PT87810B

PT87810B - Processo para a determinacao imunometrica de substancias antigenicas

Info

Publication number: PT87810B
Application number: PT87810A
Authority: PT
Inventors: Peter Molz; Gerd Schnorr; Heinz Jurgen Skrzipezyk; Helmut Strecker; Guido Simons; Hans-Peter Harthus; Gotz Walter
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-06-25
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1992-10-30
Also published as: NO882806L; EP0296544A3; DE3720983A1; DK349288D0; AU620811B2; AU1836688A; DK349288A; NO882806D0; EP0296544A2; CA1304683C; FI883057A; PT87810A; FI883057A0; JPS6428560A

Description

O objectivo da invenção é um processo de determinação imunométrica no qual, para evitar valores não es pecíficos demasiado elevados ou demasiados baixos para o antigene a determinar, se adiciona ao anticorpo não marcado e/ou marca do em excesso uma substância (substância de supressão), a qual, devido à sua grande semelhança com os anticorpos reagentes utili zados e devido ao seu largo excesso, capta selectivamente a sub£ tância que interfere com os anticorpos evitando assim que esta interfira nos resultados dos testes.

Sabe-se que se utilizam cada vez em maior numero métodos imunomêtricos para a identificação qualitativa e quantitativa de antigenes. Estes métodos baseiam-se na

N.

formação de um complexo do antigene com um ou mais anticorpos, estando um dos parceiros marcado de modo a que possa ser identificado qualitativa ou quantitativamente por meio de métodos de detecção física ou química, fi assim possível verificar se e em que quantidade se formou um complexo entre o antigene e um ou mais dos anticorpos. Obtiveram-se melhoramentos decisivos do pro cesso de determinação imunomêtrica com a introdução de anticorpos monoclonais (Milstein e Kòhler, 1975), cuja utilização era testes imunamétricos se encontra detalhadamente descrita no registo de patente alemão 31 30 834.

Os métodos de determinação imunomêtrica podem dividir-se em dois tipos principais, conforme seja o antigene ou o anticorpo que estã marcado. O parceiro marcado uti liza-se sempre em excesso.

São particularmente interessantes J os processos imunomêtricos em que um dos anticorpos utilizados se encontra marcado. Nesse caso liga-se o antigene em sanduiche na forma de um complexo ternário e, apôs a incubação do anticorpo marcado não ligado, remove-se por decantação ou lavagem. Estas formas de concretização designam-se conforme o tipo de marca ção, como teste imunoradiometrico duplo (IRMA), teste imuno-enzi momêtrico (IEMA) ou teste imuno-queniluminomêtrico (ICMA). Em ge ral, o anticorpo não marcado encontra-se ligado a uma fase sólida.

Os testes sanduiche acima mencionados podem aplicar-se em várias variantes que se distinguem pelos passos da reacção que conduz â formação do complexo ternário, Pode-se, num processo de um só passo, adicionar simultaneamente o antigene, o anticorpo marcado e o anticorpo não marcado, ou proceder-se sequencialmente fazendo reagir em primeiro lugar o antigene com o anticorpo não marcado e, apôs um tempo de incubação suficiente, fazer-se reagir então com o anticorpo marcado. Finalmente, podem efectuar-se também estes passos da reacção na ordem inversa.

Os testes sanduiche que se baseian na utilização de anticorpos marcados têm vantagens analíticas de cisivas em relação aos testes efectuados utilizando antigenes marcados:

É possível utilizar os anticorpos em excesso e, por meio do aumento da sua concentração, deslocar o equilíbrio no sentido da formação do complexo ternário. Podem assim ligar-se também peque nas quantidades de antigene e acoplarem-se à marcação. Uma vez que, além disso, o sinal emitido pela marcação é directamente proporcional à concentração de antigene e a curva sinal-dose tem um declive elevado, podem ainda identificar-se claramente os sinais fracos causados pelas baixas concentrações de antigene. Por estas razões, os testes sanduíche efectuados com anticorpos marcados são nitidamente mais sensíveis que os testes baseados na utilização de antigenes marcados.

Finalmente, uma outra vantagem dos testes sanduiche que utilizam anticorpos marcados é a gama de medição dinâmica consideravelmente superior, isto é, existe uma mais larga gama na qual uma alteração da concentração do antigene modifica ainda sensivelmente a intensidade do sinal emitido pelo complexo ternário. Além disso, é ainda significativo no emprego de rotina de métodos de determinação imunométrica comerciais gue possibilitem tempos de incubação tão pequenos quanto pos sível. Consegue-se isso quando se podem utilizar concentrações de reagente mais elevadas, como é o caso do emprego de anticorpos marcados em testes sanduiche.

Ambos os tipos de teste (os com anticorpos marcados e os com antigenes marcados) podem ser perturbados por componentes do soro que influenciam a reacção primária antigene-anticorpo e/ou a reacção de separação. Por reacção de separação entende-se neste caso a separação do traçador ligado e livre. Podem desse modo obter-se valores errados por excesso ou por defeito conforme o tipo da perturbação e o fundamento do tes te. As separações que se baseiam em reacções de precipitação não específicas, como por exemplo a precipitação de IgG por meio de álcoois como o polietilenoglicol (PEG), possuem naturalmente um maior grau de robustez em relação a perturbações imunolõgicas, mas conduzem por outro lado frequentemente a previsões analítico/diagnõsticas inseguras, devido aos seus componentes NSB(ligados não especificamente) variáveis (desclassificação do marcador

livre). As técnicas de separação de anticorpos duplas que se dis tinguem por NSB baixos e precisos são perturbadas por anticorpos naturais do organismo, para os quais se dirigem os anticorpos primários (a ligar aos antigenes), de modo que o anticorpo separado não pode voltar a atacar o complexo antigene-anticorpo. Como consequência disto resulta uma sobrestimação do teor de antigenes na amostra do paciente em testes competitivos (A. Sain et al. 71, 540 (1979)).

Varificaram-se frequentemente inter ferências na reacção primária antigene-anticorpo devido ao apare cimento de auto-anticorpos contra os utilizados na análise. Em RIAs de anticorpo duplo este efeito conduz a um resultado errado por excesso, enquanto que nos testes PEG se obtêm valores errados por defeito. Uma preparação da amostra efectuada por pré-pre cipitação com PEG evita este tipo de interferência.

Nos testes sanduiche verificaramí-se também interferências nos primeiros tempos, que se manifesta ram por valores demasiado elevados medidos nos soros NSB dos pacientes. A causa provável terá sido a presença de anticorpos con tra os reagentes do teste (R.J. Thompson et al., Clin. Chem. 32, 476 (1986) (Pig. 1 e 2).

Esta situação encontra-se represen'tada na Figura 1 segundo o modo de representação habitualmente !usado na literatura de anticorpos. Um anticorpo ligado à fase só lida (1) liga-se por meio de uma ligação não específica (NSB), por exemplo por meio de uma substância interferente (3) , ao epítopo (5) de um anticorpo marcado (2).

Na Figura 2 encontra-se representado num diagrama o modo como estas ligações não específicas (NSB) se adicionam âs ligações específicas (SB) entre os anticorpos li gados à fase sólida (1), o antigene ou a substância a analisar (4) e o anticorpo marcado (2), conduzindo assim erradamente a concentrações analíticas demasiado elevadas e muitas vezes patológicas.

Uma vez que as substâncias interferentes são anticorpos específicos da espécie, não podem ligar-se por meio do IgG (como no caso dos factores reumáticos) tendo de usar-se gamaglobulina de suporte específica da espécie em causa.

De acordo com o estado actual da técnica, adiciona-se soro não específico de rato ou de ratazana aos testes em que se utilizam anticorpos monoclonais de rato (EP -A 0 174 026 ou RIA-gnost ^hCG, Behring-Werke, Marburg, desde 1.9.1984). Apesar destas medidas, contudo, aparecem sempre soros nos quais se encontram valores errados por excesso devido ao alto teor em IgG anti-rato. Se se tratarem posteriormente estas amostras individualmente por meio de adição de uma maior quantida de de soro de rato ou de ratazana, verifica-se em geral uma diini nuição do valor inicial. As grandes quantidades para tal necessã rias impedem a sua aplicação no teste como medida profilática uma vez que é de esperar que influenciem o teste.

De acordo com a invenção podem ultrapassar-se os inconvenientes acima descritos, utilizando como substância de suporte (de supressão (6) uma proteína que seja imunologicamente muito semelhante aos IgGs usados no teste e que₍no caso ideal, se afaste destes apenas na estrutura de ligação do antigene (7) não se ligando assim ãs substâncias a analisar (Fig. 3). Estas substâncias podem misturar-se em grande excesso com os anticorpos reagentes marcados sem influenciar a reacção analítica.

Uma condição necessária para tal ê a existência de uma indiferença imunológica em relação a todos os restantes componentes do soro. O não preenchimento desta condição poderia conduzir â formação de uma rede ba amostra de soro e reduzir o efeito supressor da substância. Além disso não se po deria excluir a influência sobre a cinética e a posição de equilíbrio da reacção analítica.

O objectivo da invenção 5 por isso um processo de determinação imunomêtrico para uma substância antigênica que apresente pelo menos duas posições de ligação de an ticorpos, no qual se procede â incubação de uma amostra líquida contendo a substância antigénica (a) com um anticorpo (b) imobilizado numa fase sólida, não marcado, específico para (a) e com um outro anticorpo (c) marcado, específico para (a), sequencialmente ou num só passo, formando-se um complexo ternário de (a), (b) e (c), ligado à fase sólida, que emite um sinal identificável correspondente à quantidade de (a), caracterizado por no pro

cesso sequencial no primeiro e/ou no segundo passo de incubação, ou no processo de um passo único, se adicionar â mistura reaccio nal uma proteína que seja imunologicamente análoga aos anticorpos utilizados e que tenha a possibilidade de se ligar a componentes presentes no soro do paciente, que poderiam dar origem a ligações indesejadas com os reagentes do teste, excluindo assim a possibilidade de uma influência negativa sobre o teste.

De preferência, trata-se no caso das proteínas utilizadas, de um ou mais anticorpos diferentes, era especial da mesma espécie (espécie animal) dos anticorpos rea gentes utilizados. Preferem-se particularmente os anticorpos monoclonais e muito em especial os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos. Por proteína entende-se, no que se referiu anteriormente e no que se segue, um composto orgânico macromolecular, constituído por unidades de aminoácido, que possua propriedades antigénicas.

Por anticorpos anti-idiotípicos entendem-se aqueles que são dirigidos contra a região idiotípica do anticorpo que originou a sua formação.

De preferência, na preparação das substâncias de supressão de acordo com a invenção, parte-se dos anticorpos reagentes utilizados e modificam-se estes de modo que eles mantenham ainda a sua especificidade em relação â substância interferente, mas que jã não reajam, ou pelo menos reagem me_ nos, com o antigene a analisar. Devido ao elevado excesso em que é conveniente adicionar estas substâncias de supressão no teste imunamétrico, de entre as duas reacções concorrentes - anticorpo reagente + substância interferente e substância de supressão + substância interferente - prefere-se francamente a última, de mo do a remover mais ou menos quantitativamente as substâncias interferentes do equilíbrio reaccional.

Para a preparação destas substâncias de supressão existem as seguintes possibilidades, partindo dos anticorpos reagentes:

a) Cisão selectiva das estruturas de ligação ao antigene do anti corpo reagente utilizado

b) Blocagem das estruturas de ligação ao antigene do anticorpo reagente utilizado por meio de uma estrutura antigénica com-

plementar

c) Modificação da estrutura de ligação ao antigene do anticorpo reagente utilizado por meio de ataque externo por exemplo por mutação na estrutura celular fc) Preparação de anticorpos anti-idiotlpicos (vide registo de pa tente US 4 536 479), que pertencem ã mesma subclasse IgG do anticorpo reagente.

De acordo com a variante a), segundo processos conhecidos da literatura, podem cindir-se anticorpos por exemplo por meio de enzimas. É assim possível cindir fracj mentos individuais tanto a partir das cadeias ligeiras como a partir das cadeias pesadas. Sabe-se que as estruturas de ligação aos antigenes se encontram nos extremos N-terminais das cadeias de polipéptido, de modo que com a respectiva cisão se perdem qua se completamente os componentes do antigene capazes de reconhecer o epltopo.

Ê igualmente possível separar^- as duas partes Fab da parte Fc. No caso dos epltopos, que são reconhecidos pela substância interferente, se encontrarem por exemplo na parte Fc do anticorpo teste, a parte Fc pura deste anticorpo serã um meio de supressão ideal, uma vez que jã reage com a substância interferente, devido a não estarem presentes as partes Fab, mas não com o antigene (analito).

A blocagem das estruturas de ligação ao antigene do anticorpo reagente utilizado, por meio de uma estrutura antigénica complementar, de acordo com a variante b), pode efectuar-se em geral com qualquer substância que seja dirigida contra a região idiotlpica do anticorpo reagente e cuja afjL nidade de ligação seja suficientemente grande, por exemplo cora um anticorpo anti-idiotlpico.

A modificação por mutação na cultura celular, de acordo com a variante c), pode efectuar-se por exemplo do seguinte modo:

Como culturas celulares isolam-se mutantes somáticos de anticorpos monoclonais e testa-se em segui da o efeito destas mutações em relação à função de anticorpo. 0 isolamento de tais mutantes com estrutura Ig modificada ê possível devido â instabilidade do gene Ig em células de hibridoma

cultivadas (Morrison et al., CRC Crit. Rev. Immunol, 3: 1-22, j 1981). Conhecem-se 3 tipos de mutantes estruturais com significa do especial para a tecnologia dos hibridomas: (1) classes e sub-i classes de variantes switch (Cebra et al., Ann. Rev. Immunol.,i 2: 493-548, 1984; Subblitzky et al., Immunol. Rev., 67: 59-72, s 1982; Shimizu et al., Cell, 36: 801-803, 1984; Tilley et al.); !

(2) Mutações de delecção ou mutações pontuais na região constante com modificação da função efectora (Yelton et al., J. Exp. Med., 156: 1131-1148, 1982; Kenter et al., Science, 206: 1307-1309, 1979; Teillaud et al., J. Immunol., 1984 no prelo); e (3) Mutantes com propriedades de ligação ao anticorpo modificadas (Dildrop et al., EMBO J., 1: 635-640, 1982; Cook et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5687-5691, 1977). Estas mutações, que conduzem em ultima análise à perda completa da capacidade de for marem ligações especificas com antigene, ocorrem cora frequência espontaneamente em alguns clonos e resultam da substituição de aminoácidos individuais na cadeia pesada da região V (Rudikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 79: 197-1983, 1982).

Para aplicação como meio de supressão prefere-se a variante 3. A escolha dos mutantes mais apropri ados requer simplesmente alguns testes esclarecedores, nos quais se verifica

1. se as propriedades de ligação ao antigene ainda estão presentes e

2. se a substância interferente ainda ê capaz de reconhecer os seus epltopes no mutante e se liga a ele.

De acordo com a variante d) podem preparar-se anticorpos anti-idiotípicos por meio de imunização com um anticorpo monoclonal - dirigido contra um antigene não analítico. Estas substâncias apresentam homologia epitõpica em relação âs regiões constantes do anticorpo reagente e correspondem â exigência de não reagirem com os restantes componentes do soro.

As substâncias de supressão prepara das de acordo com as variantes a - d podem aplicar-se em métodos de determinação Imunoraêtrica com o objectivo de captar selectiva mente as espécies interferentes (por exemplo, anticorpos entre outros). Podem aplicar-se em testes imunolõgicos para a determir»

nação das mais variadas substâncias antigénicas, por exemplo para a hormona estimulante da tiroideia humana (hTSLI) ou para as proteínas oncofetais como a alfa-fetoproteína (AFP), a corionogo nadotropina (hCG) ou o antigene cercinoembrional (CEA). fi particularmente vantajosa a aplicação em analitos (antigenes) que ocorrem em concentrações baixas ou que não aparecem praticamente em pessoas saudáveis e nos quais mesmo pequenas concentrações jã indicam um estado patológico. Nestes casos, mesmo os pequenos au mentos de concentração devidos a interferências indicariam jã um estado patológico.

O novo processo de determinação imu nolêtrica de acordo com a invenção ê reprodutível, tecnicamente simples, rápido e eficiente. Pode aplicar-se num grande número de testes - sanduiche comerciais.

As substâncias supressoras com as propriedades anteriormente descritas podem também utilizar-se posteriormente em conjuntos-teste comerciais.

Podem para isso adicionar-se convenientemente aos testes usuais era concentrações de pelo menos 10 vezes, de preferência 50 vezes e muito em especial 80 vezes e quando muito de 1000 vezes, de preferência 500 bezes e muito em [especial 120 vezes a concentração de anticorpos reagentes.

Os testes comerciais são de preferência aqueles nos quais o anticorpo policlonal ou de preferência monoclonal, ligado â fase sólida, não estã marcado. Este anticorpo liga-se de preferência de forma adsorptiva ou covalente â fase sólida, sendo de preferência esta fase sólida constituída por um tubo de plástico, por uma placa de microtitulação, por partículas de plástico como esferas de plástico ou exturdidos de í plástico ou ainda por esferas de plástico microscópicas em suspensão, por exemplo, num líquido.

Os anticorpos marcados são também anticorpos policlonais ou, de preferência, monoclonais. A marcação efectua-se de acordo com processos conhecidos da literatura, por meio de um isótopo reactivo, de um enzima ou de um grupo fluorescente ou quemiluminescente.

A invenção esclarece-se mais detalhadamente por meio dos exemplos seguintes.

O

EXEMPLO 1

ΉΛ ’“***··-’« ’· ·Λ?^Η.«3'ΛΗ,_η, u^àb ·_Μ 4^0 u íi <_r >.. 4 -7| _t'3

Preparação de mutantes somáticos de anticorpos monoclonais

Reclonaram-se em placas de microtitulação clonos de células de hibridoma, que produzem anticorpos de especificidade específica, por meio de um manipulador de célu la única ou do processo de diluição liroitante. As camadas sobrenadantes de cultura dos orifícios, com crescimento celular positivo, testaram-se então em primeiro lugar em relação ao seu teor Ig e finalmente em relação âs suas propriedades de ligação ao an tigene. No caso de uma razão de clonagem suficientemente elevada, obtiveram-se clonos celulares que se distinguiram por uma elevada produção de moléculas Ig acompanha de uma insuficiência de li gação ao antigene.

ί EXEMPLO 2

Preparação de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos j Para a preparação de anticorpos monoclonais anti-idiotlpicos utilizou-se um anticorpo monoclonal como antigene de imunização. Neste caso utilizou-se um anticorpo imonoclonal, de origem singénlca, dirigido contra o antigene carcinoembrional (CEA), que se aplicou como anticorpo inteiro a ratos BALB/c fêmeas de 6-8 semanas de idade. Para tal injectaramI-se por rato cerca de 10 pg de anticorpo inteiro, emulsionado em adjuvante de Freund completo, por via subcutânea e, num segundo caso, por via intraperitoneal. Quatro ou oito semanas mais tarde efectuou-se uma segunda e uma terceira imunização. Imediatamente antes da própria fusão injectaram-se ainda os animais durante 4 dias consecutivos por via intravenosa. No dia da fusão retiraram -se os baços em meio estéril e suspenderam-se até se obterem cér» lulas isoladas. Por meio de fusão de 10° células de baço com 2 x x 10 células de uma linha celular de mielomas (SP2/o), prepararam-se células híbridas que se semearam em seguida num meio de selecção (DMEM (Dulbecco's minimal essential Médium) + 20% de • FKS (soro de vitela fetal); 0,1 mM hlpoxantina; 0,4 mM aminopte. rina; 16 mM timidlna) em placas de 24 orifícios (Costar), numa

oncentração de IO** células/orifleio. Duas a três semanas mais terde isolaram-se dos orifícios colónias celulares individuais e colocaram-se nos orifícios de uma nova placa de cultura (24-orifícios, Coster). Apôs mais dois a três dias testaram-se estas ca madas sobrenadantes de cultura num teste enzimoimune, utilizando o anticorpo de imunização conjugado com peroxidase (POD), em relação à presença de anticorpos anti-idiotípicos e testaram-se essas camadas de novo num outro teste enzimoimune em relação à sua inibição antigênica. Seleccionarara-se os híbridos promotores de anticorpos anti-idiotípicos iniblveis por antigenes e clonaram-se por meio de um manipolador de célula única.

EXEMPLO 3

De modo análogo ao do Exemplo 2 pre pararam-se anticorpos anti-idiotípicos, utilizando-se para a imu nização em vez do anticorpo inteiro o fragmento Fab* do anticorpo dirigido contra CEA, acoplado a BSA.

EXEMPLO 4

De modo análogo ao do Exemplo 2 pre pararam-se anticorpos anti-idiotípicos, utilizando-se para a imu nização em vez do anticorpo inteiro o fragmento Fab’ do anticorpo dirigido contra CEA, acoplado a KLK.

Para a identificação das propriedades de supressão das substâncias de acordo com a invenção efectur aram-se os seguintes ensaios comparativos:

EXEMPLO 5

A afinidade de ligação de substâncias interferentes (Fig.4: IgG anti-rato de cabra; Fig. 5: IgG anti-rato de coelho) aos anticorpos reagentes utilizados - expressa em % de ligação (100% de ligação -100% de anticorpo reagente ligado â substância interferente) - determinou-se à quanti

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dade constante de meio de supressão em função da quantidade de substância interferente adicionada. Utilizou-se o conjunto -tes te RIA-gnost(R) hTSH (Behringwerke, Marburg). Como meios de supressão comparativos utilizaram-se os seguintes:

Curva N9 (nas Figs. IV e V)

Múltiplos*

Soro de rato	1	4300	4300
IgG de rato	2	100	100
Substância de acordo com a
invenção (do Ex. 2)	3	100	100
* Calculado em relação ao	traçador	IgG específico utilizado

Para comparaçao apresentam-se nas Figuras IV e V mais duas curvas que descrevem, por um lado (curva no 4), o conjunto teste RIA-gnost hTSH na altura disponível no mercado (contêm 4400 vezes IgG de supressão não específico, em relação ao traçador IgG utilizado), e por outro, um conjunto teste RIA gnost isento de qualquer meio de supressão (curva n<?. 5, múltiplo = 0; padrão).

A ligação (em %) ao anticorpo reagente aumenta com o aumento da concentração da substância interferente (utilizou-se IgG anti-rato de cabra (Fig. IV) e IgG anti -rato de coelho (Fig. V)). Efectuou-se a simulação do analito. Utilizando as substâncias de acordo com a invenção, do Exemplo 2 o aumento das ligações não específicas ê mínimo (curva n9. 3 nas Figs. IV e V).

EXEMPLO 6

Calculou-se a ligação percentual do anticorpo reagente a uma substância interferente, cuja concentra ção (título) era constante, em função de quantidades variáveis de meio de supressão. Como substâncias interferentes utilizaram-se as seguintes:

IgG anti-rato de cabra IgG anti-rato de coelho

Soro do Paciente A Soro do paciente B rativas utilizaram-se as

Como substâncias de supressão compa seguintes:

Curva n9. na Fig. VI a IX

IgG de ratazana 6 Soro de rato 7 IgG de rato 8 Substância de acordo com a invenção (do Ex. 2) 9

Claims

Processo para a determinação imunomêtrica de uma substância antigênica que apresente pelo menos duas posições de ligação de anticorpos, no qual se incuba sequen cialmente ou num só passo uma amostra líquida contendo a substân cia antigênica (a) com um anticorpo (b) específico para (a), não marcado e imobilizado sobre uma fase sólida e com um outro anticorpo (c) específico para (a), marcado, formando-se um complexo ternário de (a), (b) e (c) ligado à fase sólida, que emite um si nal identificável correspondente à quantidade de (a), caracterizado por, no processo sequencial, no primeiro e/ou no segundo passo de incubação, ou no processo de um sÕ passo, se adicionar â mistura reaccional proteína que seja imunológicamente relacionada com os anticorpos empregados.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por no que respeita à proteína se tratar de um ou mais anticorpos diferentes.

Processo de acordo com a reivindica ção 2, caracterizado por o anticorpo ou anticorpos referidos serem anticorpos da mesma espécie que os anticorpos do reagente.

Λ

- 4- Processo de acordo com a reivindica ção 3, caracterizado por se utilizar um anticorpo monoclonal ou vários anticorpos monoclonais.

- 5- Processo de acordo com a reivindica ção 4, caracterizado por o anticorpo ou anticorpos monoclonais serem anticorpos monoclonais anti-idiotípicos.

- 6- Processo de acordo com a reivindica ção 3, caracterizado por o anticorpo ou anticorpos monoclonais concordarem com os anticorpos do reagente até ã posição de ligação do antigene.

- 7* Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por se bloquear imunolõgicamente as posições de ligação dos anticorpos do reagente.

Processo de acordo com a reivindica ção 7, caracterizado por se utilizar para o bloqueamento um anti ^_J^a»«RíaíB’®SS^^::il®^^^^^<4^^i,“^ES'^2:——μ··*⁵' corpo monoclonal anti-idiotípico.

-9-Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por se eliminarem as posições de ligação do antigene dos anticorpos do reagente por mutação em culturas celu lares e por se trocarem estes anticorpos por meio de um Screening adequado.

- 10- Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por se modificarem por via química ou se re moverem de modo selectivo as posições de ligação de antigene dos anticorpos do reagente.

- 11- Processo de acordo com a reivindica ção 2, caracterizado por o anticorpo ou os anticorpos adicionados se empregarem pelo menos num excesso de dez vezes em relação aos anticorpos do reagente.

- 12- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o anticorpo (b), marcado e imobilizado sobre a fase sólida, ser um anticorpo monoclonal ou policio nal.

ção 12, caracterizado por o anticorpo (b) não marcado se encontrar ligado à fase sólida de modo adsorvido ou covalente.

- 14- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por a fase sólida ser constituída por um tu bo de plástico, por microplacas, esferas ou espiras de plástico, ou por esferas microscópicas de plástico, em suspensão num líqui do,

- 15- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o anticorpo marcado (c) ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, contendo como indicador um isótopo radioactivo, um enzima ou um grupo fluorescente ou quimiluminescente.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se determinar como substância antigénica a hormona estimulante do tiróide humana (hTSM), ou as proteínas oncofetais olfafetoproteína e h-coriongonadotrofina, ou o an tigene carcinoembrional.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã, em 25 de Junho de 1987, sob o n9. P 37 20 983.3.