JP3095275B2 - リポコルチンに対する抗体の測定方法 - Google Patents
リポコルチンに対する抗体の測定方法Info
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description
【０００１】本発明は種の体液中のリポコルチン（アネ
ッキシン(annexin))に対する抗体の測定方法に関し、こ
の方法は固相に結合させたリポコルチン系のタンパク
質、およびこの種の免疫グロブリンの単一クラスまたは
複数クラスを指向する標識付けした生親和性結合パート
ナーを使用する。
ッキシン(annexin))に対する抗体の測定方法に関し、こ
の方法は固相に結合させたリポコルチン系のタンパク
質、およびこの種の免疫グロブリンの単一クラスまたは
複数クラスを指向する標識付けした生親和性結合パート
ナーを使用する。
【０００２】自己免疫に基づく炎症障害はしばしば免疫
系の異常制御を伴い、その結果自己抗体が生成するが、
それが原因で障害の病因に結び付くことはない。この種
の第二の自己抗体の診断への使用は種々な診断に対して
可能である。しかしながら、第二の自己抗体は一方で副
作用を起こすことがあり、その治療が重大事である。従
って、補体結合と続いて起こる補体の活性化を伴う細胞
表面への免疫複合体の付着は血管壁の血管炎、心筋の心
炎および腎細管における糸毬体腎炎の原因となる。
系の異常制御を伴い、その結果自己抗体が生成するが、
それが原因で障害の病因に結び付くことはない。この種
の第二の自己抗体の診断への使用は種々な診断に対して
可能である。しかしながら、第二の自己抗体は一方で副
作用を起こすことがあり、その治療が重大事である。従
って、補体結合と続いて起こる補体の活性化を伴う細胞
表面への免疫複合体の付着は血管壁の血管炎、心筋の心
炎および腎細管における糸毬体腎炎の原因となる。
【０００３】リポコルチン系のタンパク質に対するこの
種類の第二の自己抗体はリウマチ様障害（全身紅斑性狼
瘡、リウマチ様関節炎および皮膚筋炎）に記述されてい
る(Hirata, F 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９
８１年）７８巻、３１９０〜３１９４ページ)。
種類の第二の自己抗体はリウマチ様障害（全身紅斑性狼
瘡、リウマチ様関節炎および皮膚筋炎）に記述されてい
る(Hirata, F 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９
８１年）７８巻、３１９０〜３１９４ページ)。
【０００４】このリポコルチン系は現在６つの極めてよ
く特徴が判っているタンパク質からなり、それらはＰＰ
４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、ｐ６８、リポコルチンＩ
およびIIと呼称する（または新しい命名法によればリポ
コルチンまたはアネッキシンＶ、IV、III、VI、Ｉおよ
びIIと称する）。リポコルチンは特にアラキドン酸の遊
離、従って炎症の仲介物質の供給を制御し、すなわちリ
ポコルチンは抗炎症効果を持つ。
く特徴が判っているタンパク質からなり、それらはＰＰ
４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、ｐ６８、リポコルチンＩ
およびIIと呼称する（または新しい命名法によればリポ
コルチンまたはアネッキシンＶ、IV、III、VI、Ｉおよ
びIIと称する）。リポコルチンは特にアラキドン酸の遊
離、従って炎症の仲介物質の供給を制御し、すなわちリ
ポコルチンは抗炎症効果を持つ。
【０００５】これらのタンパク質はリーダー配列を持た
ないから、特に内部細胞では比較的高濃度で検出される
が体液中では痕跡量である。しかしながら、リポコルチ
ンは細胞表面にも存在し、それらが細胞外抗炎症効果を
持ち得ることも示された。
ないから、特に内部細胞では比較的高濃度で検出される
が体液中では痕跡量である。しかしながら、リポコルチ
ンは細胞表面にも存在し、それらが細胞外抗炎症効果を
持ち得ることも示された。
【０００６】しかしながら、慢性的炎症の場合リポコル
チンに対する自己抗体が生成し、この結果次にコルチコ
イド耐性が起こる危険がある。従って、リポコルチンに
対する自己抗体の測定は治療の種類の選択特に長期のコ
ルチコイドの使用の決定のための重要な基準になるはず
である。
チンに対する自己抗体が生成し、この結果次にコルチコ
イド耐性が起こる危険がある。従って、リポコルチンに
対する自己抗体の測定は治療の種類の選択特に長期のコ
ルチコイドの使用の決定のための重要な基準になるはず
である。
【０００７】ＥＬＩＳＡを使用する血清中のリポコルチ
ンＩに対する自己抗体の測定方法が開示されている(Gou
lding等、Ann. Rheum. Dis. (１９８９年)４８巻、８４
３〜８５０ページ）。しかしながらこの方法は大きな欠
点を持つ。例えば、一方でリポコルチン系の１つのタン
パク質（リポコルチンＩ）に対する抗体のみが検出され
る。他方で感度が低くそしてバックグラウンドが通常の
被験者の血清中の非特異的結合により極めて高く、従っ
て特にＩｇＧクラスの自己抗体がほとんど検出されな
い。最後に、指定された患者群において精密に予想しな
ければならないリウマチ様因子を含む血清を正しく測定
することを実証し得なかった。このゆえに本方法の臨床
的な通常の選別試験法としての適性は低い。
ンＩに対する自己抗体の測定方法が開示されている(Gou
lding等、Ann. Rheum. Dis. (１９８９年)４８巻、８４
３〜８５０ページ）。しかしながらこの方法は大きな欠
点を持つ。例えば、一方でリポコルチン系の１つのタン
パク質（リポコルチンＩ）に対する抗体のみが検出され
る。他方で感度が低くそしてバックグラウンドが通常の
被験者の血清中の非特異的結合により極めて高く、従っ
て特にＩｇＧクラスの自己抗体がほとんど検出されな
い。最後に、指定された患者群において精密に予想しな
ければならないリウマチ様因子を含む血清を正しく測定
することを実証し得なかった。このゆえに本方法の臨床
的な通常の選別試験法としての適性は低い。
【０００８】従ってこれらのリポコルチンタンパク質に
対する抗体の同定のため容易に実行される迅速な免疫学
的方法を開発することが目的であった。
対する抗体の同定のため容易に実行される迅速な免疫学
的方法を開発することが目的であった。
【０００９】ヘテロジニアス・イムノアッセイ（hetero
geneousimmunoassay）におけるリポコルチンで被覆した
固相への抗体の非特異的結合とリウマチ様因子の影響は
適当な被覆タンパク質と方法、および試料緩衝剤および
複合体緩衝剤の選択により大きく減少させ得ることを見
出した。信頼できる診断情報はすべてのリポコルチンに
対する抗体の存在を試験する場合のみ期待することがで
きる。
geneousimmunoassay）におけるリポコルチンで被覆した
固相への抗体の非特異的結合とリウマチ様因子の影響は
適当な被覆タンパク質と方法、および試料緩衝剤および
複合体緩衝剤の選択により大きく減少させ得ることを見
出した。信頼できる診断情報はすべてのリポコルチンに
対する抗体の存在を試験する場合のみ期待することがで
きる。
【００１０】従って本発明は既知のリポコルチンの混合
物を固相に結合させた生親和性結合パートナーとして使
用するリポコルチンに対する抗体の測定のためのヘテロ
ジニアス・イムノアッセイに関する。
物を固相に結合させた生親和性結合パートナーとして使
用するリポコルチンに対する抗体の測定のためのヘテロ
ジニアス・イムノアッセイに関する。
【００１１】ヘテロジニアス・エンザイム・イムノアッ
セイはそれ自体当業者に公知である。それらは抗原と抗
体を検出することができ、そして付加的例えばサンドウ
イッチ・イムノアッセイ、または競争的であることがで
きる。
セイはそれ自体当業者に公知である。それらは抗原と抗
体を検出することができ、そして付加的例えばサンドウ
イッチ・イムノアッセイ、または競争的であることがで
きる。
【００１２】結合させた被検物質の検出に使用する生親
和性結合パートナーは例えば放射性同位元素、蛍光また
は化学ルミネッセンス物質、または好ましくは酵素で標
識付けして公知の方法で結合を検出する。
和性結合パートナーは例えば放射性同位元素、蛍光また
は化学ルミネッセンス物質、または好ましくは酵素で標
識付けして公知の方法で結合を検出する。
【００１３】エンザイム・イムノアッセイの標識用酵素
は文献で公知のそれであり、そして好ましくはアルカリ
・ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびセイヨ
ウワサビペルオキシダーゼが使用されるが、特に好まし
いのはセイヨウワサビペルオキシダーゼである。
は文献で公知のそれであり、そして好ましくはアルカリ
・ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびセイヨ
ウワサビペルオキシダーゼが使用されるが、特に好まし
いのはセイヨウワサビペルオキシダーゼである。
【００１４】ヘテロジニアス・エンザイム・イムノアッ
セイ用固相はそれ自体当業者に公知であり、そして好ま
しくは成型した物品例えばシート状試験用要素であっ
て、その固相が素地の形態例えば織物または膜フィルタ
ー、または網状の管、ウエル、ビーズ、星形の物などお
よび微粒子（粒子サイズ＜１,０００nm）例えばラテッ
クス粒子および磁気誘引性粒子を使用する。この点で特
に好ましいのはミクロ力価測定板のウエル、ラテックス
粒子および磁気誘引性粒子である。ミクロ力価測定板が
極めて特に好ましい。固相用材料は当業者に公知であ
る。
セイ用固相はそれ自体当業者に公知であり、そして好ま
しくは成型した物品例えばシート状試験用要素であっ
て、その固相が素地の形態例えば織物または膜フィルタ
ー、または網状の管、ウエル、ビーズ、星形の物などお
よび微粒子（粒子サイズ＜１,０００nm）例えばラテッ
クス粒子および磁気誘引性粒子を使用する。この点で特
に好ましいのはミクロ力価測定板のウエル、ラテックス
粒子および磁気誘引性粒子である。ミクロ力価測定板が
極めて特に好ましい。固相用材料は当業者に公知であ
る。
【００１５】固相上の結合パートナーとしてヒト由来の
リポコルチン系のタンパク質（例えばRoemisch等、Bio
l. Chem. Hoppe-Seyler（１９９０年）３７１巻、３８
３〜３８８ページに記述されている）を使用するのが好
ましい。同じく使用できる結合パートナーは遺伝子工学
により調製し、原核または真核細胞で発現させたリポコ
ルチンである（例えばRoemisch等、Biochem. J. (１９
９０年)２７２巻、２２３〜２２９ページ参照）。
リポコルチン系のタンパク質（例えばRoemisch等、Bio
l. Chem. Hoppe-Seyler（１９９０年）３７１巻、３８
３〜３８８ページに記述されている）を使用するのが好
ましい。同じく使用できる結合パートナーは遺伝子工学
により調製し、原核または真核細胞で発現させたリポコ
ルチンである（例えばRoemisch等、Biochem. J. (１９
９０年)２７２巻、２２３〜２２９ページ参照）。
【００１６】ヘテロジニアス・イムノアッセイを実行す
る場合、それ自体当業者に公知の種々の溶液が特に洗浄
および希釈用に使用され、そしてこれらは特に緩衝剤、
界面活性剤および中性タンパク質を含む。これらの物質
は関連するすべての洗浄工程を含む被覆に使用する溶液
にも使用される。
る場合、それ自体当業者に公知の種々の溶液が特に洗浄
および希釈用に使用され、そしてこれらは特に緩衝剤、
界面活性剤および中性タンパク質を含む。これらの物質
は関連するすべての洗浄工程を含む被覆に使用する溶液
にも使用される。
【００１７】エンザイム・イムノアッセイに使用する緩
衝系も当業者に公知である。各々の場合使用する緩衝系
の性質は得られるｐＨによることも当業者に知られてい
る。
衝系も当業者に公知である。各々の場合使用する緩衝系
の性質は得られるｐＨによることも当業者に知られてい
る。
【００１８】ヘテロジニアス・エンザイム・イムノアッ
セイ用溶液に使用する界面活性剤は当業者に公知のよう
なものであり（例えばVoller, A 等、Bull. World Heal
th Organ. (１９７６年）５３巻、５５〜６５ペー
ジ）、そして好ましくは非イオン性および双イオン性界
面活性剤が使用され、ポリオキシエチレンが特に好まし
く、RTween ２０が極めて特に好ましい。
セイ用溶液に使用する界面活性剤は当業者に公知のよう
なものであり（例えばVoller, A 等、Bull. World Heal
th Organ. (１９７６年）５３巻、５５〜６５ペー
ジ）、そして好ましくは非イオン性および双イオン性界
面活性剤が使用され、ポリオキシエチレンが特に好まし
く、RTween ２０が極めて特に好ましい。
【００１９】エンザイム・イムノアッセイに使用する中
性タンパク質は当業者に公知であり、好ましく使用され
る例は血清アルブミン、ゼラチン、化学的に変性させた
ゼラチン例えばポリゼリン(polygeline)、および乳タン
パク質例えばラクトフェリン(lactoferrin)であり、そ
してヒトまたはウシ血清アルブミン、ポリゼリンとラク
トフェリンが特に好ましく、ポリゼリンとラクトフェリ
ンが極めて特に好ましい。
性タンパク質は当業者に公知であり、好ましく使用され
る例は血清アルブミン、ゼラチン、化学的に変性させた
ゼラチン例えばポリゼリン(polygeline)、および乳タン
パク質例えばラクトフェリン(lactoferrin)であり、そ
してヒトまたはウシ血清アルブミン、ポリゼリンとラク
トフェリンが特に好ましく、ポリゼリンとラクトフェリ
ンが極めて特に好ましい。
【００２０】さらに、本発明はリポコルチンに対する抗
体を測定するためのヘテロジニアス・イムノアッセイ用
固相を被覆する方法に関し、この場合被覆はリポコルチ
ン系の単一のタンパク質またはタンパク質の混合物を使
用し、ｐＨ５〜１０好ましくはｐＨ５〜７特に好ましく
はｐＨ５.５で実行する。
体を測定するためのヘテロジニアス・イムノアッセイ用
固相を被覆する方法に関し、この場合被覆はリポコルチ
ン系の単一のタンパク質またはタンパク質の混合物を使
用し、ｐＨ５〜１０好ましくはｐＨ５〜７特に好ましく
はｐＨ５.５で実行する。
【００２１】正常な試料に対する病的な試料のシグナル
の比率を最適化させるためｐＨと２価カチオン添加の特
定の組合せを選択するのが好ましい。この点で好ましい
のは、固相の被覆を２価カチオン特にＣａ2+の好ましく
は０.１〜１００ミリモル／リットル特に好ましくは１
〜１０ミリモル／リットルの存在下でｐＨ５〜１０の範
囲に緩衝化させたリポコルチン系のタンパク質の溶液を
使用して実行する方法である。
の比率を最適化させるためｐＨと２価カチオン添加の特
定の組合せを選択するのが好ましい。この点で好ましい
のは、固相の被覆を２価カチオン特にＣａ2+の好ましく
は０.１〜１００ミリモル／リットル特に好ましくは１
〜１０ミリモル／リットルの存在下でｐＨ５〜１０の範
囲に緩衝化させたリポコルチン系のタンパク質の溶液を
使用して実行する方法である。
【００２２】リポコルチン系のタンパク質を単一または
群で適用するのが適当である場合固相を分離し、次いで
これを試料と別にまたは一緒にインキュベートすること
が可能である。
群で適用するのが適当である場合固相を分離し、次いで
これを試料と別にまたは一緒にインキュベートすること
が可能である。
【００２３】好ましい方法は既に述べたように、固相の
被覆を吸着または共有結合により固相に結合する抗体に
結合させることにより実行することを含み、その抗体
を、リポコルチンに対する抗体を測定するべき体液が由
来する種と異なる種に由来させることにより、体液から
吸着する抗体の標識付けに使用する第二の抗体との交差
反応を回避することが必要である。
被覆を吸着または共有結合により固相に結合する抗体に
結合させることにより実行することを含み、その抗体
を、リポコルチンに対する抗体を測定するべき体液が由
来する種と異なる種に由来させることにより、体液から
吸着する抗体の標識付けに使用する第二の抗体との交差
反応を回避することが必要である。
【００２４】この第二の抗体の特性はそれが試料中の抗
体と作用するが、被覆用に選んだ抗体またはリポコルチ
ンと反応しないように選択されなければならない。ヒト
血清中のリポコルチンに対する抗体の測定を意図する場
合、ヒト抗体に対する抗体が適当である。抗体がモノク
ローナルまたはポリクローナルであるかは本発明にとっ
て重要ではない。被覆に使用したリポコルチンと交差反
応しないことが重要である。
体と作用するが、被覆用に選んだ抗体またはリポコルチ
ンと反応しないように選択されなければならない。ヒト
血清中のリポコルチンに対する抗体の測定を意図する場
合、ヒト抗体に対する抗体が適当である。抗体がモノク
ローナルまたはポリクローナルであるかは本発明にとっ
て重要ではない。被覆に使用したリポコルチンと交差反
応しないことが重要である。
【００２５】この条件は同一種からの抗体とリポコルチ
ンを使用することにより最も簡単に満たされる。さら
に、標識付けに使用した抗体と被覆に使用した抗体との
非特異的反応は適当な緩衝媒質を選択することにより減
少させることができ、この場合前記緩衝媒質は好ましく
は緩衝物質および添加物例えば洗剤およびタンパク質の
他に特に好ましくは標識付けに使用した抗体が得られた
のと同じ種に由来し、そして被覆に使用した抗原と反応
しない抗体を含む。
ンを使用することにより最も簡単に満たされる。さら
に、標識付けに使用した抗体と被覆に使用した抗体との
非特異的反応は適当な緩衝媒質を選択することにより減
少させることができ、この場合前記緩衝媒質は好ましく
は緩衝物質および添加物例えば洗剤およびタンパク質の
他に特に好ましくは標識付けに使用した抗体が得られた
のと同じ種に由来し、そして被覆に使用した抗原と反応
しない抗体を含む。
【００２６】この最適化に関連して、次に固相を当業者
に公知の作用剤、好ましくはウシ血清アルブミンを用い
て好ましい方法により被覆する。
に公知の作用剤、好ましくはウシ血清アルブミンを用い
て好ましい方法により被覆する。
【００２７】標識付けした結合パートナーは免疫グロブ
リンクラスの個々の群を指向する抗体であることができ
る。好ましい方法は標識付けした結合パートナーがＩｇ
Ｇ、ＩｇＭまたはＩｇＧとＩｇＭの重鎖を指向する抗体
であるそれである。
リンクラスの個々の群を指向する抗体であることができ
る。好ましい方法は標識付けした結合パートナーがＩｇ
Ｇ、ＩｇＭまたはＩｇＧとＩｇＭの重鎖を指向する抗体
であるそれである。
【００２８】これらの抗体は、好ましくは体液が由来す
る種ではない種を試験するべき種の免疫グロブリンで免
疫することにより得、そして当業者に公知の方法により
標識付けするのが好ましい。
る種ではない種を試験するべき種の免疫グロブリンで免
疫することにより得、そして当業者に公知の方法により
標識付けするのが好ましい。
【００２９】本発明は試験するべき体液を緩衝媒質で希
釈する方法にも関し、前記緩衝媒質は好ましくは体液中
に含まれる如何なるリウマチ様因子のこの体液中におけ
る抗体との結合も抑制する試薬を含む。
釈する方法にも関し、前記緩衝媒質は好ましくは体液中
に含まれる如何なるリウマチ様因子のこの体液中におけ
る抗体との結合も抑制する試薬を含む。
【００３０】ヒト体液を研究に使用する場合、リポコル
チンに対する抗体測定の特定の方法においては、高濃度
のリウマチ様因子（ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体）および表面
に被覆したリポコルチン（１つまたは複数）を指向する
高濃度のＩｇＧ画分の抗体を持つＩｇＭ画分または全イ
ムノグロブリン画分の試料を緩衝媒質中で希釈すること
が可能であり、この緩衝媒質はこれらのリウマチ様因子
を吸着するに適当な抗体を含み、そしてもはやリポコル
チンに吸着されるＩｇＧ画分の抗体と反応することがで
きない。
チンに対する抗体測定の特定の方法においては、高濃度
のリウマチ様因子（ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体）および表面
に被覆したリポコルチン（１つまたは複数）を指向する
高濃度のＩｇＧ画分の抗体を持つＩｇＭ画分または全イ
ムノグロブリン画分の試料を緩衝媒質中で希釈すること
が可能であり、この緩衝媒質はこれらのリウマチ様因子
を吸着するに適当な抗体を含み、そしてもはやリポコル
チンに吸着されるＩｇＧ画分の抗体と反応することがで
きない。
【００３１】この目的のための緩衝媒質への添加物とし
て好ましくはウサギ抗ヒツジ赤血球抗体のグロブリン画
分が使用される。
て好ましくはウサギ抗ヒツジ赤血球抗体のグロブリン画
分が使用される。
【００３２】本発明の測定方法の好ましい態様は次の通
りである。
りである。
【００３３】ミクロ力価測定板のウエルをリポコルチン
ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、リポコルチンＩおよ
びリポコルチンIIの混合物の緩衝溶液で、０.１〜１０
０ミリモル／リットル好ましくは１〜１０ミリモル／リ
ットル特に好ましくは５ミリモル／リットルのＣａＣｌ
2の存在下でｐＨ５〜７で被覆する。続いてウシ血清ア
ルブミンによる被覆を実行する。被覆した力価測定板を
乾燥し、そして適当な条件下例えばプラスチック被覆ア
ルミニウム箔で密封して長期間活性を失うことなく保存
することができる。被覆するには試料または対照血清を
ウエルにピペットで注入し、そして一定時間インキュベ
ーション後再び吸引排出する。
ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、リポコルチンＩおよ
びリポコルチンIIの混合物の緩衝溶液で、０.１〜１０
０ミリモル／リットル好ましくは１〜１０ミリモル／リ
ットル特に好ましくは５ミリモル／リットルのＣａＣｌ
2の存在下でｐＨ５〜７で被覆する。続いてウシ血清ア
ルブミンによる被覆を実行する。被覆した力価測定板を
乾燥し、そして適当な条件下例えばプラスチック被覆ア
ルミニウム箔で密封して長期間活性を失うことなく保存
することができる。被覆するには試料または対照血清を
ウエルにピペットで注入し、そして一定時間インキュベ
ーション後再び吸引排出する。
【００３４】固相上に固定化させた抗体を測定するた
め、ペルオキシダーゼ抗体（ＩｇＧおよび／またはＩｇ
Ｍ）複合体をピペットで添加し、さらに一定時間インキ
ュベーション後吸引排出する。結合した複合体を光度測
定法により測定するため、基質溶液（例えばＯＰＤまた
はＴＭＢ）をピペットで添加し、一定時間インキュベー
ション後硫酸で反応を停止させる。吸光度を光度計で測
定する。各々の場合吸引排出に引き続いて１回または複
数回の洗浄工程を置くことができる。
め、ペルオキシダーゼ抗体（ＩｇＧおよび／またはＩｇ
Ｍ）複合体をピペットで添加し、さらに一定時間インキ
ュベーション後吸引排出する。結合した複合体を光度測
定法により測定するため、基質溶液（例えばＯＰＤまた
はＴＭＢ）をピペットで添加し、一定時間インキュベー
ション後硫酸で反応を停止させる。吸光度を光度計で測
定する。各々の場合吸引排出に引き続いて１回または複
数回の洗浄工程を置くことができる。
【００３５】他に好ましい態様においては、超常磁性粒
子を固相として使用し、そして化学ルミネッセンス標識
例えばＥＰ ０ ３３０ ０５０に記述されたようなそれ
を検出系に使用する。
子を固相として使用し、そして化学ルミネッセンス標識
例えばＥＰ ０ ３３０ ０５０に記述されたようなそれ
を検出系に使用する。
【００３６】実施例に示す態様が特に好ましい。特許請
求の範囲も開示の一部分を形成する。
求の範囲も開示の一部分を形成する。
【００３７】次の実施例は単に本発明を例示するための
ものであり、それを限定するものではない。
ものであり、それを限定するものではない。
【００３８】実施例１ ミクロ力価測定板のリポコルチンによる被覆および正常
なドナーのプールからの血清と血漿との反応に対する種
々な条件の影響 リポコルチンＰＰ４（リポコルチンはRoemisch等、Bio
l. Chem. Hoppe-Seyler(1990年)371巻、383〜388ページ
の方法により調製した）を次の緩衝系：０.０１モル／
リットルの酢酸緩衝液（ｐＨ５.５）、０.０１モル／リ
ットルのＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸〕）（ｐＨ
７.５）に５mg／リットルの濃度に溶解した。この溶液
をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＣａＣｌ
2と０.００５モル／リットルの濃度に混合した。０.１
２５mlをミクロ力価測定板（Nuncより供給された）の各
ウエルに添加した。一晩インキュベーションし、次いで
０.０５モル／リットルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７.４）で数回洗浄し、そしてミクロ力価測定板を室温
でシリカゲル乾燥器で乾燥した。乾燥後、後の使用のた
めアルミニウム被覆プラスチックバック中で空気および
湿気の侵入がないように密封した。
なドナーのプールからの血清と血漿との反応に対する種
々な条件の影響 リポコルチンＰＰ４（リポコルチンはRoemisch等、Bio
l. Chem. Hoppe-Seyler(1990年)371巻、383〜388ページ
の方法により調製した）を次の緩衝系：０.０１モル／
リットルの酢酸緩衝液（ｐＨ５.５）、０.０１モル／リ
ットルのＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸〕）（ｐＨ
７.５）に５mg／リットルの濃度に溶解した。この溶液
をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＣａＣｌ
2と０.００５モル／リットルの濃度に混合した。０.１
２５mlをミクロ力価測定板（Nuncより供給された）の各
ウエルに添加した。一晩インキュベーションし、次いで
０.０５モル／リットルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７.４）で数回洗浄し、そしてミクロ力価測定板を室温
でシリカゲル乾燥器で乾燥した。乾燥後、後の使用のた
めアルミニウム被覆プラスチックバック中で空気および
湿気の侵入がないように密封した。
【００３９】正常なドナーのプールからのヒト血漿と血
清をトリス緩衝液（ウシ血清アルブミン１％(w／w)、Tw
een ２０：０.５％(w／w)およびＮａＣｌ ０.０４５モ
ル／リットルを含む０.０５モル／リットル トリス（ｐ
Ｈ７.４））で１：５、１：１０および１：２０に希釈
した。先に希釈した試料の０.１mlをミクロ力価測定板
のリポコルチン被覆ウエルにピペットで添加し、室温で
１時間インキュベートした。次いで溶液を吸引排出し、
緩衝液（例えばBehringwerkeの洗浄用緩衝液Enzygnos
t、整理番号ＯＳＮＫ）で３回洗浄した。次いで上記ト
リス緩衝液で１：５１に希釈した抗体複合体（例えばBe
hringwerke社の抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ複合体、
バッチ番号６３ ＡＰ ００２ Ａ；または抗ヒトＩｇＭ
ペルオキシダーゼ複合体、バッチ番号８８０４１ Ａ）
の０.１mlを各ウエルにピペットで添加し、室温で１時
間インキュベートした。もう一度３回洗浄を行い、そし
て０.１mlの基質溶液（例えばｏ−フェニレンジアミン
基質溶液、Behringwerke社、整理番号ＯＳＮＫ）を各ウ
エルに導入した。室温で３０分後反応を各々１mlの０.
５規定硫酸で停止し、４９０nmの吸光度を６３０nmの参
考波長と比較してＥＬＩＳＡ光度計（例えばTitertekが
供給）で測定した。
清をトリス緩衝液（ウシ血清アルブミン１％(w／w)、Tw
een ２０：０.５％(w／w)およびＮａＣｌ ０.０４５モ
ル／リットルを含む０.０５モル／リットル トリス（ｐ
Ｈ７.４））で１：５、１：１０および１：２０に希釈
した。先に希釈した試料の０.１mlをミクロ力価測定板
のリポコルチン被覆ウエルにピペットで添加し、室温で
１時間インキュベートした。次いで溶液を吸引排出し、
緩衝液（例えばBehringwerkeの洗浄用緩衝液Enzygnos
t、整理番号ＯＳＮＫ）で３回洗浄した。次いで上記ト
リス緩衝液で１：５１に希釈した抗体複合体（例えばBe
hringwerke社の抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ複合体、
バッチ番号６３ ＡＰ ００２ Ａ；または抗ヒトＩｇＭ
ペルオキシダーゼ複合体、バッチ番号８８０４１ Ａ）
の０.１mlを各ウエルにピペットで添加し、室温で１時
間インキュベートした。もう一度３回洗浄を行い、そし
て０.１mlの基質溶液（例えばｏ−フェニレンジアミン
基質溶液、Behringwerke社、整理番号ＯＳＮＫ）を各ウ
エルに導入した。室温で３０分後反応を各々１mlの０.
５規定硫酸で停止し、４９０nmの吸光度を６３０nmの参
考波長と比較してＥＬＩＳＡ光度計（例えばTitertekが
供給）で測定した。
【００４０】血清と血漿中のＩｇＧおよびＩｇＭ測定に
おいて種々な被覆条件下で測定した吸光度をそれぞれ図
１および２に示す。ヒト抗体はＩｇＧおよびＩｇＭ型の
いずれも上で詳述したすべての被覆条件でリポコルチン
被覆板上の正常なドナーからの血清と血漿中で検出可能
であることを証明している。使用した試料の希釈の増加
と同時のシグナルの減少はこれが複合体の非特異的結合
に対してではなく、試料のＩｇＧとＩｇＭの吸着に寄与
し得ることを示す。このシグナルを以後バックグラウン
ドと称するが、選択した実験条件下で血清におけるより
血漿においてより明白であり、そしてＩｇＭ型の抗体で
ＩｇＧ型のそれより高かった。この実施例においては、
ＩｇＧ測定用およびＩｇＭ測定用バックグラウンドは常
に中性被覆系におけるより酸性被覆系において低かっ
た。２価カチオン（例えばＣａ2+）の存在下で被覆する
ことにより酸性媒質におけるバックグラウンドをさらに
下げることが可能であった。
おいて種々な被覆条件下で測定した吸光度をそれぞれ図
１および２に示す。ヒト抗体はＩｇＧおよびＩｇＭ型の
いずれも上で詳述したすべての被覆条件でリポコルチン
被覆板上の正常なドナーからの血清と血漿中で検出可能
であることを証明している。使用した試料の希釈の増加
と同時のシグナルの減少はこれが複合体の非特異的結合
に対してではなく、試料のＩｇＧとＩｇＭの吸着に寄与
し得ることを示す。このシグナルを以後バックグラウン
ドと称するが、選択した実験条件下で血清におけるより
血漿においてより明白であり、そしてＩｇＭ型の抗体で
ＩｇＧ型のそれより高かった。この実施例においては、
ＩｇＧ測定用およびＩｇＭ測定用バックグラウンドは常
に中性被覆系におけるより酸性被覆系において低かっ
た。２価カチオン（例えばＣａ2+）の存在下で被覆する
ことにより酸性媒質におけるバックグラウンドをさらに
下げることが可能であった。
【００４１】実施例２ リポコルチン被覆ミクロ力価測定板のその後の被覆およ
びバックグラウンド・シグナルへの影響 ミクロ力価測定板をリポコルチンＩとIIの混合物（それ
ぞれ５および１.２５mg／リットル）で実施例１に記述
されたようにｐＨ５.５、７.５および９.５で０.００５
モル／リットルのＣａＣｌ2を添加して被覆した。０.０
５モル／リットルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.
４）で数回洗浄後、リポコルチン被覆に使用した緩衝液
中次のタンパク質：ウシ血清アルブミン、オボアルブミ
ン、ゼラチンの１％(w／w)溶液、ウシ胎児血清、および
０.１％ウサギＩｇＧおよびタンパク質を添加しない被
覆用緩衝液の０.１２５mlを各ウエルにピペットで添加
した。室温で３時間インキュベーション後ミクロ力価測
定板を実施例１に記述のように数回洗浄し乾燥した。バ
ックグラウンド・シグナルを実施例１に記述のように各
々の場合正常なドナーからのヒト血清のプールの１：１
０希釈液の０.１mlを使用して測定した。
びバックグラウンド・シグナルへの影響 ミクロ力価測定板をリポコルチンＩとIIの混合物（それ
ぞれ５および１.２５mg／リットル）で実施例１に記述
されたようにｐＨ５.５、７.５および９.５で０.００５
モル／リットルのＣａＣｌ2を添加して被覆した。０.０
５モル／リットルのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.
４）で数回洗浄後、リポコルチン被覆に使用した緩衝液
中次のタンパク質：ウシ血清アルブミン、オボアルブミ
ン、ゼラチンの１％(w／w)溶液、ウシ胎児血清、および
０.１％ウサギＩｇＧおよびタンパク質を添加しない被
覆用緩衝液の０.１２５mlを各ウエルにピペットで添加
した。室温で３時間インキュベーション後ミクロ力価測
定板を実施例１に記述のように数回洗浄し乾燥した。バ
ックグラウンド・シグナルを実施例１に記述のように各
々の場合正常なドナーからのヒト血清のプールの１：１
０希釈液の０.１mlを使用して測定した。
【００４２】表１の結果はバックグラウンド・シグナル
がＩｇＧ型およびＩｇＭ型抗体の測定のいずれの場合に
おいても後の被覆のために選択した被覆用緩衝剤とタン
パク質の性質により極めて実質的に減少させ得ることを
示している。この実施例において、ウシ血清アルブミン
がＩｇＧ型抗体の測定およびウシ血清アルブミンとウシ
胎児血清がＩｇＭ測定に特に適していることが判明し
た。
がＩｇＧ型およびＩｇＭ型抗体の測定のいずれの場合に
おいても後の被覆のために選択した被覆用緩衝剤とタン
パク質の性質により極めて実質的に減少させ得ることを
示している。この実施例において、ウシ血清アルブミン
がＩｇＧ型抗体の測定およびウシ血清アルブミンとウシ
胎児血清がＩｇＭ測定に特に適していることが判明し
た。
【００４３】実施例３ 測定シグナルの板の被覆の間の抗原濃度への依存 ミクロ力価測定板を酢酸緩衝液（０.０１モル／リット
ル酢酸塩（ｐＨ５.５）、０.００５モル／リットルＣａ
Ｃｌ2）中で次の濃度：３９、７８、１５６、３１３、
６２５、１２５０、２５００および５０００μｇ／リッ
トルのＰＰ４とＰＰ４−Ｘで被覆した。後の被覆を抗原
被覆に使用したのと同じ酢酸緩衝液中１％ウシ血清アル
ブミン溶液を使用して実施例２に記述されたように実行
した。板を洗浄し乾燥した後、正常なドナーのプールか
らのヒト血清および病的血清をトリス緩衝液（ウシ血清
アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w／w)お
よびＮａＣｌ ０.４５モル／リットルを含む０.０５モ
ル／リットル トリス（ｐＨ７.４））で１：２０に希釈
した。ＩｇＧ抗体測定に使用した病的血清は関節症性乾
癬患者の血清であり、そしてＩｇＭ抗体測定用は多形滲
出性紅斑患者のものであった。結合した抗体を実施例１
に記述のように測定した。
ル酢酸塩（ｐＨ５.５）、０.００５モル／リットルＣａ
Ｃｌ2）中で次の濃度：３９、７８、１５６、３１３、
６２５、１２５０、２５００および５０００μｇ／リッ
トルのＰＰ４とＰＰ４−Ｘで被覆した。後の被覆を抗原
被覆に使用したのと同じ酢酸緩衝液中１％ウシ血清アル
ブミン溶液を使用して実施例２に記述されたように実行
した。板を洗浄し乾燥した後、正常なドナーのプールか
らのヒト血清および病的血清をトリス緩衝液（ウシ血清
アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w／w)お
よびＮａＣｌ ０.４５モル／リットルを含む０.０５モ
ル／リットル トリス（ｐＨ７.４））で１：２０に希釈
した。ＩｇＧ抗体測定に使用した病的血清は関節症性乾
癬患者の血清であり、そしてＩｇＭ抗体測定用は多形滲
出性紅斑患者のものであった。結合した抗体を実施例１
に記述のように測定した。
【００４４】表２に詳述する結果は測定シグナルの絶対
的大きさの如何にかかわらず最大の反応を被覆の間のリ
ポコルチン濃度を適当に選択することにより得ることが
できることを実証している。この実施例で選択した実験
条件下で、対照と病的試料のシグナルの飽和は２mg／リ
ットルより大きいリポコルチン濃度で達成された。
的大きさの如何にかかわらず最大の反応を被覆の間のリ
ポコルチン濃度を適当に選択することにより得ることが
できることを実証している。この実施例で選択した実験
条件下で、対照と病的試料のシグナルの飽和は２mg／リ
ットルより大きいリポコルチン濃度で達成された。
【００４５】実施例４ シグナル／バックグラウンド比への試料希釈に使用する
緩衝溶液の選択の影響 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４およびリポコルチンＩ／II混合
物で被覆し、次いで実施例２に記述のようにウシ血清ア
ルブミン溶液で被覆した。正常なドナーのプールからの
ヒト血清および全身紅斑性狼瘡の患者の血清をトリス緩
衝液（ウシ血清アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：
０.５％(w／w)およびＮａＣｌ ０.０４５モル／リット
ルを含む０.０５モル／リットル トリス（ｐＨ７.
４））および種々な濃度のＮａＣｌ（０.０４５、０.
１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６および０.８モ
ル／リットル）中で１：２０の比率で希釈した。ＩｇＧ
型の結合抗体を実施例１に記述のように測定した。
緩衝溶液の選択の影響 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４およびリポコルチンＩ／II混合
物で被覆し、次いで実施例２に記述のようにウシ血清ア
ルブミン溶液で被覆した。正常なドナーのプールからの
ヒト血清および全身紅斑性狼瘡の患者の血清をトリス緩
衝液（ウシ血清アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：
０.５％(w／w)およびＮａＣｌ ０.０４５モル／リット
ルを含む０.０５モル／リットル トリス（ｐＨ７.
４））および種々な濃度のＮａＣｌ（０.０４５、０.
１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６および０.８モ
ル／リットル）中で１：２０の比率で希釈した。ＩｇＧ
型の結合抗体を実施例１に記述のように測定した。
【００４６】表３に示す結果は試料希釈に使用する緩衝
溶液の組成（例えばＮａＣｌの添加）がバックグラウン
ド・シグナルの相当の減少につながり得るが、病的試料
のシグナルへの影響は少ないことを示している。これは
最適のシグナル／バックグラウンド比の達成を可能にす
る。この実施例においては最適値はＰＰ４に対するＩｇ
Ｇ型抗体の測定の場合約０.３モル／リットルの濃度の
ＮａＣｌの添加により達せられ、リポコルチンＩとリポ
コルチンIIの混合物の場合の最適値は約０.２モル／リ
ットルであった。従って、リポコルチンに対する抗体検
出のアッセイ系の最適化においては固相の被覆が重要で
あるのみならず、固相上における血清の希釈およびイン
キュベーション用の適当な緩衝液選択が重要な役割を果
たす。
溶液の組成（例えばＮａＣｌの添加）がバックグラウン
ド・シグナルの相当の減少につながり得るが、病的試料
のシグナルへの影響は少ないことを示している。これは
最適のシグナル／バックグラウンド比の達成を可能にす
る。この実施例においては最適値はＰＰ４に対するＩｇ
Ｇ型抗体の測定の場合約０.３モル／リットルの濃度の
ＮａＣｌの添加により達せられ、リポコルチンＩとリポ
コルチンIIの混合物の場合の最適値は約０.２モル／リ
ットルであった。従って、リポコルチンに対する抗体検
出のアッセイ系の最適化においては固相の被覆が重要で
あるのみならず、固相上における血清の希釈およびイン
キュベーション用の適当な緩衝液選択が重要な役割を果
たす。
【００４７】実施例５ 固相上におけるタンパク質への抗ヒト抗体−POD 複合体
の非特異的吸着の抑制 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４およびＰＰ４−Ｘで被覆し、次
いで実施例２に記述のようにウシ血清アルブミン溶液で
被覆した。正常なドナーのプールからのヒト血清および
全身紅斑性狼瘡患者の血清（抗ＰＰ４測定用）および黒
色腫のそれ（抗ＰＰ４−Ｘ測定用）をトリス緩衝液（ウ
シ血清アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w
／w)および０.９％ＮａＣｌを含む０.０５モル／リット
ル トリス（ｐＨ７.４））中で１：１０の比率で希釈し
た。実施例１に記述のＰＰ４とＰＰ４−Ｘに対する抗体
測定との違いは種々な濃度（０、０.０１、０.０２、
０.０３および０.０４％(w／w)）のモノクローナル抗体
（例えばBehringwerke社、整理番号ＮＴＩＤＹＯ ８０
／６３）を添加したトリス緩衝液（ウシ血清アルブミン
１％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w／w)およびＮａＣ
ｌ ０.０４５モル／リットルを含む０.０５モル／リッ
トル トリス（ｐＨ７.４））を抗ｈＩｇＧ−ＰＯＤと抗
ｈＩｇＭ−ＰＯＤ複合体濃縮物の希釈に使用したことで
ある。
の非特異的吸着の抑制 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４およびＰＰ４−Ｘで被覆し、次
いで実施例２に記述のようにウシ血清アルブミン溶液で
被覆した。正常なドナーのプールからのヒト血清および
全身紅斑性狼瘡患者の血清（抗ＰＰ４測定用）および黒
色腫のそれ（抗ＰＰ４−Ｘ測定用）をトリス緩衝液（ウ
シ血清アルブミン３％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w
／w)および０.９％ＮａＣｌを含む０.０５モル／リット
ル トリス（ｐＨ７.４））中で１：１０の比率で希釈し
た。実施例１に記述のＰＰ４とＰＰ４−Ｘに対する抗体
測定との違いは種々な濃度（０、０.０１、０.０２、
０.０３および０.０４％(w／w)）のモノクローナル抗体
（例えばBehringwerke社、整理番号ＮＴＩＤＹＯ ８０
／６３）を添加したトリス緩衝液（ウシ血清アルブミン
１％(w／w)、Tween ２０：０.５％(w／w)およびＮａＣ
ｌ ０.０４５モル／リットルを含む０.０５モル／リッ
トル トリス（ｐＨ７.４））を抗ｈＩｇＧ−ＰＯＤと抗
ｈＩｇＭ−ＰＯＤ複合体濃縮物の希釈に使用したことで
ある。
【００４８】表４の結果は正常血清のプールおよび病的
血清のシグナルはいずれもマウスＩｇＧ（例えばBehrin
gwerke社のモノクローナル抗体、整理番号ＮＴＩＤＹＯ
８０／６３）の添加量の増加により減少することを証
明している。２区（病的／正常）の間の比率は抗ＰＰ４
測定においてはほぼ同一に留まるが、一方ＰＰ４−Ｘに
ついては絶対値が増加しており、これはおそらく純粋に
この場合正常血清における低いシグナルから計算するこ
とによるのであろう。従って、この実施例は固相上の複
合抗体とタンパク質との非特異的相互作用を複合体希釈
用媒質の添加物の適当な選択により抑制し得ることを示
している。
血清のシグナルはいずれもマウスＩｇＧ（例えばBehrin
gwerke社のモノクローナル抗体、整理番号ＮＴＩＤＹＯ
８０／６３）の添加量の増加により減少することを証
明している。２区（病的／正常）の間の比率は抗ＰＰ４
測定においてはほぼ同一に留まるが、一方ＰＰ４−Ｘに
ついては絶対値が増加しており、これはおそらく純粋に
この場合正常血清における低いシグナルから計算するこ
とによるのであろう。従って、この実施例は固相上の複
合抗体とタンパク質との非特異的相互作用を複合体希釈
用媒質の添加物の適当な選択により抑制し得ることを示
している。
【００４９】実施例６ リウマチ様因子によって起こる誤った陽性のＩｇＭ測定
の抑制 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４−Ｘで被覆し、次いで実施例２
に記述のようにウシ血清アルブミン溶液で被覆した。Ｉ
ｇＧとＩｇＭ型の低力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ−）の抗Ｐ
Ｐ４−Ｘ抗体を持つヒト血清およびＩｇＧ型のみ高力価
（ＩｇＧ＋／−ＩｇＭ−）またはＩｇＭ型のみ高力価
（ＩｇＧ−／ＩｇＭ＋）のそれを実施例４に記述のよう
に試料緩衝液中で１：５の比率に予め希釈した。第一の
実験の取り組みにおいては、前もって希釈した血清をリ
ウマチ様因子を含む血清の等量と混合し、そして試料緩
衝液（例えばリウマチ様因子陽性対照ＢＷ １８６８３
C．No．１２；１２５ IU／ml；Behringwerke Marburg)
中で種々な濃度に希釈した（リウマチ様血清の最終濃度
１：１６０、１：８０、１：４０、１：２０、１：１０
および１：５）。ＰＰ４−Ｘに対する抗体の含有量は実
施例１に記述したように、０.１mlのこれらの混合物中
の試料で測定した。
の抑制 ミクロ力価測定板を実施例１に記述のようにｐＨ５.５
の酢酸緩衝液中でＰＰ４−Ｘで被覆し、次いで実施例２
に記述のようにウシ血清アルブミン溶液で被覆した。Ｉ
ｇＧとＩｇＭ型の低力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ−）の抗Ｐ
Ｐ４−Ｘ抗体を持つヒト血清およびＩｇＧ型のみ高力価
（ＩｇＧ＋／−ＩｇＭ−）またはＩｇＭ型のみ高力価
（ＩｇＧ−／ＩｇＭ＋）のそれを実施例４に記述のよう
に試料緩衝液中で１：５の比率に予め希釈した。第一の
実験の取り組みにおいては、前もって希釈した血清をリ
ウマチ様因子を含む血清の等量と混合し、そして試料緩
衝液（例えばリウマチ様因子陽性対照ＢＷ １８６８３
C．No．１２；１２５ IU／ml；Behringwerke Marburg)
中で種々な濃度に希釈した（リウマチ様血清の最終濃度
１：１６０、１：８０、１：４０、１：２０、１：１０
および１：５）。ＰＰ４−Ｘに対する抗体の含有量は実
施例１に記述したように、０.１mlのこれらの混合物中
の試料で測定した。
【００５０】表５に示すリウマチ様因子を含む血清にお
ける測定を補正した結果はＩｇＧ型の高力価の抗体を持
つヒト血清において、これらのＩｇＧ抗体に結合する
「リウマチ様因子」（＝抗ヒトＩｇＧ ＩｇＭ抗体）は
ＩｇＭ測定においても検出されることを示した。抗リポ
コルチンＩｇＧ抗体の力価が低い場合（「ＩｇＧ
−」）、ＩｇＭ測定は影響されず、そして抗リポコルチ
ンＩｇＭ抗体（「ＩｇＭ−」または「ＩｇＭ＋」）の力
価と無関係である。
ける測定を補正した結果はＩｇＧ型の高力価の抗体を持
つヒト血清において、これらのＩｇＧ抗体に結合する
「リウマチ様因子」（＝抗ヒトＩｇＧ ＩｇＭ抗体）は
ＩｇＭ測定においても検出されることを示した。抗リポ
コルチンＩｇＧ抗体の力価が低い場合（「ＩｇＧ
−」）、ＩｇＭ測定は影響されず、そして抗リポコルチ
ンＩｇＭ抗体（「ＩｇＭ−」または「ＩｇＭ＋」）の力
価と無関係である。
【００５１】第二の実験においては、リウマチ様因子に
より誤った高いＩｇＭ力価を示す「ＩｇＧ＋／ＩｇＭ
−」血清（表５参照）を上述のようにリウマチ様因子を
含む血清と混合した。「ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−」血清の最
終濃度は１：１０、そしてＲＦ血清のそれは１：２０で
あった。希釈は実施例４に記述の試料緩衝液を用いて実
行し、これをウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（例えばBehrin
gwerke社のRapitex試薬用Ambo-zeptor、No. 62 ＭＨ、
バッチ０８）のγ−グロブリン画分の溶液と種々な割合
で混合した。ＩｇＭ力価を上述のように測定した。
より誤った高いＩｇＭ力価を示す「ＩｇＧ＋／ＩｇＭ
−」血清（表５参照）を上述のようにリウマチ様因子を
含む血清と混合した。「ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−」血清の最
終濃度は１：１０、そしてＲＦ血清のそれは１：２０で
あった。希釈は実施例４に記述の試料緩衝液を用いて実
行し、これをウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（例えばBehrin
gwerke社のRapitex試薬用Ambo-zeptor、No. 62 ＭＨ、
バッチ０８）のγ−グロブリン画分の溶液と種々な割合
で混合した。ＩｇＭ力価を上述のように測定した。
【００５２】同じく表５に示す結果は、固相上でリウマ
チ様因子のＩｇＧへの結合による誤った高いＩｇＭの測
定は試料希釈に使用する媒質にγ−グロブリン画分の溶
液を添加することにより中和し得ることを示す。
チ様因子のＩｇＧへの結合による誤った高いＩｇＭの測
定は試料希釈に使用する媒質にγ−グロブリン画分の溶
液を添加することにより中和し得ることを示す。
【００５３】実施例７ 全リポコルチンで被覆した固相を使用する血清の選別 正常なドナーおよび自己免疫および／または炎症障害の
患者のヒト血清のパネルを実施例６に記述のように１：
１０の希釈でリポコルチンに対するＩｇＧとＩｇＭ型の
抗体を試験した。ミクロ力価測定板を実施例１に記述の
ようにＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、ｐ６８および
リポコルチンＩ／II混合物、並びに全リポコルチン混合
物で５mg／リットル（リポコルチンII：１.２５mg／リ
ットル）の濃度で被覆し、そしてその後実施例２に記述
のようにウシ血清アルブミンで被覆した。
患者のヒト血清のパネルを実施例６に記述のように１：
１０の希釈でリポコルチンに対するＩｇＧとＩｇＭ型の
抗体を試験した。ミクロ力価測定板を実施例１に記述の
ようにＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡＰIII、ｐ６８および
リポコルチンＩ／II混合物、並びに全リポコルチン混合
物で５mg／リットル（リポコルチンII：１.２５mg／リ
ットル）の濃度で被覆し、そしてその後実施例２に記述
のようにウシ血清アルブミンで被覆した。
【００５４】１１４人の正常な血液ドナーの血清中のＩ
ｇＧとＩｇＭ抗リポコルチン抗体の測定結果を表６に示
す。この表は対数的（ミリ吸光度による）に分けたクラ
スに属する測定値の頻度を示す。各分布の平均値と中央
値はよく一致するが、各被覆抗原により異なる。
ｇＧとＩｇＭ抗リポコルチン抗体の測定結果を表６に示
す。この表は対数的（ミリ吸光度による）に分けたクラ
スに属する測定値の頻度を示す。各分布の平均値と中央
値はよく一致するが、各被覆抗原により異なる。
【００５５】自己免疫および／または炎症障害の患者の
試料１２３の内、６９は上の各々の場合に測定した「正
常分布」の９０％間隔より上のＩｇＧまたはＩｇＭ型の
リポコルチンに対する抗体の力価を持つことを見出し
た。これらを以後「陽性」と称する。３８人の患者はＩ
ｇＧ型の抗体を作り、２５人の患者はＩｇＭ型のそれを
作り、これらは１つのリポコルチンとのみ反応した。特
異性はすべてのリポコルチンに分布していた（表７参
照）。これはすべてのリポコルチンと２つの抗体型に対
する包括的な選別によってのみ抗リポコルチン抗体によ
り引き起こされるリポコルチン機能の妨害を検出し得る
ことを示す。
試料１２３の内、６９は上の各々の場合に測定した「正
常分布」の９０％間隔より上のＩｇＧまたはＩｇＭ型の
リポコルチンに対する抗体の力価を持つことを見出し
た。これらを以後「陽性」と称する。３８人の患者はＩ
ｇＧ型の抗体を作り、２５人の患者はＩｇＭ型のそれを
作り、これらは１つのリポコルチンとのみ反応した。特
異性はすべてのリポコルチンに分布していた（表７参
照）。これはすべてのリポコルチンと２つの抗体型に対
する包括的な選別によってのみ抗リポコルチン抗体によ
り引き起こされるリポコルチン機能の妨害を検出し得る
ことを示す。
【００５６】４３の陽性の試料についても全リポコルチ
ンで被覆したミクロ力価測定板で試験した。これにより
ＩｇＧで１３／２０およびＩｇＭ抗体で７／１５の「陽
性率」であることが明らかになった（表７参照）。従っ
てこの実施例は全リポコルチンで被覆した固相が試料の
単一のリポコルチンおよび数種のリポコルチンに対する
ＩｇＧとＩｇＭの抗体の選別の一般的方法として適当で
あることを証明している。
ンで被覆したミクロ力価測定板で試験した。これにより
ＩｇＧで１３／２０およびＩｇＭ抗体で７／１５の「陽
性率」であることが明らかになった（表７参照）。従っ
てこの実施例は全リポコルチンで被覆した固相が試料の
単一のリポコルチンおよび数種のリポコルチンに対する
ＩｇＧとＩｇＭの抗体の選別の一般的方法として適当で
あることを証明している。
【００５７】表１：正常なドナーのヒト血清のプールに
おけるＩｇＧとＩｇＭ測定に対するリポコルチンＩ／II
で被覆したミクロ力価測定板の後の被覆の影響（実施例
２） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（Ｏ
Ａ）、ゼラチン(Ｇ)の１％溶液、ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、および０.１％ウサギＩｇＧ（ＲＩ）およびタン
パク質無添加の被覆用緩衝液(−)をｐＨ５.５、７.５お
よび９.５で後の被覆に使用した。血清は使用時緩衝液
で１：１０に希釈した。測定値はミリ吸光度で表す。Ａ
ｂ＝抗体のクラス
おけるＩｇＧとＩｇＭ測定に対するリポコルチンＩ／II
で被覆したミクロ力価測定板の後の被覆の影響（実施例
２） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（Ｏ
Ａ）、ゼラチン(Ｇ)の１％溶液、ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、および０.１％ウサギＩｇＧ（ＲＩ）およびタン
パク質無添加の被覆用緩衝液(−)をｐＨ５.５、７.５お
よび９.５で後の被覆に使用した。血清は使用時緩衝液
で１：１０に希釈した。測定値はミリ吸光度で表す。Ａ
ｂ＝抗体のクラス
【００５８】
【表１】
【００５９】表２：正常な血液ドナー(Ｎ)と自己免疫障
害の患者(Ｐ)の血清の抗ＰＰ４および抗ＰＰ４−ＸのＩ
ｇＧとＩｇＭ測定の被覆抗原の濃度への依存。測定値は
ミリ吸光度で表す（実施例３）。
害の患者(Ｐ)の血清の抗ＰＰ４および抗ＰＰ４−ＸのＩ
ｇＧとＩｇＭ測定の被覆抗原の濃度への依存。測定値は
ミリ吸光度で表す（実施例３）。
【００６０】
【表２】
【００６１】表３：正常なドナーの血清のプール（正常
血清）および全身紅斑性狼瘡患者の血清（病的血清）の
ＰＰ４およびリポコルチンＩ／II混合物（Ｌ Ｉ／II）
に対するＩｇＧ型抗体の測定に対する試料希釈用緩衝液
中のＮａＣｌの影響。測定値はミリ吸光度で表す（実施
例４）。
血清）および全身紅斑性狼瘡患者の血清（病的血清）の
ＰＰ４およびリポコルチンＩ／II混合物（Ｌ Ｉ／II）
に対するＩｇＧ型抗体の測定に対する試料希釈用緩衝液
中のＮａＣｌの影響。測定値はミリ吸光度で表す（実施
例４）。
【００６２】
【表３】
【００６３】表４：正常なドナーのヒト血清のプール
（正常血清）並びに全身紅斑性狼瘡患者（ＰＰ４）およ
び黒色腫患者（ＰＰ４−Ｘ）の血清（病的血清）のＰＰ
４とＰＰ４−Ｘに対するＩｇＧ抗体の測定に対する複合
体希釈用緩衝液中のモノクローナル抗体の影響。測定値
はミリ吸光度で表す（実施例５）。
（正常血清）並びに全身紅斑性狼瘡患者（ＰＰ４）およ
び黒色腫患者（ＰＰ４−Ｘ）の血清（病的血清）のＰＰ
４とＰＰ４−Ｘに対するＩｇＧ抗体の測定に対する複合
体希釈用緩衝液中のモノクローナル抗体の影響。測定値
はミリ吸光度で表す（実施例５）。
【００６４】
【表４】
【００６５】表５：リウマチ様因子により引き起こされ
る誤った陽性のＩｇＭ測定の抑制。ＩｇＧとＩｇＭ型の
低力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ−）の抗体ＰＰ４−Ｘ抗体お
よびＩｇＧ型のみ高力価（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）または
ＩｇＭ型のみ高力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ＋）のそれを持
つ血清および試料緩衝液をリウマチ様因子を含むヒト血
清（１２５ IU／ml）の種々な量と混合した。無添加の
ＩｇＧとＩｇＭ測定、リウマチ様因子血清添加後、およ
びリウマチ様因子による誤った陽性反応を持つ血清への
種々な量のウサギのγ−グロブリン溶液の添加の場合の
ＩｇＭ測定値を表示している。測定値はミリ吸光度で表
す（実施例６）。
る誤った陽性のＩｇＭ測定の抑制。ＩｇＧとＩｇＭ型の
低力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ−）の抗体ＰＰ４−Ｘ抗体お
よびＩｇＧ型のみ高力価（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）または
ＩｇＭ型のみ高力価（ＩｇＧ−／ＩｇＭ＋）のそれを持
つ血清および試料緩衝液をリウマチ様因子を含むヒト血
清（１２５ IU／ml）の種々な量と混合した。無添加の
ＩｇＧとＩｇＭ測定、リウマチ様因子血清添加後、およ
びリウマチ様因子による誤った陽性反応を持つ血清への
種々な量のウサギのγ−グロブリン溶液の添加の場合の
ＩｇＭ測定値を表示している。測定値はミリ吸光度で表
す（実施例６）。
【００６６】
【表５】
【００６７】表６：対数的（ミリ吸光度）に分けたクラ
スにおける正常なドナー（ｎ＝１１４）の血清のパネル
における単一のリポコルチンおよびリポコルチンの混合
物に対するＩｇＧとＩｇＭ型の抗体の力価の分布の統計
的分析（実施例７）。
スにおける正常なドナー（ｎ＝１１４）の血清のパネル
における単一のリポコルチンおよびリポコルチンの混合
物に対するＩｇＧとＩｇＭ型の抗体の力価の分布の統計
的分析（実施例７）。
【００６８】
【表６】
【００６９】表７：自己免疫および／または炎症障害の
患者の血清におけるリポコルチンに対するＩｇＧとＩｇ
Ｍ型の抗体の発生。陽性に分類した試料はその抗体力価
が正常なドナーにおける測定値の特定の分布の９０％間
隔の上にあるものとした（表６と７参照）。ＰＰ４−Ｌ
IIは全リポコルチン；Ｌ Ｉ／II＝リポコルチンＩとリ
ポコルチンIIの混合物で被覆したミクロ力価測定板にお
けるいくらかのこれら試料の研究の結果を示す（実施例
７）。 患者の総数：１２３ その内陽性の数（ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ型）：６
９ その内各々の場合における陽性の数：
患者の血清におけるリポコルチンに対するＩｇＧとＩｇ
Ｍ型の抗体の発生。陽性に分類した試料はその抗体力価
が正常なドナーにおける測定値の特定の分布の９０％間
隔の上にあるものとした（表６と７参照）。ＰＰ４−Ｌ
IIは全リポコルチン；Ｌ Ｉ／II＝リポコルチンＩとリ
ポコルチンIIの混合物で被覆したミクロ力価測定板にお
けるいくらかのこれら試料の研究の結果を示す（実施例
７）。 患者の総数：１２３ その内陽性の数（ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ型）：６
９ その内各々の場合における陽性の数：
【００７０】
【表７】
【図１】正常なドナーのヒトクエン酸塩添加血漿のプー
ルにおけるＩｇＧとＩｇＭ抗ＰＰ４抗体の測定に対する
ＰＰ４で被覆の間のｐＨとＣａ2+の添加の影響を示す
図。試料は緩衝系で１：５および１：２０に希釈した。
ルにおけるＩｇＧとＩｇＭ抗ＰＰ４抗体の測定に対する
ＰＰ４で被覆の間のｐＨとＣａ2+の添加の影響を示す
図。試料は緩衝系で１：５および１：２０に希釈した。
【図２】正常なドナーのヒト血清のプールにおけるＩｇ
ＧとＩｇＭ抗ＰＰ４抗体の測定に対するＰＰ４で被覆の
間のｐＨとＣａ2+の添加の影響を示す図。試料は緩衝系
で１：５、１：１０および１：２０に希釈した。
ＧとＩｇＭ抗ＰＰ４抗体の測定に対するＰＰ４で被覆の
間のｐＨとＣａ2+の添加の影響を示す図。試料は緩衝系
で１：５、１：１０および１：２０に希釈した。
フロントページの続き (56)参考文献 Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｅ ｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ 48 （1989）ｐ．843−850 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53
Claims (11)
- 【請求項１】 既知のリポコルチンＩ〜VIの混合物を固
相に結合させた生親和性結合パートナーとして使用する
ことからなるリポコルチンに対する抗体の測定のための
ヘテロジニアス・イムノアッセイ。 - 【請求項２】 少なくとも１つのヒト抗体クラスに対す
る抗体または抗体の混合物を標識付けした生親和性結合
パートナーとして使用する請求項１記載のイムノアッセ
イ。 - 【請求項３】 リポコルチンＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ、ＰＡ
ＰIII、リポコルチンＩおよびIIを固相上で生親和性結
合パートナーとして使用する請求項１記載のイムノアッ
セイ。 - 【請求項４】 固相上の結合パートナーがリポコルチン
系のタンパク質であって、前記リポコルチン系のタンパ
ク質はその中でこれらのタンパク質に対する抗体を測定
するべき体液が得られるのと同じ種に由来する請求項１
記載のイムノアッセイ。 - 【請求項５】 固相をリポコルチン系の１つまたは複数
のタンパク質で、ｐＨ５〜１０好ましくはｐＨ５〜７特
に好ましくはｐＨ５.５で被覆する請求項１記載のイム
ノアッセイ。 - 【請求項６】 固相をリポコルチン系のタンパク質で、
２価のカチオン特に好ましくはＣａＣｌ2を添加して被
覆する請求項５記載のイムノアッセイ。 - 【請求項７】 体液を、前記体液中で前記体液に含まれ
るリウマチ様因子の抗体への結合を妨げる試薬、好まし
くはこの場合ウサギ血清のγ−グロブリン画分特に好ま
しくは前もってヒツジ赤血球に対して免疫したウサギの
γ−グロブリンを含む緩衝媒質で希釈する請求項１記載
のイムノアッセイ。 - 【請求項８】 標識付けした結合パートナーが単一の免
疫グロブリンクラスまたは免疫グロブリンクラスの群を
指向する抗体である請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項９】 標識付けした結合パートナーがＩｇＧ、
ＩｇＭまたはＩｇＧとＩｇＭの重鎖を指向する抗体であ
る請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項１０】 標識付けが酵素好ましくはペルオキシ
ダーゼである請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項１１】 ｐＨ５〜１０で、適当な場合２価のカ
チオン例えばＣａ2+の存在下でリポコルチン系の単一の
タンパク質またはタンパク質の混合物で被覆を行うこと
からなるリポコルチンに対する抗体の測定のためのヘテ
ロジニアス・イムノアッセイ用固相の被覆方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE40403068 | 1990-12-17 | ||
| DE4040306A DE4040306A1 (de) | 1990-12-17 | 1990-12-17 | Verfahren zur bestimmung von antikoerpern gegen lipocortine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04301569A JPH04301569A (ja) | 1992-10-26 |
| JP3095275B2 true JP3095275B2 (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=6420553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03331638A Expired - Fee Related JP3095275B2 (ja) | 1990-12-17 | 1991-12-16 | リポコルチンに対する抗体の測定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5316915A (ja) |
| EP (1) | EP0491310B1 (ja) |
| JP (1) | JP3095275B2 (ja) |
| AT (1) | ATE144048T1 (ja) |
| AU (1) | AU667029B2 (ja) |
| CA (1) | CA2057693A1 (ja) |
| DE (2) | DE4040306A1 (ja) |
| ES (1) | ES2093066T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2745513C2 (ru) * | 2016-12-26 | 2021-03-25 | Акцо Нобель Коатингс Интернэшнл Б.В. | Система кроющей композиции, способ ее получения и ее применение |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653066B1 (en) | 1994-06-17 | 2003-11-25 | Trinity Biotech | Device and method for detecting polyvalent substances |
| US5658877A (en) * | 1995-05-18 | 1997-08-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method to treat endotoxin effects by administration of 33 kilodalton phospholipid binding protein |
| US6180596B1 (en) | 1995-05-18 | 2001-01-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods of inhibiting phospholipase A2 and phospholipase A2 stimulator activities |
| US5718697A (en) | 1995-12-14 | 1998-02-17 | Johnson & Johnson, Inc. | Liquid absorbent sphagnum moss article and method for manufacturing the absorbent article |
| US6645465B2 (en) * | 1999-08-06 | 2003-11-11 | Michigan, University Of The Regents | Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
| US7700307B2 (en) | 2003-03-08 | 2010-04-20 | Auvation Limited | Mitochondrial stress-70 protein markers for colorectal cancer |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4434227A (en) * | 1982-02-08 | 1984-02-28 | Abbott Laboratories | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
-
1990
- 1990-12-17 DE DE4040306A patent/DE4040306A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-12 US US07/805,648 patent/US5316915A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-14 DE DE59108263T patent/DE59108263D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-14 AT AT91121496T patent/ATE144048T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-14 EP EP91121496A patent/EP0491310B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-14 ES ES91121496T patent/ES2093066T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-16 AU AU89728/91A patent/AU667029B2/en not_active Ceased
- 1991-12-16 CA CA002057693A patent/CA2057693A1/en not_active Abandoned
- 1991-12-16 JP JP03331638A patent/JP3095275B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４８（１９８９）ｐ．８４３−８５０ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2745513C2 (ru) * | 2016-12-26 | 2021-03-25 | Акцо Нобель Коатингс Интернэшнл Б.В. | Система кроющей композиции, способ ее получения и ее применение |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2093066T3 (es) | 1996-12-16 |
| DE4040306A1 (de) | 1992-06-25 |
| AU667029B2 (en) | 1996-03-07 |
| EP0491310A3 (en) | 1992-10-28 |
| DE59108263D1 (de) | 1996-11-14 |
| CA2057693A1 (en) | 1992-06-18 |
| EP0491310A2 (de) | 1992-06-24 |
| US5316915A (en) | 1994-05-31 |
| JPH04301569A (ja) | 1992-10-26 |
| EP0491310B1 (de) | 1996-10-09 |
| AU8972891A (en) | 1992-06-18 |
| ATE144048T1 (de) | 1996-10-15 |
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