JPS59155762A - フイ−ルドイムノアツセイ反応システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、体内物質中の抗原の診断に用いるフィール
Ｙイムノアッセイに関するものである。

ヤロウおよびバーソン（ネイチュア第１８４巻第１６４
８頁、１９５９年）により最初に報告されたラジオイム
ノアッセイ（以下、ＲＩＡと略することもある）、並び
にエングバルおよびパール３− マン、（イムノケミストリー第８巻ｍ　’ｔＥ　’７１
　頁、１（］−年）、Ｉ；よびパン・ライ−マンおよび
シュールス（＋＝”ＥＩ３Ｓレターズ′第１５巻第２３
２頁、１り７１年）により最初に報告されたＩ”：ＬＩ
ＳＡ技術を含むエンザイムイムノアッセイ（以下、１・
ニド〜と略すこともある）のような高感度の定喰的技術
の導入以来、イムノアッセイは、ひとの診断用薬および
獣医用薬に革命をもたらした。１、−れらのアンセイ体
系は、何れも抗原／抗体反応の精巧な特異ｆ１゛に依存
している。＋　９５９年に競争的ＩＲＴＡか出現して以
来、多数の異なるタイプのＲＴノルが開発され、ヘテロ
ノニアスト：ＩＡのＪ、ｔ：ｗ：をなす原理か１ｔｌＡ
のそれと同一・であるため、既存のＲＩｌ＼に類似した
ＥＴＡか゛考案され、これらは競目的アッセイ、イム／
メトリックアッセイ　２サイト・イム／メトリックアッ
セイ、サンドイッチアッセイ、および２抗体イム７メト
リツクアツセイを包含する。

ＥＴＡおよびＲＴノ＼は、何れも適１１４な溶液中の抗
体（以下、Ａｌｌと略すこともある）または抗原（以４
− 下、Ａｇと略すこともある）の何れを検出するようにも
設計することができる。以下に述べる発明は、−１−記
態様中の一方、すなわち適当な溶液中でのへ８検出のみ
に関するものである。

一般的には、イムノアッセイ体系による適当な流体中の
Ａｇの検出は、ＡＩ）とＡｇの特異的相互反応によるＡ
ＩＤ／Ａｇ錯体の生成に依存し、これは遊離ＡＩ〕およ
びＡｇから分離してＡｂ／Ａｇ錯体の検出と定量を可能
にすることを必要とする。

これら錯体の検出は種々のイムノアッセイ技法により達
成でトるが、多くの方法では先行段階として（ａ）Ａｇ
または（１＋）Ａｂの何れか一方に結合する適当なラベ
ルを含んでいる。

ラベルしたＡ８を用いるイムノアッセイでは、これは溶
液中でも適当な固相を用いてもなし得るが、これらのア
ッセイはすべて共通する１つの問題、すなわち高度に精
製した「トレーサー純度」の抗原の製造という問題をか
かえている。このような抗原の製造は、しばしば高価に
つき、かつ困難で、ある場合にはこれら両要因が結合し
て商業的使用・を目的とするラベルノ＼ｇ法の開発を不
可能にすることさえある。

ラベルしたＡ　ｂを用いるイム７アツセイについては、
このタイプのアッセイは通常ＡｇまたはＡ）〕と結合し
た適当な同相を用いて行なわれる。しかし、あらゆる入
手可能なアンセイ体系の組合せ中で、問題のある精製Ａ
ｇ製造の必要性を除外し得るのは［２サイトアツセイ１
のみである。

「２サイトアツセイ」は、同時に２個のＡ１１分子に結
合し得るＡｇに対してのみ実施可能である。

このアッセイでは、特異的Ａ　Ｉ〕を適当な固相に結合
し、Ａｇを含む溶液を、Ａ８の「捕獲−１可能な感受性
面とインキュベートする。過剰の流体を洗去し、第２の
ラベルＡｇ特異性Ａ　１１からなる結合体（ｃｏｎ　ｊ
ｕｇａｔｅ）を加え、このラベルＡＩ＋は固相」二に捕
獲されたＡｇを［標識Ｊ（ｔａｇ）する能力を有する。

「２サイトアツセイ」の利点は多数存在する。すなわち
、 （１）精製した抗原を必要としない。

（ｉ；）実験動物に対して免疫原性を有する、または免
疫原性にで外る任意の物質について使用できる。

（ｉｉｉ）水溶液として提供で儲る任意の免疫原性物質
について使用できる。

（ｉｖ）適当なｌ＼１）を用いると、Ａｇ溶液と［−標
識払１〕を同時に固相［捕獲Ａ］〕］に加えることかで
゛き、したがって極めて短時間で実施できる筒１修なア
ッセイ体系を提供する。

「２サイトアツセイ４体系の重大な制限条件は適当な「
捕獲」および「標識−Ｉ　Ａ　Ｉ〕を充分な量だけ製造
することであり、これは弱い免疫原である所のある種の
ＡｇまたはＡＦ！決定基に関して特にいえることである
。これは商業的アッセイにおいて極めて重要であり、最
近になって、バイブ１月ε−マ技術を用いることにより
ようやく取組まれ、［２サイトアッセイ−１の草大な能
力を充分利用することが可能になった。ハイブリドーマ
技術は、無類の抗原特異性と抗原決定基特異性を有する
「捕獲」およｒ、ｌ′［標識−１モノクロ一ナル抗体（
以下、Ｍａｂと略すことがある）をほとんど無制限の量
だけ生産す７− ることを可能にした。バイブリド−７技術によってもた
らされる要点は、被検Ａｇにのみ存在し池の分子には存
在しない特有の抗原決定基に結合するし捕ｌＩＭａｈと
して特異的に使用できるへ４ａｂの生産に存する。こう
して、従来製造された類１１スの抗原決定基を右する分
子と２差反応をもたらすボリクａ−ナル抗血清（以下、
ＰＡＩ）と略すことかある）で・は、ノへｇ決定基特異
性がないため、従来不可能で・あったＭａｌ＋　ｒ捕獲
」［標識１アツセイか、午や構成可能となった。

種々のタイプの同相表面が２サイトイムノアツセイに関
して用いられたが、その中には上端が開放された試験管
があり、抗体は試験管の底面トに置かれる。しカル、試
験管をこのような方法で用いると、被Ｍされるべき表面
域力伏きなため、過剰量の捕獲Ａ　ｂの使用をもたらす
という問題があった。また、試、！＋管の被覆部からの
非結合材料の洗い出しについても問題があった。これに
関係するのは、バンクグラウンドシグナルが高すぎて効
率的かつ正確な結果の解釈に問題を生ずる場合のシ８− グナル増幅過程における検出である。

プラスチックビーズまたはセファロースビーズも用いら
れるが、このようなビーズにおける大外な問題は、非結
合材料の除去に遠心分離を必要としこれは時間がかかり
、多数の試料を処理する場合非能率的である。

最近になって、４８または９６個のウェルを有するプレ
ートを用いたマイクロタイタープレート法が使用される
ようになったが、このようなプレートは、多数の被検試
料の処理には能率的であるものの、１回または少数の試
験、特に実地条件で経験するのと逆の条件で行なう試験
では能率的でない。

また、主として前述したＥＬＴＳＡのようなＥＴＡおよ
びＲＴＡ、フルオロイムノアッセイ（以下、ＰＴＡと略
すこともある）または化学発光に基づ〈従来のイムノア
ッセイ法における別の問題点として、高価につぎ、また
は比較的小さい実験室もしくは試験面では都合が悪い電
気的または電子的シグナル増幅装置を必要とすることが
含まれ実地条件下で１回限りの使用が可能で、洗浄（セ
ルロースアセテートディスク、プラスチックビーズの場
合）または生物学的試薬の使いすぎ（試験管の場合）の
問題がな（，２サイトアツセイの全能力を生かすモノク
ローナル抗体技術と結合したアッセイ体系の開発が、明
らかに必要とされている。

また、ひとまたは動物から得られた流体試料について、
その流体試料を実験室へ送ることを要さずに特定の疾病
の徴候を試験できる診断試薬を含んだ試験キットを用い
た、迅速かつ能率的なイムノアッセイ法または診断法を
実施可能とすることが、開業医、獣医、学生、実験技師
等および農場経営者、農場労働者、看護婦等の半熟練者
の間でしばしば希望されている。このように、「実地に
１または「即座に一１使用できるＥＴＡのようなイムノ
アッセイ法については、事態はよくなかった。

米国特許第４２９４８１７号は、特定の型のフルオロメ
ーターでの分析を必要とする、シングルサンプラー−１
−に設置した２個の試験面を用いるイム７アッセイ法を
記載している。このサンプラーは、被検血清試料、洗浄
用溶液、イムノフルオレッセント抗体含有溶液に連続的
に通され、最後に最終洗浄用溶液に通される。次いで２
個の表面の蛍光測定値を差引いて差測定値を得、これが
対照ＩＩｎ清溶液で得られた差測定値と比較される。し
かし、ここでは、−１−配光測定値を得るために通常必
要な特殊な型のフルオロメーターだけでなく、やはり通
常必要なマイクロコンピュータ−アクセサリ−も必要と
なる。したがって、この試験法は比較的能率的ではある
が、なお比較的複雑なシグナル増幅装置の使用を必要と
する。

また、」１記イムノアッセイで用いるサンプラーは、硝
酸＃＆紺素および酢酸繊Ｍ［素のコポリマーである特殊
な多孔性材料からなる複数の円形ディスクを粘着テープ
または適当な接着剤で棒または管に付着または付設して
なるものである。このような方法は、ディスクに抗原ま
たは抗体を適用した後、これらを特定の条件下で比較的
長時間乾燥する必要があるので、極めて時間がかかる。

また、米国特許第４．２９４．８１７号に記載されてい
るように、ディスクはある特定の抗体または抗原に対し
てのみ適当である。セルロースディスクは略孔性である
ため、多数の非特異的物質とも結合し、したがって効果
的な洗浄手段を必要とするという問題が起る。

最近、下記工程すなわ九 （１）未知抗原または抗体を含む試料を、試料中の抗原
に対応する抗体を付着したキャップの内面に接触させ、 （ｉｉ）キャップを適当な酵素結合体（ｃｏｎｊｕｇａ
ｌ（・）と接触させ、 （ｉｉｉ）キャップを酵素の基質と接触させる工程を含
むイムノアッセイ法を記載したオーストラリア特許明細
書第６’８１１７／８１号が発行された。

キャップの内面は、外側へ向かう突出部またはキャップ
内に付着もしくは保持された別部材を有することができ
、これらには抗原または抗体を（＝１着させておくこと
がで終る。

」１記の技術は、逆条件または蛇の咬傷の診断のような
実地条件下の試験に有用であると述べられている。しか
し、実験の結果、内面に抗原または抗体を付着したキャ
ップを未知試料含有容器に装着すると、容器を倒立して
、容器がキャップ」二にあり、適当な反応が生起して試
料中の抗原または抗体がキャップ内面に付着した抗体ま
たは抗原と結合できるようにする必要があることがわか
った。

この方法は、反応後にキャップを適当なだけ洗浄する際
に困難を生ずるとの欠点があると思われる。

すなわち、特許第６８１１７／８１号記載のねし山つき
キャップを使用すると、キャップ内面からの試薬の洗い
出しに困難を生ずる。

したがって、イムノアッセイ法が信頼できるためには、
効果的な洗浄法を備える必要があることを銘記しなけれ
ばならない。イムノアッセイ法の後続工程中の洗浄工程
が効果的でないならば、最終結果に誤差が入りこみ、不
正確な結果が得られる。

上記特許第６８１１７／８１号では、キャップと試薬ま
たは試料含有容器の当接面か′接触し、したかって、キ
ャンプが堅固に容器に固着していない場合には液体が直
接漏出してキャップと容器間の当接面間を通ることがで
きる。別の場合には、このような漏出は毛管現象により
、また場合によっては表面張力または圧力勾配のために
起り得る。

この欠点は、特許第６８１１’７；／８１号明細再に記
載のようにねし山つきキャップを使用しその後に容器を
倒立させて容器をキャップの−にに位置させ、抗原抗体
間の反応を行なわせる場合に最も顕著である。また洗浄
工程は容器の振盪を伴うので、液体の漏洩を防ぐために
はキャップか極めて堅固に容器を密封していなければな
らない。

このように、これ等の要因により明細１）６８］１７／
８１号に従って実施された分析結果の再現性が疑問であ
り、不純物あるいは異抗原が抗原抗体反応を妨害するよ
うな危険性があり、そこでは洗浄工程か不完全であるた
めにそのような汚染が生じる。汚染の起りやすさは特許
明細書６８１１７／８１号に記載されている２つの洗浄
工程によりて緩和される。

また、未経験者か−に記イム７アツセイ方法を実施した
際−１〕述したような汚染か頻繁に生じるものと考える
に違いない。

特許明細１６８１１７／８１号に記載されたようなチュ
ーブあるいはロット等の付属部分を有するキャップを用
いることに関して、得られた唯一の試験例は、ゴム製乳
首および液体を当該チ、−ブに引き抜きあるいはそこか
ら放出するために差動圧力又はポンプ動作を必要とする
従属チューブを有する滴下式キャップを用いたものであ
る。そのようなキャップの洗浄は通常の螺子付キャップ
におけるものと比べてより困難であり、したがって−に
連した不都合が含まれることになる。そのようなキャッ
プを用いることは、キャップおよび従属ロッドあるいは
チューブをプラスチックで一体成形した場合におけるよ
りも可成り高価に付く。

もし従属ロットあるいはチューブがキャップと分離され
て接着剤によりそのキャップに接着しなければならない
ものであれば、液がキャップと従属ロッドあるいはチュ
ー７との接合面領域への到達用か増大すると汚染が生じ
る危険ｆ１があると考えられる。

特許明細ｐ’、６８１１７／　８１号に記載されるよう
な従属ロット′あるいはキャップを備えたキャップは比
較的大きな入口を有する容器に対してのみ用いることか
でき、従ってそのようなキャップは狭小なあるいは限定
された入口を右する容器に対しては不都合であり、該入
口は毛細管現象および表面張力効果のために適正な洗浄
操作を行ない難いものにすると言えよう。

特許明ｍｉｔ　６　ｏ　１１　？　／　８１号に記載さ
れる方法のもう１つの不都合点は、その適用が１ｉ−で
あり、後述するような本発明と同様の方法で多数抗原検
定用として容易に使用し難いことである。

また、特許明細書６８］１７／８１号の方法は、本発明
において必要とされずそれだけより簡素化せしめる、キ
ャップと容器間の水封を必要としている。

最近、文献Ｃｚｅｃｌ＋、　ｐａｌ＋ｅｒ　２ｂ１．　
Ｂａｋｌ、ｒ−ｒＶｇ。

Ｔ、　Ａｈｌ、、　ＯｒｉｇＡ　　２４．０．　１１２
−１１７（１９７９）ｔ−；よび２１）Ｌ　　Ｒａｋｔ
、　　Ｈｙｇ、　　Ｔ、　　ＡＩ）Ｌ。

０ｒｉＩ？Ａ　２／ＩＯ，１１８−１２２（ＩＩ　９７
８）に記載されているように、丸味を付けた端部を有す
るポリスチレン製攪袢棒が抗原キャリヤとして用いられ
、そこでは攪拌棒の丸形端部が抗原溶媒中に浸入される
。多数コーティングを行うために、複数本の攪拌棒ある
いは“スティック”が−塊に束ねられるとともに約２ｃ
ｍの間隔をもって十字状に配列されたゴムバンドで形成
された網目に刺し込まれる。スティック束が抗原中に一
昼夜設置され、そして、該スティック束は乾燥した後洗
浄され段階的なＡｇ低下濃度を有する一群のチューブ内
に設置される。その後、Ａｇがコーティングされたステ
ィックは血清希釈液を含有する一群のチューブ内に置か
れ、そして培養される。これ等のスティックは、洗浄後
酵素結合抗ひと免疫グロブリンを収容する一群のチュー
ブ内に置かれる。培養した後、これ等のスティックは洗
浄され、そして酵素基質溶液を充満したチューブへ移送
される。その後、該基質からこれ笠のスティックを除去
して酵素反応が伴出せしめられる。その後、これ等の基
質チューブが測光により読み取られる。

更に、上記チェコ報告Ｗ（Ｃｚｅｃｌ＋　　ｐａｐｒ＋
ｒｓ）は抗体あるいはＭ　Ａ　＋１ではなく抗原を運ぷ
゛貯蔵担体の使用について記載しかつ多数回使用が試み
られている。

オーストラリア国特許第！’＋　２１００２号に関し、
図面に示すように複数のフィンから構成される種々の複
雑な形態の挿入マトリックスを用いたスティックあるい
は挿入型アッセイの使用か記載されている。精巧なマト
リックスの全てが試料容器の内側面にびった（）と近接
せしめて取りイ」けられることに注意しなければならな
い。精確に挿入することは困難であるばかりでなくその
製作が高価であり、そのような挿入材は、反応液の毛細
管粘着力のために排出が不十分となるために当該挿入材
の洗浄が厄介であるため、野外（ｆｉｅｌｄ）７ノセイ
あるいは派遣アッセイ（ｂａｒｅ「ｏｏｔ、ａｓｓａｙ
）には不適当なものとなろう。この問題点は特に本発明
において参考とされた。

上記特許第５２１００２号は明らかに上述したようなマ
トリックス挿入材の性質に起因して実験室型アッセイに
のみ指向されたものであり、前述したように２サイトア
ツセイにおけるモノクロナル抗体の使用には何ら言及し
ていない。それは単にポリクロナル抗体に言及している
。また、当該アッセイ手順を派遣アッセイあるいはそこ
で使用される反応キットに応用することには言及してい
ない。　　ＥＴＡイムノアッセイあるいは′°派遣”イ
ムノアッセイの分野に関して、そのようなアッセイは十
分に良好に開発されてはおらずかつポリクロナル抗体を
使用することにより特異性を欠きおよび重要であると考
えられる結果に対する必要性が実験室条件下で実行しな
ければならないという範囲内で欠点を有していた。」二
記チェコ報告書は単に複数スティックによる大量コーテ
ィングを開示しているだけであり、しかも該コーティン
グは抗原あるいはポリクロナル抗体から生じたものであ
ることのみを記載している。

従って、この発明の目的はイムノアッセイの分野におい
て、有効に使用し得るイムノアッセイを行えかつ特に実
験室を利用することなく正補゛な結果を提供する有用な
方法および反応装置を提供することにある。

この発明は、体質および体液中に含有される抗原に対す
る特定のモノクロナル抗体を細長いプローブにコーティ
ングすることにより野外（ｆｉｅｌｄ）イムノアッセイ
を行い得ることを見い出したことを基礎とするものであ
る。

この発明は“そのままの状態で（ｉｎ　　ｓｉｌ、ｕ）
”試験するための野外イムノアッセイ反応装置を提供す
るもので１、二の装置１よ 体物質または体液中に含まれている抗原に特有なモノク
ロナル抗体で少くとも部分的に被覆された探針プローベ
またはキャリア、 複数の容器、 モノクロナル抗体に対する抗原の非特有的結合を妨げる
洗剤または池の適当な物質、 緩衝液、 信号増幅または検知手段 から構成される。

目蝋棒プローブあるいは担体を形成する適宜な材市旧土
上記ＭＡｂと関連する限りにおいて吸収性である実質的
に非孔質のものである。そのような材料は非孔質である
ことが好ましい。そのような材料の好ましいかつ適宜な
プラスチック材料の具体例は、ポリスチレン、アクリル
、改質アクリル、ポリアミド、ナイロン等である。

」−記目盛棒部材はその各端部を開放したロッドあるい
はチューブから成る。Ｍ　Ａ　１１が勿論サンプル容器
内の抗原にアクセスせしめ得る挿入部分に加えられ、こ
の挿入部分はロッドの外面、あるいはチューブの開放端
部の内ｔ；よび外面としてもよい。好ましくは、ロッド
が使用される。

また、」二記目盛棒担体の挿入部分はハンドル部に関し
て伸展されるとともに、その上にＭＡｂのコーティング
を増大すべく実質的に表面積を増大せしめるように、１
つ又はそれ以上のリブ、溝、外方突出７１阻あるいはキ
ャビティあるいはそれ等を組み今わせたものが設けられ
ている。

」二記チューブあるいはロッドは随意の適宜な形状およ
び断面積を有し、したがって断面形状を丸形あるいは矩
形としたものであってもよい。一方、このチューブある
いはロッドは多面体、即ち、断面形状が六角形あるいは
多角形のものであってもよい。

」二記反応装置あるいはキットを糺み立てる前に、目盛
棒担体の挿入部は所定の時■旧例えば１５分間あるいは
それ以上の時間）ＭＡｂ溶液中に浸漬されて該Ｍ　Ａ　
＋）がそこに接触せしめられる。ＭＡｂは上記目盛棒部
材の挿入部に受動的にあるいは能動的にコーティングさ
れる。ＭＡｂは水素結合、ファンデルワールス（Ｖａｎ
　　ｄｅｒ　　Ｗａａｌｓ）力、場合によっては共有結
合あるいはその他その伸長部とＭＡｌ＋間の相互吸引力
に基づいて目盛棒部材に接触せしめられる。この工程は
、好ましくは、通常の培養温度Ｉ；よび所定の生理学条
件（例えば２７〜３７°Ｃ）とすることができるけれど
も室温で実行される。所望であるならば、このＭＡｂは
冷凍磯等により目盛棒部材に凍結せしめられる。

その後、−１−記目盛棒担体がサンプル抗体を収容する
容器内に挿入され、そして該サンプル抗体に含有される
抗原かコートされた捕獲Ｍ　Ａ　＋１と結合せしめられ
る。そして、−に記目盛棒部材は引き抜かれで、燐酸緩
衝食塩水（以下にＰＢＳと記す）等の適宜な洗浄剤で洗
浄される。この洗浄工程は繰り返し行なわれる。捕獲さ
れた抗原の検出は捕獲ＭＡｂ抗原反応生成物と結合する
第２酵素結合タッグＭ　Ａ　＋）を用いて行なわれる。

信号増幅手段の一例である基質に添加した後、１１′Ｉ
該サンプル中の不明の抗原量がＥＴＡ技術で決定される
。

コートされた■盛枠担体とサンプル体との接触は室温で
行なわれる。適切な洗浄剤はＰＢＳ（燐酸緩衝食塩水）
あるいはＰＢＳとトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）との混合物
である。上述した接触工程はｐＨ５〜６で適宜に行なわ
れる。適宜なイオン強度の」−眼は１Ｍである。これ等
の条件はＭ　Ａ　Ｉ）の伸長担体への接着にも用いられ
る。

この発明の方法を用いれば、アッセイ用にサンプルを収
集するためのどのような収集工程をも必要としない。よ
って、大量のサンプルが初めから得られ、サンプルのど
のような初期収集をも行なうことができる。

この発明の方法により種々の抗原を広範囲に亙って分析
することができ、これ等の抗原には生木あるいは液体内
の抗原も含まれる（糞、リンパ液、尿、あるいは血漿、
血清、血塊あるいは血液フィブリン、唾液、細胞外液、
脳を髄液、組織ホモノネートあるいはそれ等のいずれか
の溶液等の成分を含有する血液等の人体あるいは体液を
も含む）。

特に、この発明は動物の排泄および分泌の診断を行なえ
るようにしたものである。

第２　Ｍ　Ａ　Ｉ＋用標識酵素は、好ましくは、ベルオ
キシターゼ、β−ガラクトシターゼ、アルカリチ１゜ホ
スファターゼおよびウレアーゼから選択される。

ベルオキシターゼ用に適した酵素基質はＯ−フェニルジ
アミン、０−トリジンあるいはＡＢＴＳ（ＤＯち、２−
２７７７−ジー（３−エチルベンゾチアゾリンスルフォ
ン−６）である。β−ガラクトシターゼに適した酵素基
質はパラあるいはオルソニトロフェノール−β−Ｄ−ガ
ラクトシターゼがある。ウレアーゼ用に適した基質は尿
素であり、アルカリ性ホスファターゼ用に適した基質は
パラニトロフェノールホスフェートでアル。

この発明に係る反応装置においては、酵素で標識された
ｔｊｓ　２　Ｍ　Ａ　Ｉ）は適宜に凍結され、あるいは
野外用として準備される。ベルオキシターゼを使用する
と外は、通常、過酸化水素が所要のファクターとして存
在する必要がある。

標識第２　Ｍ　Ａ　ｂの変更時、もし伸長担体」二のＭ
Ａｌｌに捕獲された抗原が化学的に活性であれば、信号
増幅段階は直接的に捕獲した抗原に所定の試薬あるいは
複数の試薬と共に検出可能な化学反応を生起せしめるこ
とにより達成される。

この発明において用いられる緩衝剤は好ましくはＰＢＳ
とされるが、クエン酸緩衝剤あるいは乳酸緩衝剤等のよ
うな他の緩衝剤を用いて約７Ｔ１１（程度を呈するよう
にしてもよい。この緩衝剤は装置に粉体の形態で供給さ
れるが、所望であれば液体の形態で供給されるようにし
てもよい。

洗浄剤成分は、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビ
タンモ７ラウレートとされるが、当該技術分野の専門家
にとって明らかであるように他の適宜な洗浄剤とするこ
ともできる。洗浄剤成分はプローブあるいは担体にコー
トされたＭＡｂに対して非特異性結合を防１ヒせしめる
必要がない。洗浄剤はシ戸紙に吸着せしめたような乾燥
した形態で供給されるが、液状形態で供給するようにし
てもよい。

もし殺菌力あるいは殺細菌力が要求されるならば、殺菌
成分としてアノ化ナトリウムあるいはエチルマーキュリ
チオサリシレートが用いられる。

もし緩衝剤が液体の形態で供給されると、それは殺菌剤
と結合する。しかるに、この発明の反応装置が無菌状態
に包装されるのであれば殺菌成分を省略することができ
る。

好ましくは用いられる容器に試験チューブが用いられ、
これ等は、ある１つのチューブをその他のものと識別す
るために色フードあるいは適宜な識別手段が設けられる
。

幾つかの試験チューブは、伸長担体が１つの容器から他
の容器に移送される際の洗浄の目的にのみ用いられると
ともに、幾つかの試験チューブはサンプルあるいは標識
酵素第２モノクロナル抗体等のある反応剤を収容するの
に用いられる。

酵素基質のような成分は適宜に薬びんあるいはアンプル
に隔離される。

信号増幅段階あるいは検出段階にＥ　Ｔ　Ａ試験を用い
る際、好ましくは、試験結果を査照するのにカラー標準
あるいは携帯比色計が用いられる。

また、好ましくは、１つ又はそれ以」二のループダイリ
ュータが設けられてサンプルあるいは試薬の希釈剤を含
む試験チューブへの移送が有効に行なわれるようにされ
る。

この発明に係るイム７アツセイ方法を説明するために詳
細な試験手順が参照される。

−リン酸緩衝塩（、ｒ）−Ｂ−、ｓ→−粒界塩化ナトリ
ウム（’１．１６Ｂ、塩化カリ・ンム（１、ｆ’）０４
Ｐ、、リン酸水素−ナトリウムｆ１．ｆ’１２３ｇおよ
びリン酸下、水素カリウム（１，００４，ｇの混合物−
１ウ−イニーン注入紙 この試薬は、フィルター紙片に１Ｃ）％トウィーン２０
（ポリオキシエチレン　ソルビタンモ７ラウレー））１
（’）（ｌμ（１を滴下し、空気中で乾燥させて製せら
れる。

一醇素恭喫枢 、：れは、クエン酸塩５（１ｍＭ、〇−トリジンシ゛ヒ
ドロクロリド２．５ｍＭおよびＥＤＴＡ（’１．０２５
ｍＭからｐＨ４，５で製せられる。

ガ）酸イｐ％、１ｔ４貨σλｊ（二４更７−Ｐ力１Ｊプ
（体これは以下の処理から製せられる： カルバイオケム実験室から得られたセイヨウワサビ過酸
化物５ｍｇを蒸留水１．０ｍｌに溶かし、０゜１ＭのＮ
ａＴＯ＜（’１．２ｍｌを加える。金色から緑色へ色彩
変化が生しる。その混合物を室温で２０分間静かに混合
する。遊離したＮａＴＯ，をゲル濾過によって除去する
。ゲル濾過コラムをｐ　ＩＩ４．　、　Ｓのクエン酸塩
緩衝物０．００１Ｍで平衡させる。以下の実施例１およ
び２で述べるような人り二量体または犬心臓寄生虫抗原
から製せられたモノクロナル抗体は、イムノグロブリン
２暉にトｒＲＰＯ］ｍｇの割合で加える。ｐｒ−１９，
５のＮａ２ＣＯ３緩衝物１Ｍを加えて最終的なｐＨ９，
０〜９．５を得る。

これは、アミンにアルデヒドを結合するために最適のｐ
Ｈである。生成混合物を室温で２〜３時間静かに混合す
る。その後、２．０Ｍのエタノールアミン２００μｆを
加え、ｐＨを９．５に調節する。

混合物を４°Ｃで一夜中、培養する。エタノールアミン
をデル濾過て除去し、メチオレー）（０，０１％）エチ
ルメルクリチオサリチレートを加え、共役抗体を４℃で
保存する。最終キットの製造のために共役ＭＡＩ）は１
０％蔗糖中で１／１０に希釈し、この溶液１０μ夕を適
当管中で凍結乾燥する。

モノ」２−ロナソレ抗イ臀卆−塗、４１□た子ヌ−’　
ｌ）　ｔ＋さぐり金１は、その２つの広い表面に配置さ
れた複数の（例えば６〜８の）横リブと共に拡大した板
状ボディ部を有するポリスチレン多１を、適切に精製し
たＭＡＭたんばく質／　＋ｎ　ｌの１０Ｐｇ）中に２ｃ
ｍの深さに室温で１時間浸漬することで製せられる。

塗布した釧は、その後、ＰＢｓ／ｌ・ウィーン中３ｃｍ
の深さに浸すことで３同洗浄し、５分間放置し、他のＰ
Ｒ８／）ウィーン容器に移す。洗浄した斜は、牛の薄情
蛋白溶液中で３ｃ＋ｎの深さに浸漬させて、１１１　Ｒ
Ｓ　Ｉｊｌ（ジグマスＡ　４５　（１３）　１０　ｍｇ
／　ｍ　ｌを室温でさらに１時間、反応しない結合位置
に保持し、Ｆ’　ｒ（Ｓ　／しツイーン中さらに３回洗
浄する。

最終的に針は、過剰液を除去するように軽く打ち振り、
空気乾燥する。

実施例−１− 一伝。染性廊管内凝固−■↓ｑ）の測定用血漿十人ス差
結−今刀〈−フーリーイー誘導一本の検出この実施例で
は、反応さぐり針は、適当溶液から特殊抗原を捕獲でき
る特殊モノクロナル抗体で被覆されており、反応さぐり
針に固定された捕獲抗原は、次に、適当に分類された第
２モノクロナル抗体を用いて添えられる。

人１）二ｆ１月４ζ抗原に対するモノクロナル抗体は、
〃ルフレ（Ｇａｌｒｒｒ・）等により確ヴされた技術、
ネーチャー（Ｎａ１．ｕｒ（・）、　　２−６６．　５
５＋１−５５２（１０７？　）に従って以下のように製
せられる：（ｉ）人Ｄ　７．　ｉｌｊｌ抗体に対するＢ
Ａｌ、、　Ｂ／ｃマウスの免疫 （ＩＩ）過程（ｉ）で初られた免疫マウスからの溶融ｎ
中ＩＩ！細胞とポリエチレングリコールのあるＮ５−１
マウス骨髄腫細胞とを細胞溶融剤として使用し、雑種細
胞を９１する。

（ｉｉｉ）糾織培養菌中で」−記雑種細胞を繁殖させて
、抗−Ｄで、１１を体モノクロナル抗体分泌クローンを
１１）る。

（ｉｖ）腫瘍のあるＢＡＢＬ／ｃｖウスに過程（ｉｉｉ
）で得られたクローン化雑種細胞を注入して、抗−Ｄｚ
ｔ体モノクロナル抗体を分泌するものを得る。

（ｖ）過程（ｉｖ）で注入されたマウスからモノクロナ
ル抗体を採集する。

この技術を用いて、以下の抗−り二量体モノクロナル抗
体を製する： （ａ）りｂ−ンｒ３　４２．７．３Ｂ６／２２（１））
クローンＲ４４，７，４ｒ）２／１８２１３４、２　、
７．３ｒ（６／　２２モノクロナル抗体で被覆した反応
さぐり金１は（前記したように）製する。

−キーアートの−Ｊ（ξすｌ テストキラ）は、３Ｘ　２　ｍ　Ｑの空テスト管または
容器、凍結乾燥したセイヨウワサビ過酸化物共役ＭＡＩ
Ｉ　　Ｂ　４４．、７．４．　（１２／　］　８２をＩ
ＩＶ容する１つの２ｍｆ’赤キャップ管、清浄剤を７１
４たした紙片とＦ’　１３　Ｓ緩衝粉末を収容する分離
ノズ゛ルイ−１の１つのふたをした２ｒ１ｍθ点滴びん
、ＭＡｂ　　Ｂ４２゜？　、　３　ＩＩ　６　／　２２
を被覆したポリスチレン針、５０μｉ希釈器、および以
下のアンプル、すなわ九、１、緑色アンプル：３％過酸
化水素０．７５ｍρ２、黄色アンプル二〇−トリジン基
礎液１ｍρ３、桃色アンプル：青色色彩標準１　ｍ　（
’１を含む色彩コード化密閉ガラスアンプルから構成さ
れる。

完成したキットは、試薬を配置するだめの厚紙ホルダー
および指令セットをも備えている。

ｒ）二重体用のテストを実施できた後、いくつかのキッ
トの調製が要求される。

１、紙片と緩衝粉末とを含有する点滴びんに蒸留水２０
ＩＩｌ（゛を加えてＥたす。ノズルを挿入し内容物を混
合する。

２、第１空管に緩衝物１０点滴を加える。希釈物の助け
を借りてテストサンプル５０μｅを移送し、内容物を１
（）秒間くり返し攪拌混合する。

３、赤キャップ管に緩衝物２０点滴を加え、内容物を反
転混合する。

規定手順 テストは以下の必要な過程で行う。

１、ＭＡ＋］被覆さぐり針をそのサチェットから取り除
外、希釈したテストサンプルを含有する管中に置く。４
５分間放置する。

２１．３．および４．第２空テスト管の首１こ緩衝物を
加え、洗浄のためにこの管にさぐり針を移す。３０秒間
攪拌後、さぐり針を３０秒間放置する。その後、さぐり
針を取り除き、この管の内容物を捨てる。管に再び新鮮
な緩衝物を満たす。十分な洗浄を行う。その洗浄処理を
２回以−１−くり返す。

５、赤キャップ管にさぐり３１を移し、／１．５分間放
置する。

６、、？、および８．第３のキャップのない管にさぐり
釦を移し、上記２０．３．および４．と同様に処理する
。

９、緑色アンプルにさぐり針を移し、３０秒間放置する
。

１０、黄色アンプルにさぐり制を移し、３（）秒間さぐ
り３Ｉを回転させ、５分間放置する。１０分後にさぐり
な１を捨てる。

このアンプルを清浄で白い背最に対して保持したとき、
色彩標準（桃色アンプル）よりも大きい青色の存在が測
定される。テストサンプルが特殊な抗原を含んでいれば
、淡色から暗青色までの青色色彩が得られ、色彩度は存
在する抗原惜に比例する。実験室で定量結果が必要であ
れば、緑色アンプルの中味をキュベツトに移し、分″に
、光度計でＡ６２０ｒｕ。の吸収を測定する。人面漿サ
ンプルでの検定結果を以下に転載する表１に示す。Ｐ備
評価のために、色彩標準を設定して０．１０Ｑのノ＼６
視覚測定　　　定量測定　　　　Ｄ二量体　　　　確認
した２　　　＋＋　　　　ｆｌ、４．４５　　　　　１
２（＋　　　　　　有３　＋＋＋　０．７３６．１．５
ｎ有 ４、　＋＋＋　０，８８７６：Ｎ’ｌ有５　　　＋＋＋
　　０．７５３　　　　２８（ｌ　　　　　　有６　＋
　０．２５２　８０有 ７−０，０５無 Ｂ−ｆｌ、ｆ’１４４無 ９−０．０２６無 （１）　　　−青色なし 十　淡い青色 ＋＋　普通青色 ＋＋＋　濃青色 （２）　リラット（Ｒｙｌａｔｔ）、　Ｄ、　Ｂ０等゛
トロンポス・レス゛’　（ＴＩ＋ｒｏｍｌｔｏｓ　　Ｒ
ｅ５）、　　３−１　、　７６フー７７８．１９８３お
よびエルムス（Ｅｌｍｓ）。

Ｍ、１等′トロンブ・ホメオスビじｌ”ｈｒｏｍｌ＋　
　Ｉ−ｌ−１ｏ！Ｏ８＋、）、　−５−ｆ’、ｌ−、５
９］　　５９４．１’、）　：’ｉ　：’（に記載され
た手順に従って行なう。

（３）ウアーン、Ｊ、Ｍ、およびオスキ計゛、Ａ。

の採点システム、゛カン・メト・アソック゛’（Ｃａｎ
Ｍ　ｅｄ、　　ｒ＼５ｓｏｃ、　　）Ｊ、　　＋　　−
１，（１７−、！Ｊ　　６２−’Ｊ）　　６７により診
断されるＤＴ（’、特許 実施例２ 反応さぐり針を被覆−１−た抗体を使用する１）、−イ
ミテーイース抗原の検出 この実施例において、反応さぐり３１は、適！１１溶液
から特殊な抗原を捕獲でとる特殊な抗１）、−イーミー
７−イースＭｌ＼１〕を被覆しており、反応さぐり金１
に固定された捕獲抗原は、その後、適）１１に分類され
たｍ　２　抗、Ｄ−−−イーしティ冬モノクロナル抗体
を用いてイ」けられる。

犬の心臓の寄生虫（ゲーイーローフィーラリアーーーイ
ーミ−テーイース）抗原に対するモノクロナル抗体は、
ガルフレ等、ネーチュア（Ｎａｔｕｒｅ）、　２．−６
−６、、　Ｓ　Ｓ　Ｏ−５５２（１９７７）によって確
立した技術により以下のように製せられる： （ｉ）Ｄ、イミティス抗原に対するＢ　Ａ　Ｉ−Ｂ　／
　ｃマウスの免疫 （ｉｉ）過程（ｉ）で得られた免疫マ、ウスからの溶融
胛臓細胞をポリエチレングリコールのあるＮ５−１マウ
ス骨髄肝細胞と共に細胞溶融剤として使用して卸神細胞
を製する。

（山）紹織培養菌中で」−記屑種細胞を繁殖させて、抗
−Ｄ、−不ミ想モノクロナル抗体分泌クローンを製する
。

（ｉｖ）胛瘍のあるＢＡＬＢ／ｃｖウスに過程（ｉｉｉ
）で得られたクローン化雑種細胞を注入して、抗−り、
イミティスモノクロナル抗体を分泌するものを製する。

（ｖ）過程（１■）で注入されたマウスからのモノクロ
ナル抗体を採集する。

この技術を用いて、以下の抗−０，３剣力不各モノクロ
ナル抗体を製する： （、）クローンＢ　　４９，８．１　　Ａ１１５３（Ａ
）（ｌ〕）クローンＢ　　４８．８．４　　Ａ４／４５
（Ｂ）（Ｃ）、クローンＢ　　４８．８．４　Ｃ２／＋
２１（Ｃ）上記モノクロナル抗体（ａ）、、（１〕）、
または（（ニ）を被覆した反応さぐり針を（前記したよ
うに）製する。

・ら・織寄！Ｉ：、也の検定 テストキットは、：”！　Ｘ　２１１１（’′の空テス
）・管または容器と、実施例１で記載したように製せら
れた凍結乾１ヤ・セイヨウワサビ過酸化物共役Ｍノ＼ｌ
）　　ｉ＼。

１３またはＣを含有する１つの２　ｍ　（赤キャップ管
と、清浄剤注入紙片およびＰ　Ｂ　Ｓ緩衝粉末を含有す
る分離ノズル付の１つのキャップ（−ｊ２１１　＋ｎ　
（′点滴ぴんと、Ｍ　Ａ　ｂ　　Ａ　、　ＢまたはＣで
被覆したポリスチレン釧と、１０μｅループ希釈器と、
以下のアンプル：すなわち、 １、緑色アンプル　３％過酸化水素ｒ）、７５ｍρ２、
黄色アンプル　〇−トリジン基液１ｍＣ５、桃色アンプ
ル　青色標準］ｍ（□ を含む色彩フード化密閉ガラスアンプルとから構成され
る。

完成したキットは、試薬を配置するための厚紙ホルダー
および指令セットをも備えている。

心臓寄生虫抗原用のテストを実施で・きた後、し・くつ
かのキットの調製が要求される。

１、紙片と緩衝粉末とを含有する点滴びんに蒸留水２（
ｈ（’を加えて満ｔこす。ノズルを挿入し内容物を混合
する。

２、第１空管に緩衝物１０点滴を加える。希釈物の助け
をｍ：　ｌ）てテストサンプル（心臓寄生虫抗原２（Ｈ
１μｇ／Ｊ）Ｉ　Ｏｌｌ、（！、を移送し、内容物を１
（）秒間くり返し攪拌混合する。

３、赤キャップ管に緩衝物２０点滴を加え、内容物を反
転混合する。

検定手順 テストは以下の必要な過程で行う。

１、ＭＡＩ＋被覆さぐり針をそのサチェットから取り除
き、希釈したテストサンプルを含有する管中に置く。１
５分間放置する。

２０．３．および、１．第２空テスト管の首に緩衝物を
加え、洗浄のため１ここの管にさぐり針を移す。３０秒
間攪拌後、さぐり針を３０秒間放置する。その後、さぐ
り針を取り除き、この管の内容物を・捨てる。管に再び
新鮮な緩衝物を満たす。十分な洗浄を行う。その洗浄処
理を２同以１−くり返す。

５、赤キャップ管にさぐ瞥）釘を移し、１５分間放置す
る。

６、　、　７．および８．第３のキャップのない管にさ
ぐり針を移し、−１−記２０．３．および、１．と同様
に処理する。

９、緑色アンプルにさぐり金１を移し、３０秒間放置す
る。

１０、黄色アンプルにさぐり鉛を移し、３０秒間さぐり
釧を回転させ、５分間放置する。１０分後にさぐりｔｌ
を捨てる。

このアンプルを清浄で白い背景に対して保持したとき、
色彩標鵡（桃色アンプル）よりも大きい青色の存在が測
定される。テストサンプルが特殊な抗原を含んでいれば
、淡色から暗青色までの青色色彩が１１）られ、色彩度
は存在する抗原用に比例する。実験室で定滑結果か必要
であれば、緑色アンプルの中味をキュベツトに移し、分
光光度計で八６２０ｎｍでの吸収を測定する。人血漿サ
ンプルでの検定結果を以下に転載する表２に示す。予備
評価のため１こ、色彩標準を設定して０．１００のへ６
２ｏ、□値を１１１−る。

ヘ　ヘ　へ　へ　（＼　へ ＼　　＼　＼　＼　＼　＼ へ　ｔＸ　　へ　へ　ヘ　ヘ ＼　　＼　＼　＼　＼　＼ 甲　甲　Ｉ＋Ｉ　　甲　甲　Ｗ しかしなが呟−に記したように、吸収表示は必要ではな
く、検定は、適当な指示に従って未経験者が手作業で行
うことがで詐る。

上記実施例２か呟心繊寄生虫抗原は成熟した心臓寄生虫
抗原から得られ、−１−記実施例１および２に記載され
た処理は、ある種の条件下に犬の血液血清または血漿に
含有する循環する心臓寄生虫抗原の検出す；よび／また
は定喰化に利用することができる。

実施例−」 本例においては、反応プローベは適当な溶液からヒトト
リプシンを捕獲することが出来るヒトトリプシン特有モ
ノクロナル抗体で被Ｍされており、反応プローベ１ユに
固定化された捕獲抗原は適当にラベルされた第２の抗ヒ
トトリプシンモノクロナル抗体を用いて引続き特定化さ
れた。

ヒトトリプシンに対するモノクロナル抗体はガル７しく
Ｇａ１ｆｒｅ）ら：　Ｎａｔｕｒｅ、−２−リｊ４，５
５０５　ｊ２（１’、）　７７）で確立された方法によ
り次の如く調製された： （ｉ）１（Ａ　Ｉ−、Ｒ／ｃマウスのヒ）　ｌ−リプシ
ンヵルビオケム・カッ）Ｎｏ、ｆ’１５０２？５の免疫
化、（１１）ポリエチレングリコールをセル融合剤とす
る第（ｉ）工程で得られた免疫マウスの胛ＩＩ式セルを
ＮＳ−＋７１ノスミエローマセルと融合させてハイブリ
ドーマセルを調製、 （ｉ；ｉ）ハイブリドーマセルを糾織培養で繁殖させて
、抗ヒトトリプシンモノクロナル抗体分泌クローンを調
製、 （１ｖ）第（ｉ旨）工程で得られたクローン化ハイブリ
ドーマセルを腫瘍か作られているＲ　Ａ　Ｌ　ｒ３　／
　ｃマウスに注射して抗ヒ））リプシンモノクロナル抗
体を分泌、 （ｖ）第（ＩＶ）工程の注射されたマウスからモノクロ
ナル抗体の採取。

この方法を用いて、次の抗し））リプシンモノクロナル
抗体を調製した： Ｄ　クローンＣ１ｌ：”１，１３２ｒ）Ｉ／＋８２Ｅ　
　　　　　Ｃ，１１，１３３Ｂ６／１４０−１５７ＦＣ
，２０，１３３ｒ）６／１８４ 反応プローベを前記したように、モノクロナル抗体で被
覆した。アッセイキットは実施例１と同様であるが、赤
色キャップのチューブは西洋わさびペルオキシダーゼ結
合ＭＡＩ）　　ＤまたはＦを含有していた。

ヒトイムノアッセイ反応性トリプシンに対するテストの
前に若干のキット調整が必要である。

１、蒸留水２０Ｊを加えて、紙片とバッファーを含む点
滴ビンを充たす。

２、バッフ７−１０滴を第１の空チューブに加えた。次
いで、ネオナタール（ｎｅｏｎａｌ、ａ　Ｉ　）スクリ
ーニングプログラムの１部として得られた直径３ｍｍの
単−血清スポットを加え、内容物を室温で２時間溶出さ
せた。

３、バッファー２０滴を赤色キャップのチューブに加え
、逆転法により内容物を混和した。

検一定法 次の工程に従って実施した。

１　；　Ｍ　Ａ　ｌ］被覆プローベをそのサチェットが
ら取り出し、希釈テストサンプルを含むチューブに入れ
る。・１５分間放置。

２、、ニー！、およびイ、バッファーを第２の空チュー
ブの頚部に加え、プローベを洗浄のためこのチューブへ
移した。３０秒間回転させてから、プローベを３０秒問
放置した。次いで、プローベを取り出し、チューブの内
容物を捨てた。、二のチューブに再び新たなバッファー
で充たした。完全な洗浄が必要である。１−記洗浄方法
は２回以」―繰返した。

５、プローベを赤キャップのチューブに移し、／１５分
間放置。

６、．７．および８．プローベを第３のキャップのない
チューブに移し、上記２６．３．および４、のとおり処
理。

１〕、プローベを緑色アンプルに移し、３０秒間放置。

１０、プローベを黄色アンプルに移し、３０秒間回転さ
せてから、５分間放置する。

プローベは、１０分後に捨てられた。

このアンプルを白色の背景紙にかさ゛すと、色標準（ピ
ンクアンプル）よりも大きな青色の存在が認められた。

テストアンプルが特定の抗原（トリプシン）を含んでい
る場合、淡色ないし濃青の青色が４１られ、色の程度は
存在する抗原の電に比例した。実験室で定晴結果が必要
な場合には、緑色アンプルの内容物をキュベ帰に移しＡ
６２ｏｎｍにおける吸光度を比色計で測定する。新生児
血液スポットについての検定結果を第３表に示す。予備
的標価のため、色標準はＡ　　　　値が０．１２００ｍ （）０となるよう１こ設定された。

４７− 実施−例−づ− ￥ツｔ−１１放覆２反一応−プーロＩべ涜〕糺用す−る
一↓−ト２テ（−外ローピ］２−の−を力ｌ申１ 本例においては、反応プローベは適当な溶液からヒトヘ
モグロビンを捕獲することが出来るヒトヘモグロビン特
異性モノクロナル抗体で被覆されており、反応プローベ
−１−に固定化された捕獲抗原は適当にラベルされた第
２の抗ヒトヘモグロビンモノクロナル抗体を用いて特定
化された。

ヒトヘモグロビンに対するモノクロナル抗体は〃ルアし
くＧａｌ「ｒｅ）ら：　Ｎａｔｕ−ｒｅ、　　−２６−
←、　　５Ｓ（’１−５５２（１９７７）で確立された
方法により次の如く調製された： （ｉ）ｌ’３　Ａ　Ｉ−ｒ（／ｃマウスのヒトヘモグロ
ビン　スギマ・カッ）Ｎｏ、Ｈ７３７９による免疫化。

（ｉｉ）ポリエチレングリフールをセル融合剤とする第
（ｉ）工程で得られた免疫マウスの肺臓セルをＮ５−１
マウスミエローマセルと融合させてハイブリドーマセル
を調製。

（ｉｉｉ　）ハイブリドーマセルを組織培養で繁殖さ４
８− せて、抗ヒトヘモグロビンモノクロナル抗体分泌クロー
ンを調製。クローンＨ１■および、Ｊはウシ、ヒツジ、
プルシン、ウサギ、トリのヘモグロビンと交差反応を起
こさなかった。

（ｉｖ）　第（ｉｉｉ）工程で得られたクローン化ハイ
ブリドーマセルを腫瘍が作られているＢＡ　Ｒ１，、／
　ｃマウスに注射して抗ヒトヘモグロビンモノクロナル
抗体を分泌せしめる。

（ｖ）第い■）工程の注射されたマウスからモノクロナ
ル抗体を採取。

この方法を用いて、次の抗ヒトヘモグロビンモノクロナ
ル抗体を調製した： １（クローンＣ０４９，２５１Ａ２／９９Ｔ　　　　　
　Ｃ，４９，２５４Ａ５／］４０Ｊ　　　　　　Ｃ０４
９，２５３ｒ）４．／６（’）Ｋ　　　　　　Ｃ，５０
，２５１Ｄ６／２３反応ブローベを前記したように、モ
ノクロナル抗体で被覆した。アッセイキットは実施例１
と同様であった。

方法Ａ ヒトヘモグロビンに対するテストの前に若干のキント調
整が必要である。

１、蒸留水２０ｍ、ｆｇを加えて、紙片とバッファー粉
末を含む点滴ビンを充たす。ノズルを挿入し、内容物を
混合する。

２、バッファー１０滴を第１の空チューブに加えた。テ
ストサンプル５０μ２をグイリュウターで移し、内容物
を１０秒間攪拌して混合した。

３、バッファー２０滴を赤色キャップのチューブに加え
、逆頓法により内容物を混和した。

検定跋 次の工程に従って実施した。

１、ＭＡｂ被覆被覆プロー上のサチェットから取り出し
、希釈テストサンプルを含むチューブに入れる。４５分
間放置。

２０．３．および４．バッファーを第２の空チューブの
頚部に加え、プローベを洗浄のためこのチューブへ移し
た。３０秒間回転させてか呟プローベを３０秒間放置し
た。次いで、プローベを取り出し、チューブの内容物を
捨てた。このチューブを再び新たなバッファーで充たし
た。完全な洗浄が必要である。上記洗浄方法は史に２回
繰返した。

５、プローベを赤色キャップのチュー７に移し、４５分
間放置。

６、．７．および８．プローベを第３のキャップ。

のないチューブに移し、−１−記２６．３．および／１
゜のとおり処理。

９、プローベを緑色アンプルに移し、３０秒間放置。

１０、プローベを黄色アンプルに移し、３０秒間回転さ
せてから、５分間放置する。

プローベは、１０分後に捨てられた。

このアンプルを白色の背曖紙にかざすと、色標準（ピン
クアンプル）よりも大きな青色の存在が認められた。テ
ストアンプルか特定の抗原ヒトヘモグロビンを含んでい
る場合には、淡青色から暗青色までの青色が１１られ、
色度は存在するヒトヘモグロビン箪に比例する。実験室
で完壁結果が必要であれば、緑色アンプルの中味をキュ
ベンＦに移し、分光光度計で八６２　ｏｎｕｎの吸光度
を測定する。

ヒトヘモグロビン含有サンプルについての検定結果を以
下に転載する表４に示す。予備評価のために、色彩標準
を設定して０，１０ＱのＡ６２ｏｎ□値を得る。

−世 添イ；１図面ｆ！、１図には本発明を説明する反応キッ
トまたはシステムの外部容器１０を示す。容器１０は側
基≦〕および閉蓋８を持っている。

同様に頂部に複数個の穴７２を有する内部容器１１を示
す。この内部容器１１は各端に側蓋１３および閉蓋１４
を持っている。

更に、確認のため異なった色に着色されていてもよいキ
ャンプ１７を有する一対のチュウブ１５が示されている
。更にまた、キャップを有しない、洗浄用に使用される
一月のテストチュウブ１６が示されている。

なおまた、バッファー粉末１９と洗剤を含浸させたシ戸
紙２０を収容するビン１８が示されている。

更にループグイリュウタ−２４とモノクロナル抗体で被
覆されたプローベ２５を収容した、透明なプラスチック
材料で作られたバッグ２３が示されている。また、アン
プル２６．２７．２８およびキャップ２１を取り去って
ビン１８に適合させ、ビン１　Ｂを滴下ビンとして使用
可能にするドロッパー２９を収容するプラスチック製バ
ッグ２２が面に線引外が施されていてもよい。

操作に１５たっては、チュウブ１５と１６を穴１２に支
持する。ついて゛バッグ２２と２３を開けばよい。アン
プル２Ｇはハイドロゲンペンテイドを含んでいてもよい
。アンプル２７は基質を、アンプル２８は適当な色標準
を示す液体を含んでいてもよい。

第２のモノクロナル抗体はキャップを施したチュウブ１
７の−っに収容し、他の一つはサンプル容器として使用
すれば゛よい。かくして実施例１に記載したように検定
を実施する。

図面から容器１１はふた８および１〕を閉じる際外部容
器１０の中に収容されることか理解されよう。バッグ２
２と２３はビン１８と同様内部容器１１の中に収容され
る。チュウブ１５と１６は収容穴１２に保持されでもよ
い。かくして全体が貯蔵や運搬に便利なように包装され
うる。

本発明のフィールドイム７アンセイ法は−１−記したご
と〈従来法に比し、本質的な利点を多数有することか゛
理解されよう。

従来技術で用いられたポリクロナルまたはマルチサイト
スピーシーズに比較してモノクロナル抗体に限定した被
覆を用いることにより、２箇所検定法の有用性が一層高
められる。ガル７しくＧａ１ｆｒｅ）らにＪ：り確立さ
れたハイブリドーマ法を使用することにより、非平行抗
原特異性および抗原性決定特異質の捕獲および標識Ｍ　
Ａ　ｂの非制限的生産が可能となった。ハイブリドーマ
技術によって与えられたかぎは捕獲ＭＡ’ｌ）として具
体的に使用されるＭ　Ａ　＋］の生産に依存する。この
捕獲ＭＡｂはテス）ＡｇＪ二にのみ存在し、他の分子種
」二には存在しない特異的な抗原性決定因子と結合する
。すなわち、ＭＡｂ捕獲−標識検定は本発明により確立
されたものであって、Ａｇ決定因子特異性の欠乏の故に
従来生産されたポリクロナル抗血清（ＰＡｌ））では不
可能なものであった。このＰＡＩ）はテス）Ａｇに類（
＋１．の抗原性決定因子を有する分子と交差反応を起こ
すものである。

本発明の出現は従来技術において見られた上記の欠、α
を舒ｊ成する分野での逆の条件下における使用に適した
診断法を提供するものである。使用した物品の洗浄か容
易であり、１Ｆ−のアッセイとして使用することか゛出
来、生物学的試薬の使用の点で経済的であり、精製され
た抗原の使用を必要としない。また、Ｍ　Ａ　ｂ技術を
使用することにより、Ａ、特異ｆ１抽穫および標識Ｍ　
Ａ　ｌ＋の無限の供給が可能となり、電気的または電子
的信号の増幅を読み取る必要もない。

本発明の診断法はＭ　Ａ　ｂ技術を使用するツウサイト
（Ｔ…ｏｓｉｔｅ）イムノアッセイシステムを使用する
のに適した特異的なものであり、第２のラベル化された
標識Ｍ　Ａ　１１が単一の信号を使用する場合に限定さ
れず、ある場合には伸張メンバーに結合したＭ　Ａ　ｂ
によって捕獲されたＡｇが適当な条件下で適当な信号を
発生してもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明にががる装置またはキットの全体構成
の説明図である。 １０・・・・・・容器、１１・・・・・・内部容器、１
５、Ｉ　６　、、、　、、、チュ−ブ、１７・・・・・
・キャップ付チューブ、１８・・・・・・ビン、１９・
・・・・・バッファー粉体、２０・・・・・・シ戸紙、
２２．２３・・・・・・バッグ、２４・・・・・・ルー
プダイリュウター、２５・・・・・・プローベ、２６．
２７．２８・・・・・・アンプル、２９・・・・・・Ｆ
ロッパー。 特許出願人　フィールダー・ジ゛ルレスピー・リミテッ
ド 代　理　人　弁理士　青　１１１　　　葆　はか１名第
１頁の続き ０発　明　者　ディピッド・マイクル・マイアット オーストラリア国りイーンズラ ノド４１フ１バルモラル・スーブラ ・ストリート３９番 ０発　明　者　ジョン・シンクレア・ウェルシュ オーストラリア国りイーンズラ ノド４０６１ザ・ギャップ・ダグイ ラー・ロード３４番 手続補正書（嵯） 特許庁長官　殿 】　事件の表示 昭和５８年特許願第２３０４／１８　　　　号２、発明
の名称 フィールドイムノアッセイ反応システムおよヒ方法３、
補正をする者 シトニー、クラレンス・ストリート５５番名称　フイー
ルダー・ジルレスピー・リミテッド４代理人 ５補正命令の日付：自発 ６補正の対象：明細書の全文。 ７、補正の内容　：別紙の通り。 明　　　細　　書 １、発明の名称 フィールドイムノアッセイ反応システムおよび方法 ２、特許請求の範囲 １、体物質または体液中に含まれている抗原に特選−的
なモノクロナル抗体で少くとも部分的に被覆された探針
プローベまたはキャリア、複数の容器、 モノクロナル抗体に対する抗原の非特−異的結合を妨げ
る洗剤または他の適１（１な物質、緩衝剤、 信号増幅または検知手段 を含んで成るテスト用フィールドイムノアッセイ反応シ
ステム。 ２、酵素または酵素基質でラベルされた第２のモノクロ
ナル抗体を含む第１項の反応システム。 ３、酵素がベルオキシグーゼであり、コファクターとし
て過酸化水素を含む第１項の反応システム。 ・１．複数の容器の少くとも−・部が個々の容器を認識
するためそれと連動する認識手段を持っている＋ｉｉｒ
記各項のいずれかの反応システム、。 ５、フィールドアッセイにおける洗浄工程を実施するた
め１つまたはそれ以−１−の容器を備えた第１１項の反
応システム。 （１，１つまたはそれ以−１ユのループダイリュータ−
を備えた前記各項のいずれかの反応システム。 ７、色標準または携帯用測色計を備えた前記各項のいず
れかの反応システム。 侶１．第２のモノクロナル抗体が凍結乾燥されたもので
あり、容器の１つが必要に応じ前記＠２のモノクロナル
抗体を再調製するための希釈液を含有してなる、前記各
項のいずれかの反応システム。 ！Ｌ（ｉ）検定すベトサンプルを容器の中に移し、（Ｉ
Ｉ）該サンプル含有容器内に開口頂部がら探針プローベ
を挿入し く１ｉｉ）該サンプル含有容器から前記プローベをとり
出し、これを希釈液を含有して いる１つまたはそれ以、１−の容器内で洗ってから、再
びとり出し、 （１ν）前記プローベを信号増幅させてサンプル中の抗
原の存在を検出する ことを含んで成る前記第１項の反応システムを使用する
フィールドイムノアッセイ法。 １０、（い第（ｉｉｉ）工程後の探針プローベを酵素で
ラベルされた第２のモノクロナル抗体 を含む容器に挿入し、 （ｖｉ）該探釦プローベを希釈液を含む１つもしくはそ
れ以」−の容器内で洗い、 （ｖｉｉ）該探側プローベを第にＶ）工程前に酵素基質
を含有する容器内に挿入すること を含んで成る前記第９項の方法。 ３、発明の詳細な説明 この発明は、体内物質中の抗原の診断に用いるフィール
ドイムノアッセイに関するものである。 ヤロウおよびバーゾン（ネイチュア第１８４巻第１６４
８頁、１９５９年）により最初に報告されたラジオイム
７アツセイ（以下、ＰＴＡと略することもある）、１１
トびにエングバルおよびパール＝３− マン（イｌ、７ケミストリ一第８巻第Ｌ　７１！’ｊ、
１０７１年）、およびパン・ライ−マンおよびシュール
ス（Ｉ・”　Ｅ　ｒ４　Ｓレターズ第１５巻第２ｊ（２
頁、１９７１年）により最初に報告されたＥＬＩＳＡ技
術を含むエンサイムイム７アッセイ（以ド、１くＩＡと
略すこともある）のような高感度の定晴的技術の導入以
来、イム７７ツセイは、ひとの診断用薬および獣医用薬
に革命をもたらした。これらのアッセイシステムは、何
れも抗原／抗体反応の精巧な特異性に依存している。４
　り　５９年に競争的Ｐ　Ｔ　Ａか出現して以来、多数
の５＋２なるタイプのＲＩＡが開発され、ヘテロノニア
スＥＴＡの基礎をなす原理がＰＴＡのそれと同一・であ
るため、既存のＰ　Ｔ　Ａに類似したＰＴＡが考案され
たが、これらは競争的アッセイ、イム７メトリツクアツ
セイ、２サイト・イムノメトリックアッセイ、サンドイ
ッチアッセイ、および２抗体イムノメトリックアッセイ
を包含する。 Ｅ　Ｉ　ＡおよびＰ　Ｔ　Ａは、何れも適当な溶液中の
抗体（以下、Ａｂと略すこともある）または抗原（以＝
４− 下、八８と略すこともある）の何れを検出するようにも
設計することがでとる。以下に述べる発明は、上記態様
中の一方、すなわち適す−な溶液中でのＡＨ枠検出みに
関するものである。 一般的には、イムノアッセイシステムによる適当な流体
中のＡＨの検出は、Ａｌ１とＡｇの特異的相互反応によ
るΔｂ／Ａｇ錯体の生成に依存し、これは遊離Ａｈおよ
びＡｇから分離してＡｌｌ／Ａｇ錯体の検出と定量を可
能にすることを必要とする。これら錯体の検出は種々の
イムノアッセイ技法により達成できるが、多くの方法で
は先行段階として（ａ）Ａｇまたは（１））ＡＩ）の何
れが一方に結合する適当なラベルを含んでいる。 ラベルしたＡｇを用いるイムノアッセイでは、これは溶
液中でも適当な固相を用いてもなし得るが、これらのア
ッセイはすべて共通する１つの問題、すなわち高度に精
製した［トレーサー純度−１の抗原の製造という問題を
かかえている。このような抗原の製造は、しばしば高価
につき、かつ困難で、ある場合にはこれら両要因が結合
して商業的使用を目的とするラベルＡｇ法の開発を不可
能にすることさえある。 ラベルしたＡＩ）を用いるイムノアッセイについては、
このタイプのアッセイは通常Ａ、またはノ＼］〕と結合
した適当な固相を用いて行なわれる。しかし、あらゆる
入手可能なアッセイシステムの糾合せ中で、問題のある
精製ＡＲ製造の必要性を除外し得るのは「２サイトアツ
セイ」のみである。 「２サイトアツセイ」は、同時に２個のＡｂ分子に結合
し得るＡｇに対してのみ実施可能である。 このアッセイでは、特異的ＡＩ３を適当な固相に結合し
、Ａｇを含む溶液を、Ａｇの「捕獲」可能な感受性面と
インキュベートする。過剰の流体を洗去し、第２のラベ
ルＡｇ特異性Ａｂからなる結合体（ｃｏｎ　１ｕ８ａｔ
ｅ）を加え、このラベルＡＩ）は固相上に捕獲されたＡ
ｇを「タッグＪ（ｔａｇ、特定化または標識化）する能
力を有する。 「２サイトアツセイ」の利点は多数存在する。すなわち
、 （ｉ）精製した抗原を必要としない。 （ｉｉ）実験動物に対して免疫原性を有する、または免
疫原性にできる任意の物質について使用で外る。 （ｉｉｉ）水溶液として提供できる任意の免疫原性物質
について使用でべろ。 （ｉｖ）適当なＡｂを用いると、Ａ、溶液と「タッグ」
Ａｂを同時に固相「捕獲Ａ１）」に加えることかでと、
したがって極めて短時間で実施でトるｆ！！］、！’Ｉ
ｔなアッセイシステムを提供する。 「２サイトアツセイ」システムの重大な制限条件は適１
１′ｌな［捕獲」および「タッグ」Ａ１］を充分な量だ
け製造することであり、これは弱い免疫原である所のあ
る種のＡｇまたはＡｇ決定基に関して特にいえることで
ある。これは商業的アッセイにおいて極めて重要であり
、最近になって、ハイブリドーマ技術を用いることによ
りようやく取組まれ、［２サイＦアッセイ−１の草大な
能力を充分利用することが可能になった。ハイブリドー
マ技術は、無類の抗原特異性と抗原決定基特異性を有す
る［捕獲１および「タッグ、１モノクロナル抗体（以下
、Ｍａｂ−７＝ と略すことかある）をほとんど無制限の甲だけ生産する
ことを可能にした。ハイブリドーマ技術によってもたら
される要点は、被検Ａｇにのみ存在し飢の分子には存在
しない特有の抗原決定基に結合する［−捕獲１Ｍａｌ）
として特異的に使用でとるＭａｂの生産に存する。、二
うしで、従来製造された類１１゛ｊ、の抗原決定基を有
する分子と交差反応をもたらすポリクロナル抗血清（以
下、Ｐ　Ａ　ｂと略すことがある）では、Ａ、決定基特
異性がないため、従来不可能であったＭａｂｌ抽獲１捕
獲ッグ−１アツセイが、午や構成可能となった。 種々のタイプの同相表面が２サイトイム７アツセイに関
して用いられたが、その中には車端が開放された試験管
があり、抗体は試験管の底面−にに置かれる。しかし、
試験管をこのような方法で用いると、被覆されるべき表
面域か天外なため、過剰量の捕獲Ａｌｌの使用をもたら
すという問題があった。また、試験管の被覆部からの非
結合材料の洗い出しについても問題があった。これに関
係するのは、バックグラウンドシグナルが高すぎて効率
８− 的か−）正確な結果の解釈に問題を生ずる場合のシグナ
ル増幅過程における検出である。 プラスチックビーズまたはセファロースビーズも用いら
れるが、このようなビーズにおける大外な問題は、非結
合材料の除去に遠心分離を必要とｌ２、これは時間がか
かり、多数の試料を処理する場合非能率的で・ある。 最近になって、４８または９Ｇ個のウェルを有するプレ
ートを用いたマイクロタイタープレート法が使用される
ようになったが、このようなプレートは、多数の被検試
料の処理には能率的であるものの、１回または少数の試
験、特に実地条件でＷｆ’、験するのと逆の条件で行な
う試験では能率的でない。 また、主として前述したＥＬＩＳＡのようなＥＴＡおよ
びＲＴＡ、フルオロイムノアッセイ（以下、ＦＩＡと略
すこともある）または化学発光に基づ〈従来のイムノア
ッセイ法における別の問題点として、高価につき、また
は比較的小さい実験室もしくは試験面では都合が悪い電
気的または電子的シグナル増幅装置を必要とすることか
含まれる。 実地条件下で１回限りの使用が可能で、洗浄（セルロー
スアセテートディスク、プラスチックビーズの場合）ま
たは生物学的試薬の使いすぎ（試験管の場合）の問題が
なく、２サイトアツセイの全能力を生かすモノクロナル
抗体技術と結合したアッセイシステムの開発が、明らか
に必要とされている。 また、ひとまたは動物から得られた流体試料について、
その流体試料を実験室へ送ることを要さずに特定の疾病
の徴候を試験できる診断試薬を含んだ試験キットを用い
た、迅速かつ能率的なイムノアッセイ法または診断法を
実施可能とすることが、開業医、獣医、学生、実験技師
等および農場経営者、農場労働者、看護婦等の半熟線溝
の間でしばしば希望されている。このように、［実地に
−１または［即座に一１使用でトるＥＴＡのようなイム
ノアッセイ法については、事態はよくなかった。 米国特許第４２９４８１７号は、特定の型の７ルオロメ
ーターでの分析を必要とする、シングルサンプラー」−
に設置した２個の試験面を用いるイムノアッセイ法を記
載している。このサンプラーは、被検血清試料、洗浄用
溶液、イムノフルオレッセント抗体含有溶液に連続的に
通され、最後に最終洗浄用溶液に通される。次いで２個
の表面の蛍光測定値を差引いて差測定値をイｌ、これが
対照血清溶液で得られた差測定値と比較される。しかし
、ここでは、上記差測定値を得るために通常必要な特殊
な型のフルオロメーターだけでなく、やはりｊ１１常必
要なマイクロコンピュータ−アクセサリ−も必要となる
。したがって、この試験法は比較的能率的ではあるが、
なお比較的複雑なシグナル増幅装置の使用を必要とする
。 また、−に記イムノアッセイで用いるサンプラーは、硝
酸繊維素および酢酸繊維素のフポリマーである特殊な多
孔性材料からなる複数の円形ディスクを粘着テープまた
は適当な接着剤で棒または管に付着またはイー１設して
なるものである。このような方法は、ディスクに抗原ま
たは抗体を適用した後、これらを特定の条件下で比較的
艮時間乾・１４ＹＨする必要があるので、極めて時間が
かがる。また、米国時３′Ｆ第１１２　！］　−’Ｉ　
ｔｉ　ｌ　７号に記載されているように、ディ入りはあ
る特定の抗体または抗原に月してのみ適゛１′１である
。セルロースディスクは多孔性であるｔこめ、多数の非
特異的物質とも結合ししたかって効果的な洗浄手段を必
要とするという問題か起る。 最近、下記「稈すなわも （１）未知抗原または抗体を含む試］′１を、試ｔ′ｉ
中の抗原に対応する抗体を１７１着したキャンプの内面
に接触させ、 （１１）キャップを適゛１）な酵素結合体（ｃｏ＋１ｉ
＋＋ｇａｌｅ）と接触させ、 （ｉｉｉ）キャップを酵素の基質と接触させる工程を含
むイム７アツセイ法を記載したオーストラリア特許明細
書第６８１１７　／　ｉ’ｔ　１号か発行された。 キャップの内面は、外側へ向かう突出部またはキャップ
内に付着もしくは保持された別部材を有することができ
、これらには抗原または抗体を付着させておくことかで
外る。 −に記の技術は、逆条件または蛇の咬傷の診断のような
実地条件下の試験に有用であると述べられている。しか
し、実験の結果、内面に抗原または抗体をイ」着したキ
ャップを未知試料含有容器に装着すると、容器を倒立し
て、容器がキャップ」〕にあり、適当な反応が生起して
試料中の抗原または抗体がキャップ内面に付着した抗体
または抗原と結合で外るようにする必要があることがわ
かった。 この方法は、反応後にキャップを適当なだけ洗浄する際
に１１４５．１１を生ずるとの欠点があると思われる。 すなわち、特許第６８１１７／８１号記載のねしつぎキ
ャップを使用すると、キャップ内面からの試薬の洗い出
しに困難を生ずる。 したがって、イムノアッセイ法が信頼できるためには、
効果的な洗浄法を備える必要があることを銘記しなけれ
ばならない。イムノアッセイ法の後続工程中の洗浄工程
が効果的でないならば、最終結果に誤差が入りこみ、不
正確な結果が得られ−１−配性杵築６８１１７　／　８
１号で゛は、キャップ。 と試薬または試料含有容器の１１′１接面か接触し　し
たがって、キャップが堅固に容器に固着していない場合
には液体が直接漏出してキャップと容器間のｄ４．接面
間を通る、二とができる。別の場合には、このような晶
出は毛管現象によ１）、また場合によっては表面張力ま
たは圧力勾配のために起り得る。 この欠点は、特許第６８１１７／８１号明細が１に記載
のようにねじつきキャップを使用し、その後に容器を倒
立させて容器をキャップの−１−に位置させ、抗原抗体
間の反応を行なわせる場合に最も顕著である。また洗浄
工程は容器の振盪を伴うので、液体の漏洩を防ぐために
はキャップが極めて堅固に容器を密封していなければな
らない。 したかって、これ等の要因により明細書６８１１７／８
１号に従って実施された分析結果の再現性が疑問であり
、それは、洗浄工程が不完全であるために不純物あるい
は異抗原のような汚染物が存在して抗原抗体反応を妨害
する危険性があるためで゛ある。）Ｉう染の、１４つや
すさは特δ′１明細９ｊ、６８１１７／８１号に記載さ
れている２つの洗浄工程に」二って緩和される。 ′＋：、た、未経験者か−４−記イムノアッセイ法を実
施した際１−述したような汚染が］ニリ頻繁に生じ易い
ことも銘記する必要かある。 特許ｎＪ団１１プｊ６ｎ　１１７／８１号に記載された
ようなチューブあるいはロッド等の伺属部分を有するキ
ャップを用いることに関して、記載された唯一の試験例
は、ゴム製乳首および液体を当該チューブに引き込みあ
るいはそこから放出するために差動圧力又はポンプ動作
を必要とする従属チューブを有する滴下式キャップを用
いたものである。 そのようなキャップの洗浄は通常のねし付キャップにお
けるものと比べてより困難であり、したがって−に述し
た不都合が含まれることになる。そのようなキャップを
用いることは、キャップおよび従属ロッドあるいはチュ
ーブをプラスチックで一体成形した場合におけるよりも
可成り高価に付く。 もし従属ロッドあるいはチューブがキャップと分離され
て接着剤によりそのキャップに接着しなければならない
ものであれば、液かキャップと従属ロッｉζ゛あるいは
チューブとのす′１接面領域へ到達すると汚染か生じる
危険性かあると考えられる。 特許明細ｐｊ６　）ｉ　１１７／　８１号に記載される
Ｊ：うな従属ロッドあるいはキャップを備えたキャップ
は比較的大きな入［］を有する容器に月してのみ用いる
ことかで外、従ってそのようなキャップは狭小なあるい
は限定された人［１を有する容器に対しては不都合であ
り、該入口は毛細管現象および表面張力効果のために適
正な洗浄操作を行ない’ｌｌｊいものにすると言えよう
。 特許明細％：’　６Ｆ＋　１１７　／　Ｆ＋　１号に記
載される方法のもう１つの不都合点は、それか単一適用
に向いており、後述するような本発明と同様の方法で多
数抗原検定用として容易に使用し難いことである。 また、特許明細がｊ：６８１１７７８１号の方法は、本
発明にｔ）いて必要とされずそれだけより簡素化せしめ
る、キャップと容器間の水封を必要としている。 最近、文献Ｃｚｅｃｌ＋、ｐａｐｅｒ　２１）１．Ｂａ
ｋｌ、、　ｌ−１ｙ、７゜Ｔ、Ａｌ１１．、　Ｏｒｉｇ
　Ａ　　２４ｒｌ、　　１１２−１１７（１９７９）お
よび２＋］１．　　Ｂａ１ｒ１．、　　Ｉｌ−１ｙ、Ｔ
、ＡＩ）ｔ。 Ｏｒｉｇ　Ａ　２４（）、１１８−１２２（１９７８）
に記載されているように、丸味をイ；１けた端部を有す
るポリスチレン製攪拌棒が抗原キャリヤとして用いられ
、そこでは最初攪拌棒の丸形端部が抗原溶媒中に浸入さ
れる。多数コーティングを行うために、複数本の攪拌棒
あるいは“スティック゛’ｅ（）が−塊に束ねられると
ともに約２ｃｌＩｌの間隔をもって十字状に２段配列さ
れたゴムバンドで形成された網目に刺し込まれる。ステ
ィック束が抗原中に一夜設置され、そして、該スティッ
ク束は乾燥した後洗浄され段階的なＡ８低低下度を有す
る一群のチューブ内に設置される。その後、Ａｇがコー
ティングされたスティックは血清希釈液を含有する一群
のチューブ内に置かれ、次いでインキュベートされる。 これ等のスティックは、洗浄後酵素結合抗ひと免疫グロ
ブリンを収容する一群のチューブ内に置かれる。インキ
ュベーション後、これ等のスティックは洗浄され、そし
て酵素基質溶液を充満したチューブへ移送される。その
後、該基質からこれ等のスティックを除去して酵素反応
が停屯せしめられる。その後、これ等の基質チューブか
測光によ１）５ダ、―み取られる。 しｈ化、１−記チエフ文献（ＣＺｅｃｌ（ｐａｐ（・ｒ
ｓ）では抗体あるいはＭＡ　１１ではなく抗原を担う貯
蔵担体の使用についてのみ記載され、かつ多数回使用に
−）いては想像されているだけである５゜オーストラリ
ア国特許第５２１１１０２号では、図面に示すように複
数のフィンから構成される種々の複雑な形態の挿入マト
リックスを用いたスティックあるいは挿入型アッセイの
使用が記載されている。精巧なマトリックスの全てが試
料容器の内側面にぴったりと近接せしめて取り付けられ
ることに注意しなければならない。精確”に挿入するこ
とは困難であるぽかりでなくその製作が高価であり、そ
のような挿入材は、反応液の毛細管粘着のために排出が
不十分となり、したがって当該挿入材の洗浄が厄介で゛
あり、実地（ｆｉｅｌｄ）アッセイあるいは派遣アッセ
イ（ｂａｒｅｆｏｏｌ、ａｓｓａｙ　）には不適当なも
のとなろう。この問題点は特に本発明において参考とさ
れた。 上記特許第、５２１００２″；ｊは明らかに−に述した
ような７トリツクス挿入材の性質に起因して実験室型ア
ッセイにのみ指向されたものであり、前述したように２
サイ）・アッセイにおけるモノクロナル抗体の使用には
何ら言及していない。それは単にポリクロナル抗体に言
及しているだけである。 また、当該アッセイ手順を派遣アッセイあるいはそこで
使用される反応キットに応用することには言及していな
い。 ＥＴΔイムノアッセイあるいは゛派遣゛イムノアッセイ
の分野に関して、そのようなアッセイは十分に良好に開
発されてはおらずかつポリクロナル抗体を使用すること
により特異性を欠トおよび結果を有意であると考えるに
必要な手順が実験室条件下で実行しなければならないと
いう範囲内で欠点を有していた。」−記チエコ文献は１
ｎに複数スティックによるＪ（壁コーティングを開示し
ているだけで゛あり、しかも該コーティングは抗原ある
いはポリクロナル抗体から生じたらのである、二とのみ
を記載している。 従って、この発明の目的はフィールドイム７アツセイの
分野において、イムノアッセイを効率的にし、かつ特に
実験室を利用でトなくても正確な結果が１１られる有用
な方法および反応システムを提供することにある。 この発明は、体物質および体液中に含有される抗原に特
異的なモノクロナル抗体を細長いプローブにコーティン
グすることによりフィールドイムノアッセイを効率的か
つ正確に行い得ることを見い出したことを基礎とするも
のである。 この発明は“１そのま主の状態で（ｉｎ　　ｓｉｌ、ｔ
＋）”試験するためのフィールドイムノアッセイ反応シ
ステムを提供するもので、この装置は 体物質または体液中に含まれている抗原に特異的なモノ
クロナル抗体で少くとも部分的に被覆された探針プロー
ベ主たけキャリア、 複数の容器、 モノクロナル抗体に対する抗原の非特異的結合を妨げる
洗剤または他の過当な物質、 緩衝剤、 信号増幅または検知手段 から構成される。 目盛棒プローベあるいは担体を形成するに適当な材料は
」１記ＭＡｌ）に関する限りにおいて吸収性である実質
的に非孔質のものである。そのような材料は非孔質であ
ることが好ましい。そのような材料としてはプラスチッ
クが適当であり、その具体例は、ポリスチレン、アクリ
ル、改質アクリル、ポリアミド、ナイロン等である。 上記目盛棒部材はその各端部を開放したロッドあるいは
チューブから成る。ＭＡｂ、が勿論サンプル容器内の抗
原に近接し得る挿入部分に加えられ、この挿入部分はロ
ッドの外面、あるいは開放端部をもつチューブの内およ
び外面としてもよい。 好ましくは、ロッドが使用される。 また、上記目盛棒担体の挿入部分はハンドル部に比して
拡大されるとともに、その−１−にＭ　Ａ　ｂのコーテ
ィングを増大すべく実質的に表面積を増大せしめるよう
に、１つ又はそれ以上のリブ、溝、外方突出部、あるい
はキャビティあるいはそれ等を組み合わせたものが設け
られているのが好ましく１゜ 上記チューブあるいはロッドは随意の適宜な形状および
断面積を有し、したがって断面形状を丸形あるいは矩形
としたものであってもよい。一方、このチューブあるい
はロッドは多面体、即ち、断面形状が六角形あるいは多
角形のものであってもよい。 上記反応システムあるいはキットを組み立てる前に、目
盛棒担体の挿入部は所定の時間（例えば１５分間あるい
はそれ以」二の時ｆｉｌ′ｌ）ＭＡｂ溶液中に浸漬され
て該Ｍ　Ａｌ１がそこに付着せしめられる。 Ｍ　Ａ　＋１は」１記［１盛枠部材の挿入部に受動的に
あるいは能動的にコーティングする。二とができる。Ｍ
Ａｌｌは水素結合、ファンデルワールス（Ｖａｎ　　ｄ
ｅｒＷａａｌｓ）力、場合によっては共有結合あるいは
その他その伸長部とＭ　Ａ　ｌ）間の相互吸引力に基づ
いて目盛棒部材に接触せしめられる。この工程は、好ま
しくは、通常のインキュベーション温度および所定の生
理学条（′巨例えば２７〜３７℃）とすることがでおる
が室温でも実施し得る。所望であるならば、このＭＡｌ
＋は冷凍機等にＪ：り目盛棒部材に凍結せしめられる。 その後、上記目盛棒担体が体物質サンプルを収容する容
器内に挿入され、そして該体物質サンプルに含有される
抗原がコートされた捕獲Ｍ　Ａ　ｌ）と！／ｌ−ｉ今さ
せられる。そして、」−記目盛棒部材は引き出されて、
燐酸緩衝食塩水（以下にＰＢＳと記す）等の適宜な洗浄
剤で洗浄される。この洗浄工程は繰り返し行なうことが
できろ。捕獲された抗原の検出は捕獲ＭΔ１）抗原反応
生成物と結合する第２酵素結合タッグＭ　Ａ　＋１を用
いて行なわれる。信号増幅手段の一例である基質を添加
した後、当該サンプル中の未知抗原量がＥＴＡ技術で決
定される。 コートされた口噛棒担体とサンプル体との接触は室温で
行ない得る。適切な洗浄剤はＰＢＳ（燐２３− 酸緩衝食塩水）あるいはＰＢＳとトウイーン（ＴＩＩＩ
ｅｅｎ）との混合物である。」二連した接触工程は０１
１５〜６で適宜に行なわれる。適宜なイオン強度の」１
限は１Ｍである。これ等の条件はＭ　Ａ　Ｉ＋の伸長担
体への接着にも用いられる。 この発明の方法を用いれば、通常アッセイ用にサンプル
を濃縮するすこめのどのような濃縮工程をも必要としな
い。よって、大量のサンプルが初めから得られ、サンプ
ルのどのような初期濃縮をも克服することができる。 この発明の方法により種々の抗原を広範囲に互って分析
することができ、これ等の抗原には動物体あるいは体液
内の抗原も含まれる（ひとの体内物質または体液、例え
ば糞、リンパ液、尿、あるいはこれらの成分を含む血漿
、血清等の血液、血塊あるいは血液フィブリン、唾液、
細胞外液、脳を髄液、紹織ホモジネートあるいはそれ等
のいずれかの溶液をも含む）。特に、この発明は動物の
排泄液および分泌液の診断を行なえるようにしたもので
ある。 ２４− 第２ＭＡｌ＋用標識酵素は、好ましくは、ベルオキシタ
ーゼ、β−がラクトシターゼ、アルカリホスファターゼ
およびウレアーゼから選択される。 ベルオキシターゼ用に適した酵素基質はＯ−フェニルン
アミン、Ｏ−）リジンあるいはＡＢＴＳ（即ち、２−２
アジノージ−（３−エチルベンゾチアソ゛リンスル７オ
ンー６）である。β−ガラクトシターゼに適した酵素基
質はバラあるいはオルソニトロフェノール−β−Ｄ−ｆ
ｊラクトシターゼがある。ウレアーゼ用に適した基質は
尿素であ１）、アルカリホスファターゼ用に適した基質
はパラニトロフェノールホスフェートである。 この発明に係る反応システムにおいては、フィールＩＳ
使用のために、酵素で標識された第２ＭＡ１〕は凍結さ
れ、あるいは他の適当な処理をされる。 ベルオキシターゼを使用するときは、通常、過酸化水素
が所要のファクターとして存在する必要がある。 標識第２ＭＡｂの代わりとして、もし伸長担体れば、信
号増幅段階は直接的に捕獲した抗原に所定の試薬あるい
は複数の試薬により検出可能な化学反応を生起せしめる
ことにより達成される。 この発明１こおいて用いられる緩衝剤は好ましくはＰＢ
Ｓとされるが、クエン酸緩衝剤あるいは乳酸緩衝剤等の
ような池の緩衝剤を用いて約７　ｐ　１４程度を呈する
ようにしてもよい。この緩衝剤はシステｌ、に粉体の形
態で供給され得るが、所望であれば液体の形態で供給さ
れるようにしても上い。 洗浄剤成分は、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレートとされるが、当該技術分野の専門家
にとって明らかであるように他の適宜な洗浄剤とするこ
ともできる。洗浄剤成分はプローベあるいは担体にフー
トされたＭ　Ａ　＋１に対して非特異性結合を防＋ｌせ
しめる必要がある。洗浄剤は濾紙に吸着せしめたような
乾燥した形態で供給され得るが、液状形態で供給するよ
らにしてもよい。 もし殺菌力あるいは殺細菌力が要求されるならチルマー
キュリチオサリシレートか゛用いられる。 もし緩衝剤が液体の形態で供給されるならば、それに殺
菌剤を加える必要がある。しかし、この発明の反応シス
テムが無菌状態に包装されるのであれば殺菌成分を省略
することがでとる。 好ましくは用いられる容器に試験チューブが用いられ、
これ等は、ある１つのチューブをその他のものと識別す
るために色コードあるいは適宜な識別手段が設けられる
。幾つかの試験チューブは、伸長担体が１つの容器から
他の容器に移送される際の洗浄の目的にのみ用いられる
とともに、幾つかの試験チューブはサンプルあるいは標
識酵素第２モノクロナル抗体等のある反応剤を収容する
のに用いられる。 酵素基質のような成分は適宜に薬びんあるいはアンプル
に隔離される。 信号増幅段階あるいは検出段階にＥＩＡ試験を用いる際
、好ましくは、試験結果を査照するのに色彩標準あるい
は携帯比色計が用いられる。 また、ｔＪＴよしくけ、１つ又はそれ以」二のループ２
７− ダイリュータ−が設けられで、サンプルあるいは試薬の
、希釈剤を含む試験チューブへの移送か有効に行なわれ
るようにされる。 次に、この発明に係るイム／アシャイ方法を説明するた
めに詳細な試験手順を述べる。後記実施例では、反応シ
ステムまたはキットに用いる試薬は下記のようにして製
造する。 リーン−耐１霞衝塚←１こ一貝４））−粉−木塩化ナト
リウムｆ’）、１６ｇ、塩化カリウム０　、ＱＯ４，ｇ
、　　リン酸水素二ナトリウム０．０２３ｇｔ；よびリ
ン酸二水素カリウム（１、（’１　（ｉ　４．　Ｈの混
合物。 −卜・ンイーーン含〜濠紙− この試薬は、シ戸紙片に１０％トウィーン２０（ポリオ
キシエチレン　ソルビタンモ７ラウレ−１・）１００μ
ｅを滴下し、空気中で乾燥させて製せられる。 醇濤基−質、液− これは、クエン酸塩５０＋ｎＭ、（’）−）リンンジヒ
ドロクロリド２．５ｍＭおよびＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｆ’）
　、　（１２５ｍＭ（ｐＨ４、５）から製せられる。 ２８− 一ペソ１７にキーシーグ＼＝ビ（１昏イｊ（−／　？　
ｌス四村〕１抗イ水、これは以下の操作により製せられ
る：カルバイオケムラボラトリー販売のせいようわさび
ペルオキシダーゼ５ｍ！？を蒸留水１．０ｍｌに溶かし
、ｏ　、　］　ＭのＮａ１０．０．２ｍｌを加える。金
色から緑色へ色彩変化が生しる。その混合物を室温で２
０分間静かに混合する。遊離したＮａｌ０諌ゲル濾過に
よって除去する。デル濾過カラムをｐｌ−１４、！′）
のクエン酸塩緩衝液Ｃ）、旧）　Ｉ　Ｍで・平衡させる
。以下の実施例１および２で述べるようなひと１）ダイ
マーまたは犬心臓寄生虫抗原から製せられたモノクロナ
ル抗体は、イム７グロプリン２ｍｇにＨＲＰｏ　１　＋
ｎｇの割合で加える。ｐＨ９，５のＮａ２Ｃ（−）、緩
衝液ＩＭを加えて最終的なｐＨ９，ｉ）〜９゜５Ｈ：）
る。これは、アミンにアルデヒドを結合するために最適
の、　Ｉ−１である。生成混合物を室温で２〜３時間静
かに混合する。その後、２．ＯＭのエタノールアミン２
０Ｃ）μ（゛を加え、ＤＩ（を９８５に調節する。混合
物を４℃で一夜インキユベートする。エタノールアミン
をデル濾過で除去し、メチオレー）（ｒｌ、０１％）エ
チルメルクリチオサリチレートを加え、結合抗体を４°
Ｃで゛保存する。最終キットの製造のために結合Ｍ　Ａ
　＋１は１（）％蔗糖中でＩ　／　］　０に希釈上この
溶液１０μθを適当な管中で凍結乾燥する。 （７）−一ナノに抗一体を一塗布−またツー一二さプロ
ーベは、本体が拡大されて板状をなし広い両面に複数の
（例えば６へ・）３の）横リブが配置されたポリスチレ
ン針を、適切１こ精製したＭＡＩＤ（たんばく貿１０μ
ｇ／ｍｌ）中に２ｃｔｎの深さに室温で１時間浸漬する
ことにより製せられる。塗布した釧は、その後、ｒ’Ｒ
８／）ウィーン中３ｃ＋＋＋の深さに浸すことにより３
回洗浄し、５分間放置し他のＰＢｓ／）ウィーン容器に
移す。洗浄した狽は、未反応結合部位（シグマＡ４５（
’１３）ＰＢＳ中１０ｍ１？／＋ｎｌを取−）二げるた
めにうし血清アルブミン溶液中に３ｃｔｎの深さに室温
でさらに１時間浸漬し、ＰＢＳ／ｌウィーン中でさらに
３回洗浄する。最終的に創は、過剰液を除去するために
軽く打も振り、空気乾燥する。 一実施例−１− 散在性脈悴内凝−ｇ５←■しｑｙρ−測定用ｄ１５嬰−
中−ｐ−とヌ差結イど７−イーブーりン透導体−の検−
出この実施例では、反応プローベは、適当な溶液から特
異＋！１抗原を捕獲でとる特異性モノクロナル抗体で被
覆されており、反応プローベに固定された捕獲抗原は、
次に、適当にラベルされた第２モノクロナル抗体を用い
てタッグされる。 ひとＤダイマー抗原に対するモノクロナル抗体は、ガル
フレ（Ｇａｌｆｒｅ）等により確立された技術〔ネーチ
ャー（Ｎａｔ、ｕｒｅ）、−２，−ｆｉ瓜、５５０５５
２（１９７７））に従って以下のように製せられる：（
ｉ）ひとＤグイマー抗原によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免
疫 （ｉｉ）細胞融合剤としてポリエチレングリコールを使
用した融合による、過程（１）で得られた免疫マウスか
らの胛臓細胞とＮ５−１マウス骨髄腫細胞とのハイブリ
ドーマ細胞の生成。 （山）組織培養で」−記ハイブリドーマ細胞を繁殖させ
ることによる、抗−Ｄダイマーモノクロナル抗体分泌ク
ローンの生成。 （１ｖ）腫瘍が作られているＢＡＢＩ、／ｃマウスに過
程（ｉｉｉ）で６．　ｈれなりローン化ハイブリドーマ
細胞を注入することによる、抗−Ｄグイマーモノクロナ
ル抗体の分泌。 （ｖ）過程（ＩＶ）で注入されたマウスからのモノクロ
ナル抗体の採取。 この技術を用いて、下記の抗−Ｄダイマーモノクロナル
抗体を製する： （、）クローンＢ　４２，７ＪＲ６／２２（１））クロ
ーンＤ　　４４．’ｉ、４Ｄ２／１８２Ｂ４２，７．３
８６／２２モノクロナル抗体で被覆した反応プローベは
（前記したように）製する。 −キーンートのｊＱ−１月 テストキットは、３Ｘ２＋ｏρの空テストチューブまた
は容器、凍結乾燥したぜいようわさびベルオキシグーゼ
結合ＭＡｂ　　Ｂ／１４．７．４．ｒ１２／］８２を収
容する１個の２　ｍ　、（’、赤キャップチューブ、洗
浄剤を含浸した紙片とＰ　Ｂ　Ｓ緩衝剤粉末を収容する
分離ノズル付の１個のふたをした２（’Ｌｎ（！点滴び
ん、ＭＡｂ　　Ｂ４２，７゜３Ｒ６／２２で被覆したポ
リスチレン創、５ｏμｅグイリュータ−１および １、緑色アンプル：３％過酸化水素（’）　、　７５　
ｍ　、ｆ”２、黄色アンプル：Ｏ−）リジン基質液１　
ｍ　ｐ３、桃色アンプル：青色色彩標準ｈθ を含む色彩コード化密月ガラスアンプルから構成される
。 完全なキットは、試薬を配置するための厚紙ホノげ−お
よび指示再セットをも備えている。 Ｄダイマー用のテストを実施する前に、いくつかのキッ
トの錐備が要求される。 １、紙片と緩衝剤粉末とを含有する点滴びんに蒸留水２
ｏｍ、ｅを加えて満たす。ノズルを挿入し内容物を混合
する。 ２、第１の空チューブに緩衝剤１０滴を加える。 グイリュータ−の助けをｆｌｌってテストサンプル５０
μｒ（を移送腰内容物をループで１０秒間くり返し攪拌
混合する。 ３、赤キャップチューブに緩衝剤２０滴を加え、内容物
を反転混合する。 ＠定手順 テストは以下の必要な過程で行う。 １、ＭＡｂ被覆プローベをそのサチェットから取り出し
、希釈したテストサンプルを含有するチューブ中に置く
。４５分間放置する。 ２、．３．および・１．第２の空テストチューブの首ま
で緩衝剤を加え、洗浄のためにこのチューブにプローベ
を移す。３０秒間回転後、プローベを３０秒問放置する
。その後、プローベを取り除き、このチューブの内容物
を捨てる。チューブに再びｙｒ鮮な緩衝剤を満たす。十
分な洗浄を行う。 その洗浄処理を２回以」二くす返す。 ５、赤キャップチューブにプローベを移し、・１５分間
放置する。 ６、　、？、すほび８．第３のキャップのないチューブ
にプローベを移し、−Ｉ−記２，１．および４゜と同様
に処理する。 ９、緑色アンプルにプローベを移し、３０秒間放置する
。 １０、黄色アンプルにプローベを移し、３０秒間回転さ
せ、５分間放置する。１０分後にプローベを捨てる。 このアンプルを清浄で白い背景に対して保持したとき、
色彩標準（桃色アンプル）よりも強い青色の存在が測定
される。テストサンプルが特異性抗原を含んでいれば、
淡青色から暗青色にわたる青色色彩が得られ、色彩度は
存在する抗原量に比例する。実験室で定量的結果が必要
であれば、緑色アンプルの中味をキュベツトに移し分光
光度計でＡＡｌ１２０ｎの吸収を測定する。ひと血漿サ
ンプルでの検定結果を以下に転載する表１に示す。予備
評価のために、色彩標準を０．１０（ｌのＡ６２０１ｕ
ｌｌ値を０．１００に設定する。 表　　１ サンプル（１）プローベ検定　　　　　（２）　　　　
　　　（３）視覚測定　　　定量的測定　　　Ｄダイマ
ー　　　確認したＡｂ２ｏ　　　　　　　　　　　　　
　ｎｇ／Ｊ　　　　　　　　　　Ｄ　　Ｉ　　Ｃ＋　　
　　＋＋　　　０．４＋５　　　　　２０ｆ）　　　　
　有２　　　　＋＋　　　〇、４４５　　　　１２０　
　　　　　有３　　　＋＋＋　　０．１３６　　　　４
５１１　　　　　　有４　＋＋＋　０．８８７６２０有 ５　　　＋＋＋　　（１，７５３２８ｆ’ｌ　　　　　
　有６　＋　０．２５２　８ｆｌ有 ７−１１．（１５無 ８−１’１．０４４無 ９−０．０２６無 ＩＱ　−（’１．ｆｉ４Ｓ無 （１）　　　−青色なし 十　淡い青色 十十　普通青色 ＋＋＋　濃青色 （２）　リラット（Ｒｙｌａｔ、１．）、　Ｄ、Ｂ、　
′！４；　１１トロンポス・Ｌｉス”　（ＴＩ＋ｒｏｎ
＋Ｉ〕ｏｓ　　Ｒｅ５）、−３−１，７６７７７８１１
９８３年およびエルムス（Ｐ、ｌ＋ｎｓ）。 ＭＪ等パトロンブ・ホメオスビ（Ｔ　Ｉ＋ｒｏ＋ｎｂ　
　Ｈ。 ｍｅｏｓｔ）、５０−．５’、）］　　５９４，１９８
３年に記載された手順に従って行なう。 （３）ウアーン、Ｊ、Ｍ、およびオスキ、Ｆ、Ａ。 の採点システム、“カン・メト・アソック゛”（Ｃａｎ
Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、　　、Ｊ、　）、↓０７，９６３
−９６７により診断されるＤＩＧ特性。 メυ１例ス この実施例において、反応プローベは、適当な溶液から
特異性抗原を捕獲できる特異性抗いぬ糸状束ＭＡｂで被
覆されており、反応プローベに固定された捕獲抗原は、
その後、適当にラベルされた第２抗いぬ糸状束モノクロ
ナル抗体を用いてタッグされる。 いぬの心臓の寄生虫（いぬ糸状束、ケ−（μス不うヲ）
７　　’ｆｊ７”が）抗原に対するモノクロナル抗体は
、ガルフレ等、ネーチュア（Ｎａｔ、ｕｒｅ）、　２予
−６１５５０５５２（１９７７）によって確立された技
術により以下のように製せられる：（ｉ）いぬ糸状束抗
原によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫 （ｉｉ）細胞融合剤としてポリエチレングリコールを使
用した融合による、過程（ｉ）で得られた免疫マウスか
らの肺臓細胞とＮＳ−］マウス骨髄肝細胞とのハイブリ
ドーマ細胞の生成。 （ｉｉｉ）組織培養で上記ハイブリドーマ細胞を繁殖さ
せることによる、抗いぬ糸状束モノクロナル抗体分泌ク
ローンの生成。 （ｉい腫瘍が作られているＢＡＢＬ／ｃマウスに過程（
ｉｉｉ）で得られたクローン化ハイブリドーマ細胞を注
入することによる、抗いぬ糸状束モノクロナル抗体の分
泌。 （ｖ）過程（ｉｖ）で注入されたマウスからのモノクロ
ナル抗体の採取。 この技術を用いて、下記の抗いぬ糸状束モノクロナル抗
体を製する： （ａ）りｏ−ンＢ　４９，８１　　Ａｌ１５３（Ａ）（
ｂ）クローンＢ　　４．８，８，４．　　Ａ４／４．５
（Ｂ）（ｃ）クローンＢ　　４８，８．４　　Ｃ２／１
２１（Ｃ）上記モノクロナル抗体（ａ）、（１＋）また
は（ｃ）で被覆した反応プＵ−べを（前記したように）
製する。 −４＊ｐｊＨ＠　検’ｆｉｌ テストキットは、３Ｘ２Ｊの空テストチューブまたは容
器、実施例１により得た凍結乾燥したせいようわさびペ
ルオキシダーゼ結合Ｍ　Ａ　ｂ　　Ａ、ＢまたはＣを含
有する１個の２　ｍ　、（ｌ赤キャップチューブ、洗浄
剤を含浸した紙片とＰＢＳ緩衝剤粉末を含有する分離ノ
ズ′ル付の１個のふたをした２０１点滴びん、ＭＡｂ　
　Ａ、ＢまたはＣで被覆したポリスチレン針、１０μで
ループグイリュータ−１および １ｏ緑色アンプル：３％過酸化水素０．７５Ｊ２、黄色
アンプル二〇−トリシン基質液１．　＋ｎρ３、桃色ア
ンプル：青色色彩標準１− を含む色彩コード化密封ガラスアンプルから構成される
。 完全なキットは、試薬を配置するための厚紙ホルダーお
よび指示書セットをも備えでいる。 いぬ糸状車用のテストを実施する前に、いくつかのキッ
トの準備が要求される。 １、紙片と緩衝剤粉末とを含有する点滴びんに蒸留水２
０Ｊを加えて満たす。ノズルを挿入し内容物を混合する
。 ２、第１の空チューブに緩衝剤１０滴を加える６ダイリ
ユーターの助けを借りてテストサンプル１０μり（心臓
寄生虫抗原２０　（ｌμＦｉ／ｍρ）を移送し、内容物
をループで１（）秒間くり返し攪拌混合する。 ３、赤キャップチューブに緩衝剤２０滴を加え、内容物
を反転混合する。 檜定千−６ テストは以下の必要な過程で行う。 １、ＭＡｂ被覆被覆プロー上のサチェットから取り出し
、希釈したテストサンプルを含有するチューブ中に置く
。１５分Ｍ放置する。 ２０．３．および４．第２の空テストチューブの首まで
緩衝剤を加え、洗浄のためにこのチューブにプローベを
移す。３０秒間回転後、プローベを３０秒間放置する。 その後、プａ−べを取り除き、このチューブの内容物を
捨てる。チューブに再び新鮮な緩衝剤を満たす。十分な
洗浄を行う。 その洗浄処理を２回以上くり返す。 ５、赤キャップチューブにプローベを移し、１５分間放
置する。 ６、　、？、および８．第３のキャップのないチューブ
にプローベを移し、上記２．．３．および４゜と同様に
処理する。 ９、緑色アンプルにプローベを移し、３０秒問放置する
。 １０、黄色アンプルにプローベを移し、３０秒間回転さ
せ、５分間放置する。１０分後にプローベを捨てる。 このアンプルを清浄で白い背景に対して保持したと外、
色彩標準（桃色アンプル）よりも強い青色の存在が測定
される。テストサンプルが特異性抗原を含んでいれば、
淡青色がら暗青色にわたる青色色彩が得られ、色彩度は
存在する抗原量に比例する。実験室で定量的結果が必要
であれば、緑色アンプルの中味をキュベツトに移し、分
光光度計でＡ６２ｏｎｌｌｌの吸収を測定する。ひと血
漿サンプルでの検定結果を以下に転載する表２に示す。 予備評価のために、色彩標準を０．１００のＡ　［１２
０ｎｍ値１’ｌ　、　Ｉ　ｆ’ｌ　（ｌに設定する。 ヘべへへヘヘ ＼　　＼　　＼　　＼　＼　　＼ 甲　甲　甲　甲　甲　甲 しｈ化ながら、前述したように、吸収の読みは必要で゛
はなく、検定は、適ソ１な指示に従って未経験者か手作
業で行うことかて外る。 上記実施例２から、心馳寄生虫抗原は成熟した心臓寄生
虫！Ａ織から得られ、−に記実施例１および２に記載さ
れた処理か、＝一定の条件下にいぬの血液の血清または
血漿に含まれ循環する６秩寄生虫抗原の検出および／ま
たは定量に利用可能なことか゛当業者には明らかであろ
う。 実施例３ 本例においては、反応プローベは適当な溶液からひとト
リプシンを捕獲することが出来るひとトリプシン特有モ
ノクロナル抗体で被覆されており、反応プローベ−１−
に固定化された捕獲抗原は適）１ｊにラベルされた第２
の抗ひとトリプシンモノクロナル抗体を用いて引続トタ
ッグされた。 ひとトリプシンに対するモノクロナル抗体はガルフレ（
（’：ａｌｆｒｅ）ら：　Ｎａ１．ｕｒｅ、　　−ｇ−
６−６、騒０−５５２（１９？？）で確立された方法に
より９次の如く調製された： （ｉ）Ｂ　Ａ　Ｉ−Ｂ／ｃマウスのひとトリプシンカル
ビオケム・カットＮｏ、６５０２７５による免疫化。 （ｉｉ）ポリエチレングリフールを細胞融合剤とする、
第（ｉ）工程で得られた免疫マウスの肺臓細胞とＮ５−
１マウスミニひ−マ細胞との融合によるハイブリドーマ
細胞の生成。 （ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞を組織培養で繁殖させる
ことによる、抗ひとトリプシンモノクロナル抗体分泌ク
ローンの生成。 （ｉｖ）第（ｉｉｉ）工程で得られたクローン化ノ１イ
ブリドーマ細胞を腫瘍が作られているＢＡＬＢ／ｃマウ
スに注射することによる抗ひとトリプシンモノクロナル
抗体の分泌。 （Ｖ）第（ｉＶ）工程の注射されたマウスからのモノク
ロナル抗体の採取。 この方法を用いて、次の抗ひとトリプシンモノクロナル
抗体を調製した： Ｄ　クローンＣ，１３，１３２Ｄ１／１８２ト：　　　
　　　　　Ｃ０１１，１３３Ｂ　６　／１４０−１５７
Ｆ　　　　　　Ｃ，２０，１３９，Ｄ　６／１８４反応
プローベを前記したように、モノクロナル抗体で被覆し
た。アッセイキットは実施例１と同様であるか、赤色キ
ャップのチューブはせいようわさびベルオキシグーゼ結
合Ｍ　Ａ　ｂ　　ＤまたはＦを含有していた。 ひとイムノアッセイ反応性トリプシンに月するテストの
ｉｉ埴こ若干のキット調整が必要である。 １、蒸留水２（’１ｍρを加えて、紙片と緩衝剤を含む
点滴びんを充たす。ノズルを挿入し内容物を混合する。 ２、緩衝剤１０滴を第１の空チューブに加える。 次いで、ネオナタール（口ｅｏｎａ　ｔ、ａ　Ｉ　）ス
クリーニングプログラムの１部としで得られた直径３ｍ
ｍの単−血清スポットを加え、内容物を室温で２時間溶
出させる。 ３、緩衝剤２０滴を赤色キャップのチューブに加え、逆
転法により内容物を混和する。 検定手順 次の工程に従って実施した。 １．ＭＡｂ被覆プローベをそのサチェットから取り出し
、希釈テストサンプルを含むチューブに入れる。４５分
間放置。 ２、、：（、および４．緩衝剤を第２の空チューブの頚
部まで加え、プローベを洗浄のためこのチューブへ移す
。３０秒間回転させてか呟プローベを３０秒間放置する
。次いで、プローベを取り出し、チューブの内容物を捨
てる。このチューブに再び新たな緩衝剤を充たす。完全
な洗浄が必要である。−１−記洗浄方法は２回以上繰返
す。 ５、プローベを赤キャップのチューブに移し、４５分間
放置。 Ｇ、　、７．および８．プローベを第３のキャップのな
いチューブに移し、」１記２．．３．および４、のとお
り処理。 ９、プローベを緑色アンプルに移し、３０秒間放置。 １０、プローベを黄色アンプルに移し、３０秒間回転さ
せてか呟５分間放置する。 ４７− ブローベは、１（）分径に捨てる。 このアンプルを白色の背景紙にかざすと、色彩標準（桃
色アンプル）よりも強い青色の存在が認められる。テス
トアンプルが特異個抗原（トリプシン）を含んでいる場
合、淡色ないし濃青の青色が召１られ、色の程度は存在
する抗原の慴に比例する。 実験室で定渚結果が必要な場合には、緑色アンプルの内
容物をキュベラ）・に移し、Ａ６２０１＋ｍにおける吸
光度を比色計で測定する。新生Ｗ血液スポットについて
の検定結果を第３表に示す。予備的標価のため、色彩標
準はＡ　６２０　＋１１１１値かＣ）、１００となるよ
うに設定された。 ＝４８− ｖ−＠　　　　　　λＪ 実演例４− ｊ４へ１と被」１尽〕β夕（スニー社ｆ東用−ｊ、７＋
）７ｔ／〉−モーシー−ロー号ン９↑【リセηＪ（臂 本例においては、反応プローベは適当な溶液からひとヘ
モグロビンを捕獲することか出来るひとヘモグロビン特
異性モノクロナル抗体で被覆されており、反応プローベ
」二に固定化された捕獲抗原は適当にラベルされた第２
の抗ひとヘモグロビンモノクロナル抗体を用いてタッグ
された。 ひとヘモグロビンに対するモノクロナル抗体はガルフレ
（（’１ａｌｆｒｅ）ら：　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２６
６．　５５（１−５５２（１９７７）で碇立された方法
により次の如く調製された： （ｉ）ＢＡＬＢ／ｃマウスのひとヘモグロビン　スギマ
・カッ）Ｎｏ、Ｈ７３７’、Ｊによる免疫化。 （１１）ポリエチレングリコールをセル融合剤とする、
第（ｉ）工程で得られた免疫マウスの肺臓細胞とＭＳ−
１マウスミエローマセルとの融合によるハイブリドーマ
細胞の生成。 （ｉｉｉ　）バイプリドーマ細胞を組ａ培養で繁殖させ
ることによる、抗ひとヘモグロビンモノクロナル抗体分
泌クローンの生成。クローンＨ１■およびＪはうし、ひ
つじ、プルシン、うさぎ、とりのヘモグロビンと交差反
応を起こさなかった。 （ｉｖ）　ｆｆ１（ｉｉｉ）工程で得られたクローン化
ノ１イブリドーマ細胞を腫瘍が作られてし・るＢ　Ａ　
Ｂ　Ｌ　／　ｃマウスに注射することによる抗ひとヘモ
グロビンモノクロナル抗体の分泌。 （ｖ）　ｐｔＳ（ｉＶ）工程の注射されたマウスからの
モノクロナル抗体の採取。 この方法を用いて、次の抗ひとヘモグロビンモノクロナ
ル抗体を調製した： Ｉ］　クローンＣ０４９，２５１Ａ２／９９Ｔ　　　　
　　Ｃ１４９，２５１Ａ５／１４０Ｊ　　　　　　Ｃ，
４９，２５３Ｄ４／６０Ｋ　　　　　　Ｃ，５０，２５
１，Ｄ６／２３反応プローベを前記したように、モノク
ロナル抗体で被覆した。ア・ンセイキ・ノドは実施例１
と同様であった。 方」シ（ ５１− ひとヘモグロビンに対するテストの前に若干のキット調
整が必要である。 １、蒸留水２０＋ｎ、ｅを加えて、紙片と緩衝剤粉末を
含む点滴ビンを充たす。ノズルを挿入し、内容物を混合
する。 ２、緩衝剤１０滴を第１の空チューブに加える。 テストサンプル５０μｅをグイリュウターで移し、内容
物を１０秒問攪拌して混合する。 ３、緩衝剤２０滴を赤色キャップのチューブに加え、逆
転法により内容物を混和する。 権定」順− 次の工程に従って実施した。 １、ＭＡｂ被覆プローベをそのサチェットから取り出し
希釈テストサンプルを含むチューブに入れる。４５分間
放置。 ２、．３．および４．緩衝剤を第２の空チューブの頚部
まで加え、プローベを洗浄のためこのチューブへ移す。 ３０秒間回転させてから、プローベを３０秒間放置する
。次いで、プローベを取り出し、チューブの内容物を捨
てる。このチューブを一５２＝ 再び新たな緩衝剤で充たす。完全な洗浄が必要である。 上記洗浄方法は更に２回繰返す。 ５、プローベを赤色キャップのチューブに移し、４５分
間放置。 ６０．７．および８．プローベを第３のキャップのない
チューブに移し、」−記２０．３．および４゜のとおり
処理。 ９、プローベを緑色アンプルに移し、３０秒間放置。 １０、プローベを黄色アンプルに移し、３０秒間回転さ
せてから、５分間放置する。 プローベは、１０分後に捨てる。 このアンプルを白色の背景紙にかざすと、色彩標準（桃
色アンプル）よりも強い青色の存在が認められる。テス
トアンプルが特異性抗原ひとヘモグロビンを含んでいる
場合には、淡青色から暗青色までの青色が得られ、色度
は存在するひとヘモグロビン量に比例する。実験室で定
量結果が必要であれば、緑色アンプルの中味をキュベ・
７Ｆに移し、分光光度計でＡ６２ｏｎｍ吸光度を測定す
る。ひとヘモグロビン含有サンプルについての検定結果
を以下に転載する表４に示す。予ｉｔ評価のために、色
彩標準はＡ６２ｏｎｍ値０．１００に設定する。 ・− Ｍ　　Ｍ　　：Ｉ：　　’；Ａ　　”ｓ：　　＊　　　
　Ｅ５５− 添伺図面第１図には本発明を説明する反応キットまたは
システムの外部容器１０を示す。容器１０は側蓋９およ
び閉蓋８を持っている。 同様に頂部に複数個の穴１２を有する内部容器１１ｆ；
：示す。この内部容器１１は各端に側蓋１３および閉蓋
１４を持っている。 更に、確認のため異なった色に着色されでいてもよいキ
ャップ１７を有する一対のチューブ１５か示されている
。更にまた、キャップを有しない、洗浄用に使用される
一対のテス）・チューブ１６が示されている。 なおまた、緩衝剤粉末１９と洗剤を含浸させたシ戸紙２
０を収容するびん１８が示されでいる。更にループダイ
リュウタ−２４とモノクロナル抗体で被Ｍされたプロー
ベ２５を収容した、透明なプラスチック材料で作られた
バッグ２３が示されている。主た、アンプル２６．２７
．２８およびキャップ２１を取り去ってびん１８に適合
させ、びん１８を滴下ぴんとして使用可能にするドロッ
パー２９を収容するプラスチック製バッグ２２が示さ５
６− れている。びん１８の頚部には内面および外面に線引外
が施されていてもよい。 操作に！１′またっては、チューブ１５と１６を穴１２
に支持する。ついでバッグ２２と２３を開けばよい。ア
ンプル２Ｇはハイドロデンペンテイドを含んでいてもよ
い。アンプル２７は基質を、アンプル２８は適当な色標
準を示す液体を含んでいてもよい。 第２のモノクロナル抗体はキャップを施したチューブ１
７の一つに収容し、他の一つはサンプル容器として使用
すればよい。かくして実施例１に記載したように検定を
実施する。 図面から容器１１はふた８および９を閉じる際外部容器
１０の中に収容されることが理解されよう。バッグ２２
と２３はびん１８と同様内部容器１１の中に収容される
。チューブ１５と１６は収容穴１２に保持されてもよい
。かくして全体が貯蔵や運搬に便利なように包装されう
る。 本発明のフィールドイムノアッセイ法は上記したごと〈
従来法に比し、本質的な利点を多数有することが理解さ
れよう。 従来技術で用いられたポリクロナルまたはマルチサイト
スピーシーズに比較してモノクロナル抗体に限定した被
覆を用いることにより、２サイト検定法の有用性が一層
高められる。ガル７しくＧａ１−ｆｒｅ）らにより確立
されたハイブリドーマ法を使用することにより、非平行
抗原特異性および抗原性決定特異質の捕獲および標識Ｍ
　Ａ　＋）の非制限的生産が可能となった。ハイブリド
ーマ技術によって与えられたかぎは捕獲ＭＡＩ）として
具体的に使用されるＭＡＩ１の生産に依存する。この捕
獲ＭＡｂはデスｌＡｇ上にのみ存在し、他の分子種−ヒ
には存在しない特異的な抗原性決定因子と結合する。 すなわち、ＭＡＩ）捕獲−標識検定は本発明により確立
されたものであって、Ａｇ決定因子特異性の欠乏の故に
従来生産されたポリクロナル抗血清（ＰＡｌ））では不
可能なものであった。このＰ　Ａ　ｌ）はテス）Ａｇに
類似の抗原性決定因子を有する分子と交差反応を起こす
ものである。 本発明の出現は従来技術において見られた上記の欠点を
軽）代する分野での逆の条件下における使用に適した診
断法を提供するものである。使用した物品の洗浄が容易
であり、単一のアッセイとして使用することが出来、生
物学的試薬の使用の点で経済的であり、精製された抗原
の使用を必要としない。また、ＭＡｌ＋技術を使用する
ことによ１）、へ８特異性捕獲および標識ＭＡＩ）の無
限の供給が可能となり、電気的まｔこは電子的信号の増
幅を読み取る必要もない。 本発明の診断法はＭＡ＋）技術を使用する２サイ）（Ｔ
ｕ＋ｏ　５ｉｔｅ）イムノアッセイシステムを使用する
のに適した特異的なものであり、第２のラベル化された
標識ＭＡＩ効ｆ単一の信号を使用する場合に限定されず
、ある場合には伸張メンバーに結合したＭＡｂによって
捕獲されたＡ、が適当な条件下で適当な信号を発生して
もよい。 ４、図面の簡単な説明 第１図はこの発明にかかる装置またはキットの全体構成
の説明図である。 １０・・・・・・容器、１１・・・・・・内部容器、１
５．１６・・・・・・チュ５９− 一ブ、１７・・・・・・キャップ付チューブ、１８・・
・・・・びん、１９・・・・・・緩衝剤粉体、２０・・
・・・・ン戸紙、２２．２３・・・・・・バッグ、２４
・・・・・・ループダイリュウター、２５・・・・・・
プローへ、２６．２７．２８・・・・・・アンプル、　
２９・・・・・・ドロッパー。 特許出願人　フイールダー・ノルレスピー・リミテッド 代　理　人　弁理士　青　山　　葆　はが１名６０− 手続補正書嶋式） １　事件の表示 昭和５８年特許願第　　２３０４４８　　　号２発明の
名称 ５補正命令の日付：飴和５９年２月。８Ｂ４１６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、体物質または体液中（こ含まれている抗原に特有な
   モノクロナル抗体で少くとも部分的に被覆された探針プ
   ローベまたはキャリア、 複数の容器、 モノクロナル抗体に対する抗原の非特有的結合を妨げる
   洗剤または他の適当な物質、 緩衝液、 信号増幅または検知手段 を含んで成るテスト用フィールドイムノアッセイ反応シ
   ステム。 ２、酵素または酵素基質でラベルされた第２のモノクロ
   ナル抗体を含む第１項の反応システム。 ３、酵素か゛ペルオキシダーゼであり、コファクターと
   して過酸化水素を含む第１項の反応システム。 ４、複数の容器の少くとも一部が個々の容器を認識する
   ためそれと連動する認識手段を持っている前記各項のい
   ずれかの反応システム。 ５、フィールドアッセイにおける洗浄工程を実施するた
   め１つまたはそれ以」二の容器を備えた第４項の反応シ
   ステム。 ６．１つまたはそれ以」二のループダイリュータ−を備
   えた前記各項のいずれかの反応システム。 ７、色標準または携帯用測色計を備えた前記各項のいず
   れかの反応システム。 ８、第２のモノクロナル抗体が凍結乾燥されたものであ
   り、容器の１つが必要に応し前記第２のモノクロナル抗
   体を再調製するための希釈液を含有してなる、前記各項
   のいずれかの反応システム。 ９、　（ｉ）検定すべきサンプルを容器の中に移し、（
   ｉｉ）該サンプル含有容器内に開口頂部から探針プロー
   ベを挿入し、 （ｉｉｉ）該サンプル含有容器から前記プローベをとり
   出し、これを希釈液を含有して いる１つまたはそれ以−１の容器内で洗ってか呟再びと
   り出し、 （１ｖ）前記プローベを信号増幅させてサンプル中の抗
   原の存在を検出する ことを含んで成る前記第１項の反応システムを使用する
   フィールドイムノアッセイ法。 ＩＱ、　（ｖ）ｆｆＳ（ｉｉｉ）工程後の探１１プロー
   ベを酵素でラベルされた第２のモノクロナル抗体 を含む容器に挿入し、 （νｉ）該探針プローベを希釈液を含む１つもしくはそ
   れ以上の容器内で洗い、 （ｖｉｉ）該探針プローベを第（１ｖ）工程前に酵素基
   質を含有する容器内に挿入すること を含んで成る前記第９項の方法。