TWI504897B - 硫酸吲哚酚之測定方法 - Google Patents

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Description

硫酸吲哚酚之測定方法
本發明係關於一種硫酸吲哚酚之測定方法。根據本發明，可高感度地測定硫酸吲哚酚。
尿毒症(uremia)係急性或慢性腎功能低下之疾病。作為尿毒症發病之原因之一，存在被認為是尿毒症毒素之物質，硫酸吲哚酚係其中之一(非專利文獻1)。有報告稱實際上慢性腎功能衰竭患者之血清中硫酸吲哚酚明顯增加，為正常者之約60倍(非專利文獻2)。因此，測定體液中、尤其是血清中之尿毒症毒素濃度對於疾患之診斷或檢查而言極有用，進而此測定方法可應用於治療效果之判定、預後之推測或食物療法之指標等。
關於該硫酸吲哚酚之測定方法，先前係採用氣相層析法或高效液相層析法進行分析。於專利文獻1中揭示有使用抗體之競爭酵素免疫法(以下有時稱為競爭EIA法)作為簡便地測定硫酸吲哚酚之方法。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平10-265457號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]「腎病學論文集(Seminars in Nephrology)」1996年(荷蘭)，第16卷，p.167~182
[非專利文獻2]「日本透析療法學會誌」1988年(日本)，第21卷，p.951~956(1988)
本發明者等人得知：進行上述專利文獻1中所記載之使用抗體之競爭EIA法，結果能夠定量地測定尿中之硫酸吲哚酚，但難以定量地測定血中硫酸吲哚酚。
因此，本發明之目的在於提供一種可定量地測定血中硫酸吲哚酚之競爭EIA法。
本發明者對可定量地測定血中硫酸吲哚酚之競爭EIA法進行努力研究，結果驚異地發現人類之血液中之白蛋白會阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合。並且，進而發現通常競爭EIA之阻斷所使用之牛血清白蛋白(以下有時稱為BSA)會阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合。進而發現競爭EIA法之反應液所含之BSA會阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合。該等由白蛋白引起之阻礙對於低濃度之硫酸吲哚酚較明顯。於專利文獻1中，測定人類血清中之硫酸吲哚酚、進而測定血清或血漿中之硫酸吲哚酚的複數種ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)套組正被銷售。因此，檢體中之血液中之白蛋白、以及阻斷液及反應緩衝液中之BSA等會阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合的情況對於業者而言乃預料之外。
本發明者等人發現：對檢體中之白蛋白進行預處理，利用不含白蛋白之Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羥基甲基)胺基甲烷)緩衝液阻斷硫酸吲哚酚固相化不溶性載體，並利用不含白蛋白之Tris緩衝液使硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體反應，藉此可準確地測 定血中硫酸吲哚酚。進而，本發明者等人發現：利用不含外來性哺乳類白蛋白之緩衝液而阻斷抗硫酸吲哚酚抗體固相化不溶性載體，並利用不含外來性哺乳類白蛋白之緩衝液使抗硫酸吲哚酚抗體固相化不溶性載體與硫酸吲哚酚(檢體及標記硫酸吲哚酚)反應，藉此可準確地測定血中硫酸吲哚酚。
本發明係基於上述見解者。
因此，本發明係關於如下者：[1]一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗體反應步驟，其係使上述預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化IS-抗體反應步驟，其係使上述檢體抗體反應液、與固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在哺乳類外源性白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測之步驟；[2]一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟；[3]一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源 性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟；[4]一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體、與標記硫酸吲哚酚及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟；[5]如[1]至[4]中任一項之硫酸吲哚酚之測定方法，其中上述抗硫酸吲哚酚抗體係含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域的抗體；[6]如[1]至[5]中任一項之硫酸吲哚酚之測定方法，其中上述白蛋白之預處理係利用預處理液所進行之處理或除蛋白質處理；[7]如[1]、[5]及[6]中任一項之硫酸吲哚酚之測定方法，其中同時進行檢體-抗體反應步驟(2)及固相化IS-抗體反應步驟(3)；[8]如[2]至[6]中任一項之硫酸吲哚酚之測定方法，其中同時進行檢體-抗原反應步驟(2)及固相化抗體-標記IS反應步驟(3)；[9]一種固相化不溶性載體，其係固相化有硫酸吲哚酚並且利用 實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者；[10]一種固相化不溶性載體，其係固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者；[11]一種硫酸吲哚酚之測定套組，其包含(1)如[9]之固相化不溶性載體或如[10]之固相化不溶性載體、及(2)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑；[12]一種抗硫酸吲哚酚抗體，其含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域；[13]一種選自由(1)抗硫酸吲哚酚抗體、(2)固相化有硫酸吲哚酚並且利用不含白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體、及(3)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液及/或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑所組成之群中之1種以上者之用途，其用於製造尿毒症之診斷套組；或者[14]一種選自由(1)標記硫酸吲哚酚、(2)固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用不含白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體、及(3)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液及/或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑所組成之群中之1種以上者之用途，其用於製造尿毒症之診斷套組。
根據本發明之硫酸吲哚酚之測定方法，可定量地測定血中硫酸吲哚酚。又，藉由除蛋白質而進行檢體中之白蛋白之預處理，藉此可進一步提昇競爭EIA法之感度。又，藉由使用含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域的抗體作為所使用之抗體，可進一步提昇競爭EIA法之感度。
圖1係表示使用2種單株抗體且於反應緩衝液中添加BSA之情形、與不添加BSA之情形之校準曲線的圖表。(A)：22-40-B5(BSA+)；(B)：22-40-B5(BSA-)；(C)：9A2F6(BSA-)
 [1]硫酸吲哚酚之測定方法
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法係藉由使用抗硫酸吲哚酚抗體之競爭法的免疫測定方法，即藉由使檢體中之硫酸吲哚酚、與濃度已知之硫酸吲哚酚(以下有時稱為競爭硫酸吲哚酚)於與抗硫酸吲哚酚抗體之結合中競爭，並測定檢體中之硫酸吲哚酚之濃度。
關於該競爭法中，可列舉：對固相化之競爭硫酸吲哚酚所結合之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測的方法(以下有時稱為「抗原固相化法」)、與對固相化之抗硫酸吲哚酚抗體所結合之競爭硫酸吲哚酚進行檢測的方法(以下有時稱為「抗體固相化法」)。
[1-1]抗原固相化法
本發明之藉由抗原固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法包括如下步驟：
(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗體反應步驟，其係使上述預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化IS-抗體反應步驟，其係使上述檢體抗體反應液、與固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測之步驟。
於本說明書中，所謂「外源性哺乳類白蛋白」，意指欲測定之檢體中原本含有之白蛋白以外之白蛋白。例如於使用人類血清作為檢體 之情形時，意指人類白蛋白以外之哺乳類白蛋白，即牛白蛋白、馬白蛋白、大鼠白蛋白、小鼠白蛋白、豬白蛋白、綿羊白蛋白、或山羊白蛋白等。
又，於本說明書中，所謂「於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下」，意指不存在無法獲得本發明之充分之效果之量的哺乳類白蛋白。即意指不存在實質上阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合之量的哺乳類白蛋白。因此，亦可存在與完全不存在哺乳類白蛋白之情形時之測定值相比而顯示出10%以下之測定值之阻礙的哺乳類白蛋白。
進而，於本說明書中，所謂「實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液」，意指緩衝液不含無法獲得本發明之充分之效果之量的哺乳類白蛋白。即意指不含實質上阻礙硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合之量的哺乳類白蛋白。因此，亦可含有與例如完全不存在哺乳類白蛋白之情形時之測定值相比而顯示出10%以下之測定值之阻礙的哺乳類白蛋白。
《預處理步驟(1)》
預處理步驟(1)係具有如下目的之步驟：藉由對檢體中之白蛋白進行預處理，而使檢體中之硫酸吲哚酚自檢體中之白蛋白游離，而使之容易與抗硫酸吲哚酚抗體結合。
預處理之方法只要會使檢體中之硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合成為促進狀態，則並無限定，例如可列舉利用預處理液所進行之處理或除蛋白質處理，尤佳為除蛋白質處理。其原因在於：由於反應液中之蛋白質被去除，故而由白蛋白以外之蛋白質引起之對反應之阻礙亦被排除。
(利用預處理液所進行之處理)
預處理液只要可減弱檢體中之硫酸吲哚酚與白蛋白之結合、促 進硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合，則並無限定。例如可列舉包含界面活性劑之緩衝液。作為界面活性劑，並無限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、及/或兩性離子系，較佳為不會阻礙抗原抗體反應之非離子系界面活性劑，尤佳為Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
(除蛋白質)
除蛋白質處理只要可於不去除檢體中之硫酸吲哚酚之情況下實質上去除包含白蛋白之蛋白質，則並無限定。於本說明書中，所謂「實質上去除包含白蛋白之蛋白質」，並非意指僅自檢體中完全地去除蛋白質，而是意指於本發明之硫酸吲哚酚之測定方法中去除白蛋白直至達到可再現性良好地進行硫酸吲哚酚之測定的程度。
作為除蛋白質處理之方法，亦可使用公知之方法，例如可使用HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)之預處理所用之方法。例如可列舉：將蛋白質改性使之不溶化再將其去除之方法、利用分子大小之差異而物理性地去除之方法、或親和法，較佳為將蛋白質改性使之不溶化再將其去除之方法。其原因在於：藉由使蛋白質不溶化之處理亦具有使硫酸吲哚酚與白蛋白無法結合之效果。
除蛋白質處理亦可使用市售之套組，例如亦可使用Sirocco蛋白沈澱板(Sirocco Protein Precipitation Plate)。於使用該板之情形時，於板上添加乙腈200μL，添加檢體50μL。檢體中之蛋白質藉由乙腈而沈澱。自板之下方進行吸濾，過濾沈澱之蛋白質。回收蛋白質被去除之濾液，可於檢體-抗體反應步驟(2)中用作預處理檢體。
(檢體)
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法可使用之檢體只要為具有包含硫酸吲哚酚之可能性之檢體，則並無特別限定，可列舉：血液、血清、血漿、淋巴液、組織液、唾液、尿、淚、汗、乳汁或組織之提取液等。本發明之測定方法可針對白蛋白之含量較多之檢體(例如血液、血清、血漿、淋巴液、組織液、或組織之提取液)有效地進行測定，亦可對白蛋白之含量較少之檢體(例如唾液、尿、淚、乳汁或汗)進行測定。又，取得檢體之動物種類亦無限定，藉由本發明之硫酸吲哚酚之測定方法，可對例如源自人類、狗、貓、牛、馬、大鼠、小鼠、豬、綿羊、或山羊之檢體進行測定。
《檢體-抗體反應步驟(2)》
本發明之抗原固相化法中之檢體-抗體反應步驟(2)係使預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸的步驟。
於本說明書中，所謂「於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸」，意指於反應緩衝液中實質上不添加除檢體所含之以外之外部之哺乳類白蛋白。即，意指於本步驟中，稀釋抗硫酸吲哚酚抗體之反應緩衝液不含無法獲得本發明之充分之效果之量的來自外部之哺乳類白蛋白。換言之，可含有能夠獲得本發明之效果之量的哺乳類白蛋白。此處，例如於使用人類血清作為檢體之情形、且上述預處理檢體進行過除蛋白質之情形時，由於白蛋白被去除，故而預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體之混合液實質上不含白蛋白。另一方面，於上述預處理檢體進行過利用預處理液所進行之處理、但未進行除蛋白質之情形時，由於白蛋白未被去除，故而成為於白蛋白之存在下預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體接觸的情況。然而，由於稀釋抗硫酸吲哚酚抗體之反應緩衝液中未添加來自外部之哺乳類白蛋白，故而於不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體接觸。
(反應緩衝液)
檢體-抗體反應步驟(2)中使用之反應緩衝液係不含哺乳類白蛋白者。反應緩衝液可含有哺乳類白蛋白以外之蛋白質，但就消除該等蛋白質與抗體或硫酸吲哚酚之相互作用之觀點而言，較佳為不含蛋白質之反應緩衝液。成為基質之緩衝液並無特別限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid，2-(N-嗎啉基)乙磺酸)緩衝液、MOPS(3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid，3-(N-嗎啉基)丙磺酸)緩衝液、MOPSO(3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid，3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸)緩衝液、HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid]，2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]乙磺酸)緩衝液、TES(2-[(Tris(hydroxymethyl)methyl)amino]-1-ethanesulfonic acid，2-[(三(羥基甲基)甲基)胺基]-1-乙磺酸)緩衝液、Tricine(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine，N-[三(羥基甲基)甲基]甘胺酸)緩衝液、Bis-Tris(Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methane，雙(2-羥基乙基)胺基-三(羥基甲基)甲烷)緩衝液、ADA(N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid，N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid，N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸)緩衝液、PIPES(Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)，哌-N,N'-雙(2-乙磺酸))緩衝液、BES(N,N-bis(hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid，N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙磺酸)緩衝液、DIPSO(3-[N,N-bis(2-Hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid，3-[N,N-雙(2-羥基乙基)胺基]-2-羥基丙磺酸)緩衝液、TAPSO(3-[N-tris(Hydroxymethyl)methyl-amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid，3-[N-三(羥基甲基)甲胺基]-2-羥基丙磺酸)緩衝液、POPSO(Piperazine- 1,4-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)，哌-1,4-雙(2-羥基丙磺酸)緩衝液、HEPPS(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinepropanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌丙磺酸)緩衝液、HEPPSO(N-(Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonic acid，N-(2-羥基乙基)哌-N'-(2-羥基丙磺酸))緩衝液、Bicine(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine，N,N-雙(2-羥基乙基)甘胺酸)緩衝液、TAPS(N-[Tris(hydroxymethyl)metyl]-3-aminopropanesulfonic acid，N-[三(羥基甲基)甲基]-3-胺基丙磺酸)緩衝液、CHES(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid，2-(環己基胺基)乙磺酸)緩衝液、CAPS(3-(Cyclohexylamino)-1-propanesuhinic acid，3-(環己基胺基)-1-丙磺酸)緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，較佳為包含具有醯胺基之化合物之緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。其原因在於：包含具有醯胺基之化合物之緩衝液亦可適宜地用於阻斷。作為Tris系緩衝液，並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE(Tris-EDTA(三(羥基甲基)胺基甲烷-乙二胺四乙酸))緩衝液、TAE(Tris-acetate-EDTA(三(羥基甲基)胺基甲烷-乙酸鹽-乙二胺四乙酸))緩衝液、TBE(Tris-borate-EDTA(三(羥基甲基)胺基甲-硼酸鹽-乙二胺四乙酸))緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。各緩衝液之濃度並無特別限定，較佳為5~200mM，更佳為10~150mM，進而較佳為10~100mM。
反應緩衝液可於檢體-抗體反應步驟(2)中用於稀釋抗硫酸吲哚酚抗體。
(界面活性劑)
上述反應緩衝液可含有界面活性劑。作為界面活性劑，並無特別限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、及/或兩性離子系，較佳為不會阻礙抗原抗體反應之非離子系界面活性劑，尤佳為 Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
(哺乳類白蛋白)
於本說明書中，所謂「哺乳類白蛋白」，意指於哺乳類中稱為白蛋白之一群蛋白質。具體而言，哺乳類白蛋白一般為肝臟中產生之蛋白質，於哺乳類之情形時，占血清中之蛋白質之50~65%。又，哺乳類白蛋白亦包含於血清以外之體液中，例如有時將乳中所含之白蛋白稱為乳白蛋白。
通常，於使用抗體之免疫測定方法中，向反應緩衝液中添加牛血清白蛋白等蛋白質，以抑制抗體之非特異性反應。本發明所使用之反應緩衝液係不含外源性哺乳類白蛋白(例如血清白蛋白、乳白蛋白)者。其原因在於：於本發明之硫酸吲哚酚之測定方法中，哺乳類白蛋白會阻礙硫酸吲哚酚之測定。上述反應緩衝液所不含之哺乳類白蛋白之來源並無限定，不含所有哺乳類白蛋白，具體而言，不含牛白蛋白、人類白蛋白、馬白蛋白、大鼠白蛋白、小鼠白蛋白、豬白蛋白、綿羊白蛋白、及山羊白蛋白。
再者，反應緩衝液可含有白蛋白以外之蛋白質(與硫酸吲哚酚無結合性者)。
(抗硫酸吲哚酚抗體)
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法所使用之抗硫酸吲哚酚抗體只要可與硫酸吲哚酚結合，則並無限定，可為單株抗體，亦可為多株抗體。然而，就特異性之觀點而言，較佳為單株抗體，尤佳為含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域的9A2F6單株抗體。
硫酸吲哚酚之測定方法所使用之抗硫酸吲哚酚抗體除了使用結 合有蛋白質作為免疫抗原之連結子賦予硫酸吲哚酚以外，亦可藉由公知之方法而製作。抗硫酸吲哚酚抗體如上所述，可為多株抗體，亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。又，亦可使用現有或市售之抗體。
單株抗體可依據Koehler與Milstein之方法(Nature 256：495~497，1975)進行製作。又，對於多株抗體，例如可於兔之皮內使抗原單獨地或以與BSA、KLH(keyhole limpet hemocyanin，鑰孔蟲戚血藍蛋白)等結合之形態，與弗氏(Freund)完全佐劑等佐劑混合，並定期地進行免疫，於血中之抗體效價上升時進行採血，將其直接作為抗血清，或者藉由公知方法對抗體進行純化後使用。
又，作為抗硫酸吲哚酚抗體，亦可使用包含針對硫酸吲哚酚之抗原結合部位的抗體片段。作為抗體片段，例如可列舉：F(ab')2 、Fab'、Fab、或Fv、及雙鏈抗體、單鏈抗體分子、及由抗體片段所形成之多特異性抗體。該等抗體片段例如可藉由常法利用蛋白質分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜酶等)消化抗體，繼而藉由常法之蛋白質之分離純化之方法進行純化而獲得，或者可藉由基因重組而製備。
檢體-抗體反應步驟(2)中之預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體之容量並無特別限定，例如可以20μL~500μL左右進行。又，預處理檢體與抗硫酸吲哚酚抗體之比亦無限定，可以1：10~10：1左右之比使該等混合、接觸。抗硫酸吲哚酚抗體之濃度亦可適當決定，並無特別限定，例如可採用0.01μg/mL~100μg/mL之濃度，較佳為0.1μg/mL~10μg/mL，更佳為0.5μg/mL~5μg/mL。
預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體之接觸時間亦無特別限定，可該等接觸30分鐘~一晝夜，較佳為30分鐘~2小時。又，接觸溫度亦無特別限定，例如可於4℃~40℃左右之溫度下進行，較佳為30~37℃。
《固相化IS-抗體反應步驟(3)》
本發明之抗原固相化法中之固相化IS-抗體反應步驟(3)係使上述檢體抗體反應液、與固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸的步驟。
於本步驟中，使上述檢體-抗體反應步驟(2)中所獲得之檢體抗體反應液與已使硫酸吲哚酚固相化之不溶性載體於不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸。於本說明書中，所謂「於不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸」，與檢體-抗體反應步驟(2)同樣地意指於反應緩衝液中實質上不添加除檢體所含之哺乳類白蛋白以外之外部之哺乳類白蛋白。即，意指稀釋檢體-抗體反應步驟(2)中使用之抗硫酸吲哚酚抗體之反應緩衝液不含無法獲得本發明之充分之效果之量的來自外部之哺乳類白蛋白。換言之，可含有能夠獲得本發明之效果之量的哺乳類白蛋白。又，於本步驟中，於將檢體-抗體反應步驟(2)中所獲得之檢體抗體反應液添加至固相化不溶性載體中之情形時，於進而添加反應緩衝液之情形時亦使用不含來自外部之哺乳類白蛋白之反應緩衝液。
本步驟中使用之反應緩衝液可使用上述「檢體-抗體反應步驟(2)」欄中所記載之反應緩衝液。
《固相化不溶性載體》
本步驟中使用之固相化不溶性載體係固相化有硫酸吲哚酚並且利用不含白蛋白之緩衝液進行阻斷者，較佳為利用不含白蛋白之Tris緩衝液進行阻斷之固相化不溶性載體。所使用之不溶性載體只要為通常之免疫測定方法中所用者則並無限定，例如可列舉：免疫分析用微孔板、珠粒、或磁性粒子。不溶性載體之材質亦無特別限定，可列舉：聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚糖、多糖(Polysaccharide)等高分子、其他硝化纖維素、 紙、瓊脂糖及該等之組合等。更具體而言，可使用96孔或384孔之免疫分析用微孔板。
(硫酸吲哚酚)
固相化所使用之硫酸吲哚酚並無限定，較佳為使之結合於載體蛋白質上而成者。作為載體蛋白質，只要為白蛋白以外之蛋白質則並無特別限定，例如可列舉：鑰孔蟲戚血藍蛋白、卵白蛋白、或運鐵蛋白、甲狀腺球蛋白、或免疫球蛋白，較佳為運鐵蛋白。向載體蛋白質之結合方法亦可依據通常方法進行。例如硫酸吲哚酚與載體蛋白質之結合物可藉由如下方式獲得：使上述硫酸吲哚酚與蛋白質於pH值為6~8之緩衝液或水中混合，使該等於室溫下反應數小時~20小時左右，其後進行透析，將內液離心而去除不溶物。
供硫酸吲哚酚溶解之緩衝液亦無特別限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。
固相化之條件亦可依據於免疫測定方法中通常使抗原於不溶化載體上固相化之條件而進行，例如採用96孔板之情形時，可使濃度為100ng~10μg/mL之結合於載體蛋白質上之硫酸吲哚酚以50μL~200μL/孔之容量於4℃、O/N(Overnight，整夜)之條件下固相化。
(阻斷液)
阻斷液係不含哺乳類白蛋白者。阻斷液可含有哺乳類白蛋白以外之蛋白質，但就消除該等蛋白質與抗體或硫酸吲哚酚之相互作用之 觀點而言，較佳為不含蛋白質之阻斷液。成為基質之緩衝液只要不含哺乳類白蛋白，則並無限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液。然而，為了進行有效之阻斷，較佳為包含具有醯胺基之化合物的緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。作為Tris系緩衝液並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。
又，上述阻斷液亦可含有界面活性劑。作為界面活性劑，並無特別限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、及/或兩性離子系，較佳為不會阻礙抗原抗體反應之非離子系界面活性劑，尤佳為Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
例如於使用96孔板作為不溶性載體之情形時，所添加之阻斷液之量只要多於包含固相化所使用之硫酸吲哚酚之緩衝液之容量即可，例如可以200μL~400μL進行。又，阻斷溫度及時間亦無特別限定，例如可於4℃~37℃下進行30分鐘~一晝夜。
《檢測步驟(4)》
本發明之抗原固相化法中之檢測步驟(4)係如下步驟：針對於固相化不溶性載體上固相化之硫酸吲哚酚所結合之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測。抗硫酸吲哚酚抗體之檢測可直接利用標記物質對抗硫酸吲哚 酚抗體進行標記，並檢測其訊號。即，檢測步驟(4)之一態樣係(a)對經標記之抗硫酸吲哚酚抗體之標記進行檢測的步驟，具體而言係對結合於固相化不溶性載體上之經標記之抗硫酸吲哚酚抗體(1次抗體)之訊號進行檢測的步驟(1階段法、直接法)。
進而，抗硫酸吲哚酚抗體之檢測亦可對針對抗硫酸吲哚酚抗體之2次抗體(例如抗小鼠免疫球蛋白抗體)進行標記，使該標記2次抗體與抗硫酸吲哚酚抗體結合，將標記2次抗體之標記作為訊號而進行檢測。即，檢測步驟(4)之另一態樣係(b)對針對抗硫酸吲哚酚抗體之經標記之抗體之標記進行檢測的步驟，具體而言係使之與針對抗硫酸吲哚酚抗體之標記2次抗體接觸，並對結合於固相化不溶性載體上之標記2次抗體之訊號進行檢測的步驟(2階段法、間接法)。
(標記物質及反應受質)
作為抗體之標記物質，可列舉：辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、及螢光素酶等。又，除酵素以外，作為標記物質，亦可使用：吖啶鎓衍生物等發光物質，若丹明、異硫氰酸螢光素(FITC)、或銪等螢光物質，3 H、14 C、或I125 等放射性物質等。又，可配合標記物質而適當選擇受質或發光誘導物質。進而，可對抗體進行生物素標記，利用上述標記物質對生物素所結合之抗生物素蛋白進行標記，並檢測訊號。
(檢測用反應緩衝液)
檢測步驟(4)所使用之檢測用反應緩衝液係於2階段法中用於稀釋上述針對抗硫酸吲哚酚抗體之標記2次抗體者。
檢測用反應緩衝液並無特別限定，較佳為不含哺乳類白蛋白者。檢測用反應緩衝液可含有哺乳類白蛋白以外之蛋白質，但就消除該等蛋白質與抗體或硫酸吲哚酚之相互作用之觀點而言，較佳為不含蛋白質之檢測用反應緩衝液。成為基質之緩衝液並無限定，例如可列 舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，較佳為包含具有醯胺基之化合物之緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。其原因在於：包含具有醯胺基之化合物之緩衝液亦可適宜地用於阻斷。作為Tris系緩衝液並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。
(標記2次抗體之接觸)
利用檢測用反應緩衝液稀釋標記2次抗體，添加至不溶性載體中使之反應。反應時間並無特別限定，可使之反應30分鐘~一晝夜，較佳為30分鐘~2小時。又，反應溫度亦無特別限定，例如可於4℃~40℃左右之溫度下進行，較佳為30~37℃。
(訊號之檢測)
於檢測步驟(4)中，藉由對螢光物質、放射性物質、針對酵素之受質、及發光誘導物質等之訊號進行檢測，而可檢測固相化之硫酸吲哚酚所結合之抗硫酸吲哚酚抗體。
於本發明之硫酸吲哚酚之測定方法中，檢體中之硫酸吲哚酚與固相化之競爭硫酸吲哚酚於與抗硫酸吲哚酚抗體之結合中競爭，因此若檢體中之硫酸吲哚酚之量較多，則訊號降低，若檢體中之硫酸吲哚酚之量較少，則訊號提高。
《檢體-抗體反應步驟(2)及固相化IS-抗體反應步驟(3)之同時實施》
於本發明之藉由抗原固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法 中，可同時進行檢體-抗體反應步驟(2)及固相化IS-抗體反應步驟(3)。
具體而言，使預處理檢體、抗硫酸吲哚酚抗體及固相化之硫酸吲哚酚於固相化不溶性載體上同時接觸之步驟。
反應時間並無特別限定，可該等反應30分鐘~一晝夜，較佳為30分鐘~2小時。又，反應溫度亦無特別限定，例如可於4℃~40℃左右之溫度下進行，較佳為30~37℃。
於本發明之藉由抗原固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中，於各步驟之間可清洗固相化不溶性載體。
[1-2]抗體固相化法
本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟。
於本說明書中，所謂「固相化有抗硫酸吲哚酚抗體之固相化不溶性載體」不僅包括使抗硫酸吲哚酚抗體直接於不溶性載體上固相化者，亦包括使抗硫酸吲哚酚抗體經由對抗硫酸吲哚酚抗體具有親和性之成分(例如針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體)而於不溶性載體上固相化者、或使抗硫酸吲哚酚抗體經由抗生物素蛋白及生物素等之結合而於不溶性載體上固相化者。具體而言，可使針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體(例如抗小鼠抗體)於不溶性載體上固相化，經由其使小鼠抗硫酸吲哚酚抗體於不溶性載體上固相化。又，亦可使抗生物素蛋白於不溶性載體上固相化，經由其使生物素標記抗硫酸吲哚酚抗體固相化。
又，本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法包含包括如下步驟之藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，上述步驟為：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟。
進而，本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法包含包括如下步驟之藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，上述步驟為：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體、與標記硫酸吲哚酚及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟。
《預處理步驟(1)》
抗體固相化法中之預處理步驟(1)可藉由與抗原固相化法中之預處理步驟(1)相同之方式進行。
《檢體-抗原反應步驟(2)》
抗體固相化法中之檢體-抗原反應步驟(2)係如下步驟：使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條 件下接觸。緩衝液並無特別限定，可無限定地使用抗體固相化法中所記載之「反應緩衝液」。
於本說明書中，所謂「於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸」，意指於反應緩衝液中實質上不添加除檢體所含之白蛋白以外之外部之哺乳類白蛋白。即，意指於本步驟中，稀釋標記硫酸吲哚酚之反應緩衝液不含無法獲得本發明之充分之效果之量的來自外部之哺乳類白蛋白。換言之，可含有能夠獲得本發明之效果之量的哺乳類白蛋白。此處，例如於使用人類血清作為檢體之情形、且上述預處理檢體進行過除蛋白質之情形時，由於人類血清白蛋白被去除，故而預處理檢體及標記硫酸吲哚酚之混合液實質上不含白蛋白。另一方面，於上述預處理檢體進行過利用預處理液所進行之處理、但未進行除蛋白質之情形時，由於人類血清白蛋白未被去除，故而成為於白蛋白之存在下預處理檢體及標記硫酸吲哚酚接觸之情況。然而，由於稀釋標記硫酸吲哚酚之反應緩衝液中未添加來自外部之白蛋白，故而於不存在外源性白蛋白之條件下預處理檢體及標記硫酸吲哚酚接觸。
再者，本步驟中使用之緩衝液可不含蛋白質，但較佳為包含哺乳類白蛋白以外之蛋白質。哺乳類白蛋白以外之蛋白質並無限定，例如可使用明膠、酪蛋白、卵白蛋白、或市售之阻斷劑等。
抗體固相化法中所記載之「反應緩衝液」、「界面活性劑」、「哺乳類白蛋白」係與上述抗原固相化法之「檢體-抗體反應步驟(2)」中所記載之「反應緩衝液」、「界面活性劑」、「哺乳類白蛋白」相同者。
(標記硫酸吲哚酚)
本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法所使用之標記硫酸吲哚酚只要可與抗硫酸吲哚酚抗體結合則並無限定，例如可為游離之硫酸吲哚酚，亦可為結合於載體蛋白質上者。作為載體蛋白質，只要為哺乳類白蛋白以外之蛋白質(與硫酸吲哚酚無結合 性者)，則並無特別限定，例如可列舉：運鐵蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、或免疫球蛋白等。結合於載體蛋白質上之方法亦可依據通常之方法進行。
(標記物質)
作為標記硫酸吲哚酚所使用之標記物質，可列舉：辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、及螢光素酶等。又，除酵素以外，作為標記物質，亦可使用：吖啶鎓衍生物等發光物質，若丹明、異硫氰酸螢光素(FITC)、或銪等螢光物質，3 H、14 C、或I125 等放射性物質等。
檢體-抗原反應步驟(2)中之預處理檢體及標記硫酸吲哚酚之容量並無特別限定，例如可以20μL~500μL左右進行。又，預處理檢體與標記硫酸吲哚酚之比亦無限定，可以1：10~10：1左右之比使該等混合、接觸。標記硫酸吲哚酚之濃度亦可適當決定，並無特別限定，例如可採用0.01μg/mL~100μg/mL之濃度，較佳為0.1μg/mL~10μg/mL，更佳為0.5μg/mL~5μg/mL。
預處理檢體與抗硫酸吲哚酚抗體之接觸時間亦無特別限定，可使該等接觸30分鐘~一晝夜，較佳為30分鐘~2小時。又，接觸溫度亦無特別限定，例如可於4℃~40℃左右之溫度下進行，較佳為30~37℃。
《固相化抗體-標記IS反應步驟(3)》
固相化抗體-標記IS反應步驟(3)係如下步驟：使上述檢體抗體反應液、與固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸。緩衝液並無特別限定，可無限定地使用抗體固相化法中所記載之「反應緩衝液」。
於本步驟中，使上述檢體-抗原反應步驟(2)中所獲得之檢體抗原 反應液、與使抗硫酸吲哚酚抗體固相化之不溶性載體於實質上不存在外源性白蛋白之條件下接觸。於本說明書中，所謂「於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸」，與檢體-抗原反應步驟(2)同樣地意指於反應緩衝液中實質上不添加來自外部之哺乳類白蛋白。即，意指稀釋檢體-抗原反應步驟(2)中使用之標記硫酸吲哚酚之反應緩衝液不含無法獲得本發明之充分之效果之量的來自外部之哺乳類白蛋白。又，於本步驟中，於將檢體-抗原反應步驟(2)中所獲得之檢體抗原反應液添加至固相化不溶性載體中之情形時，於進而添加反應緩衝液之情形時亦使用不含來自外部之哺乳類白蛋白之反應緩衝液。
再者，本步驟中使用之緩衝液可不含蛋白質，但較佳為包含哺乳類白蛋白以外之蛋白質。哺乳類白蛋白以外之蛋白質並無限定，例如可使用明膠、酪蛋白、卵白蛋白、或市售之阻斷劑等。
本步驟中使用之反應緩衝液可使用上述抗原固相化法之「檢體-抗體反應步驟(2)」欄中所記載之反應緩衝液。
《固相化不溶性載體》
本步驟中使用之固相化不溶性載體係固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者。緩衝液並無特別限定，可無限定地使用抗原固相化法中所記載之「反應緩衝液」。所使用之不溶性載體只要為通常之免疫測定方法中所用者則並無限定，可列舉：免疫分析用微孔板、珠粒、或磁性粒子。不溶性載體之材質亦無特別限定，可列舉：聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚糖、多糖等高分子、其他硝化纖維素、紙、瓊脂糖及該等之組合等。更具體而言，例如可使用96孔或384孔之免疫分析用微孔板。
(抗硫酸吲哚酚抗體)
固相化所使用之抗硫酸吲哚酚抗體可使用上述抗原固相化法之 「檢體-抗體反應步驟(2)」欄中所記載之抗硫酸吲哚酚抗體。
供抗硫酸吲哚酚抗體溶解之緩衝液亦無特別限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。
固相化之條件亦可依據於免疫測定方法中通常使抗體於不溶性載體上固相化之條件而進行，例如於使用96孔板作為不溶性載體之情形時，可使濃度為100ng~10μg/mL之抗硫酸吲哚酚抗體以50μL~200μL/孔之容量於4℃、O/N之條件下固相化。
(阻斷液)
阻斷液係不含哺乳類白蛋白者，可使用抗原固相化法之「檢體-抗體反應步驟(2)」欄中所記載之阻斷液同樣地進行阻斷。
本步驟中使用之緩衝液較佳為包含哺乳類白蛋白以外之蛋白質。哺乳類白蛋白以外之蛋白質並無限定，例如可使用明膠、酪蛋白、卵白蛋白、或市售之阻斷劑等。
《檢測步驟(4)》
檢測步驟(4)係如下步驟：對在固相化不溶性載體上固相化之抗硫酸吲哚酚抗體上所結合之標記硫酸吲哚酚進行檢測。標記硫酸吲哚酚之檢測係將標記硫酸吲哚酚之標記作為訊號而進行檢測。即，檢測步驟(4)之一態樣係對標記硫酸吲哚酚之標記進行檢測之步驟，具體而言係對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚之訊號進行檢測之步驟。
再者，於使用硫酸吲哚酚與載體結合而成者之情形時，可不直接對硫酸吲哚酚進行標記，而對載體進行標記，或使用針對載體之標記抗體，檢測訊號，於本說明書中，此種態樣亦包括在標記硫酸吲哚酚之檢測內。
於本發明之抗體固相化法中之檢測步驟(4)中，可使用上述抗原固相化法之「檢測步驟(4)」欄中所記載之「標記物質及反應受質」、「檢測用反應緩衝液」。
(訊號之檢測)
於本發明之抗體固相化法中之檢測步驟(4)中，藉由對螢光物質、放射性物質、針對酵素之受質、及發光誘導物質等之訊號進行檢測，而可對固相化之抗硫酸吲哚酚抗體所結合之標記硫酸吲哚酚進行檢測。
於本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中，由於檢體中之硫酸吲哚酚與標記硫酸吲哚酚(競爭硫酸吲哚酚)於與抗硫酸吲哚酚抗體之結合中競爭，故而若檢體中之硫酸吲哚酚之量較多，則訊號減弱，若檢體中之硫酸吲哚酚之量較少，則訊號增強。
《檢體-抗原反應步驟(2)及固相化抗體-標記IS反應步驟(3)之同時實施》
於本發明之藉由抗原固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中，可同時進行檢體-抗原反應步驟(2)及固相化抗體-標記IS反應步驟(3)。
具體而言係使預處理檢體、標記硫酸吲哚酚及固相化之抗硫酸吲哚酚抗體於固相化不溶性載體上同時接觸之步驟。
反應時間並無特別限定，可使之反應30分鐘~一晝夜，較佳為30分鐘~2小時。又，反應溫度亦無特別限定，例如可於4℃~40℃左右之溫度下進行，較佳為30~37℃。
於本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中，於各步驟之間，可清洗固相化不溶性載體。
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法係對在先前之硫酸吲哚酚之測定方法中阻礙硫酸吲哚酚之測定之白蛋白之影響加以抑制者。因此，本發明係關於一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中之白蛋白之測定阻礙之抑制方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗體反應步驟，其係使上述預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化IS-抗體反應步驟，其係使上述檢體抗體反應液、與固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測之步驟。
又，本發明係關於一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法中之白蛋白之測定阻礙之抑制方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記IS反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟。
[2]尿毒症之診斷方法
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法可用作尿毒症之診斷方法。本發明之硫酸吲哚酚之測定方法可用作尿毒症之診斷輔助方法。又，本發明之尿毒症之診斷方法係藉由自體內分離檢體(例如血液、血清、血漿、淋巴液、組織液、唾液、尿、淚、汗、乳汁或組織之提取液)並於活體外(in vitro)測定硫酸吲哚酚而進行。進而，本發明之尿毒症之診斷方法係為了提供尿毒症之診斷所需之資訊而測定硫酸吲哚酚者，不包括醫師之臨床判斷。
作為體內之硫酸吲哚酚上升之尿毒症，可列舉：慢性腎功能衰竭、急性腎功能衰竭等各種腎臟疾患。
上述抗硫酸吲哚酚抗體可用作尿毒症之診斷(方法)中所使用之抗體。
[3]固相化不溶性載體
本發明之固相化不溶性載體係(A)固相化有硫酸吲哚酚並且利用不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者，或(B)固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者。
再者，上述固相化不溶性載體(B)不僅包括使抗硫酸吲哚酚抗體直接於不溶性載體上固相化者，亦包含使抗硫酸吲哚酚抗體經由對抗硫酸吲哚酚抗體具有親和性之成分(例如針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體)而於不溶性載體上固相化者、或使抗硫酸吲哚酚抗體經由抗生物素蛋白及生物素等之結合而於不溶性載體上固相化者。具體而言，可使針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體(例如抗小鼠抗體)於不溶性載體上固相化，經由其使小鼠抗硫酸吲哚酚抗體於不溶性載體上固相化。又，亦可使抗生物素蛋白於不溶性載體上固相化，經由其使生物素標記抗硫酸吲哚酚抗體固相化。
上述固相化不溶性載體(A)係可用於本發明之藉由抗原固相化法 所進行之硫酸吲哚酚之測定方法者，固相化不溶性載體(B)係可用於本發明之藉由抗體固相化法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法者。
本發明之固相化不溶性載體所使用之「硫酸吲哚酚」及「阻斷液」可使用上述「[1]硫酸吲哚酚之測定方法」中所記載之「硫酸吲哚酚」及「阻斷液」。本發明之固相化不溶性載體所使用之「抗硫酸吲哚酚抗體」及「阻斷液」可使用上述「[1]硫酸吲哚酚之測定方法」中所記載之「抗硫酸吲哚酚抗體」及「阻斷液」。又，固相化不溶性載體所使用之不溶性載體可無制限地使用通常之免疫測定方法中所使用之不溶性載體，例如可列舉：免疫分析用微孔板、珠粒、或磁性粒子。不溶性載體之材質亦無特別限定，可列舉：聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚糖、多糖等高分子、其他硝化纖維素、紙、瓊脂糖及該等之組合等。更具體而言，可使用96孔之免疫分析用微孔板、及384孔之免疫分析用微孔板等。
《固相化不溶性載體(A)之製造方法》
固相化不溶性載體(A)之製造方法包括如下步驟：(1)使硫酸吲哚酚於不溶性載體上固相化之步驟；及(2)利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷之步驟。
固相化步驟(1)係使不溶性載體接觸包含硫酸吲哚酚之緩衝液而使之結合硫酸吲哚酚者。供硫酸吲哚酚溶解之緩衝液並無限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝 液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。作為Tris系緩衝液，並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。使結合於載體蛋白質上之硫酸吲哚酚(例如結合於運鐵蛋白上之硫酸吲哚酚)於該等緩衝液中溶解為100ng~10μg/mL之濃度，並以50μL~200μL/孔之容量於4℃、O/N之條件下固相化。
阻斷步驟(2)係使阻斷液接觸固相化有硫酸吲哚酚之不溶性載體而對不溶性載體之表面進行阻斷者。阻斷液只要為實質上不含哺乳類白蛋白者，則並無限定，較佳為不含蛋白質者。具體而言，可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液。然而，為了進行有效之阻斷，較佳為包含具有醯胺基之化合物之緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。作為Tris系緩衝液並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。
又，上述阻斷液亦可含有界面活性劑。作為界面活性劑，並無特別限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、及/或兩性離子系，較佳為不會阻礙抗原抗體反應之非離子系界面活性劑，尤佳為Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
例如採用96孔板之情形時，可藉由添加上述阻斷液50μL~300 μL，例如於4℃~37℃下靜置10分鐘~一晝夜而進行阻斷。
《固相化不溶性載體(B)之製造方法》
固相化不溶性載體(B)之製造方法包括如下步驟：(1)使抗硫酸吲哚酚抗體於不溶性載體上固相化之步驟；及(2)利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷之步驟。
固相化步驟(1)係使不溶性載體接觸包含抗硫酸吲哚酚抗體之緩衝液而使之結合抗硫酸吲哚酚抗體者。供抗硫酸吲哚酚抗體溶解之緩衝液並無限定，例如可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液，尤佳為Tris系緩衝液。作為Tris系緩衝液，並無限定，可列舉：Tris鹽酸緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、或Tris緩衝生理食鹽水。使抗硫酸吲哚酚抗體於該等緩衝液中溶解為100ng~10μg/mL之濃度，並以50μL~200μL/孔之容量於4℃下、O/N之條件下固相化。
再者，包括如上所述使抗硫酸吲哚酚抗體經由對抗硫酸吲哚酚抗體具有親和性之成分(例如針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體)而於不溶性載體上固相化者、或使抗硫酸吲哚酚抗體經由抗生物素蛋白及生物素等之結合而於不溶性載體上固相化者。針對抗硫酸吲哚酚抗體之抗體之固相化可與上述抗硫酸吲哚酚抗體之固相化同樣地進行。又，抗生物素蛋白於不溶性載體上之固相化及抗硫酸吲哚酚抗體之生物素標記可依據常法進行。
阻斷步驟(2)係使阻斷液接觸固相化有抗硫酸吲哚酚抗體之不溶性載體而對不溶性載體之表面進行阻斷者。阻斷液只要為實質上不含哺乳類白蛋白者，則並無限定。具體而言，可列舉：Tris系緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate Buffered Saline：PBS)、MES緩衝液、MOPS緩衝液、MOPSO緩衝液、HEPES緩衝液、TES緩衝液、Tricine緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、BES緩衝液、DIPSO緩衝液、TAPSO緩衝液、POPSO緩衝液、HEPPS緩衝液、HEPPSO緩衝液、Bicine緩衝液、TAPS緩衝液、CHES緩衝液、CAPS緩衝液、咪唑鹽酸鹽緩衝液、甘胺醯甘胺酸緩衝液、或甘胺醯胺緩衝液。
又，阻斷液可含有哺乳類白蛋白以外之蛋白質。哺乳類白蛋白以外之蛋白質並無限定，例如可使用明膠、酪蛋白、卵白蛋白、或市售之阻斷劑等。
又，上述阻斷液亦可含有界面活性劑。作為界面活性劑，並無特別限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、及/或兩性離子系，較佳為不會阻礙抗原抗體反應之非離子系界面活性劑，尤佳為Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
例如採用96孔板之情形時，可藉由添加上述阻斷液50μL~300μL，例如於4℃~37℃下靜置10分鐘~一晝夜而進行阻斷。
[4]硫酸吲哚酚之測定套組
本發明之硫酸吲哚酚之測定套組包含：(1)上述固相化不溶性載體(A)或固相化不溶性載體(B)、及(2)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑。
固相化不溶性載體(A)及固相化不溶性載體(B)可包含上述「[2]固 相化不溶性載體」中所記載者。
(預處理液)
預處理液係於本發明之硫酸吲哚酚之測定方法中可使用者，其係減弱檢體中之硫酸吲哚酚與哺乳類白蛋白之結合且促進硫酸吲哚酚與抗硫酸吲哚酚抗體之結合者。具體而言，可列舉包含界面活性劑之緩衝液。作為界面活性劑，並無限定，可列舉：非離子系、陰離子系、陽離子系、兩性離子系，尤佳為作為非離子系之Triton X、Tween、或Pluronic。
又，界面活性劑之濃度亦無特別限定，較佳為0.002~2重量%，更佳為0.008~0.5重量%，最佳為0.02~0.2重量%。
(除蛋白質試劑)
除蛋白質試劑只要可於不實質上去除檢體中之硫酸吲哚酚之情況下實質上去除包含白蛋白之蛋白質，則並無限定，可無限制地使用公知之除蛋白質試劑。關於除蛋白質處理之原理，可採用例如HPLC之預處理所用之方法。具體而言，可列舉：將蛋白質改性使之不溶化再將其去除之方法、利用分子大小之差異而物理性地去除之方法、或親和法，較佳為將蛋白質改性使之不溶化再將其去除之方法。其原因在於：藉由使蛋白質不溶化之處理亦具有使硫酸吲哚酚與白蛋白無法結合之效果。作為除蛋白質試劑，亦可使用市售之試劑，例如本發明之套組中亦可包含Sirocco蛋白沈澱板(Sirocco Protein Precipitation Plate)。
本發明之測定套組於包含固相化不溶性載體(A)之情形時，包含抗硫酸吲哚酚抗體。又，於包含固相化不溶性載體(B)之情形時，包含標記硫酸吲哚酚。抗硫酸吲哚酚抗體或標記硫酸吲哚酚可使用上述「[1]硫酸吲哚酚之測定方法」中所記載之抗硫酸吲哚酚抗體或標記硫酸吲哚酚。進而，本發明之測定套組可包含明確記載有可特異性地 測定血中之硫酸吲哚酚之主旨的使用說明書。亦可將上述內容記載在分析套組之容器上。
[5]尿毒症診斷套組
本發明之硫酸吲哚酚測定套組可用作尿毒症之診斷套組。因此，本發明係關於一種尿毒症之診斷套組，其包含(1)上述固相化不溶性載體(A)或固相化不溶性載體(B)、及(2)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑。上述尿毒症之診斷套組於包含固相化不溶性載體(A)之情形時，可包含抗硫酸吲哚酚抗體，於包含固相化不溶性載體(B)之情形時，可包含標記硫酸吲哚酚。
本發明之硫酸吲哚酚測定套組可用於尿毒症之診斷。因此，本發明係關於一種硫酸吲哚酚測定套組於尿毒症之診斷方面之用途，該硫酸吲哚酚測定套組包含(1)上述固相化不溶性載體(A)或固相化不溶性載體(B)、及(2)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑。進而，上述硫酸吲哚酚測定套組於包含固相化不溶性載體(A)之情形時，可包含抗硫酸吲哚酚抗體，於包含固相化不溶性載體(B)之情形時，可包含標記硫酸吲哚酚。
抗硫酸吲哚酚抗體、或標記硫酸吲哚酚可用於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)。因此，本發明係關於一種抗硫酸吲哚酚抗體或標記硫酸吲哚酚於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)方面之用途。
又，上述固相化不溶性載體(A)或固相化不溶性載體(B)可用於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)。因此，本發明係關於一種固相化不溶性載體於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)方面之用途，該固相化不溶性載體係固相化有硫酸吲哚酚並且利用實 質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者。進而，本發明係關於一種固相化不溶性載體於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)方面之用途，該固相化不溶性載體係固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷者。
進而，上述對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑可用於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)。因此，本發明係關於一種對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)方面之用途。進而，本發明係關於一種藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑於製造尿毒症之診斷套組(硫酸吲哚酚測定套組)方面之用途。
進而，本發明係關於一種選自由(1)抗硫酸吲哚酚抗體、(2)固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體、及(3)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液及/或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑所組成之群中之1種以上者於製造尿毒症之診斷套組方面之用途。
進而，本發明係關於一種選自由(1)標記硫酸吲哚酚、(2)固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體、及(3)對檢體中之白蛋白進行預處理之預處理液及/或藉由除蛋白質而去除檢體中之白蛋白之試劑所組成之群中之1種以上者於製造尿毒症之診斷套組方面之用途。
[實施例]
以下，藉由實施例具體地說明本發明，但該等並非限定本發明之範圍者。
《製造例1：連結子賦予硫酸吲哚酚之製備》
硫酸1-(2',3'-環氧丙基)吲哚酚鈉鹽之製備
使市售之硫酸吲哚酚鉀鹽1.00g溶解於二甲基甲醯胺(以下稱為DMF)20mL中，添加氫化鈉(60%，油性物)222mg，於室溫下攪拌1小時。於混合物中添加表氯醇934μL，於室溫下攪拌5.5小時。反應結束後，添加蒸餾水終止反應，其後蒸餾去除溶劑。於殘渣中添加甲醇，去除不溶成分。蒸餾去除濾液之溶劑，藉由矽膠管柱層析法(Kieselgel 60，40g，氯仿/甲醇=10/1~10/2)進行純化，獲得作為淡黃色泡狀物的標記之化合物(1)749mg(64%)。MS(FAB.，陰性)m/z=268[M-23]-1H-NMR(CDCl3 )δ(ppm)：2.59(dd,1H),2.77(dd,1H),3.17(m,1H),4.11(dd,1H),4.43(dd,1H),6.96(t,1H),7.08(t,1H),7.16(s,1H),7.44(d,1H),7.50(d,1H).
《製造例2：硫酸吲哚酚與運鐵蛋白結合體之製作》
製造例1中所獲得之硫酸環氧體吲哚酚與運鐵蛋白(源自人類血清，SigmaCat.T-2252)之結合係預先使用3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(N-succimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)(Funakoshi Cat.No.FM-0185-31)向運鐵蛋白導入硫醇基，將兩者以莫耳比90：1(58.5mg~160mg/14mL磷酸緩衝液，0.1M、pH值6.0、2.5mM之EDTA)進行混合，於4℃下反應96小時後，於4℃下於杜貝可(Dulbecco)磷酸緩衝生理食鹽水(不含Ca++ Mg++ ，pH值為7.4)中透析24小時，將內液離心(5000×g，10分鐘)而去除不溶物。對於在蛋白質上之結合量，推斷為於運鐵蛋白上為2分子。結合數之推斷係根據每1mg/mL蛋白質於275nm下之吸收增加而進行計算。蛋白質之定量係藉由色素法(蛋白定量分析套組(Protein Assay Kit)，JAPAN Bio-Rad Laboratories，Cat.No.500-0001)而進行，關於275nm、1mg/mL之值，運鐵蛋白係以0.9進行計算，硫酸環氧體吲哚酚係以20進行計算。
《製造例3：抗硫酸吲哚酚小鼠單株抗體之製作》
將上述製造例2中所製備之硫酸吲哚酚抗原(運鐵蛋白-IS)與等量之完全弗氏佐劑混合，以硫酸吲哚酚換算，對4~6週齡之BALB/c小鼠腹腔內投予10μg。1週後利用10μg不完全弗氏佐劑進行追加免疫，進而重複2次追加免疫。
於最終免疫後第3天，自該小鼠無菌地摘取脾臟，使用剪刀及鑷子將脾臟分解成各個細胞，利用RPMI-1640培養基清洗3次。利用RPMI-1640培養基將對數增殖期之小鼠骨髄瘤細胞株P3U1清洗3次後，將該細胞與脾臟細胞以1：10之細胞數比進行混合。進行200×g、5分鐘之離心分離後，去除上清液，一面緩慢地混合細胞團(cell mass)，一面緩慢地添加50%聚乙二醇(PEG)1500(Roche公司)1mL，進而添加RPMI-1640培養基9mL使細胞融合。
融合細胞係藉由離心分離(200×g，5分鐘)而去除PEG後，使之懸浮於包含10%胎牛血清及次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷(HAT)之RPMI-1640培養基中，接種至96孔細胞培養板中。培養7天，僅使融合瘤增殖後，藉由ELISA法檢索產生抗體之純系，而獲得目標產物，即產生具有反應特異性之單株抗體之融合瘤。
針對所獲得之融合瘤，藉由限制稀釋法使之成為單純系，而建立抗體產生融合瘤(9A2F6)。所獲得之單株抗體(9A2F6)之同型為IgG2b。
《單株抗體之可變區基因之鹼基序列之確定》
藉由常規方法自產生9A2F6抗體之融合瘤中提取總RNA(total RNA)，使用寡dT(deoxythymidylic acid，脫氧胸苷酸)引子進行逆轉錄反應，而製作cDNA(complementary DNA，互補DNA)。為了擴增可變區基因而使用小鼠Ig引物套組(mouse Ig primer set)(Novagen公司)，由所獲得之cDNA依據其操作說明進行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)。所獲得之抗體可變區基因係TA選殖至pCR2.1載體上 而確定鹼基序列。將9A2F6之輕鏈可變區之鹼基序列示於序列編號1，將胺基酸序列示於序列編號2，將重鏈可變區之核苷酸之鹼基序列示於序列編號3，將胺基酸序列示於序列編號4。
《比較例1》
於本比較例中，使用上述9A2F6，向血清中添加硫酸吲哚酚，而研究回收率。未進行檢體中之白蛋白之預處理，但使用不含外源性哺乳類白蛋白之反應緩衝液及不含哺乳類白蛋白之阻斷液。
(a)添加有硫酸吲哚酚之檢體之製備
向大鼠血清及人類血清中添加硫酸吲哚酚，而製備測定用之檢體。利用Tris緩衝液稀釋硫酸吲哚酚(Alfer Aeser公司)，以成為31.3μg/mL、15.6μg/mL、7.81μg/mL、3.90μg/mL、1.95μg/mL、0.98μg/mL、或0.49μg/mL之方式添加至大鼠血清及人類血清中。
(b)固相化板之製造
利用Tris緩衝液將上述製造例2中所獲得之結合於運鐵蛋白上之硫酸吲哚酚(以下有時稱為Tf-IS)稀釋成1μg/mL。以50ng/50μL/孔添加至ELISA板(IWASKI公司)中，於4℃、O/N之條件下靜置，藉此使硫酸吲哚酚固相化。去除固相液，添加清洗液(利用包含0.05%Tween20之TBS(Tris Buffered Saline，三羥甲基氨基甲烷緩衝鹽水)清洗3次。添加300μL之阻斷液(Trisma base(三(羥基甲基)胺基甲烷))，於25℃下進行30分鐘之阻斷。
(c)硫酸吲哚酚之測定
將上述添加有硫酸吲哚酚之檢體(大鼠血清及人類血清)50μL、與利用反應緩衝液(包含0.05%Tween20之TBS)稀釋成1μg/mL之9A2F6單株抗體50μL進行混合，使混合液於37℃下反應90分鐘。去除上述固相化板之阻斷液，向孔中添加混合液50μL，於37℃下反應45分鐘。利用清洗液清洗3次，添加利用檢測反應緩衝液(包含 0.05%Tween20之TBS)稀釋成0.1μg/mL之抗小鼠IgG兔IgGFab'-HRP 50μL，於37℃下反應45分鐘。利用清洗液清洗3次，添加顯色受質液(TMB(四甲基聯苯胺))50μL，於室溫下顯色15分鐘。添加反應停止液(1N之H2 SO4 )50μL，使反應停止。利用讀板儀(iMark，Bio-Rad公司)測定吸光度。將結果示於表1。
即便於添加有31.3μg/mL之硫酸吲哚酚之情形時，對於大鼠血清及人類血清，回收率亦非常低，分別為32.9%與10.8%。又，若為7.81μg/mL以下則完全無法測定。
《參考例1》
於本參考例中，使用緩衝液代替人類血清，對向阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應緩衝液中添加BSA之情形時之影響進行研究。
(硫酸吲哚酚添加檢體之製備)
利用Tris緩衝液將硫酸吲哚酚(Alfer Aeser公司)2倍連續稀釋至500μg/mL~61ng/mL。
(固相化板之製造)
利用Trizma-base(SIGMA公司)將上述製造例2中所獲得之結合於運鐵蛋白上之Tf-IS稀釋成1μg/mL。以50ng/50μL/孔添加至ELISA板 (IWAKI公司)中，於4℃、O/N之條件下靜置，藉此使硫酸吲哚酚固相化。去除固相液，利用清洗液(包含0.05%Tween20之TBS)清洗3次。添加未添加300μL之BSA之阻斷液(Trisma base)、或添加有BSA之阻斷液(包含1%BSA之PBS)，於25℃下進行30分鐘之阻斷。
(硫酸吲哚酚之測定)
將上述添加有硫酸吲哚酚之檢體50μL、與利用添加有BSA之反應緩衝液(包含1%BSA、0.05%Tween20之TBS)或未添加BSA之反應緩衝液(包含0.05%Tween20之TBS)稀釋成1μg/mL之9A2F6單株抗體或者22-40-B5單株抗體50μL進行混合，使混合液於37℃下反應90分鐘。去除固相化板之阻斷液，向孔中添加混合液50μL，於37℃下反應45分鐘。利用清洗液清洗3次，添加利用添加有BSA之反應緩衝液(包含1%BSA、0.05%Tween20之TBS)或未添加BSA之檢測反應緩衝液(包含0.05%TWeen20之TBS)稀釋成0.1μg/mL之抗小鼠IgG兔IgGFab'-HRP 50μL，於37℃下反應45分鐘。利用清洗液清洗3次，添加顯色受質液(TMB)50μL，於室溫下顯色15分鐘。添加反應停止液(1N之H2 SO4 )50μL，使反應停止。利用讀板儀(iMark，Bio-Rad公司)測定吸光度。將結果示於圖1。
對於22-40-B5單株抗體，於使用添加有BSA之阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應緩衝液之情形時，感度為15.6μg/mL。另一方面，於使用未添加BSA之阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應緩衝液之情形時，感度上升至3.9μg/mL。
又，與22-40-B5單株抗體相比，若使用9A2F6單株抗體，則感度上升至0.49μg/mL。
由以上之比較例1及參考例1得知：添加有BSA之阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應緩衝液會阻礙硫酸吲哚酚之測定，及於使用大鼠血清及人類血清之情形時難以進行硫酸吲哚酚之測定。
《實施例1》
於本實施例中，使用人類血清，不進行檢體之除蛋白質處理，使用未添加BSA之阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應緩衝液進行測定。
向人類血清中添加硫酸吲哚酚，而製備測定用之檢體。利用Tris緩衝液稀釋硫酸吲哚酚(Alfer Aeser公司)，以成為25.0μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、或0.20μg/mL之方式添加至人類血清中。
(利用預處理液之處理)
利用預處理液之處理係向人類血清中添加2倍容量以上之預處理液(免疫生物研究所)。
(硫酸吲哚酚之測定)
使用進行過利用預處理液之處理的檢體，除此以外，重複上述比較例1之「(c)硫酸吲哚酚之測定」之操作。將結果示於表2。
《實施例2》
於本實施例中，使用大鼠血清、及人類血清，進行檢體之除蛋白質處理，進而使用未添加BSA之阻斷液、反應緩衝液、及檢測反應 緩衝液進行測定。
(硫酸吲哚酚添加檢體之製備)
向大鼠血清及人類血清中添加硫酸吲哚酚，而製備測定用之檢體。利用Tris緩衝液稀釋硫酸吲哚酚(Alfer Aeser公司)，以成為25.0μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、或0.20μg/mL之方式添加至大鼠血清及人類血清中。
(除蛋白質)
除蛋白質係使用Sirocco蛋白沈澱板(Sirocco Protein Precipitation Plate)而進行。向板中添加乙腈200μL，繼而添加上述添加有硫酸吲哚酚之大鼠血清或人類血清50μL。攪拌1分鐘，利用歧管進行吸濾，回收濾液並冷凍保存。
(硫酸吲哚酚之測定)
使用進行過除蛋白質之檢體，除此以外，重複上述比較例1之「(c)硫酸吲哚酚之測定」之操作。將結果示於表3。
藉由對大鼠血清與人類血清均進行除蛋白質，可幾乎100%回收硫酸吲哚酚。又，亦可使感度上升至0.2μg/mL。
[產業上之可利用性]
本發明之硫酸吲哚酚之測定方法可準確地測定與硫酸吲哚酚有關之疾患患者(例如腎臟疾患患者)之血液中之尿毒症毒素即硫酸吲哚酚，可用於與硫酸吲哚酚有關之疾患(例如腎臟疾患)之診斷或治療之監測。
以上，根據特定之態樣對本發明進行了說明，但從業者自知之變化或改良包括在本發明之範圍內。
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Claims (7)

  1. 一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗體反應步驟，其係使上述預處理檢體及抗硫酸吲哚酚抗體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化硫酸吲哚酚(IS)-抗體反應步驟，其係使上述檢體抗體反應液、與固相化有硫酸吲哚酚並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之抗硫酸吲哚酚抗體進行檢測之步驟。
  2. 一種藉由競爭法所進行之硫酸吲哚酚之測定方法，其包括如下步驟：(1)對檢體中之白蛋白進行預處理之步驟；(2)檢體-抗原反應步驟，其係使上述預處理檢體及標記硫酸吲哚酚於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(3)固相化抗體-標記硫酸吲哚酚(IS)反應步驟，其係使上述檢體抗原反應液、與固相化有抗硫酸吲哚酚抗體並且利用實質上不含哺乳類白蛋白之緩衝液進行阻斷的固相化不溶性載體於實質上不存在外源性哺乳類白蛋白之條件下接觸；(4)對結合於固相化不溶性載體上之標記硫酸吲哚酚進行檢測之步驟。
  3. 如請求項1或2之硫酸吲哚酚之測定方法，其中上述抗硫酸吲哚 酚抗體係含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域的抗體。
  4. 如請求項1或2之硫酸吲哚酚之測定方法，其中上述白蛋白之預處理係利用預處理液所進行之處理或除蛋白質處理。
  5. 如請求項1之硫酸吲哚酚之測定方法，其中同時進行檢體-抗體反應步驟(2)及固相化硫酸吲哚酚(IS)-抗體反應步驟(3)。
  6. 如請求項2之硫酸吲哚酚之測定方法，其中同時進行檢體-抗原反應步驟(2)及固相化抗體-標記硫酸吲哚酚(IS)反應步驟(3)。
  7. 一種抗硫酸吲哚酚抗體，其含有包含序列編號2所表示之胺基酸序列之輕鏈互補性決定區域及包含序列編號4所表示之胺基酸序列之重鏈互補性決定區域。
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