CN109069600B - Il-21抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了结合人IL‑21的抗体或其抗原结合片段。这些抗体可用于IL‑21水平的免疫测定，和/或体内、离体或体外免疫化学和其他成像方法中，所述方法用于确定IL‑21的存在和/或定量IL‑21水平以及用于诊断、预后和预测目的和/或优化其中IL‑21信号传导牵涉于发病机理的患者中的治疗方案。

Description

IL-21抗体及其用途
本发明涉及医药领域。更具体地，本发明涉及结合人白介素-21(IL-21)以形成可检测的IL-21/抗IL-21抗体复合物的抗体，所述IL-21/抗IL-21抗体复合物可用于以高灵敏度(亚皮克/毫升(pg/ml))测定人生物基质中发现的IL-21水平。具体而言，本发明涉及测定IL-21的飞克/毫升水平的体外测定。
IL-21是参与炎性疾病(包括过敏性疾病、癌症和自身免疫性疾病，特别是银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性炎性肠病和舍格伦氏综合征)的发病机理的重要细胞因子。据报道，升高的血清IL-21水平与患有自身免疫性疾病(诸如银屑病、SLE或舍格伦氏综合征)的患者中的疾病严重程度相关。用于检测人IL-21的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒是市售可得的，但其具有16 pg/mL的低检测限值(Weir等人 Cytokine 60 (2012) 220-225)。然而，该试剂盒不能检测患者样品中的IL-21的真实水平。
因此，需要抗IL-21抗体，其对人IL-21具有更高的结合亲和力和选择性，导致IL-21测定的灵敏度增强，或者当用于ELISA测定中时，提供最小的干扰和广泛的稀释线性。优选地，所述抗体是单克隆抗体，并且包括例如两种或更多种不同抗体，所述抗体识别IL-21上的两种或更多种不同表位，使得一对抗体可以在测定中同时结合IL-21。
需要结合IL-21的抗IL-21抗体，其允许在患者治疗之前、期间和/或之后诊断性评价IL-21水平，其与市售可得的测定相比具有最小的血浆蛋白干扰且具有更高的灵敏度。因此，本发明寻求提供特异性结合人IL-21的替代性抗IL-21抗体。本发明进一步寻求提供用于以飞克/毫升(fg/ml)水平体外定量人IL-21的快速和方便的方法。
因此，本发明的第一个方面提供了结合人IL-21的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含三个轻链互补决定区(LCDR)且所述HCVR包含三个重链互补决定区(HCDR)，其中所述三个LCDR和所述三个HCDR的氨基酸序列选自：
a) RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 1)、YTSRLHS (SEQ ID NO: 2)、QQFHTLRTF (SEQID NO: 3)、GYTFTDYWMH (SEQ ID NO: 4)、LIDTSDSYTIYNQKFKG (SEQ ID NO: 5)和YGPLAMDY (SEQ ID NO: 6)；
b) RASKSIEKYIA (SEQ ID NO: 7)、AGGTLQS (SEQ ID NO: 8)、QQHEEYPLT (SEQID NO: 9)、GYDFTGYTMN (SEQ ID NO: 10)、LINPYNGGTAYSPKFKG (SEQ ID NO: 11)和THYYGSEYTGMDY (SEQ ID NO: 12)；和
c) KSSQSLLDVDGKTYLN (SEQ ID NO: 13)、LVSKLDS (SEQ ID NO: 14)、WQGTHFPYT(SEQ ID NO: 15)、GYFFTLYMMH (SEQ ID NO: 16)、YINPSSGYTEYNQKFKD (SEQ ID NO: 17)和DFDY (SEQ ID NO: 18)。
在一个进一步实施方案中，本发明提供了结合人IL-21的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR和所述HCVR的氨基酸序列选自：
a) SEQ ID NO: 19的氨基酸序列和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列；
b) SEQ ID NO: 21的氨基酸序列和SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；和
c) SEQ ID NO: 23的氨基酸序列和SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合人IL-21的抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链和所述重链的氨基酸序列选自：
a) SEQ ID NO: 25的氨基酸序列和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列；
b) SEQ ID NO: 27的氨基酸序列和SEQ ID NO: 28的氨基酸序列；和
c) SEQ ID NO: 29的氨基酸序列和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合人IL-21的抗体，其中所述抗体包含两条轻链和两条重链，其中所述各轻链和所述各重链的氨基酸序列选自：
a) SEQ ID NO: 25的氨基酸序列和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列；
b) SEQ ID NO: 27的氨基酸序列和SEQ ID NO: 28的氨基酸序列；和
c) SEQ ID NO: 29的氨基酸序列和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列。
本发明还提供了包含编码本发明的抗体的LCVR和/或HCVR或轻链和/或重链的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如SEQ ID NO: 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中所示的核苷酸序列。
本发明还提供了重组表达载体，其包含编码本发明的抗体的LCVR和/或HCVR，或轻链和/或重链的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了已经通过表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含编码本发明的抗体的LCVR和/或HCVR或轻链和/或重链的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了包含可检测标记物的抗体或抗原结合片段，其中所述可检测标记物选自发色团、色原、染料、荧光剂、生荧光剂、磷光剂、化学发光剂、生物发光剂、放射性核素、正电子发射断层扫描-可成像剂和磁共振-可成像剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测或定量组织或体液样品中的人IL-21的体外方法，其包括：使所述样品与本发明的所述抗体或其抗原结合片段接触；任选地，除去任何非特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和定量、半定量或定性地检测或定量与所述样品中的人IL-21特异性结合的抗体或其抗原结合片段的量。
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其用于体外诊断、预后和/或患者监测程序。
在另一个方面，本发明提供了用于体外检测或定量组织或体液样品中的人IL-21的试剂盒，其包含
a) 第一试剂，其中所述第一试剂是抗体或其抗原结合片段，包含具有SEQ ID NO:21的氨基序列的LCVR和具有SEQ ID NO: 22的氨基序列的HCVR；和
b) 第二试剂，其中所述第二试剂是抗体或抗原结合片段，包含具有SEQ ID NO:19的氨基序列的LCVR和具有SEQ ID NO: 20的氨基序列的HCVR。
优选地，组织或体液样品是血浆样品或血清样品。
根据本发明的又另一个方面，提供了根据本发明的抗体，其用于体外测量人样品中的IL-21的量。
如本文所用，术语“IL-21”(也称为白介素-21)意指对先天性和适应性免疫应答发挥多效作用的I型细胞因子。IL-21由活化的CD4阳性T细胞(包括滤泡性T辅助细胞和Th17细胞)产生。人IL-21的氨基酸和cDNA序列分别列为SEQ ID NO: 43和45。
抗体或全长抗体是包含由二硫键互连的两条重链和两条轻链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基端部分包括约100-110个氨基酸的可变区，其主要负责经由其中含有的互补决定区(CDR)的抗原识别。每条链的羧基端部分定义主要负责效应功能的恒定区。本发明的抗体是单克隆抗体(“mAb”)。单克隆抗体可以例如由杂交瘤技术、例如CDR-移植或此类或本领域已知的其他技术的组合产生。在本发明的另一个实施方案中，提供了分离形式的抗体或编码其的核酸。如本文所用，术语“分离的”是指在自然界中未发现且不含或基本上不含在细胞环境中发现的其他大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所用，“基本上不含”意指目标蛋白、肽或核酸包含大于80％、优选大于90％、更优选大于95％(基于摩尔)的存在的大分子物质。
如本文所用，“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合至由全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。优选地，所述抗体片段是Fab片段。
CDR散布在被称为框架区(“FR”)的更保守的区域。每个轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR和4个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。 轻链的3个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，且重链的3个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。所述CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。用于抗体的三种CDR分配系统通常用于序列描绘。Kabat CDR定义(Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991))基于抗体序列可变性。Chothia CDR定义(Chothia等人,“Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani等人, “Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal ofMolecular Biology, 273, 927-948 (1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构。Chothia CDR定义与Kabat CDR定义相同，除了HCDR1和HCDR2。North CDR定义(North等人,“A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal of MolecularBiology, 406, 228-256 (2011))基于具有大量晶体结构的亲和传播聚类。本发明中使用Kabat CDR定义，除了HCDR1用Kabat和Chothia定义。
本发明的另一个方面涉及编码任何前述抗IL-21抗体的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述核酸分子的宿主细胞。另外，本发明提供了表达载体，其含有与控制序列（诸如表达序列、启动子和/或增强子序列）可操作连接的前述多核苷酸序列。已经开发了多种表达载体，其用于在原核系统(诸如细菌)和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中高效合成抗体多肽。本发明的载体可以包含染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。
用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域已知的，并且可见于例如Harlow和Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 第5-8和15章, ISBN 0-87969-314-2中。抗原结合片段也可以通过常规方法制备。本发明还提供了含有前述重组载体的重组宿主细胞。基于高水平的表达、目标蛋白的组成型表达和来自宿主蛋白的最小污染来选择特别优选的细胞系。可用作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括许多永生化细胞系，诸如但不限于COS-7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其他的，包括淋巴来源的细胞系，诸如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。用于转化载体和表达本发明的抗体的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如NSO细胞(非分泌性(0)小鼠骨髓瘤细胞)、人胚肾(HEK) 293、SP20和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和淋巴来源的其他细胞系，诸如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。本发明的抗体可以在除了杂交瘤中以外的细胞系中表达。也可以替代地使用其他真核宿主，诸如酵母。抗体和更具体地其抗原结合片段也可以从原核细胞诸如大肠杆菌产生。包含编码根据本发明的抗体的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
本发明进一步提供了纯化任何前述抗IL-21抗体的方法。可以使用已知方法制备和纯化本发明的工程改造的抗体或抗原结合片段。
本文公开的抗IL-21抗体可通过检测细胞、组织或器官中存在的IL-21的水平（无论是体内和/或各种离体制备物的形式和在体液中）而用于诊断、预后和/或患者监测程序。术语“体液”是指源自正常或患病受试者的身体的任何流体或液体样材料，诸如血液、血清、血浆、淋巴、骨髓、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液、乳汁、羊水、胆汁、尿液、支气管液、腹水、脓液和任何其他生物液体产物。流体样材料的含义内还包括器官或组织提取物，以及已经孵育的来自受试者的细胞或组织制备物的培养基。本文所述的抗IL-21抗体可以与酶缀合并用于酶联免疫吸附测定(ELISA)中。此类测定详细描述于例如Butler (1994) “ELISA”(Chapter 29), I: van Oss, C. J.等人，编，Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc.,New York, pp. 759-803. 本发明的抗IL-21抗体还可用于IL-21表达的放射免疫测定和荧光活化的细胞分选(FACS)分析中。
如本文所用，术语“接触”是指将抗体或其抗原结合片段和抗原或靶蛋白(例如IL-21)以这样的方式放在一起，其中形成了可以用于在体外测定中检测或定量组织或体液样品中的抗原或靶蛋白中的可检测的抗原/抗体复合物。这种接触可以在体外完成，例如在试管、微孔板等中完成。或者，“接触”是指在体外测定中将抗体或其抗原结合片段与液体诸如血清或血浆混合在一起。
抗体组合物和方法
存在本领域众所周知的方法，技术人员可以使用所述方法以形成稳定的、可检测的抗原-抗体复合物(参见，例如，Antibodies, A Laboratory Manual by Harlow andLane (目前版本), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork，用于允许形成可检测的抗原/抗体复合物的条件)。
可以使用任何本领域已知的手段可检测地标记本发明的抗IL-21抗体或其抗原结合片段或本文所述的IL-21/抗IL-21抗体复合物(参见，例如，Antibody EngineeringVolume 2, Kontermann, Roland; Dubel, Stefan (编辑))。标记物可以是，例如但不限于，发光或光吸收剂、发色团、色原、磁性或铁颗粒、染料、荧光剂、荧光团、磷光体、化学发光剂、生物发光剂、放射性核素、酶、正电子发射断层扫描-可成像剂、磁性微珠、铁磁流体纳米颗粒、二级抗体和磁共振-可成像剂。
术语“可检测标记的”意味着本发明的抗IL-21抗体或其抗原结合片段，或IL-21/抗IL-21抗体的复合物具有与之共价或非共价附着的有用的可检测标记物。在直接缀合物标记的抗体方法中，可以采用许多不同的有用标记物，包括例如辅基复合物、发色团、色原(产生颜色的物质)、染料、荧光化合物、生荧光化合物、放射性同位素、顺磁同位素和可以通过正电子发射断层扫描(PET)和磁共振成像(MRI)成像的化合物。简单地通过γ计数器、闪烁计数器、PET扫描或放射自显影检测的有用的放射性标记物包括3H、124I、125I、131I、35S和14C。对于体内诊断，放射性核素可以使用螯合剂诸如DTPA和EDTA与抗体或抗原结合片段直接或间接地结合。此类放射性核素的实例包括99Tc、123I、125I、131I、111In、97Ru、67Cu、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Y和201Tl。其他合适的标记物是本领域已知的或可以通过常规实验确定。在间接方法中，二级抗体可以与例如但不限于酶或荧光标记物缀合。然后可以通过在适当条件下与酶的生色底物反应以产生可检测信号来检测二级抗体与结合靶抗原的一级抗体的结合。
可以使用比色检测，其采用具有或产生具有高消光系数的发色团且因此容易检测的发色化合物。当后来在适当的反应条件下暴露于其底物时，所述酶将与底物反应以产生化学标记物，其可以例如通过分光光度法、荧光测定法或视觉手段检测。
通常用于此目的的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶，α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括，例如，但不限于，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。优选使用色原，因为采用他们的测定可以在临床诊断实验室中容易地进行，并且由病理学家用这些实验室中常用的设备进行评审。常用的色原包括二氨基联苯胺(DAB)；增强的DAB；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；4-氯-1-萘酚(4-CN)；Hanker-Yates试剂；α-萘酚派洛宁；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；快蓝BB；快红TR；新品红；BCIP-NBT；四唑鎓；四硝基蓝四唑鎓(tetranitoblue tetrazolium)(TNBT)；和银增强的免疫金。
有用的荧光标记物包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、二氯三嗪基胺荧光素、罗丹明、丹磺酰基、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺和Cy5 (Haugland((1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第六版,Molecular Probes, Eugene, Ore.)。
本发明的抗IL-21抗体或其抗原结合片段或IL-21/抗IL-21抗体复合物也可以使用发射荧光的金属诸如152Eu+或其他镧系元素的成员通过使用金属螯合基团诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺-四乙酸(EDTA)附着他们来可检测地标记。
本发明的抗IL-21抗体或其抗原结合片段或IL-21/抗IL-21抗体复合物也可以通过将他们与磷光或化学发光化合物偶联来可检测标记，其然后可以通过在化学反应过程期间产生的磷光或发光来检测。有用的化学发光化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶酯（theromatic acridinium ester）、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。同样，生物发光化合物诸如荧光素、荧光素酶或水母发光蛋白可用于标记本发明的抗体或其抗原结合片段。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。
本发明的抗体或其抗原结合片段也可以附着至固体支持物，所述固体支持物特别可用于靶抗原的免疫测定或纯化。此类固体支持物包括，例如不限于，珠粒，例如微观顺磁珠粒、玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在免疫测定中使用本发明的抗体
特定蛋白诸如IL-21可以通过多种免疫测定方法测量，所述免疫测定方法包括例如但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用诸如例如不限于蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。对于免疫学和免疫测定程序的综述，一般而言参见例如Stites和Terr (编)(1991) Basic and Clinical Immunology (第7版)。此外，本发明的免疫测定可以在许多如本领域已知的配置中进行(参见例如Maggio (编) (1980) Enzyme Immunoassay CRCPress, Boca Raton, Fla.; Gosling J P 2000 Immunoassays: A Practical Approach(Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Diamandis & Christopoulus,1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, Calif.)。
用于定量的免疫测定可以通过多种本领域已知的方法进行。简而言之，用于测量IL-21的免疫测定可以是竞争性或非竞争性结合测定。在竞争性结合测定中，待分析的样品与标记的分析物竞争与固体表面结合的捕获剂上的特异性结合位点。优选地，捕获剂是本发明的抗体，诸如Ab2-1，其特异性结合IL-21。与捕获剂结合的标记分析物的浓度与样品中存在的游离分析物的量成反比。
在一些实施方案中，体液(例如血清或血浆)中的人IL-21可以使用Quanterix的SIMOA™技术定量(其可以实现fg/ml水平的蛋白定量)。SIMOA™技术(以单分子阵列命名)是基于使用标准ELISA试剂在顺磁珠粒上分离单独免疫复合物。Simoa和常规免疫测定之间的主要区别在于能够在飞升大小的孔中俘获单一分子，允许每个单独珠粒的“数字”读出以确定其是否与靶分析物结合。与常规测定相比，该技术的数字性质允许灵敏度增加平均1000×倍，其中CV <10％。市售可得的SIMOA™技术平台可以在多种分析物组上提供最高达10-路的多路选项，并且可以使测定自动化。多路实验可以生成大量数据。因此，在一些实施方案中，利用计算机系统来自动化和控制数据收集设置、组织和解释。
在一个进一步实施方案中，可以在IL-21 Quanterix SIMOATM测定中分析来自人正常对照和患有不同疾病(在自身免疫性疾病，诸如银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性炎性肠病和舍格伦氏综合征中)的患者的样品。IL-21的“升高水平”可以通过将患病样品与健康对照样品进行比较来确定。术语“升高水平”是指“截点”，在该“截点”之上，患者可以通过施用结合IL-21的治疗性抗体来优先响应于疗法。优选地，“截点”是比健康对照的平均值高2个标准偏差(SD)，并且更优选地，比健康对照的平均值高3个标准偏差(SD)。
与健康对照受试者相比，任何观察到的自身免疫性疾病中血浆IL-21的显著增加可用于患者裁量，由此确定基于临床试验中的IL-21测量的“截点”。在这方面，IL-21水平可用于鉴定优先响应于疗法的患者亚组。这种鉴定可以用单独的IL-21水平或与其他基线患者特征或生物标志物(例如CRP)组合的IL-21水平进行。
可以采用多种方法来鉴定IL-21截点，其定义每种目标疾病状态或适应症中的响应患者亚组(参见Lipkovich I, Dmitrienko A, D’Agostino BR. Tutorial inbiostatistics: data-driven subgroup identification and analysis in clinicaltrials. Statistics in medicine. 2017;36(1): doi:10.1002/sim.7064; Foster JC,Taylor JMG, Ruberg SJ. Subgroup identification from randomized clinical trialdata. Statistics in medicine. 2011;30(24):10.1002/sim.4322. doi:10.1002/sim.4322; Ruberg SJ, Chen L, Wang Y. The mean does not mean as much anymore:finding sub-groups for tailored therapeutics. Clinical Trials. 2010;7(5):doi:10.1177/1740774510369350。
因此，本发明提供了选择患有自身免疫性疾病诸如银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、慢性炎性肠病和舍格伦氏综合征且具有升高的IL-21水平的患者群体的方法，其包括测定来自患者的血浆样品，确定存在的IL-21的水平，和当血浆IL-21水平升高时，施用有效量的治疗性IL-21抗体。
本发明的另一个实施方案提供了结合人IL-21的治疗性抗体，其用于治疗患者中的自身免疫性疾病诸如银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、慢性炎性肠病和舍格伦氏综合征)。
治疗性IL-21抗体的实例是诸如WO 2015/142637 (Eli Lilly & Company)中公开的那些的实例。这种抗体由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，其中每条重链包含重链可变结构域，其氨基酸序列是WO 2015/142637中公开的SEQ ID NO: 1的序列，且其中每条轻链包含轻链可变结构域，其氨基酸序列是WO 2015/142637中公开的SEQ ID NO: 2的序列。
以下实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意在限制本发明的范围。
实施例1
抗体表达和纯化
抗人IL-21抗体AbM2、Ab2-1和Ab3-1的重链和轻链的可变区的多肽、完整重链和轻链氨基酸序列以及编码其的核苷酸序列列于下面标题为“序列表”的部分中。AbM2、Ab2-1和Ab3-1的CDR的氨基酸序列和相应的SEQ ID NO显示于下表1A和1B中；AbM2、Ab2-1和Ab3-1的可变区和全长轻链和重链的氨基酸序列以及编码DNA序列的SEQ ID NO显示于表1C中。
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本发明的抗人IL-21抗体，包括但不限于AbM2、Ab2-1和Ab3，可以使用本领域已知的适合在HEK293或CHO细胞中表达的载体遵循标准转染程序在HEK293或CHO细胞中瞬时表达。简而言之，可以构建包含SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 37和SEQ IDNO: 38或SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42的一种或多种重组载体，并用于瞬时转染HEK293EBNA细胞。转染后，将转染的细胞在含有遗传霉素(G418)和妥布霉素的标准无血清培养基10中在37℃下培养48至120小时。可以使用用PBS, pH7.2预平衡的蛋白A MabSelect色谱树脂(GE Healthcare, #17-5199-01)或用PBS, pH7.2预平衡的HiLoad Superdex 200 26/60制备级尺寸排阻色谱柱(GE Healthcare, #28-9893-36)纯化抗人IL-21抗体。结合的蛋白随后用10mM柠檬酸盐, pH3洗脱，并且将合并的级分立即用1M Tris, pH8的1:10稀释液中和。中和的合并物使用Amicon Ultra-15浓缩器(Millipore, #UFC903024)浓缩。
实施例2
IL-21抗体配对分析
使用表面等离子体共振(SPR)，在使用HBS-P（GE Healthcare目录BR-1003-68, 10mM HEPES pH 7.4 + 150 mM NaCl + 0.0005%表面活性剂P20)）运行缓冲液引发和分析温度为25℃下，在Biacore 2000仪器上，确定可以在基于ELISA的测定中配对(或同时结合)的抗体。。含有固定化的山羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体(Jackson ImmunoResearch目录115-005-008)的CM4芯片用于捕获针对IL-21的抗体。在测试流动室上捕获IL-21抗体。注射过量的小鼠IgG同种型对照抗体以阻断剩余的捕获抗体的能力。人IL-21被IL-21抗体捕获。注射二级抗体以测试与捕获的IL-21的累加结合。
将本发明的抗体AbM2、Ab2-1和Ab3-1以0.5mg/mL与珠粒(Quanterix目录号101360)缀合，并根据制造商的方案以40:1的生物素:抗体的比率生物素化。产生三种抗体对的九种组合，并针对重组IL-21参考曲线(100ng/mL – 1.0fg/mL)进行分析。将珠粒稀释于珠粒稀释剂(Quanterix，目录号100458)中，并将检测抗体稀释于样品/检测缓冲液(Quanterix，目录号101359)中。由于区分fg/mL范围内的IL-21浓度的能力，两对抗体进行进一步优化。第一对是Ab2-1和AbM2，其在任一方向上都表现良好。第二对是作为捕获的Ab3-21和作为检测的Ab2-1。
进行抗体对的进一步优化以增加灵敏度和百分比回收率。在一系列实验中改变捕获抗体和检测抗体的浓度以确定最佳灵敏度。在三种抗体浓度(0.1、0.5和1.0mg/ml)下测试捕获抗体。使用40X生物素:抗体比率在三种浓度(0.5、1.0和1.5mg/ml)下测试检测抗体。该组合产生18对不同的抗体组合。使用重组人IL-21蛋白作为标准品，范围为10,000至0.64fg/ml。在测定稀释剂(PBS + 1% BSA) (分别为Gibco目录号20012-043和Meso ScaleDiscovery目录号R93BA-1)中稀释抗原。将捕获抗体稀释于珠粒稀释剂(Quanterix，目录号100458)中，并将检测抗体稀释于样品/检测缓冲液(Quanterix，目录号101359)中。最佳的抗体对和抗体浓度被确定为Ab 2-1作为珠粒上的捕获抗体(1.0 mg/ml)和生物素化的AbM2作为检测抗体(0.5 mg/ml)。
如SEQ ID NO: 44中所示的重组人IL-21蛋白(25-155)可以在大肠杆菌中表达，并作为不溶性包涵体发现。分离包涵体，溶解于高浓度尿素缓冲液中，并通过离子交换色谱法纯化溶解的材料。合并所得主峰级分并进行依次透析重折叠过程。然后使用反相色谱法将主峰级分纯化至均一。合并主峰级分，通过冷冻-干燥冻干，重悬于PBS，pH7.2缓冲液中并作为工作等分试样储存在-80℃。
实施例3
Quanterix Simoa™测定
根据标准Quanterix方案，以1.0mg/ml将抗IL-21抗体Ab2-1与羧化的顺磁珠粒(Quanterix目录号100451)缀合。根据标准Quanterix方案(40:1生物素比率)将抗IL-21抗体AbM2生物素化。对于Quanterix上的每次运行，在珠粒稀释剂(Quanterix目录号100458)中制备Ab2-1珠粒(近似500万珠粒/ml)，并将生物素化的AbM2抗体(0.5μg/mL)在样品/检测缓冲液中(Quanterix目录号101359)中稀释至适当的体积。链霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶(SBG)(Quanterix目录号100439)在SBP稀释剂(Quanterix目录号100376)中以150 pM制备。将IL-21重组蛋白或样品以适当的稀释度稀释于测定缓冲液(600 mM NaCl, 0.5%Tween 20, 25% FBS, 2% BSA和200 μg/ml HBR，在PBS中 (分别为Boston BioProducts目录号BM-244; Thermo Scientific目录号28320; Gibco目录号16010-159; Meso ScaleDiscovery目录号R93BA-2; Scantibodies目录号3KC534-075和Hyclone目录号SH30258.01)中。将Ab2-1珠粒、生物素化的AbM2抗体、校准物、SBG和供应的试卤灵-β-D吡喃半乳糖苷(RGP) (Quanterix目录号10030)试剂装载至仪器中，并根据Simoa™ HD-1分析仪用户指南在室温下作为两步Homebrew方法运行。Ab2-1与重组人IL-21蛋白的结合数据显示于表1和图1中。为了测定Quanterix Simoa测定中的掺入和回收率，将不同量的重组IL-21掺入人血清基质中。百分比回收率概述于表2中。血清基质中的LLOQ被计算为30 fg/ml。在肝素血浆中也进行了探索性验证，其中稀释线性、掺入回收率和总误差的结果相当。
表1. IL-21 Quanterix测定结合数据
IL-21 (pg/ml) 重复1 AEB* 重复2 AEB*
5 4.049 4.080
1.25 1.145 1.318
0.3125 0.324 0.324
0.078125 0.098 0.101
0.01953125 0.026 0.030
0.004882813 0.010 0.013
0.001220703 0.008 0.009
0.000305176 0.006 0.006
*AEB = 每个珠粒的平均酶。
表1和图1中的数据表明，IL-21 Quanterix测定具有0.0003-5 pg/ml IL-21的大动态范围，其中在血清基质中计算的定量下限为0.03 pg/ml。
表2. 人血清中的IL-21掺入和回收率
Pg/ml %回收率
2.5 86
0.625 87
0.156 95
0.039 93
0.010 100
0.002 103
0.001 95
开发的IL-21 Quanterix Simoa测定表明血清中给定量的IL-21的可接受的百分比回收率。
实施例4
在IL-21 Quanterix SIMOA™测定中人正常对照样品和患病样品的分析
在IL-21 Quanterix SIMOA™ Homebrew测定中运行人正常对照样品和舍格伦氏综合征和SLE患者样品，包括13个健康、11个舍格伦氏综合征和14个SLE血清样品。样品在Quanterix SIMOA™ Homebrew测定中以1：2稀释度在IL-21测定缓冲液中运行：在PBS (1x,Hyclone, 目录号SH30258.01)中的NaCl (600mM, Boston BioProducts, 目录号BM-244)，新生小牛血清(25%, Gibco, 目录号16010-159)，tween 20 (0.5%, Thermo Scientific,目录号28320)，BSA (2%, MSD, Cat # R93BA-2)和嗜异性封闭剂(200ug/ml,Scantibodies, 目录号3KC534-075)。将Ab 2.1抗体与珠粒缀合用于捕获，并将生物素化的AbM2用于检测。结果呈现于图1中。正常健康对照和舍格伦氏综合征和SLE患者的血清之间的IL-21水平存在显著差异。在这方面，观察到自身免疫性疾病受试者相比于健康对照受试者的血浆IL-21的显著增加。
图1. 健康对照和患病样品的个体数据点。
Figure 395164DEST_PATH_IMAGE004
序列表
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Figure DEST_PATH_IMAGE007
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Claims (7)

1.特异性结合人IL-21的第一抗体或其抗原结合片段和特异性结合人IL-21的第二抗体或其抗原结合片段在制备用于检测组织或体液样品中的人IL-21的体外方法的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a) 将所述样品与特异性结合人IL-21的第一抗体或其抗原结合片段接触，其中形成所述第一抗体或其抗原结合片段与人IL-21的复合物，并且在固体支持物上捕获所述复合物，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含三个轻链互补决定区(LCDR)且所述HCVR包含三个重链互补决定区(HCDR)，其中所述三个LCDR和所述三个HCDR的氨基酸序列分别是：RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 1)、YTSRLHS (SEQ ID NO: 2)、QQFHTLRTF (SEQ ID NO: 3)、GYTFTDYWMH (SEQ ID NO: 4)、LIDTSDSYTIYNQKFKG (SEQ ID NO: 5)和YGPLAMDY (SEQ ID NO: 6)；
b) 去除非特异性结合的第一抗体或其抗原结合片段；和
c) 用特异性结合人IL-21的第二抗体或其抗原结合片段检测所述第一抗体或其抗原结合片段与人IL-21的复合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段包含可检测标记物，并且其中所述第二抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含三个轻链互补决定区(LCDR)且所述HCVR包含三个重链互补决定区(HCDR)，其中所述三个LCDR和所述三个HCDR的氨基酸序列分别是：
i) RASKSIEKYIA (SEQ ID NO: 7)、AGGTLQS (SEQ ID NO: 8)、QQHEEYPLT (SEQ IDNO: 9)、GYDFTGYTMN (SEQ ID NO: 10)、LINPYNGGTAYSPKFKG (SEQ ID NO: 11)和THYYGSEYTGMDY (SEQ ID NO: 12)。
2.权利要求1的用途，其中所述第一抗体或其抗原结合片段的LCVR和HCVR分别包含SEQID NO: 19的氨基序列和SEQ ID NO: 20的氨基序列。
3.权利要求1的用途，其中所述第一抗体的轻链和重链分别包含SEQ ID NO: 25的氨基序列和SEQ ID NO: 26的氨基序列。
4.权利要求1的用途，其中所述第二抗体或其抗原结合片段的所述LCVR和所述HCVR分别由SEQ ID NO: 21的氨基序列和SEQ ID NO: 22的氨基序列组成。
5.权利要求1的用途，其中所述第二抗体的轻链和重链分别包含SEQ ID NO: 27的氨基序列和SEQ ID NO: 28的氨基序列。
6.权利要求1的用途，其中所述可检测标记物选自发色团、色原、染料、荧光剂、生荧光剂、磷光剂、化学发光剂、生物发光剂、放射性核素、正电子发射断层扫描-可成像剂和磁共振-可成像剂。
7.权利要求1的用途，其中所述方法进一步包括定量所述第一抗体或其抗原结合片段与人IL-21的复合物的量的步骤。
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