 등의 검체 중에 포함된 단백질의 검출은, 많은 질환의 진단에 유용하다. 예를 들어 대변 검체 중의 혈액을 검출하는 변잠혈(便潛血) 검사에 따라, 대장암을 비롯한 소화기 질환의 진단에서 중요한 정보를 얻을 수 있다. 대변 등의 검체 중에 포함되는 헤모글로빈이나 합토글로빈(haptoglobin), 헤모글로빈-합토글로빈(hemoglobin-haptoglobin) 복합체 등의 혈액 단백질 등을 검출하는 방법으로서, 이들의 단백질에 대한 항체를 이용하여 검출하는 면역학적 측정방법이 알려져 있다.
잠혈 검사에 사용하는 검체는, 통상, 피험자 자신이 보존 용액이 들어 있는 보존 용기로 채취하여, 병원 등의 검사기관으로 수송된다. 많은 경우, 검체를 함유하는 보존 용액(시료)의 수송에는 며칠의 시간을 필요로 하고, 일반적으로 수송 중의 온도 관리가 곤란하기 때문에, 보존상 바람직하지 않은 온도 조건에 노출되는 경우도 많다. 검체 중에 포함된 혈액 단백질 등의 단백질이, 수송시의 온도조건 등에 의해서 변성되거나 검체 중의 세균이나 효소에 의해서 분해 또는 변질됨으로써, 에피토프(epitope) 또는 그 근방의 구조가 변화하면, 항체가 이들의 대변 중에 포함된 단백질을 인식할 수 없게 되고, 면역학적 측정법에 따른 정확한 측정이 불가능하게 된다. 특히 헤모글로빈은 용액 중에서 불안정하고, 고온 조건하에서는 특히 변성되거나 또는 분해되기 쉽다.
보존 용액 중의 헤모글로빈을 안정화시키는 기술로는, 예를 들어 티메로살(thimerosal), 클로르헥시딘(chlorhexidine) 등의 항균제를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 1), 프로테아제(protease) 저해 물질을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 2), 글리코시다제(glycosidase)형 용균효소(lytic enzyme)를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 3), 헤모글로빈의 효소 분해 산물을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 4), 말산(malic acid) 등의 유기산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 5), 이미노카복실산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 6), 할로알칸설폰산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 7) 등의 다양한 방법들이 제안되어 있다.
게다가, 헤모글로빈을 안정화시키기 때문에, 합토글로빈을 첨가하는 방법도 알려져 있다(예를 들어 특허문헌 8). 합토글로빈은 광범위한 동물의 혈액 중에 존재하고, 헤모글로빈과 신속하게 결합하여, 안정한 헤모글로빈-합토글로빈 복합체(Hb-Hp 복합체)를 형성한다는 것이 알려져 있다. 대변 등의 검체를 보존하는 보존 용액 등에 미리 합토글로빈을 첨가해 둠으로써, 대변 등의 검체를 가했을 때, 생체로부터 유래하는 검체에 포함된 헤모글로빈을, 안정된 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 하는 것이 가능하다.
하지만, 헤모글로빈은 매우 불안정하기 때문에, 이러한 헤모글로빈의 안정화 방법에도, 그의 변성 또는 분해를 충분히 방지하는 것에는 이르지 못하였다. 그 때문에, 변잠혈을 검출하는 방법으로서, 헤모글로빈 보다 안정성이 뛰어난 트랜스페린(transferrin)을 측정하는 방법도 알려져 있지만(예를 들어 특허문헌 9), 혈액 중의 트랜스페린은 헤모글로빈의 1／60 정도밖에 존재하지 않기 때문에, 감도가 낮다는 문제를 안고 있다.
대변, 뇨, 타액 등의 생체로부터 유래하는 검체, 특히 대변 중에는, 헤모글로빈 등의 단백질을 분해시키거나 또는 변질시키는 세균이나 효소가 많이 존재하기 때문에, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체와 같은 비교적 안정성이 높은 단백질일지라도, 분해되거나 변질되는 경우가 있었다.
따라서 본 발명은 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 분해 또는 변성 등을 일으키기 쉬운 바람직하지 않은 온도 조건에서도 안정성을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[1] 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키는 방법으로서,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존 시키는 공정을 포함하되,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈(haptoglobin) 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체(hemoglobin-haptoglobin complex)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법.
[2] 아릴 보론산이, 페닐 보론산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, [1]에 기재된 방법.
[3] 아릴 보론산이, 페닐 보론산, 하이드록시페닐 보론산, 카복실페닐 보론산, 아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종인, [1] [2]에 기재된 방법.
[4] 상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산을 포함하는 용액 중에 분산시키는 공정이고,
상기 아릴 보론산의 상기 용액 중의 농도가, 0.1 mmol/L 이상인, [1] 내지 [3]에 기재된 방법.
[5] 상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산 및 당(糖)과 공존시키는 공정인, [1] 내지 [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 당이, 당 알코올, 단당(單糖) 및 이당(二糖)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, [5]에 기재된 방법.
[7] 상기 당이, 소르비톨, 글루코스, 만니톨, 프럭토스, 자일리톨, 에리트리톨(erythritol), 수크로스, 트레할로스(trehalose), 락토스 및 말토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, [5] [6]에 기재된 방법.
[8] 상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산 및 상기 당을 포함하는 용액 중에 분산시키는 공정이며, 상기 당의 상기 용액 중의 농도가, 5 mmol/L 이상인, [5] 내지 [7]에 기재된 방법.
[9] 상기 생체로부터 유래하는 검체는 적어도 헤모글로빈을 포함하되,
상기 방법은, 상기 헤모글로빈과 합토글로빈을 접촉시켜서, 헤모글로빈과 합토글로빈의 복합체를 형성하는 공정을 포함하는, [1] 내지 [8]에 기재된 방법.
[10] 상기 생체로부터 유래하는 검체가, 대변, 타액, 또는 뇨인, [1] 내지 [9]에 기재된 방법.
[11] 생체로부터 유래하는 검체에 포함되는 단백질을 안정화시키기 위한 용액으로서,
아릴 보론산을 포함하고,
상기 생체로부터 유래하는 검체에 포함되는 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 안정화 용액.
[12] 상기 아릴 보론산이, 페닐 보론산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, [11]에 기재된 안정화 용액.
[13] 상기 아릴 보론산이, 페닐 보론산, 하이드록시페닐 보론산, 카복실페닐 보론산, 아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종인, [11] 내지 [12]에 기재된 안정화 용액.
[14] 당을 포함하는, [11] 내지 [13]에 기재된 안정화 용액.
[15] 당이, 소르비톨, 글루코스, 만니톨, 프럭토스, 자일리톨, 에리트리톨, 수크로스, 트레할로스, 락토스 및 말토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, [14]에 기재된 안정화 용액.
[16] 합토글로빈을 포함하는, [11] 내지 [15]에 기재된 안정화 용액.
[17] 상기 검체가 대변, 타액, 또는 뇨인, [11] 내지 [16]에 기재된 안정화 용액.
[18] 상기 생체로부터 유래하는 검체를 보존하기 위한 용액인, [11] 내지 [17]에 기재된 안정화 용액.
[19] 생체로부터 유래하는 검체 중의 단백질을 검출하는 방법으로서,
[11] 내지 [18]에 기재된 안정화 용액에, 상기 생체로부터 유래하는 검체를 첨가하여 상기 검체를 함유하는 시료를 얻는 공정과,
시료 중의 상기 단백질을 면역학적 측정방법에 의해서 검출하는 공정,
을 포함하고,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중의 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법.
[20] 상기 생체로부터 유래하는 검체는, 적어도 헤모글로빈을 포함하되,
상기 시료 중의 상기 헤모글로빈은 합토글로빈과 복합체를 형성하는 것인, [19]에 기재된 방법.
[21] 상기 안정화 용액은 [16]에 기재된 안정화 용액인, [20]에 기재된 방법.
[22] 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하기 위한 키트로서,
[11] 내지 [18]에 기재된 안정화 용액과,
상기 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 시약,
을 포함하되,
상기 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 키트.
본 발명에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 혈액 단백질 등의 단백질을 안정화시킬 수 있다. 부언하면, 본 발명에 따라, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 혈액 단백질 등의 단백질의 변성, 분해 또는 변질을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 면역학적 측정방법에 의해서 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다.
[생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정화 방법, 단백질의 안정화 용액]
본 발명의 일 실시형태와 관련되는, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정화 방법은 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존시키는 공정을 포함한다. 본 실시형태에 있어서, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질은, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존시킴으로써, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정성을 높일 수 있다. 단백질을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체는 대변, 타액, 또는 뇨이어도 좋고, 대변이어도 좋다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 아릴 보론산을 포함하는 용액 중에, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 분산시키는 방법을 들 수 있다. 여기서, 「분산」에는 용해 및 현탁이 포함된다.
아릴 보론산을 포함하는 용액으로는 생체로부터 유래하는 검체를 보존하기 위한 보존 용액, 검체를 보존 용액에 분산시킨 시료를 추가로 희석시키기 위한 희석 용액, 검체 중의 단백질을 검출하기 위한 키트 등에서의 반응 용액 등을 들 수 있다. 특히, 본 실시형태에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정성을 현저히 향상시킬 수 있기 때문에, 검체의 보존 용액을 매우 바람직하게 사용하는 것이 가능할 수 있다.
아릴 보론산은 공지의 것으로부터 적절히 선택할 수 있다. 아릴 보론산은 페닐 보론산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 페닐 보론산, 하이드록시페닐 보론산, 카복실페닐 보론산, 아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 페닐 보론산, 3-하이드록시페닐 보론산, 2-카복실페닐 보론산, 3-카복실페닐 보론산, 4-카복실페닐 보론산, 3-아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 특히 페닐 보론산, 3-하이드록시페닐 보론산, 3-카복실페닐 보론산, 3-아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종이어도 좋다.
상기 용액 중의 아릴 보론산의 농도는, 하한치가 0.1 mmol/L 이상, 0.2 mmol/L 이상, 또는 0.5 mmol/L 이상인 것이 바람직하다. 아릴 보론산의 농도가 상기 하한치 이상이면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정화 효과가 보다 우수한 것이 된다.
그렇다면, 상기 용액 중의 아릴 보론산의 농도는 상한치가 100 mmol/L 이하, 50 mmol/L 이하, 또는 30 mmol/L 이하인 것이 바람직하다. 아릴 보론산의 농도가 너무 높으면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 면역학적 측정법으로 측정했을 때에, 외견상의 회수율을 저하시킬 수 있다. 이것은 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정화 효과가 저하되는 것이 아니라, 고농도의 아릴 보론산이 면역학적 측정에 악영향을 주는 것으로 생각된다. 그러나, 아릴 보론산의 농도가 상기 상한치 이하이면, 면역학적 측정법에 대한 악영향이 억제되어 보다 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
다만, 용액 중에 고농도의 아릴 보론산을 포함되는 경우에도, 후술하는 고농도의 당과 공존하는 경우, 아릴 보론산과 당이 복합체를 형성함으로써, 고농도의 아릴 보론산에 의한 면역학적 측정방법에 대한 악영향이 억제된다. 그 때문에, 고농도의 당과 공존하는 경우에는, 아릴 보론산의 농도가 50 mmol/L 정도, 또한 100 mmol/L 정도일지라도, 면역학적 측정법에 의한 정확한 측정이 확보된다.
본 실시형태의 것보다 구체적인 태양으로서, 아릴 보론산은, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 용액(안정화 용액)에 함유시키킬 수 있다. 예를 들어 안정화 용액이 후술하는 합토글로빈을 포함하지 않는 경우, 아릴 보론산의 안정화 용액 중의 농도는, 하한치가 0.1 mmol/L 이상, 0.2 mmol/L 이상, 또는 0.5 mmol/L 이상으로 하는 것이 가능할 수 있다. 또한, 아릴 보론산의 안정화 용액 중의 농도는 상한치가 20 mmol/L 이하, 10 mmol/L 이하, 또는 5 mmol/L 이하로 하는 것이 가능할 수 있다.
상기 공정은, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산과 함께, 또한 당과 공존시키는 공정으로 할 수 있다. 아릴 보론산에 더하여, 당과 공존시킴으로써, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정성을 더욱 높일 수 있다. 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 당과 공존시키는 방법은 예를 들어 상기 아릴 보론산을 포함하는 용액에, 당을 더 함유시키는 방법을 들 수 있다.
당은, 공지의 것으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨 등이 당 알코올; 글루코스, 프럭토스, 만노스(mannose), 갈락토스 등이 단당; 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스 등의 이당; 올리고당(oligosaccharide); 등을 들 수 있다.
당은, 당 알코올, 단당 및 이당으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 소르비톨, 글루코스, 만니톨, 프럭토스, 자일리톨, 에리트리톨, 수크로스, 트레할로스, 락토스 및 말토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 소르비톨, 만니톨, 프럭토스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋다.
그러나, 글루코스나 프럭토스 등의, 용액 중에서 알데하이드기나 케톤기를 형성하는 당(환원당)은, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질이나 이들 단백질의 안정화제로서 용액에 첨가되는 알부민(albumin) 등과 반응(메일라드 반응(Maillard reaction))하여 단백질을 변질시키고, 갈색 물질(멜라노이딘((melanoidin))을 생성하기 때문에, 단백질과 반응하지 않는 당이 바람직하다. 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 에피토프 또는 그의 근방이 환원당에 의해서 변질된 구조가 변화하면, 항체에 따라 이들의 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 인식할 수 없게 되어, 면역학적 측정법에 의한 정확한 측정을 할 수 없게 되는 것이다. 그 때문에, 본 실시형태의 것보다 구체적인 일 태양으로는, 단백질과 반응하지 않는 비환원당을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 비환원당은, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레할로스, 수크로스 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋고, 소르비톨, 만니톨 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋다.
당의 농도는, 하한치가 5 mmol/L 이상, 10 mmol/L 이상, 또는 25 mmol/L 이상인 것이 바람직하다. 당의 농도가 상기 하한치 이상이면, 아릴 보론산과 상승적으로 작용하여, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정화 효과가 보다 더 뛰어난 것으로 된다.
당의 농도의 상한치는, 당 알코올 및 단당에서는 1000 mmol/L 이하, 500 mmol/L 이하, 또는 100 mmol/L 이하이어도 좋고, 이당에서는 500 mmol/L 이하, 250 mmol/L 이하, 또는 100 mmol/L 이하이어도 좋다. 당의 농도가 상기 상한치 이하이면, 안정화 용액의 점도가 너무 높지 않아서 측정에 지장을 주어서 곤란하다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 보존하기 위한 안정화 용액은, pH를 5~10, 바람직하게는 6~8으로 유지할 수 있는 완충액이면 좋고, 2-모르폴리노에탄설폰산(MES), 하이드록시 에틸피페라진-2-에탄설폰산(HEPES), 피페라진-비스(2-에탄설폰산)(PIPES) 등의 양호한 완충액을 포함하는 완충액이어도 좋고, 인산 완충액, 트리스 완충액 또는 글리신 완충액이어도 좋다.
안정화 용액은, 항균제, pH 조정제, 이온 강도를 조절하기 위한 염류, 계면활성제, 응집 촉진제, 단백질의 보존시에 사용하는 공지의 안정화제 등의 첨가제를 더 포함해도 좋다. 항균제는, 아지드화 나트륨(sodium azide), 항생물질, 용균효소를 포함한다. 첨가제로는 히스티딘(histidine), 리신(lysine) 등의 아미노산, 알부민, 프로테아제 저해제, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 등의 킬레이트제(chelating agent) 등, 단백질을 안정화시키는 작용을 가지는 것이 알려진 공지의 물질이 포함된다.
상기 안정화 방법 또는 안정화 용액에 따르면, 아릴 보론산의 작용에 의해서, 또는 아릴 보론산과 당의 상승 작용에 의해서, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 안정성을 높일 수 있다. 부언하면, 상기 안정화 방법 또는 안정화 용액에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 변성, 분해 또는 변질을 방지할 수 있고, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질의 에피토프 및 그 주변부의 구조를 유지하는 것이 가능할 수 있다. 그 때문에, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 면역학적 측정방법에 의해서 검출하는 경우, 검출의 정확성 향상이 기대된다.
본 실시형태의 보다 구체적인 일 태양은, 적어도 헤모글로빈을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체를, 합토글로빈과 접촉시킴으로써, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 형성하는 공정을 포함해도 좋다. 이 경우에 있어서, 헤모글로빈을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체는, 대변, 타액, 또는 뇨이어도 좋고, 대변이어도 좋다. 대변 중에는, 헤모글로빈의 분해 또는 변질을 일으키는 세균이나 효소가 특히 많이 존재하기 때문에, 본 실시형태의 방법이 특히 유용하다.
헤모글로빈을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체와 합토글로빈은 어떻게 접촉시켜도 좋지만, 합토글로빈을 포함하는 상기 보존 용액 중에, 헤모글로빈을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체를 첨가하는 것이 바람직하다. 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 헤모글로빈은, 보존 용액 중의 합토글로빈과 신속하게 반응 하여, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 형성한다. 그리고, 생체로부터 유래하는 검체를 첨가한 보존 용액을 그대로 보존함으로써, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 안정적으로 보존할 수 있다. 또한, 헤모글로빈과 합토글로빈과의 복합체 형성에서는, 헤모글로빈은 α 사슬과 β 사슬이 2개씩 회합한 4량체(α2β2)로부터 2개의 2량체(αβ)로 괴리되지만, 이 현상은 본원 명세서에서 「분해」 또는 「변성」에 해당하지는 않는다.
본 실시형태와 관련된, 헤모글로빈을 포함하는 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 안정화 용액은, 아릴 보론산, 또는 아릴 보론산 및 당을 포함하는 상기 안정화 용액에, 합토글로빈을 더 첨가한 것인 것이 바람직하다. 안정화 용액 중의 합토글로빈의 농도는, 생체로부터 유래하는 검체의 양에도 따르지만, 예를 들어 0.05 단위/L 내지 50 단위/L, 0.1 단위/L 내지 10 단위/L, 또는, 0.2 단위/L 내지 2 단위/L이다. 여기서, 1 단위는 1mg의 헤모글로빈에 결합하는 합토글로빈의 양을 나타낸다. 상기 범위의 합토글로빈 농도는, 생체로부터 유래하는 검체 중의 모든 헤모글로빈을, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 하는데 충분한 농도이다.
여기서, 안정화 용액이 후술하는 합토글로빈을 포함하는 경우, 상기 아릴 보론산이 안정화 용액 중의 농도는, 하한치가 0.1 mmol/L 이상, 0.2 mmol/L 이상, 0.5 mmol/L 이상, 1 mmol/L 이상, 또는 5 mmol/L 이상으로 하는 것이 가능할 수 있다. 아릴 보론산의 농도가 상기 하한치 이상이면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 헤모글로빈이 아릴 보론산에 따른 안정화 효과가, 합토글로빈에 의한 안정화 효과와 함께, 보다 현저해진다.
또한, 아릴 보론산의 안정화 용액 중의 농도는, 상한치가 100 mmol/L 이하, 50 mmol/L 이하, 또는 30 mmol/L 이하로 하는 것이 가능할 수 있다. 아릴 보론산의 농도가 상기 상한치 이하이면, 면역학적 측정법에 대한 악영향이 억제되어 보다 정확한 측정이 가능해진다.
상기 일 태양과 관련된 안정화 방법 또는 안정화 용액에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 헤모글로빈을, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체의 형태로, 안정적으로 보존할 수 있다. 부언하면, 상기 안정화 방법 또는 안정화 용액에 따르면, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 헤모글로빈의 변성, 분해 또는 변질을 방지할 수 있기 때문에, 헤모글로빈의 에피토프 및 그 주변부위의 구조를 유지할 수 있다. 따라서 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 헤모글로빈을 면역학적 측정방법에 의해서 측정하는 경우, 검출의 정확성 향상을 기대할 수 있다.
[생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질이 검출 방법, 검출 키트]
본 발명의 일 실시형태에 따라 제공되는, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하는 방법은, 그 단백질을 안정화시키기 위한 상기 안정화 용액에 생체로부터 유래하는 검체를 첨가하여, 생체로부터 유래하는 검체를 포함하는 시료를 얻는 공정과, 시료 중의 단백질을 면역학적 측정방법에 의해서 검출하는 공정을 구비한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시형태에 따라 제공되는, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하기 위한 키트는 상기 안정화 용액과, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 시약을 포함한다.
상기 검출 방법 또는 검출 키트에 있어서, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질은 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로부터 선택된 적어도 1종이어도 좋다.
본 실시형태에 이용되는 안정화 용액으로는, 생체로부터 유래하는 검체를 보존하기 위한 보존 용액, 검체를 보존 용액에 분산시킨 시료를 더 희석시키기 위한 희석 용액, 검체 중의 단백질을 검출하기 위한 키트 등에서 반응 용액 등을 들 수 있다. 키트 등에서 반응 용액으로는, 후술하는 면역학적 측정방법에서 항체를 함유하는 용액 외에, 시료와 혼합하여 측정 환경을 조정하기 위한 용액 등이 포함된다.
면역학적 측정방법은 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질에 대한 항체를 이용하는 방법이고, 공지의 면역학적 측정법을 사용할 수 있다. 면역학적 측정방법은 예를 들어 라텍스(latex) 응집법이나 금 콜로이드 응집법 등의 면역 응집법, 이뮤노크로마토그래피 법, 또는 ELISA 법이어도 좋다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질에 대한 항체는 제한되지 않고, 다클론성 항체이든, 단클론성 항체이어도 좋고, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 인식할 수 있는, 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질에 대한 항체의 단편이어도 좋다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질에 대한 항체는, 측정 대상이 되는 단백질을 인식하는 것이면 좋고, 항헤모글로빈 항체, 항합토글로빈 항체, 항헤모글로빈-합토글로빈 복합체 항체이어도 좋다. 이들 항체는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질, 예를 들어 헤모글로빈의 검출은, 일례로서 다음과 같이 실시할 수 있다. 우선, 보존 용액이 들어 있는 용기에 검체를 첨가하여, 시료로 한다. 용기 내에서 검체를 임의의 시간동안 보존해도 좋고, 또한 검체를 함유하는 보존 용액을 여과하여 시료로 해도 좋다. 이어서, 시료 중의 헤모글로빈을, 면역학적 측정방법, 예를 들어 라텍스 응집법에 의해서 검출한다. 보다 구체적으로는, 항헤모글로빈 항체를 표면에 담지한 라텍스 입자를 포함하는 시약을, 시료에 가한다. 라텍스 입자를 포함하는 시약을 가하기 전에, 시료를 희석액으로 희석 해도 좋고, 또한 반응 용액을 첨가해도 좋다. 본 태양에 있어서, 아릴 보론산을 포함하는 전술한 안정화 용액은 보존 용액, 희석액, 반응 용액 중의 어느 것이어도 좋다. 보존 용액이, 상기 안정화 용액이면, 특히 바람직하고, 이 경우에, 희석액 및/또는 반응 용액은, 아릴 보론산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
헤모글로빈은, 생체로부터 유래하는 검체 중에서, 검체 중의 합토글로빈과 복합체를 형성하고 있는 것도 있고, 유리된 헤모글로빈으로 존재하는 것도 있다. 그 때문에, 헤모글로빈의 검출에 사용하는 항헤모글로빈 항체는, 유리된 헤모글로빈의 에피토프를 인식 가능함과 동시에, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체에서 헤모글로빈의 에피토프도 인식 가능하고, 또한, 합토글로빈과 교차 반응을 일으키지 않는 것이 바람직하다.
시료 중에 헤모글로빈이 존재하는 경우, 항헤모글로빈 항체가 헤모글로빈을 인식하고, 항체를 담지하는 라텍스 입자가 응집한다. 응집에 의한 탁도의 변화를 측정하고, 농도가 알려진 헤모글로빈을 포함하는 캘리브레이터(calibrator)를 사용하여 작성한 검량선에 의해서, 시료 중의 헤모글로빈 농도를 구한다. 또한, 캘리브레이터의 헤모글로빈의 농도에 근거하여 작성한 검량선에 의해서, 시료 중의 헤모글로빈의 농도를 구할 수도 있다.
상기 안정화 용액이 합토글로빈을 포함하는 경우에, 헤모글로빈의 검출은 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다. 우선, 보존 용액이 들어 있는 용기에 검체를 첨가하여, 시료로 한다. 용기 내에서 검체를 임의의 시간동안 보존해도 좋고, 또한, 검체를 함유하는 보존 용액을 여과하여 시료로 해도 좋다. 이어서, 시료 중의 헤모글로빈을, 면역학적 측정방법, 예를 들어 라텍스 응집법에 의해서 검출한다. 보다 구체적으로는, 항헤모글로빈 항체를 표면에 담지한 라텍스 입자를 포함하는 시약을, 시료에 가한다. 라텍스 입자를 포함하는 시약을 가하기 전에, 시료를 희석액으로 희석해도 좋고, 또한 반응 용액을 첨가해도 좋다.
본 태양에 있어서, 아릴 보론산 및 합토글로빈을 포함하는 안정화 용액은 보존 용액, 희석액, 반응 용액 중의 어느 것이어도 좋다.
보존 용액이, 아릴 보론산 및 합토글로빈을 포함하는 안정화 용액이면 특히 바람직하고, 이 경우에, 희석액 및/또는 반응 용액은 합토글로빈을 포함해도 포함하지 않아도 좋으며, 또한 아릴 보론산을 포함해도 포함하지 않아도 좋다.
본 태양에 있어서는, 검체 중에 헤모글로빈이 존재하는 경우, 헤모글로빈은 안정화 용액으로 포함되는 합토글로빈과 반응하여, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 형성한다. 검체 중의 모든 헤모글로빈이 복합체를 형성할 필요는 없고, 검체를 함유하는 안정화 용액(시료)로는, 합토글로빈과 복합체를 형성하지 않는 헤모글로빈이 존재해도 좋지만, 검체 중의 모든 헤모글로빈이 합토글로빈과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다.
항헤모글로빈 항체는, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체에서 헤모글로빈의 에피토프를 인식할 수 있고, 또한, 합토글로빈과 교차 반응을 일으키지 않는 것이 바람직하다.
시료 중에 헤모글로빈이 존재하는 경우, 항헤모글로빈 항체가 헤모글로빈(합토글로빈과 복합체를 형성한 헤모글로빈을 포함한다)을 인식하고, 항체를 담지한 라텍스 입자가 응집한다. 응집에 의한 탁도의 변화를 측정하고, 헤모글로빈 농도가 알려진 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 포함하는 캘리브레이터를 사용하여 작성한 검량선에 의해서, 시료 중의 헤모글로빈 농도를 구한다. 또한, 캘리브레이터의 헤모글로빈-합토글로빈 복합체의 농도에 기초하여 작성한 검량선에 의해서, 시료 중의 헤모글로빈-합토글로빈 복합체의 농도를 구할 수도 있다.
이상 설명한 실시형태는 본 발명의 이해를 돕기 위해서 기재된 것으로, 본 발명을 한정하기 위해서 기재된 것이 아니다. 따라서, 상기 실시형태에 개시된 각 요소는 본 발명의 기술적 범위에 속하는 모든 설계 변경이나 균등물도 포함하는 취지이다.
[실시예]
실시예 1
40 mmol/L의 HEPES(pH6.8), 0.1％의 BSA, 0.1％의 NaN3, 1단위/L의 합토글로빈 및 0 내지 100 mmol/L의 페닐 보론산을 첨가한 보존 용액을 조제하였다. 헤모글로빈이 첨가된 대변 검체를 대변 농도가 0.5％로 되도록 보존 용액에 넣은 시료를 37℃에서, 0, 7, 14 및 21일 보존하였다. 한편, 대변 검체에는, 시료 중의 헤모글로빈 농도가 약 300㎍/L로 되는 양의 헤모글로빈이 첨가되었다. 헤모글로빈이 첨가된 대변 검체 대신에, 시료 중의 헤모글로빈 농도가 300㎍/L로 되도록 헤모글로빈을 보존 용액에 첨가하였다. 대변 검체가 포함되지 않은 시료를, 동일한 방식으로 보존하였다. 보존된 시료 중의 헤모글로빈(Hb) 농도(㎍/L)를 라텍스 응집법에 따라 측정하였다.
헤모글로빈의 농도는, 측정 시약으로서 「OC-헤모디아(등록상표) 오토 III '에이켄'」(에이켄가가쿠가부시키가이샤제), 측정 장치로서 「OC-센서-DIANA」(에이켄가가쿠가부시키가이샤제)를 이용하여 측정하였다. 상기 측정 시약은, 항인간 헤모글로빈 토끼 다클론성 항체를 담지시킨 라텍스 입자를 포함한다.
측정된 헤모글로빈의 농도로부터, 대변 검체를 보존 용액에 가한 직후의 헤모글로빈 농도(즉, 대변 검체를 가한지 0일 후의 농도)에 대한 회수율(％)을 산출하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1으로부터 명확하듯이, 대변 1, 대변 2 및 대변 3의 어느 시료에 대해서도, 페닐 보론산을 0.5 mmol/L 이상의 농도로 첨가함으로써, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 향상되었다. 헤모글로빈의 회수율은 페닐 보론산 농도에 의존하여 향상되고, 페닐 보론산의 농도 15 mmol/L에서 최대로 되고, 50 mmol/L 이상의 첨가에서는 외관상의 회수율이 저하되었다. 대변 검체를 포함하지 않는 시료에 있어서는, 페닐 보론산의 첨가에 의한 회수율의 향상이 관측되지 않았다. 이러한 결과는, 페닐 보론산이, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈을 안정화시키는 것을 나타낸다. 또한, 시료 중의 헤모글로빈은, 보존 용액 중에 포함되는 합토글로빈과 결합된 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로서 존재하기 때문에, 상기 결과는, 페닐 보론산이, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 안정화시키는 것을 의미한다.
[표 1]
실시예 2
실시예 1의 보존 용액인 페닐 보론산 대신에, 2-카복실페닐 보론산(2-CPBA), 3-카복실페닐 보론산(3-CPBA), 4-카복실페닐 보론산(4-CPBA), 3-하이드록시페닐 보론산(3-HPBA) 및 3-아미노페닐 보론산(3-APBA)를 각각 15 mmol/L 씩 첨가해서 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교예로서 아릴 보론산을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2로부터 명백하듯이, 다른 아릴 보론산을 사용하는 경우에도, 아릴 보론산을 첨가하지 않은 비교예와 비교하여, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 대변 검체에 대해서도, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 향상되었다.
[표 2]
실시예 3
실시예 1의 보존 용액인 페닐 보론산의 농도를 15 mmol/L로 고정하고, 50 mmol/L 혹은 100 mmol/L의 당(소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 프럭토스, 또는 만니톨)을 더 첨가한 보존 용액, 또는 당을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교예로서, 페닐 보론산 및 당을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3으로부터 명백하듯이, 페닐 보론산에, 소르비톨, 만니톨, 수크로스, 또는 프럭토스를 더 첨가한 경우, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 대변 검체에 대해서도, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 더 향상되고, 특히 소르비톨 및 만니톨에서 회수율이 현저히 향상되었다. 그러나 트레할로스, 또는 글루코스에서는, 회수율의 향상을 볼 수 없는 대변 검체(대변 3)도 발견되었다. 이러한 결과는, 페닐 보론산에, 당을 더 첨가함으로써, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 안정성을, 더욱 향상시킬 수 있었지만, 첨가하는 당의 종류에 따른, 효과의 차이인 것으로 여겨진다. 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 프럭토스, 또는 만니톨 중에서 소르비톨 및 만니톨의 효과가 현저하고, 특히 소르비톨은 대변 검체(대변 1)에 대한 회수율의 저하가 전혀 관측되지 않았다.
[표 3]
실시예 4
페닐 보론산을 포함하지 않는 실시예 1의 보존 용액에, 100 mmol/L의, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 프럭토스, 또는 만니톨을 첨가한 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교를 위해, 이들의 당을 첨가하지 않고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4로부터 명백하듯이, 페닐 보론산을 포함하지 않는 보존 용액에, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 또는 프럭토스를 첨가하여도, 대변 검체를 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 회수율은 향상되지 않았다. 이러한 결과는, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 또는 프럭토스 등의 당 단독으로는, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈을 안정화시키지 않는다는 것을 의미하고, 페닐 보론산과 당이 함께 존재할 필요가 있다는 것을 의미한다.
[표 4]
실시예 5
실시예 1의 보존 용액인 페닐 보론산을 15 mmol/L로 고정하고, 10 내지 500 mmol/L의 소르비톨, 혹은 10 내지 250 mmol/L의 수크로스를 첨가한 보존 용액, 또는 당을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교예로서, 페닐 보론산 및 당을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5로부터 명백하듯이, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 시료에 대해서도, 소르비톨, 또는 수크로스의 첨가 농도에 의존하여, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 향상되고, 25 mmol/L 이상의 첨가에서 일정하였다.
[표 5]
실시예 6
실시예 1의 보존 용액인 페닐 보론산 대신에, 3-카복실페닐 보론산(3-CPBA), 3-하이드록시페닐 보론산(3-HPBA) 및 3-아미노페닐 보론산(3-APBA)을 각각 15 mmol/L 씩 첨가하고, 100 mmol/L의, 소르비톨, 수크로스, 또는 만니톨을 첨가해서 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교예로서, 아릴 보론산을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 표 6으로부터 명백하듯이, 다른 아릴 보론산을 사용하는 경우에도, 소르비톨, 수크로스, 또는 만니톨을 더 첨가하는 경우, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 대변 검체에 대해서도, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 더욱 향상되어, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 안정성이 상승적으로 높아질 수 있는 것을 알았다.
[표 6]
실시예 7
실시예 1의 보존 용액인 페닐 보론산을 0 내지 50 mmol/L로 하고, 100 mmol/L의, 소르비톨, 또는 만니톨을 첨가한 보존 용액을 조제하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7으로부터 명백하듯이, 당을 첨가한 보존 용액에 있어서는, 페닐 보론산을 50 mmol/L 첨가하여도 외관상의 회수율의 저하가 관측되지 않았다. 이의 이유는 아릴 보론산은 (고농도에서) 면역 응집반응을 저해하는 성질을 가지고 있지만, 고농도의 아릴 보론산이 존재하면 면역학적 측정 방법에 악영향을 주고 외관상의 회수율이 저하하는 한편, 더욱이 고농도의 당이 공존하는 경우에는, 아릴 보론산과 당이 복합체를 형성함으로써, 고농도의 아릴 보론산에 의해서 면역학적 측정 방법에 대한 악영향이 억제되는 것으로 고려된다.
[표 7]
실시예 8
40 mmol/L의 HEPES(pH6.8), 0.1％의 BSA, 0.1％의 NaN3 및 0 내지 2.5 mmol/L의 페닐 보론산을 첨가한 보존 용액을 조제하였다. 또한, 페닐 보론산 대신에, 3-카복실페닐 보론산(3-CPBA), 3-하이드록시페닐 보론산(3-HPBA) 및 3-아미노페닐 보론산(3-APBA)를 각각 0.5 mmol/L 씩 첨가해서 보존 용액을 아울러 조제하였다. 헤모글로빈을 첨가한 대변 검체를, 대변 농도가 0.5％로 되도록 보존 용액에 가한 시료를 37℃에서, 0, 16, 38 및 62 시간동안 보존하였다. 또한, 대변 검체에는, 시료 중의 헤모글로빈 농도가 약 300㎍/L로 되는 양의 헤모글로빈을 첨가하였다. 헤모글로빈이 첨가된 대변 검체 대신에, 시료 중의 헤모글로빈 농도가 300㎍/L로 되도록 헤모글로빈을 보존 용액에 첨가하였다, 대변 검체를 포함하지 않는 시료를, 동일한 방식으로 보존하였다. 보존된 시료 중의 헤모글로빈(Hb) 농도(㎍/L)를, 실시예 1과 동일한 측정 시약 및 측정 장치를 이용하여 라텍스 응집법에 따라 측정하였다.
본 실시예에서는, 보존 용액으로 합토글로빈이 포함되어 있지 않기 때문에, 실시예 1 내지 7과 비교하면 헤모글로빈은 빨리 분해되지만, 아릴 보론산에 의한 헤모글로빈의 안정화 효과는 본 실시예에 있어서도 관측되었다. 즉, 표 8으로부터 명백하듯이, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 시료에 대해서도, 아릴 보론산을 0.25 mmol/L 이상의 농도로 첨가함으로써, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 향상되었다. 또한, 실시예 1 내지 7과는 달리 보존 용액 중에 합토글로빈이 포함되어 있지 않기 때문에, 시료 중의 헤모글로빈의 대부분은 합토글로빈과 복합체를 형성 하지 않고 존재하는 것으로 인정된다. 그 때문에, 상기 결과는, 아릴 보론산이, 합토글로빈과 복합체를 형성하고 있지 않은 헤모글로빈에 대해서도 안정화시키는 것을 의미한다.
[표 8]
실시예 9
실시예 8의 보존 용액인 페닐 보론산의 농도를 0.5mmol／L로 고정시키고, 10 내지 250mmol／L의 소르비톨 혹은 수크로스, 또는 50 내지 100mmol／L의 트레할로스, 글루코스, 프럭토스 혹은 만니톨을 더 첨가한 보존 용액을 조제하고, 실시예 8과 동일한 방식으로 시험하였다. 또한, 페닐 보론산을 첨가하고 당을 첨가하지 않은 보존 용액, 또한 비교예로서 페닐 보론산 및 당을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 9a 및 9b에 나타낸다. 표 9a 및 9b로부터 명백하듯이, 합토글로빈을 포함하지 않은 보존 용액도, 페닐 보론산에, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 프럭토스 또는 만니톨을 더 첨가하는 경우, 대변 1, 대변 2 및 대변 3 중의 어느 대변 검체에 대해서도, 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 더욱 향상되었다. 또한, 페닐 보론산을 포함하지 않은 보존 용액에 당을 첨가하여도, 대변 검체를 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 회수율은 향상되지 않았다. 이러한 결과는, 합토글로빈을 포함하지 않은 보존 용액도, 실시예 2 내지 7과 동일한 방식으로 페닐 보론산과 각종 당과의 상승 효과(synergistic effect)를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.
[표 9a]
[표 9b]
실시예 8의 보존 용액인 페닐 보론산의 농도를 0.5 mmol/L로 고정시키고, 또한 페닐 보론산 대신에, 3-카복실페닐 보론산(3-CPBA), 3-하이드록시페닐 보론산(3-HPBA) 및 3-아미노페닐 보론산(3-APBA)를 각각 0.5 mmol/L 씩 첨가하고, 100 mmol/L의 소르비톨 또는 수크로스를 첨가한 보존 용액을 조제하고, 실시예 8과 동일한 방식으로 시험하였다. 비교예로서, 아릴 보론산을 첨가하지 않은 보존 용액을 조제하고, 동일한 방식으로 시험하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다. 표 10으로부터 명백하듯이, 합토글로빈을 포함하지 않은 보존 용액도, 각종 아릴 보론산과 당을 병용하는 것에 의해서 시료 중의 헤모글로빈의 회수율이 더욱 향상되고, 대변을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈의 안정성을 상승적으로 높이는 것으로 밝혀졌다.
[표 10]
Claims (22)
- 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키는 방법으로서,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 아릴 보론산과 공존 시키는 공정을 포함하되,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈(haptoglobin) 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체(hemoglobin-haptoglobin complex)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 1 항에 있어서,
아릴 보론산이, 페닐 보론산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
아릴 보론산이, 페닐 보론산, 하이드록시페닐 보론산, 카복실페닐 보론산, 아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산을 포함하는 용액 중에 분산시키는 공정이고,
상기 아릴 보론산의 상기 용액 중의 농도가, 0.1 mmol/L 이상인, 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산 및 당(糖)과 공존시키는 공정인, 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 당이, 당 알코올, 단당(單糖) 및 이당(二糖)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 당이, 소르비톨, 글루코스, 만니톨, 프럭토스, 자일리톨, 에리트리톨(erythritol), 수크로스, 트레할로스(trehalose), 락토스 및 말토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 5 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공정은, 상기 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을, 상기 아릴 보론산 및 상기 당을 포함하는 용액 중에 분산시키는 공정이며, 상기 당의 상기 용액 중의 농도가, 5 mmol/L 이상인, 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생체로부터 유래하는 검체는 적어도 헤모글로빈을 포함하되,
상기 방법은, 상기 헤모글로빈과 합토글로빈을 접촉시켜서, 헤모글로빈과 합토글로빈의 복합체를 형성하는 공정을 포함하는 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생체로부터 유래하는 검체가, 대변, 타액, 또는 뇨인, 방법. - 생체로부터 유래하는 검체에 포함되는 단백질을 안정화시키기 위한 용액으로서,
아릴 보론산을 포함하고,
상기 생체로부터 유래하는 검체에 포함되는 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 안정화 용액. - 제 11 항에 있어서,
상기 아릴 보론산이, 페닐 보론산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 안정화 용액. - 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 아릴 보론산이, 페닐 보론산, 하이드록시페닐 보론산, 카복실페닐 보론산, 아미노페닐 보론산 및 그들의 염으로 이루어진 군부터 선택된 적어도 1종인, 안정화 용액. - 제 11 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
당을 포함하는, 안정화 용액. - 제 14 항에 있어서,
당이, 소르비톨, 글루코스, 만니톨, 프럭토스, 자일리톨, 에리트리톨, 수크로스, 트레할로스, 락토스 및 말토스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 안정화 용액. - 제 11 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
합토글로빈을 포함하는 것인, 안정화 용액. - 제 11 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 검체가 대변, 타액, 또는 뇨인, 안정화 용액. - 제 11 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생체로부터 유래하는 검체를 보존하기 위한 용액인, 안정화 용액. - 생체로부터 유래하는 검체 중의 단백질을 검출하는 방법으로서,
제 11 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 기재된 안정화 용액에, 상기 생체로부터 유래하는 검체를 첨가하여 상기 검체를 함유하는 시료를 얻는 공정과,
시료 중의 상기 단백질을 면역학적 측정방법에 의해서 검출하는 공정,
을 포함하고,
상기 생체로부터 유래하는 검체 중의 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 생체로부터 유래하는 검체는, 적어도 헤모글로빈을 포함하되,
상기 시료 중의 상기 헤모글로빈은 합토글로빈과 복합체를 형성하는 것인, 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 안정화 용액은 제 16 항에 기재된 안정화 용액인, 방법. - 생체로부터 유래하는 검체 중에 포함된 단백질을 검출하기 위한 키트로서,
제 11 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 기재된 안정화 용액과,
상기 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 시약,
을 포함하되,
상기 단백질이, 헤모글로빈, 합토글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 키트.
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