JPS618665A - 抗原、抗体、またはハプテンの免疫検定法、この免疫検定法を用いたリポ蛋白質、およびα−フエトプロテインの検定法、およびこの検定法を実施する検定キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、抗原、ハプテン、または抗体の免疫定量また
は免疫学的決定法に関し、特に、リポ蛋白質のような血
漿蛋白質を定量するために利用できるものに関するもの
である。

数年の間、リポ蛋白質の定量は、悪性脂肪血症の存在、
特に脂肪過剰血症に関連する心血管の危除塵を正確に評
価するために発達してきている。

このような目的のために、血液中を循環している全脂質
（トリグリセライドおよびコレスゲロール）がまず定量
されたが、その疫学的研究はこれらのノぐラメ−ターの
測定が不正確であることがすぐに明らかとなった。次い
で、興味の対像は特殊なアポ蛋白質に運ばれるこれら脂
質のある分′画に向けられ、例えば、ＨＤＬコレステロ
ールおよびＬＤＬコレステロールが定量された。なぜな
ら、悪性脂肪血症の存在に関するより正確な情報をそれ
らは与えることができるからである。

リポ蛋白質は、脂質と蛋白質の複合分子化合物である。

その重要な特徴の一つは他の血清蛋白質より密度が低い
ことであり、従って、他の蛋白質からリボ蛋白質を分離
可能で、更に、リボ蛋白質を超遠心分離により分類する
ことができる。

即ち、これらのリボ蛋白質はその密度に従って分類され
、以下の如き分画に分離される。

１）密度０．９４．　ｙ／ａｔ以下のキロミクロンは、
略９８％脂質からなる最大および最小密度粒子である； ２）密度０．９４から１’、００６の非常に低密度リポ
蛋白質； ６）密度１．００６から１０６３の低密度リポ蛋白質； ４）密度１．０６３から１．２１の高密度リポ蛋白質； ５）非常に高密度なリボ蛋白質 しかしながら、この物理化学的特性に基づいた経験的分
類は蛋白質におけるそれらの組成に基づく非常に不均一
な分類を与えるものである。即ち、低密度リポ蛋白質は
必ず、アポ蛋白質Ｂばかりでなく、アポ蛋白質Ｃ１およ
びアポ蛋白質Ｅを含有する。一方、高密度リポ蛋白質分
画は主にアポ蛋白質Ａ１およびＡ２、更に、アポ蛋白質
Ｃ１アポ蛋白質Ｄ１およびアポ蛋白質Ｅを含有する。

次に、興味の対像は、これら脂質の比較的複雑な代謝を
よく理解するだめ、脂質の輸送におけるこれらのアポ蛋
白質によって演じられる役割に向けられた。それは、こ
れらベクター蛋白質の特定のものを定量することは悪性
脂肪血症の検出に関連した優秀な指針となることを示そ
うとすることであった。加えて、血漿中に含まれる特定
のアポリポ蛋白質の量をもつと正確に測定するため、他
の定量方法を発達させた。

しかし、これらの定量方法は特定の問題が表われる。こ
れは、血漿の高アポリポ蛋白質濃度、およびいわゆる正
常状態と病理学的状態の間でリボ蛋白質の濃度レベルの
変化が限定されていることのためである。たとえば、２
５〜４０才・の男の正常脂肪血症患者におけるリボ蛋白
質とアポリボ蛋白質の血漿濃度を以下に示す。

ＶＬＤＬ　・・・・・・・・・・・・　８０　　　　Ａ
ｐｏ−Ｂ・・・・・・・・・８Ｏ−１００ＬＤＬ　・・
・・・・・・・・・・・・・２７６　　　　Ａｐｏ−Ａ
Ｉ・・・・・・１２０−１５０ＨＤＬ、・・・・・・・
・・・・・・・・８６Ａｐｏ　−Ａ工工・・・・・・２
Ｏ−８０ＨＤＬ３・・・・・・・・・・・・　２５４　
　　　Ａｐｏ−Ｅ　・・・・・・・・・１０ＨＤＩ４／
ＨＤＬ３−・＝　０．５６　　Ａｐｏ−ＣＩ　・・・・
・・・＝　５−１０Ａｐｏ−ＣＩ工・・・・・・６−５ Ａｐｏ−Ｃエエエ・、−：、１５−２０Ａｐｏ−Ｄ・・
・・・・・・・・・・１Ｏ−２０Ａｐｏ−Ｆ’・・・・
・・・・・・・・１５更に、満足する感度を得るため、
免疫定量法を発展させた。例えば、放射免疫拡散法、免
疫比濁法、レーザー光線による免疫比濁法、およびＭ。

Ｒｏｓｓｅｎｅｕ　、　Ｒ−Ｖｅｒｃａｅｍｓｔ　、に
、　Ｋ、ＳｔｅｉｎｂｅｒｇおよびＧ、Ｒ、Ｃｏｏｐｅ
ｒによツーｃ　Ｃｌ、１：Ｎ、ＣＨＥＭ、２９７６ＰＰ
。

４２７−４５５　（１９８３）に記述されているような
放射免疫学または酵素免疫学などである。

しかし、これまで発展された方法の大部分は臨床生物学
的試験室のルーチンのためにはそれらを利用することは
容易でない困難性に直面していた。

即ち、免疫電気泳動法は自動化の困難な方法である。更
に、勧奨される試料（２鱈）は一連の定量に適さない。

レーザー光線による比濁法は定量すべき試料の土希釈の
み必要である。しかしこの方法は特別な高価な装置が必
要である。更に、非常に高含量の脂質を有する試料を定
量しようとすると問題に直面する。

放射線免疫学または酵素免疫学による検定法は良好な感
度を得ることができる。々ぜなら、これらは、極小量の
抗原を検出するために発展されてきた。しかし、それら
の方法はリポ蛋白質を別置するのに最適であるとは言え
ない。リポ蛋白質は血中に大量（約１Ｆ／β）存在して
いる。これらの方法でリポ蛋白質を定量するには、必要
な試料□を十分に希釈させる。これらは、ルーチン分析
試験の作業に適当でない。更に、これらの希釈は主要な
誤差の源となるものである。

加えて、アホリボ蛋白質Ｂの酵素免疫検定法では、試料
の２００倍希釈のみ必要であるように発展されてきた。

しかし、この方法で使用される試薬の安定性は数日を越
えると保障されなく、ルーチン作業には適してない。こ
の方法はＪｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　２１．１９７８．ＰＰ
。

３１７−３２４　　に記載されている。

〔発明の概要〕

本発明は、定量すべき試料を大きく希釈することなく、
非常に良好な感度を得ることができる免疫検定法に関す
るものである。

少なくとも１つの免疫活性試薬の助力により物質を免疫
検定するだめの本方法は以下の段階からなる。

物質を免疫検定する方法において、１）検定される物質
を含む試料と該物質に特異的な標識された免疫活性を有
する試薬とを、検定される物質を標識された免疫活性を
有する試薬に比べて過剰にするような免疫活性を有する
試薬量にて接触反応させ、２）こうして得られた反応溶
液の少なくとも１部を検定される物質に特異的な免疫活
性を有する試薬を固定した固相と接触反応させ、３）反
応溶液を固相から分離し、４）固相における標識された
免疫活性を有する試薬量を測定する段階よりなること。

この方法の変形例によれば、検定される物質を標識され
た免疫活性を有する試薬及び該試薬を固定した固相とに
同時に接触反応させることにより、段階１）及び２）が
同時になされる。

本発明によれば、定量される物質は抗原、ハシテン、ま
たは抗体であシ、免疫活性試薬は定量される物質を認識
、かつこれと結合できる免疫学的活性を有する試薬であ
る。定量される物質が抗原またはハプテ／である時は免
疫活性試薬は該抗原またはハシテンに特異的な抗体であ
る。

この場合、ラベルされた免疫活性試薬はラベルされた抗
体であり、抗体は放射性元素、螢光要素、酵素などから
選択してラベルされる。たとえば、定量される抗原まだ
はハプテンに特異的な抗体と酵素の複合化合物がある。

固相に固定される免疫活性試薬もまた、抗体であり、該
ラベルされる抗体と同一であることができる。しかし、
ラベルされる抗体と固相、に固定される抗体は異なる源
からのものでよいが、これら両抗体が同一の抗原を認識
できることが条件である。

抗原まだはハプテンを検定するための本方法の好ましい
態様によれば、モノクローナル抗体が種棒の抗体の中の
少なくとも一つとして使用される。

本方法により抗原の免疫検定を実施するためのより詳細
な説明を以下に記す。この場合、本方法の第一段階にお
いては、定量される抗原はこれに特異的なラベルされた
抗体と反応することによりラペルされ、該抗原は該抗体
に比較して過剰に存在するように、ラベルされた抗体は
一定量存在す′る。さらに、この段階の最後で、過剰の
結合してない自由な抗原とラベルされた抗体に結合され
た抗原とからなる反応液が得られる。

第２段階においては、該反応液またはこの反応液の一部
を定量される抗原に特異的な抗体が固定されている固相
に接触させると、ラペ′ルされた抗体に結合された抗原
と自由な抗原分子との間に固相に固定された抗体サイト
を求める競合が起こる。

この段階の終シでは、固相上で利用できる抗体サイトは
フリーな抗原分子とラベルされた抗体に結合した抗原に
よってほとんど占められる。そして、このように該固相
に固定されるフリーな抗原分子とラベルされた抗体に給
した抗原との割合は、反応液中に存在するフリーな抗原
量に依存する。即ち、フリーな抗原量が大きい程、第２
段階の終了時には該固相に固定されるフリーな抗原量も
それだけ大きくなる。

前記したように、抗原を抗原に特異的なラベルされた抗
体、および定量される抗原に特異的な抗体が固定されて
いる固相に同時に接触させてこれら前記２段階を同時に
行うことができる。即ち、定量される抗原をラベルする
こと、および固相に抗体を固定することが同一段階で起
き乙。

本方法の最後の段階では、固相の該ラベルされた抗体量
が決定される。この決定は中でも特に使用されるマーカ
ーあるいはトレーサーに依存する。

これが放射性元素である場合には、固相の放射能または
可能ならば固相から分離した反応液の放射能が測定され
る。マーカーが酵素である時は、固相に固定された酵素
量が比色定量的に検出され、その液の吸光度が分光光度
計により測定される。

この測定に続いて、この情報は固定に固定されているラ
ベルされた抗体に結合された抗原量を決めるために利用
される。そしてこの抗原量は第１段階の終了時に残存し
ているフリーな抗原に依存している。従って、これらか
ら試料中の抗原量を導き出すととができる。

この値を得るためには、初めに標準曲線を作成するため
抗原量既知の試料の定量が行なわれ、この対照は後の試
料の抗原量決定のために用いられる。

本発明方法は特に、比較的高濃度を有する生体液中に存
在する蛋白質によって組成されている抗原を定量ために
便利である。

即ち、本方法では、フリーな蛋白質とラベルされた蛋白
質に結合した蛋白質とがその蛋白質に特異的な抗体のサ
イトを求めて競合するので、第１段階では蛋白質の過剰
量と共に操作する必要がある。従って、この方法は、比
較的高濃度の蛋白質を有する試料の該蛋白質の定量に好
適であり、定量される試料を十分希釈する必要なしに満
足する感度を得ることができる。

しかし、いわゆる過剰量の免疫検定法を用いる場合、固
体支持体に固定された該抗体は限定された量であるので
、第１段階の間過剰である抗体と共に操作するだめに必
要なことは定量される試料の量に比例して増加する抗原
を希釈する必要がある。

更に１本発明方法によれば、安定な試薬と共に操作する
ことができ、酵素でラベルされた抗体を用いる時は、特
別な、複雑な装置を用いる必要が、　　なく、最後の測
定を行うだめの分光光度計があれば十分である。また、
この方法は比濁法と同等の感度を得ることができ、他の
大部分の定量方法よシ優れている。

本発明による方法は、異なる蛋白質の定量に適用するこ
とができる。特に、血漿蛋白質の定量、たとえば、血清
のリポ蛋白質、免疫グロブリン、補体因子、糖蛋白質な
どである。

たとえば、リボ蛋白質はアポリポ蛋白質ＢＮ　Ａ１１Ａ
２、ＣＸＤＸＥｌ等とそれらの結合物である。免。

疫グロブリンはＩｇＧ、　工ｇＡ、　ＩｇＭ、肱り、　
■ｇＥｌ：等である。補体因子はＣｌｑ％　Ｃ１０％　
　Ｃ４、ＣｓまたはＣｓａである。血清の糖タンパク質
は、オロソムコイド、ハプトグロブリン、α−２−マク
ログロブリン、コエルレオプラスミン、プレアルブミン
、アルブミン、トランスフェリン、レチノール結合蛋白
質、α−１−アンチトリプシン、アンチトロンビン−■
、アンチトリジシンインヒビター、ヘモペシｙ　（ｈｏ
ｅｍｏｐｅｓｃｉｎ　）　、オよびβＳＰ　カある。

また、循環している免疫複合体、ハプトグロビン、活性
な蛋白質Ｃ１胎盤催乳ホルモン、α−フエトプロティン
、Ｃｌエステラーゼ、Ｃ１エステラーゼインヒビター、
およびα１−アンチキモトリプシンの定量に利用するこ
ともできる。

本発明方法は、血漿中のリボ蛋白質の定量を実施するた
めに特に興味あるものである。この場合、この方法は以
下の段階からなる。

血漿中のリポ蛋白を検定する方法において、１）検定さ
れるリポ蛋白を含む血漿試料と該リポ蛋白に特異的な抗
体と酵素との複合化合物を、検定されるリポ蛋白が抗体
に比べて過剰量にして、接触反応させ、２）こうして得
られた反応溶液の少なくとも１部を、リポ蛋白に特異的
な同一の抗体を固定しだ固相と接触反応させ、６）反応
溶液を固相から分離し、４）固相における酵素量を測定
する段階よシなること。

この方法の変形例によれば、検定されるリポ蛋白を含む
血漿試料を、こうした検定されるリポ蛋白に特異的な抗
体及び酵素との複合化合物に接触反応させると同時に、
検定されるリポ蛋白に特異的な同一の抗体を固定した固
相に接触反応させることにより、段階１）及び２）が同
時になされる。

定量を実施するときは、リポ蛋白質濃度の関数として、
（操作の終了時に測定される）吸光度を与える標準曲線
をプロットするために既知のリポ蛋白質量の試料を定量
することから始める。

次にこの標準曲線を対照として、定量される試料の吸光
度の値を基にしてこの試料のリポ蛋白濃度を決定するこ
とができる。

本発明方法に用いられる種々の試薬は従来法により調製
される。

即ち、既知濃度の標準試料は、人血漿から希釈すること
により得られる。人血漿は脂質バランスの立場から見て
正常かつ限定された提供者から得られる。所望のリポ蛋
白質は、Ｈａｖｅｌ、Ｒ，Ｊ、とＣｏ１１　（１９５５
）、Ｊ、Ｃ１１ｎ　、　Ｂｉｏｃｈ　３４　、１　。

３４５−３５３、ＣｈａｐｍａｎとＣｏ１１　（１９７
６）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉａ　２５　、２６７
−２９１に記載されている方法を用いる一連の超遠心分
離にょシ分離される。

通常、血液は断食している種々の患者から、エチレンジ
アミン４酢酸ナトリウムをｉ　ｔｎｙ７ｔｘｔの割合で
含むチューブに集められる。

次に、血漿は２５００ｐで２０分遠心分離により分離さ
れるが、溶媒の密度はＮａ１Ｏ１にょシ１．０５０に調
整される。次に、１．０２５〜１．０５０の密度範囲を
有する分画を得るように、数段階を実施するととによる
超遠心分離を行なう。これらの分画を基にして、所望の
リポ蛋白質を従来法にょシ分離する。たとえば、リポ蛋
白質Ｂの場合には、超遠心分離拠よ郵、そしてそのリポ
蛋白質溶液は正確な分析法により測定される。

リポ蛋白質に特異的な抗体は前記の分離されたリポ蛋白
算から調製される。このリポ蛋白質はうさぎ、羊、等の
動物に免疫感作を起こさせることにより大技リポ蛋白質
に特異的な免疫グロブリンを得るために使われる。免疫
グロブリンは免疫感作された動物の血清から得られ、カ
プリル酸で沈殿させて精製され、そして遠心分離される
。上清物質はろ過により回収され、そして酢酸緩衝液に
対して４℃で一晩透析される。この溶液はろ過され、そ
の純度は電気泳動法にょシ試験される。

酵素と定量されるリポ蛋白質の特異的な抗体との複合化
合物は従来法により生成される。例えばＢ、　Ｍ、ウィ
ルソン、およびＰ、　Ｋ、ナヵネにより記載された「セ
イヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲ’ＰＯ）を抗体
に複合化させる過ヨウ素酸塩法の最近の進歩」（出版者
、Ｋｎａｐｐｗ、　Ｈｏ１ｕｂａｒｋａｎｄ　Ｗｉｃｋ
Ｇ　）の過ヨウ素酸法、「免疫栄光と関連した染色技術
」、ニューヨーク：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　／Ｎｏｒｔｈ
　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　１９７８、Ｐ２ｊ６ヲ用いて、酵素がライフオル
トペルオキシダーゼである時は、ゲルろ過にょシ精製さ
れる。

本方法を実施するためには、抗体が固定される固相はプ
ラスチックチユーブ中に配置したプレード装置により一
般に構成される。この装置はポリアミ）ＩＩから通常作
られ、抗体はたとえば羊肉で得られた精製大技リポプロ
ティン免疫グロブリン溶液をチューブ内へ導入しかつ、
この溶液を約４時間該ブレード装置と接触させておくこ
とによりブレード装置に固定される。好ましくは、その
免疫グロブリンは、イシカヮエイジ、ハマグテヨシメカ
、イマガワマサヨシにより記載された方法（■。

８−サンドインチ酵素免疫法のための抗体固定ポリスチ
レンの調製ＰＰ、　１１９−’１２２　　酵素免疫法イ
シカワ、カワイ、ミャイ、イガクショイン、トーキヨー
、１９８１）Ｋよシ事前に活性化される。

所望の抗体量を含む数本のチューブはこのように調製さ
れる。

抗体をラベルするために用いられる酵素がライフオルト
ペルオキシダーゼである時は、酵素の検出は色原体によ
り実施される。この色原体はリン酸ナトリウムのオルト
フェニレンジアミン溶液の凍結乾燥により得られた粉末
を使用時に溶解して用いる。

本発明による方法の第１段階のためには、ブレード装置
を有さないプラスチックチューブまたは抗体が固定され
ているブレード装置およびその上部に合成物質ドームを
有したプラスチックチューブを用いることができる。こ
のドームは第１段階の終了時固相上へ、即ち、チューブ
のよシ底部に配置されたブレード装置上へ反応液が流出
されるように容易に開口しなければならない。本方法に
利用できるブレード装置を有したチューブは中でも特に
、Ｃｏｍｍ１ｓｓａｒｉａｔ　ａ　ｌ′Ｅｎｅｒｇｉｅ
Ａ　ｔｏｍｉｑｕｅ　　出願のフランスｉ許ＥＮ　７８
１０５００４０に記載されている。

本発明による免疫検定法に用いられる種々の試薬および
装置は以下の構成からなるキットに置きかえることがで
きるニ ー　チューブシステム、各チューブは固相、たとえば、
同条件で入坑リポ蛋白質免疫グロブリンを固定したブレ
ード装置、このチューブは適当なブリスタータイプのパ
ック内で温気から保護されている； −０，１〜０．００５　ｙ／ｉ、の範囲のリポ蛋白質を
力・ζ−する標準試料を含む一連のボトル１．標準試料
はたとえば抗生物質、・酸化防止剤、プロテアーゼイン
ヒビターのような適当な安定化剤を添加した液状で、ま
たはショ糖存在下で凍結乾燥したその状態で貯蔵される
； −　ライフオルトペルオキシターゼのような酵素と入坑
リボ蛋白質免疫グロブリンをカップリングして得られる
複合化合物を含むＮトル、この複合化°合物はできれば
、チメロサールのような保存剤およびリポ蛋白質を除い
た羊の血清を含むＩレート緩衝液に事前に希釈した溶液
状または凍結乾燥状である；および −酵素の検出のだめの色原体を含有する♂トル、この色
原体はできれば凍結乾燥状がよく、この場合、キットは
色原体希釈緩衝液を含む、Ｎ）ルも有する。

即ち、このキットは標準値測定曲線および試料を定量す
るために必要な全要素を含むものである。

本方法はまた、α−フエトプロティン免疫検定法に利用
できる。α−フエトプロティンは胎児の肝臓、および卵
黄嚢の細胞で合成される糖蛋白質である。それはまた、
羊水、および母体の血清にも見られる。羊水の中アは、
α−フエトプロティンの最大濃度、は約１５週で（２０
〜５０μＰ／ｄ）に達し、母体血清中では、３４週目で
（７２００ηＰ／ｄ！　）　　である。α−７エトプロ
テイ／の定量は特に以下の場合に有用である。

産科学において、母体血液、次いで約妊娠１６〜１７週
目に羊水のα−フエトプロティンの定量をすることによ
り、神経管奇形による異常出生の診断ができる。加えて
、過大量のα−フエトプログインレベルは、胎児の苦痛
、および多給妊娠を示すことができ、一方低レベルでは
毒血症、発育。

遅滞、あるいは胎盤腫瘍を示すことが可能である。

癌学においては、α−フエトプロティンは診断を助け、
肝細胞性癌特に、肝硬変、全局所の奇形癌、更に、−卵
巣、精巣、およびサクロコシギール（Ｓａｃｒｏｃｏｃ
ｃｙｇｅａｌ　）、および肝転位癌などの種棒の癌、消
化器癌などの後治療の助けとなる。

ヘパトロジーにおいては、α−フエトプロティンはウィ
ルス肝炎の強力な新生過程を明らかにする。

小児科学においては、α−フエトプロティンは担管閉鎖
と新生児ウィルス肝炎を識別することができ、また遺伝
的なチロシン症を確認することができ為。

本発明において、羊水、血清、または血漿を試料として
、そのα−プロティンを定量するには、以下の段階から
成る： １）検定するα−フエト蛋白を含む試料と検定するα−
フエト蛋白に特異的な抗体及び酵素との複合化合物とを
この抗体に比べて検定するα−フエト蛋白を過剰量とし
て接触反応させ、２）こうして得られた反応溶液の少な
くとも１部を検定するα−フエト蛋白に特異的な抗体を
固定した固相と接触反応させ、６）反応溶液を固相から
分離し、４）固相における酵素量を測定する。

この方法の変形例として、検定されるα−フエト蛋白を
含む試料を、検定するα−フエト蛋白に特異的な抗体及
び酵素との複合化合物と接触反応させると同時に検定す
るα−フエト蛋白に特異的な抗体の固定された固相に接
触反応させることにより段階１）及び２）が同時になさ
れる。

この方法を実施する好適な態様によれば、複合化合物の
抗体がモノクローナル抗体であり、かつ固定に固定され
る抗体が抗−α−フエトプロティン免疫グロブリンであ
る。

゛リポ蛋白質の検定の場合と同様に、この検定を゛巣飾
するだめの必要な要素を以下の構成からなるキットにお
きかえることができる： ゛　同一の条件下でヒト抗−α−フエト蛋白免疫グロブ
リンを被覆した固相をそれぞれ有するチューブ系、５０
〜１００ηｇｌｕｔ　の範囲のα−フエト蛋白を有する
標準試料を含む一連のｉトル、α−フエト蛋白に特異的
なモノクローナル抗体と酵素とを共役させることにより
得られる複合化合物を含むボトル、及び酵素的検出のた
めの色原体を含むゼトルからなること。

リボ蛋白質の検定の場合と同様に、チューブはゾレード
装置を構成する固相を有し、色原体は凍結乾燥状である
とよい。この場合、キットは色原体希釈緩衝液を含むｚ
トルをも有′する。

〔好適実施態様の詳細な説明〕

第１図は、後述する語例に用いられるアッセイ装置であ
り、この装置は環状部をフラットペース３によって底が
閉じられている略円筒状の透明なチューブにより構成さ
れている。この底から連続して、そのチュ・−ブは第１
反応層Ａを有し、アッセイされる蛋白質に特異的な抗体
を固定するだめの部材５をここに保持している。この部
材はベース３に載置された硬質の円筒状スリーブ５ａと
チューブ１の内面１ａと密着している縦ブレード５ｂと
からなる。これによってチューブ内にこの部材を保持す
ることができる。なぜならこの部材はゴム状物質、たと
えばポリアミドから作られる。部材５の高さはチューブ
１の反応層Ａの高さを決定　　　−する。

この図から明らかなように、フラットベース６があるの
で、使用する試薬量を制限することができる。即ち、部
材５が完全に浸漬されるようにするだけで十分である。

第１反応層の上に、このチューブは第２リーディング層
を有し、更にこの上に各洗浄段階を実施するために十分
な高さを有した０層を有している。

第２リーディング層において、該チューブはチューブ１
の壁の内面１ａと外面１ｂは互いに中心を共有するよう
に設けられ、この結果特に、非常に良好な光学的性質を
有している。即ち、該第２リーディング層の壁の厚さｅ
は均一かつ一定である。

チューブ１はプラスチック物質、たとえばポリメチルメ
タクリレートから作られ、好ましくは射出成型により得
られる。

例１：アポリポ蛋白質Ｂのアッセイ このアッセイを実施するために、初めに１５０ｍ　Ｍ　
ＮａＣ１，２０ηＭＫＣ１，更に、超遠心分離によりリ
ボ蛋白質を除いた正常な羊の血清１５％（Ｖ／Ｖ　）　
　を含む０．０５Ｍ＝ｇレート緩衝液ｐＨ＝８ｏ１　ｙ
／Ｘ　ＩＪ＆蛋白質Ｂｏ母溶液を１／２．１／１０．１
／２０．１１５０．１／１００、および１／２００　に
希釈した０、５〜０．００５２１１Ｐ／−の範囲の既知
のリボ蛋白質濃度を有した６標準試料が調製される。

この人リポ蛋白質Ｂに特異的な抗体は、標準試料の調製
に用いられたものと同一の人リポ蛋白質Ｂを用いた羊の
免疫感作により得られる。この免疫グロブリンは、この
免疫感作された羊の血清から得られ、カプリル酸による
沈殿、遠心分離、ろ過による上清液の回収、０．１μア
セテート緩衝液ｐＨ５，７に対しこの上清液生成物を４
℃−晩透析によって精製される。この溶液は次に蛋白質
１Ｐ当り該緩衝液ＤＥＡＥ　Ａ５０が５０Ｆの割合であ
るＤＥＡＥＡ５０ゲルに１５分間接触される。ろ過する
ことにより、免疫グロブリン含有溶液が集められる。こ
の精製度は電気泳動法により試験することができる。

次に、該リボ蛋白質に特異的な抗体とある酵素の複合化
合物が、該得られた免疫グロブリンとウィルノンとナカ
ネにより説明された過ヨウ素酸ナトリウム法に従ったダ
ーリンガーライフオルトペルオキシダーゼ（グレーｒＩ
　　Ｒ，ｚ＝３）によって確立された酵素とをカップリ
ングすることにより調製される。この得られた複合化合
物は、次に、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａｃ　Ａ　４４を用い
たゲルマろ過し、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ；ｐＨ７，２
）で溶離することにより精製される。この精製は定量操
作でかなり障害となる該未結合の微量の酵素を除去する
ことができる。この得られた複合化合物は、次に、０．
０５　Ｍゼレート緩衝液、即ち、ｐＨ８，０，１５０ｍ
ＭＮａｃ１．２０ｍＭＫＣｌ、超遠心分離によりりＩ蛋
白質を除いた正常な羊の血清１５％（Ｖ／Ｖ）を含む溶
液に１７２００に希釈される。

定量する目的では、第１図に示したポリメチルメタアク
リレートのチューブが使用され、その底にポリアミドか
ら作られたブレード装置が固定されている。

このチューブのブレード装置を構成する固相へこれらの
抗体を固定するために、このチューブにリン酸塩緩衝液
（０，０５Ｍ　；　ｐＨ＝７．０　）の５０μｍ／ｄ免
疫グロブリン溶液１ｄを加え雰囲気温度で４時間静簡：
する。この時、イシ力ワエイジ、ハマグチョシタカ、お
よびマサヨシイマガワの方法に従って免疫グロブリンを
活性化した後年内に得られる免疫グロブリンを用いる。

４時間後、このチューブは５回リン酸塩緩衝液で洗われ
、６７℃減圧下で乾燥、湿気をさけて４℃に保たれる。

定量は以下の如〈実施される。ブレード装置のない最初
のプラスチックチューブに、０．０５ｄの標準液、また
は定量する試料、および該ゼレート緩衝液で１７２００
にあらかじめ希釈された該複合化合物０．５−を加え、
雰囲気温度に静置する。９０分静置後、この最初のチュ
ーブの内容物、またはその一部（少なくとも０．４５０
．／）をリポ蛋白質Ｂに料異的な抗体を固定したブレー
ド装置を有するプラスチックチューブの一つに注入する
。この溶液質は雰囲気温度下２時間このブレードと接触
するように維持される。次にチューブの液相は吸引され
、初めにこのチューブをＴｗｅｅｎ　２００．１％含有
軟水で洗浄し次に、軟式で２回洗浄する。これらの洗浄
操作はチューブに液を２＃Ｉ／満たし次にこれを吸引す
ることにより行なう。

これらの洗浄操作に続いて、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４
。

２Ｈ２０が１００９／＊ｇ　）溶液３．２　＃ＬＩ！中
オルトフェニレンジアミン・２Ｉ’（Ｃ１（シグマ）１
０即７’ｍｌ溶液を凍結乾燥して得た混合物に０．９２
係（Ｖ／Ｖ）　１水和クエン酸、０．０１％（ｗｔ／ｖ
　）チメロサールおよび０．０２％（ｖ／ｖ）　３０％
Ｈ２Ｏ２を含有する緩衝液１６ｒｘｉｆ：使用直前に加
えて作った色原体溶液０．５．７をチューブに注入する
。雰囲気温度下６０分酵素反応を進行させ、１Ｎシュウ
酸浴液２ｍｌを加えてこれを止める。次に、この溶液の
吸光度は、光線りがリーディング層Ｂを有するチューブ
１の水準を通過するようにチューブ１に分光光度計２を
導入しすることによ、？、４９２ηｍで該光度計により
決定される。

定量操作を全ての標準試料について繰シ返し、その結果
は表１および第２図に示した。第２図は標準曲線が試料
のリポ蛋白質Ｂ量の関数として吸光度を与えていること
を示している。

同様の定量操作を定量すべき試料について実施し、そし
て、この試料について測定された吸光度と一致するリボ
蛋白質Ｂ濃度を標準曲線により決定する。

表　　　　１ 希釈　　　＃度（キ／、ｌ）　　　　吸光度１／２　　
　　　　０．５　　　　　０．２８１１５　　　　　　
０．２　　　　　０．４９１／１０　　　　　０．１　
　　　　　０．７４１／２０　　　　　　０．０５　　
　　　１．０１１１５０　　　　　　０．０２　　　　
　１．４２１／１００　　　　　０．０１　　　　　１
．６０例２：アポリボ蛋白質の定量 これらの定量を実施するため、例１と同様に、１５０　
ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍ　Ｍ　ＫＣＩ、史に、超遠心分
離によってリポ蛋白を除いた正常な羊の血清１５％（ｖ
／ｖ）を含むｐＨ８（７）０．０５　Ｍ　、ｙｖ　−ト
緩衝液の１　ｙ／β　のリボ蛋白質Ｂの母溶液を１／２
．１１５．１／１０．１／２０．１１５０、および１／
１００に希釈した０、５から０．０１　ｔＩＶｄの範囲
の既知のリボ蛋白質Ｂの濃度を有した６標準試料を調製
する。

この定量をするために、例１と同様のチューブ、抗体、
複合化合物のそれぞれを使用し、抗体はチューブのブレ
ード装置を構成する固相に固定される。定量は、以下の
様に実施される。

抗体を固定したブレード装置を含むチューブに１００μ
に標準試料、および１−の事前に１／２０００に希釈し
た複合化合物を加え、６７℃２時間インキュベーション
する。次に、チューブの液相を吸引しチューブは例１と
同様に洗浄される。該固相の酵素的検出が例１と同様に
行なわれ、同様の生成物が使用される。

この定量操作を全ての標準試料について繰シ返す。この
結果を表２および第３図に示した。第３図は、標準曲線
が標準試料のリポ蛋白質Ｂ量の関数として吸光度を与え
ていることを示す。更に１同様の操作が定量すべき試料
について実施されるが、１０μ２の試料、および事前に
１／２０００　に希釈した該複合化合物の１ｄを用いる
。

表　　　　２ 希釈　　　　濃度（＋ｌＩＰ／ｓ／）　　　　吸光度１
／２　　　　　　０．５　　　　　０．３５１１５　　
　　　　０．２　　　　　０．５８１／１０　　　　　
　０．１　　　　　０．８４１／２０　　　　　　０．
０５　　　　　１．２４１１５０　　　　　　０．０２
　　　　　１．８５０１／１００　　　　　０．０１　
　　　　２．０００例３：リポ蛋白質Ｂの定量 比較のために、以下同一試薬を用いるが以下の如き段階
を含む従来の免疫−酵素的定量方法の結果を示す。

１、抗体が固定されている該固相と共に標準試料または
定量すべき試料のインキュベーション事前に１／１００
．１１５００．１／１０００゜１／２０００．１／４０
００．１１５０００．１７１００’００゜１／２０００
０　Ｋ希釈した標準試料０．５−が、リポ蛋白質ＢＫ特
異的な抗体を固着したブレード装置を含むチューブに雰
囲気温度下１時間インキ　　　□ユベートされる。チュ
ーブ内容物を次に吸引し、チューブを０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０溶液で洗浄、続いて軟水で２回洗浄する。

２、複合化合物のインキュベーション １／１５００に希釈したライフオルトペルオキシダーゼ
−大技リポ蛋白質抗体複合化合物の０．５−を、次に、
チューブに加え、雰囲気温度で２時間インキュベートす
る。次に、液相を吸引しチューブを前記と同様に洗浄す
る。初めに０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０で、次いで軟水で
２回行う。

３、固相に固定された酵素の定量 酵素の検出は前記と同様の色原体を用いて同条件で行な
う。リーディングも４９２ηｍ　で行なう。得られた結
果を以下表６と第４図に示した。第４図はこれらの条件
下得られた標準曲線である。

この従来法を用いると、定量すべき試料を１１５０００
または１／１００００に希釈しなければなら々い。一方
、本発明によれば、試料が２０μ℃であれば希釈の必要
がなく、あるいは試料が１ｄの場合は１／２５または１
１５０だけ希釈すれば十分である。

表　　　　６ 希釈　　　濃度（μｙ／ｙ）　　　　吸光度１／１００
　　　　１０μＰａｄ　　　　　　１．７０１１５００
　　　　５　　　　　　　　１．６５１／１０００　　
　　１　　　　　　　　１．５０１／　２０００　　　
　０．５　　　　　　　１．３２１／４０００　　　　
０．２５　　　　　　　１．０５１１５０００　　　　
０．２　　　　　　　０．８５１／１００００　　　０
．１　　　　　　　０．５１１／２００００　　　０．
０５０　　　　　　０．３７ｂｌａｎｋ　　　　　　　
　　　０　、１６例４：α−フエトプロティンの定量 この例は第１の抗体としてα−フエトプロティンに特異
的なモノクローナル抗体とやぎから得られる大技−α−
フエトプロティン免疫グロゾリンを第２の抗体として、
固相に固定される本発明によるα−フエトプロティンの
定量方法を説明するものである。

初めに、羊水をリン酸塩緩衝液（５３ｍＭ；ｐＨ７，４
）ただし５％（ｖ／ｖ）正常羊血清と０．０１　％（Ｖ
／Ｖ）チメロザールを含む溶液で希釈し５０〜１０００
μＰ／ｌｄの既知のα−フエトプログイン濃度を有する
４標準試料を調製する。

人α−フエトプロティンで免疫感作されたＢ　Ａ　Ｌ　
Ｂ／Ｃマウス牌臓細胞とミエローマ細胞とを融合するこ
とにより得たモノクローナル抗体に６Ｂ。

を使用するが、この操作はＪ、“トチャー、Ｄ、ペレッ
ト、Ｊ、Ｌサラ−ドおよびＪ、マーチヤントによって著
わされた「ＡＦＰ定量におけるポリクローナルまだはモ
ノクローナル抗体、生体液の前線、第３１回コロキウム
」、ブリュッセルズ１９８６、出版者Ｄｒ　ＨｏＰｅｅ
ｔｅｒｓ　−Ｐｅｒｇａｍｏｎ　　ゾレスオックスフォ
ードアンドニュ〒ヨーク、即ち、Ｇ、コーラ−とＣ，ミ
ルスタインにより導かれた方法に従ったものである。

続いてα−フエトプロティンに特異的なモノクローナル
抗体と酵素の複合化合物の調製を行々う。

これは、例１で用いた操作に従ってモノクローナル抗体
をライフオルトペルオキシダーゼでカップリングするこ
とにより得られる。またこの複合化合物は例１の操作と
同条件で精製され、次に５％（ｖ／ｖ）正常羊血清、お
よび０．０１　％チメロサールを含むリン酸塩緩衝液（
５３ｍＭ；ｐＨ＝７．４）にそれらを１／２００００に
希釈する。

この定量を実施するために、第１図に示したポリスチレ
ン製チューブが用いられ、その底部に、α−フエトプロ
ティンに特異的な第２の抗体を固定しであるポリアミド
のブレード装置が保持されている。

チューブのブレード装置によって構成されている固相に
この抗体を固定するためには、リン酸塩緩衝液（０，０
５Ｍ　；　ｐＨ＝７．０　）の５０μｙ／ｌ　免疫グロ
ブリン溶液１ｄをチューブに雰囲気温度下４時間導入す
る。この時、イシ力ワエイジ、ハマグチョシタカ、およ
びイマガワマサヨシにより記載された方法に従ってそれ
らを活性化した後ヤギ内に得られた抗−α−フエトプロ
ティン免疫グロブリンを使用する。

４時間後チユーブをリン酸緩衝液で６度洗浄し、次いで
減圧下６７℃で乾燥し、次に湿気を避けて４℃に貯蔵す
る。

定量は以下の様に実施する。標準試料０．５ｄまたは定
量すべき試料０．５　ｗおよびリン酸緩衝液に１７２０
０００に希釈した該複合化合物０．５−をブレード装置
のない第１のプラスチックチューブに加え６７℃でイン
キュ技−ションする。９０分のインキュベーションの後
、このチューブの内容全部または少なくとも一部（少な
くとも０．４５０−ｔ　）をプラスチックチューブの一
つに注入する。このチューブのブレード装置はヤギから
得られた抗−α−フエトプロティン免疫グロブリンによ
って組成される特異的抗体が固定されている。この溶液
質は６７℃１時間、ブレード装置との接触が維持される
。次いで、このチューブの液相は吸引され、チューブは
（）、ｌ　％　Ｔｗｅｅｎ　２０含有軟式で初めに洗浄
され、続いて、２度軟水で洗浄する。

これらの洗浄操作に続いて、例１で用、いた色原体溶液
０．５ｄをこのチューブに注入し、酵素の検出が例１と
同条件下で実施される。

得られた結果を第５図に示した。第５図は上記条件下で
得られた標準曲線を示す。

【図面の簡単な説明】 本明細書中、非限定実施例であるアポリボ蛋白質Ｂ１お
よびα−フエトプロティンの検定に関して詳細々記載と
共に添付した図として：第１図は本発明による検定装置
であり、概略垂直断面図である。 第２および６図は本発明により得られるリポ蛋白質Ｂの
検定のだめの標準曲線である。 第４図は従来例により得られるリポ蛋白質Ｂの検定のだ
めの標準曲線で生る。 第５図は、本発明方法によりモノクローナル抗　一体を
用いで得られるα−フエト蛋白を検定するための標準曲
線である。 代理人　弁理士　（８１０７）　　佐々木清隆“（ほか
３名）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）物質を免疫検定する方法において、１）検定され
   る物質を含む試料と該物質に特異的な標識された免疫活
   性を有する試薬とを、検定される物質を標識された免疫
   活性を有する試薬に比べて過剰にするような免疫活性を
   有する試薬量にて接触反応させ、２）こうして得られた
   反応溶液の少なくとも１部を検定される物質に特異的な
   免疫活性言有する試薬を固定した固相と接触反応させ、
   ３）反応溶液を固相から分離し、４）固相における標識
   された免疫活性を有する試薬量を測定する段階よりなる
   ことを特徴とする物質の免疫検定方法。
2. （２）検定される物質を、標識された免疫活性を有する
   試薬及び該試薬を固定した固相とに同時に接触反応させ
   ることにより、段階１）及び２）が同時になされる特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）検定される物質が抗原又はハプテンである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）標識された免疫活性を有する試薬が放射性元素で
   標識された抗体である特許請求の範囲第３項記載の方法
   。
5. （５）標識された免疫活性を有する試薬が、酵素及び検
   定される抗原又はハプテンに特異的な抗体との複合化合
   物である特許請求の範囲第３項記載の方法。
6. （６）標識された免疫活性を有する試薬が、けい光要素
   により標識された抗体である特許請求の範囲第３項記載
   の方法。
7. （７）少なくとも免疫活性を有する試薬の１がモノクロ
   ーナル抗体である特許請求の範囲第３項記載の方法。
8. （８）検定される物質が、リポ蛋白、免疫グロブリン、
   補体フアクター及び糖蛋白を含むグループから選択され
   る血漿蛋白である特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）検定される物質が抗体である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
10. （１０）血漿中のリポ蛋白を検定する方法において、１
    ）検定されるリポ蛋白を含む血漿試料と該リポ蛋白に特
    異的な抗体と酵素との複合化合物を、検定されるリポ蛋
    白が抗体に比べて過剰量にして、接触反応させ、２）こ
    うして得られた反応溶液の少なくとも１部を、リポ蛋白
    に特異的な同一の抗体を固定した固相と接触反応させ、
    ３）反応溶液を固相から分離し、４）固相における酵素
    量を測定する段階よりなることを特徴とする血漿中のリ
    ポ蛋白の検定方法。
11. （１１）検定されるリポ蛋白を含む血漿試料を、こうし
    た検定されるリポ蛋白に特異的な抗体及び酵素との複合
    化合物に接触反応させると同時に、検定されるリポ蛋白
    に特異的な同一の抗体を固定した固相に接触反応させる
    ことにより、段階１）及び２）が同時になされる特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）酵素がライフオートパーオキシダーゼである特
    許請求の範囲第１０項及び第１１項記載の方法。
13. （１３）同一の条件下でヒト抗リポ蛋白免疫グロブリン
    を被覆した固相をそれぞれ有するチユーブ系、０．１〜
    ０．００５ｇ／ｌの範囲の標準リポ蛋白試料を含む一連
    のボトル、ヒト抗リポ蛋白免疫グロブリンと酵素とを共
    役させることにより得られる複合化合物を含むボトル及
    び酵素的検出のための色原体を含むボトルから成ること
    を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の方法を実施
    することによりリポ蛋白を検定するためのキツト。
14. （１４）血清、血漿又は羊水試例中に存在するα−フエ
    ト蛋白を検定する方法において、１）検定するα−フエ
    ト蛋白を含む試料と検定するα−フエト蛋白に特異的な
    抗体及び酵素との複合化合物とをこの抗体に比べて検定
    するα−フエト蛋白を過剰量として接触反応させ、２）
    こうして得られた反応溶液の少なくとも１部を検定する
    α−フエト蛋白に特異的な抗体を固定した固相と接触反
    応させ、３）反応溶液を固相から分離し、４）固相にお
    ける酵素量を測定する段階よりなることを特徴とする血
    清、血漿又は羊水試料中に存在するα−フエト蛋白の検
    定方法。
15. （１５）検定されるα−フエト蛋白を含む試料を、検定
    するα−フエト蛋白に特異的な抗体及び酵素との複合化
    合物と接触反応させると同時に検定するα−フエト蛋白
    に特異的な抗体の固定された固相に接触反応させること
    により段階１）及び２）が同時になされる特許請求の範
    囲第１４項記載の方法。
16. （１６）複合化合物の抗体がモノクローナル抗体である
    特許請求の範囲第１４項記載の方法。
17. （１７）固相に固定される抗体が抗−α−フエト蛋白免
    疫グロブリンである特許請求の範囲第１４項記載の方法
    。
18. （１８）酵素がライフオートパーオキシダーゼである特
    許請求の範囲第１４項記載の方法。
19. （１９）同一の条件下でヒト抗−α−フエト蛋白免疫グ
    ロブリンを被覆した固相をそれぞれ有するチユーブ系、
    ５０〜１００ηｇ／ｍｌの範囲のα−フエト蛋白を有す
    る標準試料を含む一連のボトル、α−フエト蛋白に特異
    的なモノクローナル抗体と酵素とを共役させることによ
    り得られる複合化合物を含むボトル、及び酵素的検出の
    ための色原体を含むボトルからなることを特徴とする特
    許請求の範囲第１４項記載の方法を実施することにより
    α−フエト蛋白を検定するためのキツト。
20. （２０）色原体希釈用緩衝液を含むボトルが含まれる特
    許請求の範囲第１３及び第１９項記載のキツト。