JP2007248373A - 免疫測定用ブロッキング剤組成物およびそれを用いたブロッキング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明によるブロッキング剤組成物は、セリシン、その加水分解物、その同等物、およびそれらの組合せからなる群より選択されるセリシン成分を有効成分として含んでなる、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するブロッキング剤組成物である。
【選択図】なし
Description
本発明は、免疫測定用ブロッキング剤組成物およびそれを用いたブロッキング方法に関する。より詳しくは、本発明は、生体材料中の微量物質測定法である免疫測定において、非特異的反応を抑制するブロッキング剤組成物およびそれを用いたブロッキング方法に関する。
抗原抗体反応を利用した免疫測定では、その測定精度を高めるため、抗原−抗体による特異的な反応を確実にさせる一方で、目的以外の物質と抗原もしくは抗体との間で起こりうる非特異的反応を防止することが重要である。この非特異的反応を抑制する手段として、例えば、測定器材の吸着座に特異的でない抗体等が吸着することを防止するために、そのような非特異的結合を起こしうる吸着座をブロック(封止)可能な物質(例えばブロッキング剤)によってブロッキングすることが挙げられる。
本発明によるブロッキング剤組成物は、前記したように、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するものであって、セリシン成分を有効成分として含んでなるものである。
前記したように、本発明によるブロッキング剤組成物は、セリシン、その加水分解物、その同等物、およびそれらの組合せからなる群より選択されるセリシン成分を有効成分として含んでなる。
天然物由来のセリシン、特に非加水分解物であるものは、繭糸または生糸から慣用の抽出方法により得ることができる。具体的には例えば、以下のようにして純度90%以上の高精製度単一タンパク質の状態で抽出して得ることができる。
(1) 前記セリシン水溶液のpHを、有機酸もしくは無機酸によってpH3〜5に調整した後、そこに有機凝集剤または無機凝集剤を添加してセリシンを析出させ、これをさらに濾過後、乾燥させて固体セリシンを得ることができる。
(2) 前記セリシン水溶液と、メタノール、エタノールまたはジオキサンなどの水溶性溶媒と混合し、これによりセリシンを析出させた後、濾別乾燥して固体セリシンを得ることができる。
(3) 特開平4−202435号公報に記載のように、前記セリシン水溶液を限外濾過膜または逆浸透膜に付し、所定の濾過処理を行った後、乾燥させてセリシン粉体を得ることができる。
ここで「有効成分として含んでなる」とは、本発明による組成物が、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するブロッキング性能を発揮するのに充分な量(すなわち、有効量)のセリシン成分を含有することをいう。したがって、このような量で、有効成分を含んでなる限りにおいて、本発明による組成物は、他の補助成分を含んでなることができる。このような補助成分としては、例えば、緩衝剤、塩類、アルコール類、ポリオール類、界面活性剤、抗生物質、防腐剤、安定剤、着色剤、分散剤等が挙げられる。
アルコール類としては、例えば、エタノールやメタノール、プロパノールなどが挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどが挙げられる。
前記したように、本発明の別の態様によれば、本発明によるブロッキング剤組成物を使用することを含んでなる、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するブロッキング方法が提供される。ここで、ブロッキング剤組成物は、典型的には、溶液状態とされて使用される。
セリシン濃度が1%(w/v)になるよう緩衝剤にセリシンを溶解し、ブロッキング溶液を調製した。ここで、緩衝剤にはPBS溶液(リン酸濃度9.5mM)を使用した。また、セリシンとしては、セーレン株式会社製(分子量3〜70kDa)のものを使用した。
ヒトエリスロポエチンを検出するウェスタンブロット法を用いて、セリシンによるブロッキング効果を確認した。
ヒトエリスロポエチン産生細胞(BHK21-pcDNA3.1-HC、American Type Culture Collection)の培養上清を、SDS−PAGE電気泳動により分離し、泳動したタンパクをメンブレン(Hybond−P、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)上に転写した。調製したブロッキング溶液に前記メンブレンを浸して4℃で一晩振とうした。なお対照のブロッキング溶液として、スキムミルクをその濃度が5%(w/v)になるよう緩衝剤に溶解させたものを使用した。ここで使用した緩衝液は、上記セリシンを含むブロッキング溶液の場合と同様であった。
図1に示すように、セリシンまたは5%(w/v)スキムミルクでブロッキングすることによって、ヒトエリスロポエチンが特異的に検出された。セリシン濃度はスキムミルク濃度の1/5であるにもかかわらず、ヒトエリスロポエチン以外の物質は検出されなかった。このことから、セリシンのブロッキング効果は、スキムミルクによるブロッキング効果よりも優れていることが示された。
ヒト血清アルブミン(HSA)と特異的に反応する抗HSA抗体は、ブロッキングに使用するウシ血清アルブミン(BSA)と非特異的に反応して、HSA測定に影響を与える場合がある。このことを利用して、本発明によるブロッキング溶液が、非特異的な反応を抑制するか否かを確認した。この試験では、HSA測定のための酵素免疫測定法を利用し、比較として1%BSAによるブロッキングを行った。
ヤギ由来抗HSAポリクローナル抗体(Cappel社製)をPBS緩衝液に溶解し、96穴アッセイプレート(Becton Dickinson社製)に添加して30℃で2時間反応させ、プレートに吸着させた。次にブロッキング溶液を添加して4℃で一晩反応させた。つづいて、ブロッキング溶液で調製した標準HSA(ナカライテスク社製)溶液を添加して30℃で2時間反応させた。
なおここで対照となるブロッキング溶液としては、PBS緩衝液で溶解した1%(w/v)BSA(ナカライテスク社製)溶液を用いた。
図2に示すように、BSAによるブロッキングでは抗HSA抗体と非特異的に反応したため、HSA濃度に依存した吸光値を得ることができなかった。一方、セリシンによるブロッキングではHSA濃度に依存した吸光値が得られた。このため、セリシンによるブロッキングは、HSA定量系における抗HSA抗体の非特異的反応の抑制に効果があることが示された。
酵素免疫測定法でのセリシンのブロッキングによる検出感度範囲を測定した。試験には、マウスモノクローナル抗体測定を利用し、マウスモノクローナル抗体の濃度を種々変化させて、それぞれの濃度における検出の可否を調べた。比較ブロッキング溶液として、1%(w/v)BSA、および5%(w/v)スキムミルク(ナカライテスク社製)を用いた。
一次抗体にはラビット由来抗マウスIgGポリクローナル抗体(Cappel社製)を使用し、二次抗体にはHRPO標識ヤギ由来抗マウスIgGポリクローナル抗体(Cappel社製)を使用した。また、標準となるマウスモノクローナル抗体は、マウス抗体産生細胞の培養上清からプロテインGカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて精製した抗体を使用し、これをブロッキング溶液に溶解した。他の条件は実施例2と同様にして行った。
セリシンによるブロッキングは、BSAまたはスキムミルクによるブロッキングよりも、マウスモノクローナル抗体を検出できる濃度範囲が広いことが示された。
Claims (7)
- セリシン、その加水分解物、その同等物、およびそれらの組合せからなる群より選択されるセリシン成分を有効成分として含んでなる、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するブロッキング剤組成物。
- セリシンおよび/またはその加水分解物が、繭糸または生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである、請求項1に記載のブロッキング剤組成物。
- 同等物が、化学合成または遺伝子工学的手法により得られたものである、請求項1に記載のブロッキング剤組成物。
- 緩衝剤成分をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のブロッキング剤組成物。
- 組成物が溶液形態であって、セリシン成分を0.1〜50g/L含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のブロッキング剤組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のブロッキング剤組成物を使用することを含んでなる、免疫測定法において非特異的な反応を抑制するブロッキング方法。
- 測定器材の吸着座に抗原または抗体を吸着させた後、ブロッキング剤組成物を被覆することによって、非特異的な反応を抑制することを含んでなる、請求項6に記載の方法。
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