NL8200631A

NL8200631A - Reagens en werkwijze voor immunologische analyse.

Info

Publication number: NL8200631A
Application number: NL8200631A
Authority: NL
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1981-02-18
Filing date: 1982-02-17
Publication date: 1982-09-16
Also published as: JPS57136165A; SE8200978L; IT8247814A0; FR2500166A1; DE3205849A1; DE3205849C2; GB2095831A; CH658131A5; GB2095831B; FR2500166B1; IT1147626B

Description

V i VO 3086

Reagens en werkwijze voor immunologische analyse.

Gedurende de laatste jaren heeft de vooruitgang op het gebied van de immunochemie geleid tot uitgebreide onderzoeken van antilichamen, waarvan in het verleden weinig bekend was, en zijn het controle mechanisme voor antilichamen-produktie en de biochemische structuren en 5 eigenschappen van antilichamen in detail bestudeerd.

In 1975 is C. Milstein et al. erin geslaagd om een monoclonaal antilichaam te produceren door celfusie van muizen myeloma cellen met antilichaam-producerende cellen uit de milt. Het monoclonale antilichaam zal naar verwachting sterk bijdragen aan de ontwikkeling van fundamentele 10 onderzoeken van de immunologie, en er zijn op dit gebied actief onderzoeken uitgevoerd.

Enzymoimmuno-analyse (EIA) is eerder gebruikt als een zeer gevoelige en kwantitatieve immunologische analyse methode. In het bijzonder wordt vaak de op deze analyse gebaseerde sandwich-methode gebruikt en 15 dan vanwege de eenvoud van de procedure en de hoge gevoeligheid. Omdat de sandwich-methode echter 1 tot 4 dagen voor de reactie nodig heeft, is het gewenst dat de vereiste reactietijd geminimaliseerd wordt.

Verder bestaat in verband met recente vooruitgang in de clinische geneeskunde, behoefte aan een snelle evaluatie van de proefresultaten om 20 de patiënt onmiddellijk te kunnen behandelen. Ook vanuit dit oogpunt is verkorting van de reactietijd dringend gewenst. Volgens de conventionele sandwich-methode leidt echter verkorting van de reactietijd tot een verlaging van de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de analyse zoals onderstaand zal worden toegelicht, zodat een significante verkorting 25 van de reactietijd niet bereikt kan worden.

Thans zal de conventionele sandwich-methode nader in detail worden beschreven. Hoewel de methode hier voor het gemak wordt toegelicht in relatie tot EIA, kan de uitleg ook worden toegepast op de methode die gebaseerd op FIA (fluoroimmuno-analyse).

30 De conventionele sandwich-methode wordt in de volgende volgorde uitgevoerd zoals in het schematische diagram in figuur 1 wordt getoond, i) Men laat onoplosbaar gemaakt antilichaam 2’, verkregen door een antilichaam voor een te analyseren antigeen 3 aan een onoplosbare drager (vaste fase) 4 te binden, reageren met het antigeen 3 teneinde het 35 antigeen 3 aan het antilichaam 2' op de vaste fase te binden (eerste reactie).

8200631 h i -2- ii) De vaste fase 4 wordt gewassen om stoffen die niet gereageerd hebben te verwijderen.

iii) De aldus gewassen vaste fase 4 wordt in reactie gebracht met gelabeld antilichaam 1', verkregen door een enzym 5 te binden aan 5 een antilichaam voor het te analyseren antigeen 3, teneinde het gelabelde antilichaam 11 te binden aan een niet gereageerd hebbende antigenische plaats van het antigeen 3 dat aan de vaste fase 4 is bevestigd (tweede reactie).

iv) De vaste fase 4 wordt gewassen om de overmaat gelabeld anti- 10 lichaam 1' te verwijderen en daarna wordt een substraat voor het enzym toegevoegd en aan de enzym-reactie onderworpen.

Omdat antigeen 3 en gelabeld antilichaam 1' aan de vaste fase 4 zijn gebonden, vindt de enzym-reactie in evenredigheid aan de aanwezige hoeveelheid enzym plaats. De hoeveelheid te analyseren anti-15 geen 3 wordt bepaald uit de hoeveelheid verkregen reactieprodukt.

Omdat de sandwich-methode algemeen gezien wordt als een niet-competitieve analyse , zou men kunnen denken dat daarbij van een competitieve reactie geen sprake is Deze klassificatie brengt echter niet noodzakelijkerwijze de exacte reactietoestanden tot uitdrukking. In 20 feite kan derhalve een evenwichtstoestand bestaan in de sandwich-methode, die schematisch als volgt kan worden aangegeven.

Eerste reactie.

a (@D + CAS)^—p ( |~Ab| - Ag^) a» a’ cl 25 Tweede reactie.

(Ξ-Ag-Ab*]

,π. */· X

l -Ab. -Ag J + (Ab*D (Eb]) - (Ag-Ab*] \ Ί

(L-AbjJ +(Agj +(Ab*J

(In bovenstaande schema stellen fABj het onoplosbaar gemaakte 35 antilichaam voor? Ag het te analyseren antigeen voor; AB* het gelabelde antilichaam voor; a, a’, b, b', c, c', d, d', e en e' evenwichtscon-stanten voor? en betekent - dat het antigeen en het antilichaam aan elkaar gebonden zijn).

8200631 * ‘+ -3-

Wanneer het complex van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het te analyseren antigeen in de tweede reactie in reactie wordt gebracht met hét gelabelde antilichaam, binden het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam competitief aan het te analyseren 5 antigeen in overeenstemming met hun affiniteitswaarden voor het antigeen (omdat de eigenschappen van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam vrijwel gelijk zijn, worden hun affiniteitswaarden voor het te analyseren antigeen nagenoeg equivalent geacht), en als gevolg van de competitie dissocieert het door de eerste reactie gevormde 10 onoplosbaar gemaakte antilichaam-antigeencomplex onder vorming van complexen van verschillende combinaties zoals boven is getoond.

Dit wendt door het volgende experiment aangetoond.

Een kunststofproefbuis met een anti-HCG-β subeenheid antilichaam daaraan bevestigd, wordt in reactie gebracht met HCG-β dat met peroxi-15 dase gelabeld is, en daarna gewassen. Wanneer het in reactie wordt gebracht met een anti-HCG-β antilichaam dissocieert het met enzym gelabelde HCG-β dat aan de vaste fase is bevestigd, geleidelijk uit de vaste fase en begeeft zich in de vloeistoffase. Figuur 2 toont deze toestand.

20 Wanneer echter de tijd van de eerste reactie voldoende lang is, wordt de binding vein antigeen en antilichaam gedeeltelijk irreversibel, en ondergaat het antigeen-antilichaam complex niet zo gemakkelijk de dissociatie, zelfs niet wanneer het gelabelde antilichaam daaraan wordt toegevoegd. Anderzijds kan worden gezegd, dat wanneer de tijd van de 25 tweede reactie voldoende lang wordt gemaakt, de reactie voortschrijdt in een richting waarbij een complex wordt gevormd van "het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam". Om deze redenen is het in de conventionele sandwich-methode beslist noodzakelijk dat de reactie gedurende een voldoende lange tijd 30 wordt uitgevoerd. Wanneer de sandwich-methode derhalve zonder de eerste reactie wordt uitgevoerd of de tijdsduur van de eerste reactie in extreme mate wordt verkort (bijvoorbeeld wanneer het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam gelijktijdig met het te analyseren antigeen in reactie worden gebracht), moet de tweede reactie worden ver-35 lengd en worden toch de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de analyse verminderd. Wanneer de tijdsduur van de tweede reactie wordt yerkort, worden de gevoeligheid en nauwkeurigheid nog verder verminderd.Om deze redenen was het in de conventionele methode niet mogelijk om de reactie- 8200631 _4_ h * duur te verkorten zonder een vermindering van de gevoeligheid en nauwkeurigheid te veroorzaken. In dit opzicht hebben Ichihara et al.[ The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978)] vermeld, dat een dergelijke competitieve reactie bestaat en dat alleen wanneer voor 5 het uitvoeren van de reactie voldoende tijd wordt genomen, de reactie gedeeltelijk irreversibel werd.

Het reactiesysteem in de conventionele methode is derhalve gecompliceerd en niet efficiënt en vereist een lange reactieduur.

Doel van de onderhavige uitvinding is om een reagens te verschaffen 10 voor immunologische analyse, dat een opmerkelijke verkorting van de vereiste analyseduur mogelijk maakt zonder dat dit gepaard gaat met verlaging van de gevoeligheid en nauwkeurigheid.

In het bijzonder is een doel van de onderhavige uitvinding om èen reagens te verschaffen voor de sandwich-methode, welk reagens een onoplos-15 baar gemaakt antilichaam en gelabeld antilichaam, bereid uit monoclonale antili chamen, omvat.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om een verbeterde sandwich-methode te verschaffen, welke een opmerkelijke verkorting van de vereiste analyse-duur mogelijk maakt zonder dat dit gepaard gaat met 20 vermindering van de gevoeligheid en nauwkeurigheid.

Figuur 1 is een schematisch diagram dat de reactiewijze in een conventionele sandwich-methode toont,

Figuren 2 en 3 zijn grafieken die de aanwezigheid of afwezigheid van de competitie tussen antilichamen tonen, 25 Figuur 4 is een schematisch diagram dat de reactiewijze volgens de uitvinding toont,

Figuur 5 is een grafiek die een vergelijking tussen de onderhavige uitvinding en de conventionele methode toont,

Figuur 6 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld I toont, 30 Figuur 7 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld II toont, en

Figuur 8 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld III toont.

De bovenstaande doeleinden van de onderhavige uitvinding worden bereikt door gebruik te maken van monoclonale antilichamen voor het bereiden van onoplosbaar antilichaam en gelabeld antilichaam, welke ver-35 schillende antigenische determinanten op het zelfde antigeen onderscheiden, en binden, terwijl in conventionele methoden zogenaamde polyclonale antilichamen (verkregen uit dieren die met hetzelfde antigeen geïmmuniseerd waren) gebruikt werden voor het bereiden van deze twee antilichamen, zodat ze 8200531

Jf * -5- voor dezelfde antigenische determinanten van het antigeen in competitie treden.

De onderhavige uitvinding wordt derhalve gekenmerkt doordat het onoplosbaar gemaakte antilichaam respectievelijk het gelabelde anti-5 lichaam, antilichamen omvatten die in staat zijn om verschillende antigenische determinanten van hetzelfde te analyseren antigeen te herkennen en daaraan te binden, of antilichamen omvatten die de verschillende antigenische determinanten van het antigeen onderscheiden zodat het mogelijk is om de twee respectievelijke antilichamen zich aan verschillende anti-10 genische plaatsen te doen binden die op een voldoende afstand van elkaar op hetzelfde antigeen zijn gelegen dat ze elkanders binding niet verstoren.

Monoclonale antilichamen zijn als dergelijke antilichamen zeer geschikt.

15 De monoclonale antilichamen worden verkregen door celfusie tussen myeloma cellen en antilichaam-producerende cellen volgens de methode van Milstein et al. [Nature, 256, 495 (1975)].Omdat deze antilichamen geproduceerd worden uit antilichaam-producerende cellen van een enkele kloon, zijn ze volledig homogeen en zijn hun specificiteiten 20 voor antigenische determinanten volledig identiek. Omdat te analyseren antigeen gewoonlijk verschillende antigenische determinanten heeft, zal, wanneer monoclonale antilichamen met het vermogen om verschillende antigenische determinanten van het antigeen te herkennen en daaraan te binden, als onoplosbaar gemaakt antilichaam en als gelabeld antilichaam 25 worden gebruikt, geen competitie tussen deze antilichamen optreden en kan een zeer specifieke analyse van het antigeen worden bereikt. Derhalve kan ook een mengsel -van twee of meer monoclonale antilichamen die aan verschillende antigenische determinanten binden, worden gebruikt als onoplosbaar gemaakt antilichaam en/of als gelabeld antilichaam, mits 30 deze antilichamen niet een dergelijke competitie veroorzaken.

De analyse volgens de uitvinding kan op dezelfde wijze als volgens de stander- techniek worden uitgevoerd. Benadrukt moet echter worden dat het reactiemechanisme is vereenvoudigd ten opzichte van dat volgens de conventionele methode, omdat het onoplosbaar gemaakte antilichaam 35 zoals onderstaand getoond geen competitie met het gelabelde antilichaam aangaat.

8200631 i \ -6- f lAbl -Ag) + [Ab*) -// ,¾

5 QAbj) + [Ag) + (Ab*) X® *AS 'Ab*J

^ ‘V/.

(|AbQ + (Ag - Ab*) p^> p’, q^> q', r ’ > s^> s1 10 (|ABj , Ag, Ab en - hebben dezelfde betekenissen als boven, en p, p', q, q', r, r', s, s' zijn evenwichtsconstanten).

Omdat geen competitie bestaat tussen het onoplosbaar gemaakte 15 antilichaam en het gelabelde antilichaam wanneer ze verschillende bin-dingsplaatsen aan een antigeen hebben,schrijdt de reactie voort in een zodanige richting dat de componenten in de reactie-oplossing een"onoplos-baar gemaakt antilichaam-antigeen-gelabeld antilichaam" complex vormen.

Dit kan met het volgende experiment worden aangetoond: 20 in hetzelfde reactiesysteem als bij de conventionele sandwich-methode, werden twee verschillende monoclonale anti-HCG antilichamen,die in staat waren om verschillende antigenische determinanten van HCG te herkennen, gebruikt als het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam, en hetzelfde experiment werd uitgevoerd. Volgens het resultaat, 25 zoals weergegeven in figuur 3, zal wanneer eenmaal het antigeen aan het onoplosbaar gemaakte antilichaam is gebonden, geen dissociatie meer optreden uit het onoplosbaar gemaakte antilichaam (vaste fase) wanneer een anti-HCG antilichaam, dat overeenkomt met een andere antigeendeterminant, daaraan wordt toegevoegd. Het is dus duidelijk dat competitie tussen de 30 antilichamen voor dezelfde antigenische plaatsen niet optreedt. Volgens de onderhavige uitvinding worden derhalve soortgelijke resultaten verkregen, ongeacht of het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam gelijktijdig in reactie worden gebracht, of het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het anti-35 geen eerst worden gemengd en daarna met het gelabelde antilichaam in reactie worden gebracht, of het onoplosbaar gemaakte antilichaam met het 8200631 -7- antigeen in reactie wordt gebracht en na een tijdje het mengsel met het gelabelde antilichaam in reactie wordt gebracht. Er bestaat derhalve geen beperking voor de volgorde van de reacties.

De reactie die volgens de uitvinding plaatsvindt, wordt getoond 5 door een schematisch diagram in figuur 4. Omdat het onoplosbaar gemaakte antilichaam 2 en het gelabelde antilichaam 1 niet met elkaar in competitie treden, kan een grotere hoeveelheid gelabeld antilichaam 1 aan het antigeen 3 worden gebonden binnen een kortere tijdsperiode, en is het niet alleen mogelijk om de analysetijd te verkorten, maar ook om 10 de nauwkeurigheid en gevoeligheid van de analyse te verhogen.

Tabel A vat de voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding boven de conventionele werkwijze samen bij gebruik van polyclonale antilichamen in de analyse van α-fetoproteïne (AFP). üit de tabel is duidelijk dat vele voordelen zoals een uitgesproken verkorting van de 15 analyseduur, een vereenvoudiging van de analyse-procedure en een vergroting van de analyse-nauwkeurigheid en -gevoeligheid, kunnen worden verkregen.

TABEL A.

20 Methode volgens de conventionele methode ..... uitvinding

Reactie —wassen eerste reactie —> wassen , -> enzvmreactie -$> tweede reactie—s. wassen

Procedure _ ' > enzymreactie 25 gebruikte monoclonale anti- polyclonale antilichamen antilichamen lichamen benodigde tijd '30 min. j 270 min.

gevoeligheid j 3 ng/ml j 10 ng/ml 30 intraexperi-i j mentele fout . 0 0 c 4 2 C.V. in 10 i l'2 % ! 2,5 % vn k o repxtities . in........ — --j-!...............

•H j ^ interexperx- | S mentele fout ! - 35 I C.V. in 5 3f? % j 5,6 % g repetities j 8200631 -8-

De analyse werd uitgeveerd onder toepassing van een fluorofoto-meter met het serum van een zwangere vrouw als analysemonster, een polystyreen proefbuis als vaste fase, mierikswortel peroxidase als labelend enzym en floretinezuur als substraat.

5 Het is ook mogelijk dat alleen het onoplosbaar gemaakte anti- lichaam of het gelabelde antilichaam uit monoclonale antilicharaen wordt bereid en het andere uit gewone polyclonale antilichamen wordt bereid. In dit geval treedt echter competitie op bij een antigenischedeterminant die gemeenschappelijk is aan het monoclonale en polyclonale anti- 10 lichaam en soms is de affiniteit van de antigenische determinant voor het polyclonale antilichaam sterker, hetwelk een lagere nauwkeurigheid en gevoeligheid van de analyse veroorzaakt zelfs in vergelijking tot de conventionele methode, dus niet alleen de methode waarin beide antilichamen monoclonaal zijn.

15 Figuur 5 toont standaardkrommen in de analyse van CEA (carcino- embryonisch antigeen) wanneer het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam worden gecombineerd zoals getoond in tabel B. Het is duidelijk dat het analyse-systeem dat gebaseerd is op de combinatie volgens de uitvinding de beste resultaten geeft.

20 TABEL B.

onoplosbaar gemaakt gelabeld antilichaam antilichaam 25 methode volgens uitvinding monoclonaal monoclonaal vergelijkingsmethode 1 monoclonaal polyclonaal vergelijkingsmethode 2 polyclonaal monoclonaal conventionele methode polyclonaal polyclonaal 30 De gebruikte monoclonale antilichamen werden verkregen door de celfusietechniek waarbij muis myeloma cellen werden gebruikt overeenkomstig voorbeeld II en waren afgeleid van klonen die met verschillende antigenische plaatsen correspondeerden. De gebruikte polyclonale antilichamen waren de in de handel verkrijgbare produkten van Dako Company 35 (Denemarken). Polystyreen proefbuizen werden gebruikt als onoplosbare drager; mierikswortel peroxidase werd als enzym gebruikt; en o-fenyleen-diamine werd als substraat toegepast.

8200631 -9-

Elke gewenste combinatie van myeloma cellen en antilichaam-pro-ducerende cellen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van monoclonale anti lichamen en de aard vein het dier waarvan de cellen zijn afgeleid, is niet beperkt, zolang beide cellen in de combinatie samen hybridoma 5 kunnen vormen en bij het groeien een antilichaam produceren.

Alle in conventionele immuno-analyses toegepaste onoplosbare dragers kunnen in de uitvinding worden gebruikt. Voorbeelden van dergelijke onoplosbare dragers zijn polystyreen, polyetheen , acrylharsen, polytetrafluoroetheen (Teflon^ papier, glas, an Agarose. De onoplosbare 10 drager kan de vorm hebben van een Rollet,(tandwielvormige korrel), korrel, staaf, schijf of cuvet. Het kan bijvoorbeeld een optische cel, een proefbuis enz. zijn. Hij kan ook een andere vorm hebben.

De normaliter toegepaste middelen voor het labelen omvatten bijvoorbeeld peroxidase, β-D-galactosidase en basische fosfatase voor 15 EIA en fluoresceïne-isothiocyanaat voor FIA.

Wanneer het middel voor het labelen een enzym is, is een substraat vereist om zijn activiteit te meten. Het substraat kan zodanig zijn, dat wanneer het in reactie wordt gebracht met het overeenkomstige enzym, de hoeveelheid van het verkregen produkt of de hoeveelheid van 20 het verminderde of overblijvende substraat gemakkelijk kan worden gemeten. Bijvoorbeeld kunnen S-aminosalicylzuur-H^O^, o-fenyleendiamine-, floretinezuur-H£, enz. als substraten voor peroxidase worden genoemd.

Als substraten voor β-D-galactosidase kunnen bijvoorbeeld 25 worden genoemd fluorescelne-di-(β-D-galactopyranoside)r o-nitrofenol-β-D-galactopyranoside), 4-methyl-umbelliferyl^-D-galactoside enz.

Stoffen die met het reagens volgens de uitvinding kunnen worden geanalyseerd, dienen tenminste twee antigenische determinanten in het molecuul te hebben. Omdat stoffen die met de sandwich-methode geanaly-30 seerd zijn twee of meer antigenische determinanten hebben, kunnen vrijwel alle stoffen die met de conventionele methode kunnen worden geanalyseerd, volgens de onderhavige uitvinding worden geanalyseerd. Voorbeelden van dergelijke stoffen zijn enzymen zoals γ-glutamyl transpetidase (γ-GTP), basisch fosfatase en transglycosidase; proteïne hormonen zoals thyrolde-35 stimulerend hormoon (TSH), luteinisatie-hormoon (LH), menselijk chorion gonadotropine (HCG), insuline, secretine en groeihormoon (GH); plasma proteïnes, zoals fibrine degradatie produkt (FDP), C-reactieve proteïne (CRP), α -acidisch glycoproteïne (α^-AG), a^-antitrypsine (a^-AT), 8200631 -10- a^-plasmine inhibitor (α^-ΡΙ) t p^-microglobuline ^-MG) en immunoglobu-line; carcinoembryonische proteïnen zoals α-fetoproteïne (AFP), carcino-embryonisch antigeen (CEA) en embryonisch ferritine; en lymfocyten en bacterie-cellen, celoppervlak antigenen, celfracties enz.

5 Omdat met het reagens volgens de uitvinding de volgorde van de reacties tussen het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam in het geheel niet beperkt is, is het ook mogelijk om het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam vooraf te mengen. Meer in het bijzonder is het mo-10 gelijk dat onoplosbaar gemaakt antilichaam, gebonden aan een drager, bijvoorbeeld kunststofkorrels enz., en gelabeld antilichaam zich in hetzelfde vat bevinden, bijvoorbeeld een proefbuis, of is het ook mogelijk om antilichaam te binden aan de binnenwand van een geschikt vat, bijvoorbeeld een proefbuis, die zelf dient als onoplosbare drager en 15 waarbij zich dan gelabeld antilichaam daarin bevindt. Het gelabeld antilichaam kan de vorm van een oplossing of een gelyofiliseerd produkt van de oplossing alsook de vorm van tabletten, granules of poeders hebben.

Behalve het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam, kan het reagens volgens de uitvinding verschillende hulpstoffen 20 bevatten om zijn bruikbaarheid te verhogen. Dit kunnen bijvoorbeeld een middel voor het oplossen van het gelabelde antilichaam (wanneer het als gelyofiliseerd produkt wordt toegepast), een wasvloeistof voor het wassen van de vaste fase na de reactie van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het te analyseren antigeen en na verdere reactie van 25 het gelabelde antilichaam, een substraat voor het meten van de enzymatische activiteit van het middel voor het labelen (wanneer dit een enzym is), en een reactiestopper voor de enzymatische reactie zijn.

De uitvinding zal thans aan de hand van uitvoeringsvoorbeelden van de uitvinding nader worden toegelicht.

30 Voorbeeld I.

Een reagens voor AFP analyse, a) Bereiding van gezuiverd AFP.

Men verkreeg 16,2 g ruw AFP extract uit 5 liter ascites van hepatoma patiënten door uitzouten met ammonium sulfaat (fractie tussen 45 %

35 en 70 % verzadiging werd verzameld). Het ruwe extract werd gezuiverd door affiniteit chromatografie onder toepassing van 50 ml sefarose 4 B

8200531 -11- waaraan konijnen anti-AFP antilichamen waren gefixeerd (1 mg/ml sefarose) teneinde 924 mg gezuiverd AFP te verkrijgen.

b) Bereiding van monoclonale anti-AFP antilichamen.

5 Men immuniseerde een vrouwtjes BALB/C muis door subcutane injectie van SU yg van het onder a) verkregen gezuiverde AFP tezamen met compleet Freund's adjuvans. De immunisatie werd vier maal met tussenpozen van een week herhaald. De milt werd op de vierde dag na de laatste immunisatie verwijderd, en miltcellen werden verzameld. De milt- 10 cellen werden gewassen met Dulbecco's gemodificeerd MEM cultuurmedium 0 verder afgekort als D-MEM). Men telde 1 x 10 van deze cellen en mengde 7 met 1 x 10 muizen myeloma cellen (P3-NSI/l-Ag 4.1). Ze werden gedurende 1 minuut bij 37 C in 1 ml D—MEM dat 42,5 % polyethyleenglycol 77^ 1540 en 7,5 % dimethylsulfoxyde bevatten, aan celfusie onderworpen. Aan cfealdus 15 aan celfusie onderworpen cellen werd 20 ml HAT-medium toegevoegd (RPMI-1640 medium dat hypoxanthine,aminopterine, thymidine, en 10% foetal runderserum bevatte). Nadat 0,2 ml porties van het celmengsel waren gebracht in een microplaat met 96 putten en gedurende twee weken waren gekweekt, werden de antilichaamtiters van de bovendrijvende vloeistoffen 20 in de putten bepaald.

Daarna werden de cellen in de putten waarin de antilichamen werden waargenomen, respectievelijk toegevoegd aan 40 ml RPMI-1640 medium, bevattende 10 % foetal runderserum en thymocytes van BALB/c muizen. Porties van de verkregen celuspensie werden in twee microplaten met 25 96 putten gebracht en gedurende een week gekweekt om 9 klonen van anti-AFP antilichaam-producerende hybridoma te verkrijgen. Ze werden overgebracht in grootschalige culturen en telkens 10 liter van de verkregen bo/endri jvende vloeistoffen werd aan affiniteit chromatografie onderworpen onder toepassing van 50 ml sefarose 4 B, gefixeerd met ge-30 zuiverd AFP (0,5 mg AFP/ml sefarose). Als resultaat werden 4,2 tot 11,6 mg monoclonale antilichamen verkregen die aangeduid werden als series No's 1 tot 9.

c) Identificatie van antigeen-herkennende plaatsen.

i) Bereiding van anti-AFP antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen.

35 Fysiologische zoutoplossingen, die gebufferd waren met 0,05M

fosfaat (pB 6,4; verder afgekort als PBS) die respectievelijk 0,2 mg van de monoclonale anti-AFP antilichamen Series No's 1 tot 9 bevatten, 8200631 -12- werden in een hoeveelheid van 2 ml toegevoegd aan polystyreen proefbuizen die met PBS waren gewassen. Daarna werden de buizen gedurende 20 minuten bij 56°C geincubeerd en met PBS gewassen om gesensibiliseerde proefbuizen te verkrijgen.

5 ii) Bereiding van enzym-gelabelde anti-AFP antilichamen.

Men loste 5 mg mierikswortel peroxidase (kwaliteit 1 van Boehringer Mannheim GMBH; verder afgekort als HRPO) op in 1,0 ml 0,3M natriumbicarbonaat buffer en aan deze oplossing voegde men 0,1 ml 1 % ethanoloplossing van l-fluoro-2, 4-dinitrobenzeen toe en het mengsel 10 liet men gedurende 1 uur reageren.

Vervolgens werd 1,0 ml 0,06M natriumperiodaat-oplossing toegevoegd en liet men gedurende 30 minuten reageren. Daarna werd 1,0 ml 0,16M ethyleenglycol oplossing toegevoegd en werd de reactie gedurende 1 uur uitgevoerd. Het reactiemengsel werd gedialyseerd tegen 0,01M 15 natriumcarbonaat oplossing bij een pH 9,5. Aan de verkregen oplossing werden elk van de negen onder b) verkregen series van anti-AFP lichamen toegevoegd in een hoeveelheid van 5 mg en men liet het mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur reageren. Daarna werd 5 mg natrium borohydride toegevoegd, en werd de reactie gedurende een nacht 20 uitgevoerd. De reactiemengsels werden respectievelijk gedialyseerd tegen 0,0lM PBS bij een pH 7,2 om HRPO-gelabelde anti-AFP antilichamen te verkrijgen.

iii) Identificatie van de antigeen-herkennende plaatsen.

Aan elk van de anti-AFP antilichamen-gesensibiliseerde proef-25 buizen, verkregen onder i) voegde men toe 1,5 ml PBS, 0,1 ml standaardoplossing van het onder a) verkregen AFP welke verdund was met PBS tot 100 ng/ml en 0,4 ml HRPO-gelabelde anti-AFP antilichamen/verkregen onder ii) en 100-voudig verdund, en men liet het mengsel gedurende 30 minuten reageren. Na de reactie werd de proefbuis met wasvloeistof ge-30 wassen, en werd 3 ml substraatoplossing die 100 mg/dl o-fenyleendiamine en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte toegevoegd. De enzymreactie werd gedurende 30 minuten uitgevoerd,en daarna werd 0,05 ml 4M zwavelzuur toegevoegd om de enzymreactie te stoppen. De absorbantie van het reactiemengsel bij 450 nm werd gemeten. In tabel C zijn de combinaties die een 35 positieve reactie indiceerden, aangegeven met +, en die welke geen reactie indiceerden aangegeven met -.

8200631 i -13- TABEL C.

| HRPQ-gelabeld antilichaam 5 i ________ ; 1 2. 3 -4 '5 6 7 :8 9 11--- + -4-- + + 10 121--- + - + - + + iö l (ΰ * % \ 3 \ - - - + - + - + + -H ! üj ‘ 4J 4·!+ + + — + + + — — c i tö | jj 51--- + - + - + + _ ^ i 15 ε 6 + + + + + - + + + £ :

Di j m 71- -- + - + - + + rö ; (ö i 8 i + + + — + + + — — t o ï ί o 9 + + + — + + + — — 20 i o

Door de verschillen in antigeen-herkennende plaatsen, kunnen de 9 series monoclonale anti-AFP antilichamen die onder b) zijn verkregen, 25 in drie groepen worden ingedeeld, namelijk de eerste groep bestaande uit de series No's 1, 2, 3, 5 en 7, de tweede groep, bestaande uit serie No.

6 en de derde groep bestaande uit series No’s 4, 8 en 9. Deze antilichamen groepen werden respectievelijk aangeduid als anti-AFP antilichamen [A], [B] en [C].

30 d) Bereiding van een reagens voor AFP analyse.

Anti-AFP antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen werden gemaakt met de methode volgens c-i) onder toepassing van het monoclonale antilichaam [A].

Het monoclonale antilichaam [C] werd gelabeld met HRPO met de me-35 thode volgens c-ii) , en met PBS tot 1 : 10 verdund. Twee ml van het verdunde gelabelde antilichaam werd in de gesensibiliseerde proefbuis gebracht. Nadat de inhoud van de proefbuis was gelyofiliseerd, werd hij afgedicht om een reagens voor AFP analyse te verkrijgen.

8200531 -14- * > e) Analyse van AFP.

Men voegde 1,8 ml PBS toe aan de onder d) verkregen anti-AFP-antilichaam-gesensibiliseerde proefbuis,en daarna werd 0,1 ml van de standaardoplossing van AFP verkregen onder a) en verdund tot een con-5 centratie van 1000, 100, 10, 1 en 0 ng/ml met het serum van een gezonde persoon, toegevoegd, gevolgd door een verdere toevoeging van 0,1 ml van een oplossing van het HRPO-gelabelde anti-AFP antilichaam,verkregen onder d), in 2 ml gedistilleerd water. De reactie werd gedurende 20 minuten uitgevoerd. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met 10 fysiologische zoutoplossing die 0,005 % Tween 20 bevatte (verder aangeduid als wasmiddel). Daarna werd 3 ml enzymsubstraatoplossing die 5 mg/ml o-fenyleendiamine en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte, toegevoegd en werd gedurende 10 minuten gereageerd. Men voegde 0,05 ml 4N zwavelzuur aan het reactiemengsel toe om de enzymreactie te stoppen.

15 De absorbantie bij 450 nm van het reactiemengsel werd met een fotometer gemeten. De resulterende standaardkromme is in figuur 6 getoond. Voorbeeld II.

Een reagens voor CEA analyse.

a) Bereiding van gezuiverd CEA.

20 Men homogeniseerde 40 g kankerweefsels van de dikke darm met een homogenisator na toevoeging van 100 ml gedistilleerd water. Dezelfde hoeveelheid van 1,2M perchloorzuur werd aan het homogenisaat toegevoegd, en hij werd gedurende 30 minuten onder roeren geëxtraheerd. De gecentrifugeerde bovendrijvende vloeistof werd gedialyseerd tegen gedistilleerd 25 water waarbij een ruw CEA extract werd verkregen.

• Het ruwe extract werd tot 10 ml geconcentreerd en aan gelfil- tratie onderworpen onder toepassing van sefarose 4B, geëquilibreerd met fysiologische zoutoplossing en de eerste fractie werd verzameld. Deze werd opnieuw aan geifiltratie over sefadex G-200 dat op dezelfde wijze 30 geëquilibreerd was, onderworpen en de tweede fractie werd verzameld.

Deze werd geconcentreerd door 2 ml waarin 135 yg gezuiverd CEA werd verkregen.

b) Bereiding van monoclonale anti-CEA antilichamen.

Men verkreeg 8 klonen van anti-CEA antilichaam-producerende 35 hypridoma door het onder a) verkregen gezuiverde CEA te gebruiken op een soortgelijke wijze als in voorbeeld I b).

Muizen werden geïmmuniseerd mt 30 yg gezuiverd CEA in elke im-

Q

munisatie. Intraperitoneaal werden 1 x 10 hybridoma geënt in een 8200631 -15- vrouwtjes BALB/c muis waaraan intraperitoneaal 0,5 ml pristaan (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecaan; een produkt van Wako Pure Chemicals, Co. Ltd.) was toegediend. Twee weken later werd de ascites verzameld. De ascites werd aan chromatografie over DEAE-cellulose, geëquilibreerd met 5 0,01M fosfaatbuffer bij een pH 7,0 onderworpen,en men verkreeg een niet geadsorbeerde fractie als monoclonaal anti-CEA antilichaam.

Door een proef voor het identificeren van antigeen-herkennende plaatsen, welke vrijwel overeenstemde met die van I-c), konden de verkregen antilichamen worden ingedeeld in drie groepen van 5 series, 2 10 series en 1 serie, die respectievelijk aangeduid werden als anti-CEA antilichamen [A], [B] en [C].

c) Bereiding vein anti-CEA antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen.

Polystyreen proefbuizen werden elk gewassen met PBS, en 2 ml van het anti-CEA antilichaam [A] (1 mg/ml), verkregen onder b) werd 15 daarin gebracht en gedurende 20 minuten bij 56°C gereageerd. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met PBS om een anti-CEA antilichaam [A]-gesensibiliseerde proefbuis te verkrijgen.

d) Bereiding van een reagens voor CEA analyse.

Men verkreeg HRPO-gelabeld anti-CEA antilichaam [B] door het 20 onder b) verkregen anti-CEA antilichaam [B] te gebruiken overeenkomstig voorbeeld I-c-ii). Het gelabelde antilichaam werd met fysiologische zoutoplossing tot 1:50 verdund; en 0,2 nlvan het verdunde antilichaam werd in elk van de onder c) verkregen anti-CEA antilichaam- [A]-gesenataLi-seerde proefbuizen gebracht en gelyofiliseerd om een reagens voor 25 de CEA-analyse reagens te vormen.

e) Analyse van CEA.

Het onder a) verkregen gezuiverde CEA werd verdund met het serum van een gezonde persoon tot een concentratie van respectievelijk 100, 30, 10, 3 en 1 ng/ml. Men voegde 0,2 ml van elk van het verdunde CEA 30 en 0,8 ml gedistilleerd water gelijktijdig toe aan het onder d) verkregen CEA analyse reagens en reageerde gedurende 20 minuten onder roeren. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met het wasmiddel en daarna werd 3 ml van een substraatoplossing die 300 mg/dl floretinezuur en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte, toegevoegd. De reactie werd gedu-35 rende 10 minuten uitgevoerd en daarna werd 0,1 ml 5 % natriumsulfiet toegevoegd om de enzymreactie te stoppen. Vervolgens werd de fkiorescen-tie-intensiteit gemeten bij een excitatie golflengte van 323 nm en een fluorescentie golflengte van 420 nm met behulp van een fluorofotometer.

8200631 -16-

De resulterende standaardkromme is in figuur 7 getoond.

Voorbeeld III.

Een reagens voor HCG-p-analyse.

a) Bereiding van HCG-β subeenheid.

5 Men loste 1 g HCG (2000 iu/mg) op in 2 ml 0,025M fosfaatbuffer (pH 5,6), en de oplossing werd door chromatografie over DEAE-sefadex A-50 (3 g), welke tevoren met dezelfde buffer geëquilibreerd was, ge-fractioneerd. Een met 0,05M fosfaatbuffer (pH 5,6) geëlueerde fractie werd verzameld en gedialyseerd tegen gedistilleerd water, waarbij een 10 oplossing werd verkregen die 308 mg gezuiverd HCG bevatte dat daarna gelyofiliseerd werd. Men loste 300 mg van het gelyofiliseerde HCG op in 10 ml 10M ureum (pH 4,5) en reageerde gedurende 1 uur bij 40°C. Het reactiemengsel werd door chromatografie DEAE-sefadex A-50 (2 g), dat vooraf geëquilibreerd was met een oplossing die 0,03M glycine en 10M 15 ureum bevatte, gefractioneerd. Een fractie die geëlueerd was met een oplossing die 0,2M glycine, lM NaCl en 8M ureum bevatte, werd gedialyseerd tegen een fysiologische zoutoplossing waarbij 147 mg HCG-β subeenheid werd verkregen.

b) Bereiding van anti-HCG-β antilichamen.

20 Er werden elf series anti-HCG-β antilichamen geproduceerd vol gens de methode van Voorbeeld Il-b), behalve dat Wistar-stam ratten werden gebruikt als dieren voor toediening van het antigeen in plaats van de BALB/c muizen. De antigeen-herkenningsplaatsen van deze antilichamen werden nagenoeg overeenkomstig de methode van Voorbeeld I-c) 25 geïdentificeerd. De resulterende antilichamen werden in twee groepen ingedeeld, namelijk een groep bestaande uit acht series anti-HCG-β antilichamen [A] en de andere groep bestaande uit drie series anti-HCG-β antilichamen [B].

c) Bereiding van anti-HCG^-antilichamen-gesensibiliseerde korrels 30 (onoplosbare drager)

Men voegde 100 polyetheen korrels toe aan 100 ml PBS dat 50 mg van het onder b) geproduceerde anti-HCG^-antilichaam [A] bevatte, en liet gedurende 20 minuten bij 56°C reageren. Daarna werden de polyetheenkorrels gewassen om anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibili-35 seerde korrels te verkrijgen.

d) Bereiding van enzym-gelabelöë anti-HCG-β antilichamen.

Men herhaalde dezelfde methode als in Voorbeeld I-c-ii), onder toepassing van de onder b) geproduceerde anti-HCG-β antilichamen [B·].

8200631 -17-

Na verdunning tot 200 maal het volume met PBS, werden HRPO-gelabelde. anti-HCG-β antilichamen [B] verkregen.

e) Bereiding van wasmiddel.

Men woog precies 9 g NaCl en 50 ml Tween 20 af, en loste op in 5 gedeioniseerd water om 100 ml van een oplossing te vormen. De oplossing werd in een flesje gebracht dat vervolgens met een stop werd afgedacht. Aldus werd een wasmiddel verkregen.

f) Bereiding van enzymsubstraat.

Men mengde en verpoederde in een mortier 25,40 g 5-aminosalicyΙ-ΙΟ zuur, 54,34 g monokaliumfosfaat en 5,72 g dinatriumfosfaat. Men woog precies 550 mg van het mengsel af, en bracht dit in een flesje. Men verdunde 1,5 ml waterstofperoxyde (30 % oplossing) met gedeioniseerd water tot 100 ml. Men bracht 1 ml van de oplossing in een ampul die daarna door smelten werd afgedicht. Aldus werd een enzymsubstraat be-15 reid.

g) Bereiding van een stopper voor de enzymreactie.

Men woog precies 2 g natriumazide af en loste dit op in 100 ml gedistilleerd water. Men bracht 2 ml van de oplossing in een ampul, die daarna door smelten werd afgedicht om een stopper voor de enzym-20 reactie te verkrijgen.

h) Bereiding van een analysereagens voor HCG.

Een analysereagens voor HCG werd bereid door de onder c) tot g) geproduceerde materialen op de volgende wijze te gecomboneren.

1. Anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibiliseerde korrels 25 2. HRPO-gelabeld anti-HCG-β antilichaam [B] 3. Wasmiddel (tienvoudig geconcentreerde oplossing) 4. Enzymsubstraat (5-aminosalicylzuur-waterstofperoxyde) 5. Stopper voor de enzymreactie i) Analyse van HCG.

30 De volgende analyse werd uitgevoerd onder toepassing van het onder h) verkregen reagens voor HCG-analyse. Men nam 0,4 ml van het HRPO-gelabelde anti-HCG-β antilichaam [B] in een proefbuis, en voegde een anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibiliseerde korrel toe. Daarna werd 0,1 ml van een standaardoplossing toegevoegd, verkregen door HCG be-35 schreven in de Japanse Pharmacopoeia te verdunnen met het serum van een gezonde persoon tot een concentratie van respectievelijk 10.000, 1.000, 100, 10 en 1 miu/ml, en reageerde gedurende 15 minuten .Na de reactê werd·, het wasmiddel verdund tot 10 x zijn volume met gedestilleerd water ,en verd 3200631 -18- de korrel gewassen met het verdunde wasmiddel. Daarna werd 3 ml van de substraatoplossing, bereid door alle enzymsubstraat op te lossen in 150 ml gedistilleerd water, toegevoegd en werd de reactie gedurende 30 minuten uitgevoerd. Vervolgens werd 0,025 ml van de stopper toegevoegd 5 om de reactie te stoppen, en werd de absorbantie van het reactiemengsel bij 500 nm gemeten. De resulterende standaardkromme word;in figuur 8 getoond.

8200631 .........................

Claims

1. Reagens voor immunologische analyse van antigenen, gebaseerd op de sandwich-methode, met het kenmerk, dat het onoplosbaar gemaakt monoclo-naal antilichaam en gelabeld monoclonaal antilichaam omvat, waarbij de monoclonale antilichamen respectievelijk in staat zijn om verschillende 5 antigeen determinanten van een te analyseren antigeen te onderscheiden en daaraan te binden.

2. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat korrels of een vat van kunststof of glas gebruikt worden als drager van het onoplosbaar gemaakte antilichaam.

3. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een enzym gebruikt wordt als middel voor het labelen bij het produceren van het gelabelde antilichaam.

4. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een fluorescerend materiaal gebruikt wordt als middel voor het labelen bij het produ- 15 ceren van het gelabelde antilichaam.

5. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gelabelde antilichaam en het onoplosbaar gemaakte antilichaam zich in een vat bevinden.

6. Reagens volgens conclusies 1 of 5, met het kenmerk, dat het ge- 20 labelde antilichaam zich bevindt in een kunststof- of glazen vat dat als drager van het onoplosbaar gemaakte antilichaam wordt gebruikt.

7. Reagens volgens conclusies 1, 5 of 6, met het kenmerk, dat het gelabelde antilichaam gelyofiliseerd is.

8. Reagens voor immunologische analyse van antigenen, gebaseerd op 25 de sandwich-methode, met het kenmerk, dat het onoplosbaar gemaakt monoclonaal antilichaam en gelabeld monoclonaal antilichaam omvat, welke monoclonale antilichamen respectievelijk in staat zijn om verschillende antigeen determinanten van een te analyseren antigeen te onderscheiden en daaraan te binden, alsmede 1 tot 4 hulpmiddelen, gekozen uit de groep 30 oplosmiddel, wasmiddel, substraat en reactiestopper, omvat.

9. Verbeterde sandwich-methode voor immunologische analyse van antigenen, met het kenmerk, dat onoplosbaar gemaakt antilichaam en gelabeld antilichaam gelijktijdig met een te analyseren antigeen reageren, waarbij 82 0 0 6 3 1 “..........................‘ -20- het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam mono-clonale antilichamen omvatten die in staat zijn om verschillende antigeen determinanten van het antigeen te onderscheiden en respectievelijk aan verschillende antigeen determinanten te binden. 8200631 --.....—