CN113728233A - 用于生物样品中的游离aim的免疫分析方法和分析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明要解决的问题是提高抗‑AIM抗体在包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中对游离AIM的特异性。该问题可以通过用于测定包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法解决，所述方法包括在抗‑IgM抗体存在下使所述生物样品与抗‑AIM抗体接触。
Description
技术领域
本发明涉及用于生物样品中的游离AIM的免疫分析方法。本发明还涉及用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒。本发明还涉及用于抑制非特异性反应的方法，该非特异性反应是在用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法中的非特异性反应。
背景技术
AIM(巨噬细胞的凋亡抑制剂)是由组织巨噬细胞产生的、具有约50kDa分子量的分泌性血液蛋白。AIM具有下列结构，其中，具有包含许多半胱氨酸残基的特异性序列的3个富含半胱氨酸的清道夫受体(SRCR)结构域串联连接，并且认为半胱氨酸残基在各结构域中彼此二硫键结合以形成紧凑的球形三维结构。
已知AIM具有与各种分子诸如脂多糖、IgM、补体调节因子和脂肪酸合成酶结合的特征。特别地，已知AIM在血液中以与IgM的复合体的形式存在。由于IgM是超过500kDa的巨大的蛋白复合体，只要AIM结合到IgM，AIM则不通过肾小球和转移至尿中，并且保持AIM的高血液浓度。当从IgM解离时，AIM迅速被排泄至尿中。因此，大多数AIM在血液中与IgM形成复合体，并且与作为缀合物相比，在血液中极少以游离状态存在。
近年来，已阐明AIM牵涉各种疾病诸如胰岛素抵抗或动脉硬化中的病理状态的进展。例如，报告了以不结合于其它结合配偶的游离形式存在的游离AIM与肝疾病之间的关联(专利文献1)。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO 2017/043617。
发明概述
技术问题
当基于游离AIM量的测定结果诊断特定疾病时，需要排除形成复合体的AIM的量，测定仅游离AIM的量。但是，当检测游离AIM时，也可检测结合于其它结合配偶的复合体AIM。因此，对无复杂操作的、能够排除形成复合体的AIM的非特异性反应的技术存在需求。
本发明的目的是提供具有优异特异性的、用于测定包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，和具有优异特异性的、用于测定包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒。
解决问题的方案
与游离AIM和复合体AIM二者结合的抗体比仅对游离AIM特异性结合的抗体更容易获得。作为用于通过应用容易获得的与游离AIM和复合体AIM二者结合的抗体解决所述问题的深入研究的结果，本发明人发现通过在抗-IgM抗体存在下使生物样品与抗-AIM抗体接触，可以提高抗-AIM抗体对游离AIM的特异性，由此完成本发明。
具体地，本发明如下。
<1>用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述方法包括在抗-IgM抗体存在下使所述生物样品与抗-AIM抗体接触。
<2>根据<1>所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述生物样品是体液样品。
<3>根据<1>或<2>所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述生物样品是血液、血清、血浆或尿。
<4>根据<1>至<3>中任一项所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述抗-AIM抗体是多克隆抗体。
<5>用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述试剂盒包含抗-IgM抗体和抗-AIM抗体。
<6>根据<5>所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述生物样品是体液样品。
<7>根据<5>或<6>所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述生物样品是血液、血清、血浆或尿。
<8>根据<5>至<7>中任一项所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述抗-AIM抗体是多克隆抗体。
<9>用于抑制非特异性反应的方法，所述非特异性反应是用于测定在生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法中的非特异性反应，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述方法包括在抗-IgM抗体存在下使所述生物样品与抗-AIM抗体接触。
<10>根据<9>所述的用于抑制非特异性反应的方法，其中，所述生物样品是体液样品。
<11>根据根据<9>或<10>所述的用于抑制非特异性反应的方法，其中，所述非特异性反应是由所述生物样品中的IgM引起的非特异性反应。
发明的有益效果
根据本发明，在用于测定包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法中，可以提高抗-AIM抗体对游离AIM的特异性。
附图说明
[图1]图1是显示当各种抗-人IgM抗体添加至测定系统时的非特异性反应抑制效果的图。
具体实施方式
[1]用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法(生物样品)
本发明中可分析的生物样品的例子包括来自机体(生物体)的固体组织和体液，并且优选应用体液。本发明中可分析的生物样品更优选为体液样品，诸如血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、泪液、耳漏或前列腺液，进一步优选血液、血清、血浆或尿。机体或对象的例子包括人或动物(例如，小鼠、豚鼠、大鼠、猴、狗、猫、仓鼠、马、牛和猪)，并且优选为人。来自对象的生物样品可在本发明实施之时收集或制备、或可预先地收集或制备并保存。测定样品的人和测定样品中游离AIM的量的人可不同。生物样品可以是体内样品。在本发明中，生物样品包含游离AIM和复合体AIM二者。
(AIM)
AIM(巨噬细胞的凋亡抑制剂)是由组织巨噬细胞产生的、具有约50kDa分子量的分泌性血液蛋白。AIM具有下列结构，其中，3个富含半胱氨酸的清道夫受体(SRCR)结构域、即包含许多半胱氨酸残基的特异性序列串联连接，并且认为半胱氨酸残基在各结构域中彼此二硫键结合以形成紧凑的球形三维结构。
人AIM由SEQ ID NO:1所表示的347个氨基酸组成并且包含富含半胱氨酸的3个SRCR结构域。SRCR1结构域相应于由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号24至125。SRCR2结构域相应于由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号138至239。SRCR3结构域相应于由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号244至346。
人AIM的氨基酸序列如下。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG(SEQ ID NO：1)
具体地，人AIM中的SRCR1结构域、SRCR2结构域和SRCR3结构域的氨基酸序列如下。
SRCR1结构域：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE(SEQ ID NO：2)
SRCR2结构域：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE(SEQ ID NO：3)
SRCR3结构域：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS(SEQ ID NO：4)
(游离AIM)
在本说明书中，“游离AIM”意味着不结合于其它物质诸如脂多糖或IgM、以游离状态存在的AIM。另一方面，在本说明书中，结合于其它物质诸如脂多糖或IgM并以复合体状态存在的AIM被称为复合体AIM。游离AIM优选地是人游离AIM，并且复合体AIM优选地是人复合体AIM。
(抗-IgM抗体)
如本文所用的术语“抗-IgM抗体”意味着具有与IgM结合的性质的抗体。换言之，“抗-IgM抗体”意味着这样的物质，通过Ouchterlony方法从所述物质产生人IgM和沉淀线。所述抗体可具有与其它抗原结合的性质，只要抗体具有与IgM结合的性质且不损害本发明的效果。本发明中使用的抗-IgM抗体优选地是抗-人IgM抗体。作为在本发明中使用的抗-IgM抗体，可以应用多克隆抗体和单克隆抗体二者。抗-IgM抗体可为能够与IgM结合的功能性片段。
在本发明的免疫分析方法中，通过应用抗-IgM抗体，与不添加抗-IgM抗体的情况相比，由复合体AIM引起的非特异性反应可以减少至50％或更低，优选地60％或更低、进一步优选地70％或更低、最优选地90％或更低。
尽管本发明中获得效果的原因尚未充分阐明，复合体AIM中的IgM部分和抗-IgM抗体之间的结合可能抑制复合体AIM的AIM部分与抗-AIM抗体之间的结合。令人惊讶的是，抗体与结合配偶中一者的结合影响抗体与另一结合配偶的结合。
可商购的抗-IgM抗体也可以用作本发明中所应用的抗-IgM抗体。可商购的抗-IgM抗体可以是HBR-1、HBR-3、HBR-6、HBR-Plus、HBR-9、HBR-11、HBR20、HBR21、HBR22、HBR23、HBR24、HBR25、HBR26(SCANTIBODIES)、P0911(Trina Bioreactives AG)和TRU Block(注册商标)ULTRA(Meridian Bioscience)，优选地是HBR-6、HBR-20和/或可商购的抗-人IgM多克隆抗体，更优选地是HBR-6、HBR-20和/或P0911(Trina Bioreactives AG)。
抗-IgM抗体的添加浓度没有特别限定，实现足够的非特异性反应抑制效果且免疫测定的主要反应不受影响即可，在单克隆抗体的情况下，期望抗体以1至1000μg/mL的浓度范围应用，更期望10至1000μg/mL，进一步期望10至300μg/mL。在多克隆抗体的情况下，抗体期望以0.01至2wt％的浓度范围应用，期望以0.03至2wt％的浓度范围应用，进一步期望以0.05至1wt％的浓度范围应用。
在本发明中，只要可以获得本发明的效果，抗-IgM抗体对IgM的结合亲和力没有特别限定，例如，对IgM的结合亲和力可以是Kd为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更多。
抗-IgM抗体可以根据已知的方法作为单克隆抗体或多克隆抗体制备。单克隆抗体可以例如，通过从用IgM或IgM片段免疫的非人哺乳动物分离为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，通过使该细胞与具有高增殖能力的骨髓瘤衍生细胞系融合以产生杂交瘤，并纯化该杂交瘤产生的抗体而获得。多克隆抗体可以从用IgM或IgM片段免疫的动物的血清获得。免疫原的例子包括但不限于灵长动物诸如人和猴、啮齿动物诸如大鼠和小鼠，狗，猫，马，绵羊和猪的IgM或IgM片段。
抗-IgM抗体可以是抗体分子整体以及具有抗原-抗体反应活性的抗体的片段，并可以是通过如上述动物的免疫步骤获得或通过应用基因重组技术获得的抗体，或可以是嵌合抗体。抗体的片段优选地是功能性片段；其例子包括F(ab')2、Fab'、scFv等；这些片段可以通过用蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上述获得的抗体、或通过将抗体的DNA进行克隆并在应用大肠杆菌或酵母的培养系统中表达而产生。
在本说明书中，“非特异性反应”意味着除了游离AIM以外的物质与本发明中使用的抗-AIM抗体结合。在本发明中，通过应用抗-IgM抗体，可以抑制由复合体AIM，或特别地由结合有IgM作为结合配偶的复合体AIM引起的非特异性反应。换言之，在本发明中，通过应用抗-IgM抗体，可以提高抗-AIM抗体对游离AIM的特异性。
本发明的用于抑制包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的量的免疫分析中的非特异性反应的方法可以是下列方法，在游离AIM的量的免疫分析中抑制复合体AIM与抗-AIM抗体的结合，所述方法包括在抗-IgM抗体存在下使包含复合体AIM和游离AIM的生物样品与抗-AIM抗体接触。
(抗-AIM抗体)
在本说明书中，抗-AIM抗体是指在抗-IgM抗体不存在时下与复合体AIM和游离AIM二者反应的抗体。如本文应用的术语“抗-AIM抗体”不包括与游离AIM反应且实质上不与复合体AIM反应的、对游离AIM有特异性的抗体。在本说明书中，“与游离AIM反应且不与复合体AIM实质上反应”意味着当通过本领域技术人员已知的方法测定抗体的反应性时，当对游离AIM的结合力是100时，对复合体AIM的结合力低于10％。
尽管本发明的“抗-AIM抗体”可为当通过本领域技术人员已知的方法测定抗体的反应性时，对复合体AIM的反应性和对游离AIM的反应性处于相同水平的抗-AIM抗体，对游离AIM的反应性比对复合体AIM的反应性强的抗-AIM抗体，和对复合体AIM的反应性比对游离AIM的反应性强的抗-AIM抗体中的任一，优选地，应用对游离AIM的反应性比对复合体AIM的反应性强的抗-AIM抗体。更具体地，当通过本领域技术人员已知的方法测定抗体的反应性时，优选应用当对游离AIM的结合力是100时，对复合体AIM的反应性为50％或更低的抗-AIM抗体。
本发明的免疫分析方法中使用的抗-AIM抗体可以是与人AIM的SRCR3结构域中的表位结合的抗体。本发明的免疫分析方法中使用的抗-AIM抗体优选地与SRCR3结构域中的表位结合且不与SRCR1结构域结合。本发明的免疫分析方法中使用的抗-AIM抗体更优选地与SRCR3结构域中的表位结合且不与SRCR1结构域或SRCR2结构域结合。
本发明中使用的抗-AIM抗体在抗-IgM抗体不存在下时与复合体AIM和游离AIM二者反应。反应系统中抗-IgM抗体的存在可以降低与复合体AIM的反应性。尽管将抗-IgM抗体添加至测定系统的时机没有特别限定，只要可以获得本发明的效果即可，抗-IgM抗体优选地在添加抗-AIM抗体之前或与其同时添加。
抗-AIM抗体可以根据已知的方法作为单克隆抗体或多克隆抗体制备。单克隆抗体可以例如，通过从用游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段免疫的非人哺乳动物分离为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，使该细胞与具有高增殖能力的骨髓瘤衍生细胞系融合以产生杂交瘤，并纯化该杂交瘤产生的抗体而获得。多克隆抗体可以从用游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段免疫的动物的血清获得。免疫原的例子包括但不限于灵长动物诸如人和猴、啮齿动物诸如大鼠和小鼠，狗，猫，马，绵羊和猪的游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段。例如，抗-AIM单克隆抗体可以通过如专利文献1的实施例中的下列程序产生。
<动物敏化>
通过混合作为抗原的全长人rAIM(2mg/ml)与等量的TiterMax Gold(G-1Funakoshi)制备乳剂。将两只8周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River Laboratories)用作免疫动物，将50μL的抗原溶液施用于后足底。两周后进行相同的施用，并且在另一个2周或更长时间后，将50μg的抗原溶液施用于后足底，以准备用于3天后进行的细胞融合。
<骨髓瘤细胞>
小鼠P3U1用作骨髓瘤细胞，并且通过添加谷氨酰胺和丙酮酸至RPMI1640(11875-119GIBCO)并以10％添加FBS(S1560 BWT)获得了用于生长培养的培养基。以适当量添加了青霉素和链霉素作为抗生素。
<细胞融合>
在麻醉下收集心脏血液后，从小鼠无菌取出腘淋巴结，并将腘淋巴结置于带有#200网孔的烧杯上并用硅棒按压，以制备细胞悬浮液。将细胞在RPMI 1640中离心洗涤2次，然后计数细胞的数目。将对数生长期中的骨髓瘤细胞通过离心收集，洗涤，然后调节使得淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比是5:1，并进行混合离心。通过应用PEG1500(783641Roche)进行细胞融合。具体地，在细胞球团与1mL的PEG溶液反应3分钟后，然后梯度稀释，并通过离心洗涤，添加培养基，并且在15个96孔板中置入200μL/孔，进行培养1周。关于培养基，将HAT补充剂(21060-017GIBCO)添加至用于骨髓瘤细胞的培养基以调节FBS浓度至15％。
<小鼠腹水收集>
将冷冻保存的细胞解冻和进行增殖培养后，将1×107个细胞施用于在1周或更长时间之前对其腹膜内施用了0.5ml的pristane(42-002Cosmo Bio)的裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu Nippon Clea)的腹腔，并且在约2周后，获得4至12ml的腹水。通过离心除去固体物后，冷冻保存腹水。
抗-AIM抗体可以是抗体分子整体以及具有抗原-抗体反应活性的抗体的片段。抗-AIM抗体可以是通过如上述动物的免疫步骤获得或通过应用基因重组技术获得的抗体、或可以是嵌合抗体。抗体的片段优选地是功能性片段，其例子包括F(ab')2、Fab'、scFv等。这些片段可以通过用蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上述获得的抗体、或通过克隆抗体的DNA并在应用大肠杆菌或酵母的培养系统中表达而产生。
尽管与AIM“反应”、“识别”AIM和与AIM“结合”在本说明书中同义应用，它们应以最广义解释而不限于这些示例。抗体是否与抗原(化合物)诸如AIM“反应”可以通过下列确认：抗原固相ELISA法、竞争ELISA法、夹心ELISA法等，以及应用表面等离子体共振原理的方法(SPR法)等。SPR法可以通过应用可在Biacore(注册商标)名称下商购的装置、传感器和试剂进行。
在本说明书中，“不溶性载体”可表示为“固相”，并且用不溶性载体物理上或化学上支持抗原或抗体或支持状态可表示为“固定”、“固定的”或”固相化的”。术语“分析”、“检测”或“测定”应以最广义的含义解释，包括游离AIM的存在证明和/或定量，并且不应以任何意义以限定方式解释。
(免疫分析方法)
本发明的免疫分析方法的例子包括但不限于电化学发光免疫分析(ECL法)、ELISA、酶免疫分析、免疫组化染色法、表面等离子体共振法、乳胶凝集免疫分析、化学发光免疫分析、荧光抗体法、放射免疫分析、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、免疫色谱、EATA法(电动分析物传输分析(Electrokinetic Analyte Transport Assay))和高效液相色谱(HPLC)，其为本领域技术人员已知的技术。
通过应用可以与所应用的抗体结合的标记的抗体(二次抗体)，可以测定结合于游离AIM的抗体的量并且可以由此测定生物样品中的游离AIM的量。用于产生标记的抗体的标记物质的例子包括酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素、放射性同位素、胶体金颗粒或着色乳胶。本领域技术人员可以取决于所应用的抗体和标记物质适当选择免疫分析方法，并且由于可以容易地构建实验系统，优选应用电化学发光免疫分析(ECL法)。
电化学发光免疫分析(ECL法)是指通过使标记物质通过电化学刺激发光和检测发光的量来计算分析物的量的方法。在电化学发光免疫分析(ECL法)中，钌络合物可以用作标记物质。通过在固相(微孔板或珠等)上设置电极并在电极上引起电化学刺激，可以检测此钌络合物的发光的量。
电化学发光免疫分析(ECL法)可以通过在抗-IgM抗体存在下应用抗-AIM抗体作为固相抗体，和其它抗-AIM抗体(即，与固相抗体识别不同的表位的抗体)作为检测抗体(标记的抗体)进行。当应用固相抗体和标记的抗体，同时珠和钌络合物分别用作固相和标记时，测定原理如下。下文描述本发明的一个实施方案中的测定原理，且完全不限制本发明的范围。
1.当具有与其结合的抗-AIM抗体的珠与样品在抗-IgM抗体存在下反应时，样品中的游离AIM与结合于珠的抗体结合。
2.洗涤珠之后，使钌-标记的抗体(与结合于珠的抗体具有不同的识别表位的抗体)与结合于珠的游离AIM反应并且以夹心形状结合。
3.洗涤珠之后，当在电极上应用电能时，钌络合物取决于经由游离AIM结合于珠的钌-标记的抗体的量而发光。通过测定此发光的量，可以测定样品中的游离AIM。
在用于免疫分析的方法中，由于可以容易和快速地测定靶，应用酶标记的ELISA法也是优选的。在夹心ELISA的情况下，可以应用具有在其上固定的抗-AIM抗体的不溶性载体，和被标记物质标记且与固定的抗体具有不同的表位的抗-AIM抗体。在此情况下，不溶性载体优选地是板(免疫板)，并且可以适当选择和应用标记物质。
在不溶性载体上固定的抗体在抗-IgM抗体存在下捕获样品中的游离AIM并在不溶性载体上形成抗体-游离AIM复合体。用标记物质标记的抗体与捕获的游离AIM结合，以与上述抗体-游离AIM复合体形成夹心结构。通过用对应于标记物质的方法测定标记物质的量，可以测定样品中的游离AIM。对于具体的方法，诸如，用于在不溶性载体上固定抗体的方法以及用于结合抗体和标记物质的方法，可以没有限制地应用本领域技术人员公知的方法。
也可以应用高效液相色谱法(HPLC法)。在此情况下，使荧光标记的抗-AIM抗体与生物样品接触，使得抗-AIM抗体结合于游离AIM和复合体AIM。随后，只有结合于游离AIM的抗-AIM抗体可以通过HPLC分离。
乳胶免疫凝集方法(下文也称为LTIA法)是典型的颗粒凝集免疫分析，并且也优选作为免疫分析方法。在LTIA法中，使用携带有针对靶成分的抗体的乳胶颗粒，并通过光学方法(例如，测定透射光的浊度法(turbidimetric method)、测定散射光的比浊法(turbiditymethod))对乳胶颗粒的凝集程度(浊度)进行检测，由此可以分析靶成分，其中，所述凝集由作为靶成分的抗原与支持有抗体的乳胶颗粒之间形成抗原-抗体复合体而结合而引起。在本发明的免疫分析方法中应用了携带有抗-AIM抗体的乳胶颗粒，可以通过光学方法检测乳胶颗粒的凝集的程度，该凝集由在抗-IgM抗体存在下、为靶成分的游离AIM与支持有抗体的乳胶颗粒之间结合形成抗原-抗体复合体而引起。
高效液相色谱法(HPLC法)或EATA法(电动分析物传输分析)也可以用作免疫分析方法。EATA法可以通过应用富士胶片和光纯药株式会社制造的μTAS Wako i30进行。
[2]用于测定游离AIM的量的分析试剂盒
本发明的用于测定游离AIM的量的分析试剂盒包括抗-IgM抗体和抗-AIM抗体。本发明的分析试剂盒也可以包括其它检测试剂、样本稀释剂和/或使用说明书。
本发明的用于测定游离AIM的量的分析试剂盒优选地包括下列(1)至(3)：
(1)固相，在其上固定有第一抗-AIM单克隆抗体；
(2)第二抗-AIM抗体，其用电化学发光物质标记且与第一抗-AIM抗体具有不同的表位；和
(3)抗-IgM抗体。
当应用ECL法时，本发明的分析试剂盒可以包括在其上固定有第一抗-AIM抗体的固相，和用电化学发光物质诸如钌络合物标记的第二抗-AIM抗体。例如，在应用微珠作为固相的试剂盒中，在抗-IgM抗体存在下，将生物样品添加至在其上固定有第一抗-AIM抗体的微珠并与其反应，然后除去和洗涤样品。随后，添加用电化学发光物质标记且与第一抗-AIM抗体识别不同表位的第二抗-AIM抗体，并使其反应。洗涤微珠后，施加电能用于发光，可以测定标记物质的发光的量以获得游离AIM浓度。
当应用夹心ELISA法时，分析试剂盒包括至少下列(1)至(3)：
(1)不溶性载体，在其上固定有第一抗-AIM抗体(固相抗体)；
(2)第二抗-AIM抗体(标记的抗体)，其被标记物质标记且与第一抗-AIM抗体识别不同的表位；和
(3)抗-IgM抗体。
在这样的试剂盒中，首先，在抗-IgM抗体存在下将生物样品添加至在其上固定有第一抗-AIM抗体的不溶性载体，然后温育，并除去和洗涤样品。添加标记的抗体然后温育，并添加底物用于显色。通过用读板仪等测定显色，可以获得所述生物样品中的游离AIM浓度。
当应用LTIA法时，分析试剂盒包括至少下列(1)至(3)。
(1)乳胶颗粒，在其上固定有第一抗-AIM抗体；
(2)乳胶颗粒，在其上固定有与第一抗-AIM抗体识别不同的表位的第二抗-AIM抗体；和
(3)抗-IgM抗体。
在这样的分析试剂盒中，在抗-IgM抗体存在下，第一抗-AIM抗体和第二抗-AIM抗体借助游离AIM凝集。通过应用光学方法检测凝集的程度，可以获得所述生物样品中的游离AIM浓度。
本发明将在下文用实施例具体描述；但这些实施例并不限制本发明的范围。如果没有特别说明，则％意味着按重量计的％。
实施例
[实施例1：通过总AIM测定系统测定复合体AIM和游离AIM量]
1.通过柱色谱分离人样本
通过尺寸排阻色谱(TSKgel G3000 SWXL,Tosoh)对10μL人样本进行了尺寸分级，以获得复合体AIM和游离AIM的各自级分(复合体AIM：级分号6和7，游离AIM：级分号14和15)。通过以1mL/min的流速应用磷酸盐缓冲液进行HPLC，获得各级分各500μL。
2.抗-AIM单克隆抗体-结合的磁珠的制备
1)测定用150mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)进行了透析的抗-AIM单克隆抗体的吸光度，并通过应用相同缓冲液调节至Abs 0.5。
2)应用缓冲液，洗涤1mL(30mg/mL)的Dynamic Biotech制造的Dynabeads M-450Epoxy 3次，并添加1mL的1)的抗体溶液。在25℃进行旋转搅拌18小时或更长时间。
3)用珠封闭缓冲液[50mM Tris,150mM NaCl,0.1％BSA,0.09％NaN3,pH 7.8]洗涤2)中制备的珠两次。通过洗涤除去缓冲液，从而除去保持在溶液中且未与珠结合的抗-AIM单克隆抗体。随后，添加1mL的珠封闭缓冲液并搅拌，并在25℃进行旋转搅拌18小时或更长时间。
4)用珠封闭缓冲液洗涤珠两次后，添加1mL的珠封闭缓冲液并搅拌。将它们用作抗-AIM单克隆抗体-结合的磁珠并在4℃保存直至应用。
3.钌-标记的抗-AIM单克隆抗体的产生
1)向用150mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)进行了透析的312.5μL的抗-AIM单克隆抗体溶液(与结合于磁珠的抗-AIM单克隆抗体具有不同的表位的抗体)添加14.1μL的10mg/mL钌络合物(Origin Tag-NHS ESTER，IGEN制造)，并搅拌溶液30分钟。随后，添加50μL的2M甘氨酸，并搅拌溶液20分钟。
2)将钌络合物-标记的抗-AIM单克隆抗体用于在直径1cm，高度30cm的玻璃管中填充的凝胶过滤柱色谱(Sephadex G-25，GE Healthcare Bioscience制造)，以分离和纯化非标记钌络合物和钌络合物-标记的抗体。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)进行洗脱。
4.级分的测定
1)从复合体AIM级分(编号6和7)各采取10μL，以将总共20μL添加至200μL的反应溶液[50mM HEPES,50mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM EDT-4Na,0.5％BSA,0.09％NaCl3,100μg/mL小鼠IgG,pH 7.8]或包含抗-IgM抗体-的反应溶液。类似地，游离AIM级分(编号14和15)采取各10μL，以将总共20μL添加至200μL的反应溶液或包含抗-IgM抗体的反应溶液。对于抗-IgM抗体，使用单克隆抗体(HBR-6,HBR-20，调节至50μg/mL)或多克隆抗体(P0911(TrinaBioreactives AG)，调节至0.125％)。
2)向溶液中添加25μL的、用珠稀释剂[50mM HEPES,100mM NaCl,0.1％Tween 20,1mM EDT-4Na，0.5％BSA，0.09％NaN3，pH 7.8]稀释为0.5mg/mL的浓度的抗体号12-结合的磁珠，并在30℃反应9分钟(第一反应)。
随后，用磁体捕获磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液[50mmol/LTris HCl，0.01％(W/V)Tween 20，0.15mol/L NaCl，pH 7.5]洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。
3)随后，添加200μL的，用对于钌的稀释液[50mM HEPES,50mM NaCl,0.05％Tween20,1mM EDT-4Na,0.5％BSA,0.09％NaN3,100μg/mL小鼠IgG,pH 7.8]稀释至0.6μg/mL浓度的钌-标记的抗体号12，并在30℃反应9分钟(第二反应)。
用磁体捕获反应后的磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。
4)随后，将300μL的三丙胺置于反应管中并与磁珠混合。通过在此状态施加电能，钌络合物发光，并通过检测器检测发光强度。
在向反应管添加磁珠的操作后，这在自动钌络合物发光测定仪Picolumi III上进行。
结果示于图1。当F6+F7的计数比低于基准时，抗体与复合体AIM的非特异性反应可能更受抑制。当F14+F15的计数比低于基准时，抗体对游离AIM的灵敏度可能更降低。相对于不添加抗-IgM抗体的测定系统，在添加了抗-IgM抗体的测定系统中，F6+F7的计数比是37.4％(HBR-6)、55.8％(HBR-20)和4.4％(P0911)，并且在所有测定系统中，抗-AIM抗体与复合体AIM的非特异性反应被抑制。具体地，与不添加HBR-6的系统相比，添加了HBR-6的系统中的非特异性反应降低约63％，与不添加HBR-20的系统相比，添加HBR-20的系统中的非特异性反应降低约44％，并且与不添加P0911的系统相比，添加P0911的系统中的非特异性反应降低约96％。因此，证明了通过在抗-IgM抗体存在下使生物样品与抗-AIM抗体反应，可以抑制由复合体AIM引起的非特异性反应。
工业实用性
根据本发明，在包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中，可以提高抗-AIM抗体对游离AIM的特异性。
Claims (11)
1.用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述方法包括在抗-IgM抗体存在下使所述生物样品与抗-AIM抗体接触。
2.根据权利要求1所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述生物样品是体液样品。
3.根据权利要求1或2所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述生物样品是血液、血清、血浆或尿。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法，其中，所述抗-AIM抗体是多克隆抗体。
5.用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述试剂盒包含抗-IgM抗体和抗-AIM抗体。
6.根据权利要求5所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述生物样品是体液样品。
7.根据权利要求5或6所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述生物样品是血液、血清、血浆或尿。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的用于测定生物样品中的游离AIM的量的分析试剂盒，其中，所述抗-AIM抗体是多克隆抗体。
9.用于抑制非特异性反应的方法，所述非特异性反应是在用于测定生物样品中的游离AIM的量的免疫分析方法中的非特异性反应，所述生物样品包含复合体AIM和游离AIM，所述方法包括在抗-IgM抗体存在下使所述生物样品与抗-AIM抗体接触。
10.根据权利要求9所述的用于抑制非特异性反应的方法，其中，所述生物样品是体液样品。
11.根据权利要求9或10所述的用于抑制非特异性反应的方法，其中，所述非特异性反应是由所述生物样品中的IgM引起的非特异性反应。
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