CN111741974B - 单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体及/或其抗原结合片段的组成物及其使用 - Google Patents
单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体及/或其抗原结合片段的组成物及其使用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明有关于一种专一性辨识蛋白结合型尿毒素─硫酸吲哚酚(IS)的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，编码上述单离单株抗体及/或其抗原结合片段的单离聚核苷酸区段，利用上述单离抗IS的单株抗体及/或其抗原结合片段的免疫分析法、元件组成物及其用于诊断及治疗IS相关疾病的药学组成物。
Description
技术领域
本发明揭露一种针对尿毒素─硫酸吲哚酚(IS)的抗原结合片段，特别是有关于专一性辨识IS的单离单株抗体及/或其抗原结合片段及其用于诊断及治疗IS相关疾病。
背景技术
尿毒症(uremia)是由多种尿毒素在体内病理累积而引起的疾病，而这种虚弱的状况会导致永久丧失肾功能，逐渐进入慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)的阶段，最后变成危及生命的末期肾脏病(end-stage renal disease，ESRD)。尿毒症患者可能有各种以下临床症候及症状，涉及神经、消化、循环、骨骼系统(1)。虽然尿毒症及其产生的并发症通常是利用透析治疗控制，包括血液透析及腹膜透析，然而在患者进展到肾衰竭的状况时，可能会产生严重的电解质不平衡，代谢废物已累积达危险的程度，需要进行肾移植才能存活。话虽如此，这种治疗选择受限于捐赠者肾脏短缺、手术相关的死亡风险、以及患者于术后终生必须抑制免疫功能以避免发生器官排斥。
目前已鉴定出数百种潜在的尿毒素。尿毒素根据透析时的物化性质或其行为可分成三大类：(a)小分子、水溶性且非蛋白质结合的化合物(分子量<300D，例如尿素)；(b)「中大型分子」化合物，以胜肽为主，其分子量为300D至12,000D，以及(c)小分子且与蛋白质结合的化合物(2)。尿毒素与例如白蛋白的血清蛋白结合，会限制透析清除这些蛋白质结合的化合物。因此，接受透析的病患，其体内这些毒素的平均浓度可能逐渐累积到正常浓度的10倍至20倍。
硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)及对硫甲酚(p-Cresyl Sulfate，PCS)是二个典型的白蛋白结合的毒素，且此二者皆由肠胃道的微生物菌相酦酵食物中的色氨酸及酪氨酸所产生的。有些团队证实，CKD病患血清中IS及PCS的浓度与总死亡率及心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)具有病理相关性。因此，IS及PCS不仅是预测肾功能及疾病进展的生物标记，也是治疗操作上的标的(3,4)。
在正常情况下，尿毒素可通过尿液排出体外。尿毒素依其生理特性及其对透析的反应性，可分为三类：(1)小分子、水溶性且非蛋白质结合的化合物，例如尿素及肌酸酐；(2)「中型分子」化合物，例如胜肽及β2-微球蛋白；(3)小分子且与蛋白质结合的化合物。例如对甲酚、马尿酸及硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)。与例如白蛋白的血清蛋白结合会限制透析清除这些蛋白结合化合物在这些尿毒症毒素中，据报导，IS与其前驱物(如吲哚)及其衍生物已被报导与CKD患者的预估肾小球滤过率(estimated glomerular filtrationrates，eGFRs)呈显著高度负相关，并发现IS有助于诊断CKD及预测预后评估。
AST-120〔克里美净(Kremezin)；吴羽株式会社(Kureha Corporation)，东京，日本〕，是口服球形碳质吸附剂，可吸附各种小分子尿毒素。AST-120可吸附肠道中IS的前驱物─吲哚，借此抑制IS生合成，进而间接减少血清及尿液中的IS浓度(5)。虽然已有多项前瞻性随机临床研究证明AST-120具有延缓CKD进展的效果，但结论是中度至重度CKD患者的标准治疗中加入AST-120的益处，并未获得这些试验数据的支持(6,7)。
利用例如液相层析─质谱法(liquid chromatography–mass spectrometry，LC–MS)以及高效液相层析(high-performance liquid chromatography，HPLC)的分析化学方法检测及判定IS，其设备成本高、样本制备复杂、样本体积量大又不适合检测数量大的生物样本(8)。反之，酵素连结免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)操作简单，且试剂相对便宜。省略复杂的样本前处理，ELISA操作流程可自动化，进而提供更准确且可重复的结果、更快的处理时间(turnaround time)且更低人力成本。星(Hoshi)等人开发一种定量检测IS的竞争型ELISA法，不过该方法使用的单株抗体株9A2F6会被牛或人的血清白蛋白抑制(9,10)。在进行实验步骤前，进行例如去蛋白(deproteinization)的样本前处理是特别优选或必要的，不过这有可能会降低该技术在实验室或工业应用性的标准。
综言之，尽管技术不断推进，实际上仍持续需要提供用于改善定性或定量的免疫分析法，其中单离抗-IS的单株抗体(mAb)是必要的功能性成分。同时，此免疫分析法能具有对于待分析的生物样品中的血浆蛋白不敏感的性能，特别是对白蛋白不敏感。其次，实际上亦持续需要提供用于从受试对象有效去除IS的方法，借此治疗IS相关疾病。上述方法包括对受试对象施以有效剂量的单离抗-IS的单株抗体，或将单离抗-IS的单株抗体结合至实体支持物，使IS与单离抗-IS的单株抗体彼此接触，从而捕获或去除生物样品中的IS。
发明内容
因此，本发明的一态样是提供一种单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其是专一性结合硫酸吲哚酚(或称为抗-IS的mAb)。
其次，本发明的另一态样是提供一种多特异性结合分子，其包含上述单离单株抗体及/或其抗原结合片段的部分或整体。
再者，本发明的又一态样是提供一种检测硫酸吲哚酚的免疫分析法，借此判断从受试对象收集的生物样本的硫酸吲哚酚的浓度。
又，本发明的再一态样是提供一种去除硫酸吲哚酚的元件组成物。
再者，本发明的又另一态样是提供一种去除或减少硫酸吲哚酚的药学组成物。
再者，本发明的又一态样是提供一种单离聚核苷酸区段，其编码上述单离单株抗体及/或其抗原结合片段。
另，本发明的又一态样是提供一种单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其具有抗原表位(epitope)以及斯卡查德键结亲和力(Scatchard binding affinity)，且斯卡查德键结亲和力为针对硫酸吲哚酚但排除L-色氨酸、吲哚及3-吲哚乙酸。
根据本发明的上述态样，提出一种单离单株抗体及/或其抗原结合片段。上述单离单株抗体及/或其抗原结合片段可包含重链可变(heavy chain variable，VH)域及轻链可变(light chain variable，VL)域。VH域包含多个互补性决定区(complementarity-determining regions，CDRs)CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而VL域包含多个互补性决定区CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在一实施例中，上述互补性决定区包含以下一或多个氨基酸序列：CDR-H1选自于序列辨识编号(SEQ ID NO)：1或11的任一者；CDR-H2选自于SEQ ID NO：2或12的任一者；CDR-H3选自于SEQ ID NO：3或13的任一者；CDR-L1选自于SEQ ID NO：6或16的任一者；CDR-L2选自于SEQ ID NO：7或17的任一者；以及CDR-L3选自于SEQ ID NO：8或18的任一者。
在一实施例中，上述单离抗体及/或其抗体结合片段可为单离人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体、合成抗体、重组抗体及/或其抗体结合片段的全长免疫球蛋白分子、单链可变区片段(single-chain variable fragment，scFv)、可变区片段(variable fragment，Fv)、Fab片段、Fab'片段、单域抗体(single domain antibody，dAb)、多特异性结合分子或上述的任意组合。
在一实施例中，上述单离单株抗体及/或其片段可由体外表面呈现系统筛选而得。
在一实施例中，上述单离单株抗体及/或其片段可经化学性修饰或与药学上可接受的载体混合。
根据本发明的其他态样，提出一种多特异性结合分子，包含上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段的一部分或整体。
在一实施例中，上述多特异性结合分子专一性结合硫酸吲哚酚。
根据本发明的其他态样，提出一种检测硫酸吲哚酚的免疫分析法，其包含上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段。
根据本发明的其他态样，提出一种检测硫酸吲哚酚相关疾病的免疫分析法，其包含上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，借此判断从受试对象收集的生物样本的硫酸吲哚酚的浓度。
在一实施例中，上述生物样本包括血液、血清、血浆、腹膜液、尿液及活体组织检体(biopsy specimen)。
在一实施例中，上述生物样本包括白蛋白。
根据本发明的其他态样，提出一种去除硫酸吲哚酚的元件组成物，其包含上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段。
在一实施例中，上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段是结合至固相。
根据本发明的其他态样，提出一种去除或减少受试对象的硫酸吲哚酚的药学组成物，其包含上述的单离单株抗体及/或其抗原结合片段。
在一实施例中，上述药学组成物还包含医药吸附剂与单离单株抗体及/或其抗原结合片段结合。
在一实施例中，上述医药吸附剂包括活性碳吸收剂。
根据本发明的其他态样，提出一种单离聚核苷酸区段(segment)，其中单离聚核苷酸区段编码抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，且单离单株抗体及/或其抗原结合片段包含VH域及VL域的一或多个多肽序列。在一实施例中，上述VH域可如SEQ IDNO：4或14所示，而VL域可如SEQ ID NO：9或19所示。
根据本发明的其他态样，提出一种单离聚核苷酸区段，其中单离聚核苷酸区段编码抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段。在一实施例中，上述该单离单株抗体及/或其抗原结合片段包含以下一或多个多肽序列：CDR-H1选自于SEQ ID NO：1或11的任一者；CDR-H2选自于SEQ ID NO：2或12的任一者；CDR-H3选自于SEQ ID NO：3或13的任一者；CDR-L1选自于SEQ ID NO：6或16的任一者；CDR-L2选自于SEQ ID NO：7或17的任一者；以及CDR-L3选自于SEQ ID NO：8或18的任一者。
根据本发明的其他态样，提出一种单离单株抗体及/或其抗原结合片段。在一实施例中，单离单株抗体及/或其抗原结合片段具有抗原表位(epitope)以及斯卡查德键结亲和力(Scatchard binding affinity)，且斯卡查德键结亲和力为针对硫酸吲哚酚但排除L-色氨酸、吲哚及3-吲哚乙酸。
应用本发明的单离单株抗体及/或其片段，其专一性辨识硫酸吲哚酚，在有白蛋白的存在下，可优异地呈现检测硫酸吲哚酚的灵敏性及动力学的广度，并可应用到各种用途，例如检测硫酸吲哚酚的免疫分析法，去除硫酸吲哚酚的元件组成物，去除或减少受试对象的硫酸吲哚酚的药学组成物，单离聚核苷酸区段，以及具有抗原决定位以及针对硫酸吲哚酚但排除L-色氨酸、吲哚及3-吲哚乙酸的斯卡查德键结亲和力的单离单株抗体及/或其抗原结合片段等。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：
图1A及图1B是显示根据本发明一实施例的数株单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体LG303(图1A)及LG332(图1B)对硫酸吲哚酚-牛血清白蛋白(indoxyl sulfate-bovineserum albumin，IS-BSA)的滴定曲线图。
图2A至图2D是分别绘示本发明一实施例的数株单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体LG303及LG332在不同浓度的硫酸吲哚酚(图2A)、左旋色氨酸(L-tryptophan；图2B)、吲哚(图2C)、3-吲哚乙酸(3-indoleacetic acid；图2D)的存在下的B/B％柱形图。
图3是绘示本发明另一实施例的利用竞争型ELISA法在序列浓度的硫酸吲哚酚下，检测单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体LG332的空白试验极限(limit of blank，LoB)与检测极限(limit of detection，LoD)的标准曲线图。
图4是绘示根据本发明一实施例的慢性肾病动物模式的实验策略流程图。
图5A与图5B是显示根据本发明一实施例的试验动物的肾脏(图5A)及心脏(图5B)切片经苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色的组织切片影像。
图6是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经天狼星红(Siriusred)染色检测胶原蛋白的组织切片影像。
图7是绘示本发明一实施例的利用第IV型胶原蛋白抗体对试验动物的肾脏及心脏切片的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)影像。
图8是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体检测纤维增生区域的IHC影像。
图9是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经M30抗体检测细胞凋亡区域的IHC影像。
具体实施方式
以下详细说明配合所附图式将清楚呈现本发明的实施例，其中相同的元件编号代表相同的元件。
此处参照引用的所有文献，视同通过引用每篇个别文献或专利申请书特定且个别并入参考文献。如果引用文献对一术语的定义或用法，与此处对该术语的定义不一致或相反，则适用此处对该术语的定义，而不适用该引文对该术语的定义。
为了解释说明书，将适用以下定义，在适当的情况中，单数名词也包括多个，反之亦然。整个详细说明阐述额外的定义。
除非上下文不适当，否则此处所述的「一(a/an)」及「该(the/said)」是定义为「一或多」且包括复数型。
本发明揭露利用抗蛋白质结合的尿毒素─硫酸吲哚酚(IS)的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，诊断及治疗慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)病患合并尿毒症的检测及清除方法。关于诊断使用，本发明提供一种同时定性及定量检测生物样本的IS的免疫分析法。为有效去除受试对象体内循环的IS，可对受试对象投予有效剂量的单离抗-IS的单株抗体，或使生物样本通过结合单离抗-IS的单株抗体的固相载体以吸附IS。生物样本可以是血液、血清、血浆、腹膜液、尿液、生物检体样本(biopsy specimen)等。由于从受试对象收集的上述生物样本，其中常包含正常或异常生理状态的各种血浆蛋白，上述单离抗-IS的单株抗体的结合活性的呈现不该被任何血浆蛋白干扰，特别是最常见的白蛋白。尽管IS被认为会加重CKD及一些其他的肾病变，不过本发明的应用并不限于肾病变。
此处所述「受试对象(subject)」一词包括人类或非人类的动物。非人类的动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳类动物及非哺乳类动物，诸如非人类的灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物及爬行类动物。除非另有所指，否则此处所述「患者(patient)」或「受试对象」可互相置换。
此处所述「核酸」一词可与「聚核苷酸(polynucleotide)」互相置换，其是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。核酸一词包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接基的核酸，可为合成、天然存在及非天然存在者，其结合特性与参考核酸相似，且其代谢方式亦与参考核苷酸类似。前述类似物的具体例可包括但不限于硫代磷酸酯(phosphorothioates)、氨基磷酸盐(phosphoramidate)、磷酸甲酯(methylphosphonates)、旋旋光性-磷酸甲酯(chiral-methyl phosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methyl ribonucleotides)、胜肽-核酸(peptide-nucleic acids，PNAs)。
除非另有所指，特定的核酸序列亦隐含其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代，degenerate codon substitutions)、互补序列以及明确指出的序列。进言之，选定的一或多个(或全部)密码子的第三位置被混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代所产生的序列，可产生简并密码子取代。
此处所述「多肽」一词可与「蛋白」互相置换，是指氨基酸残基的聚合物。「多肽」一词用于氨基酸聚合物时，其中一或多个氨基酸残基可为对应的天然存在氨基酸的人工化学仿真物、自然存在氨基酸聚合物以及非自然存在的氨基酸聚合物。除非另有所指，特定多肽序列亦隐含其经保守修饰的变体。
「抗体」一词是指完整免疫球蛋白分子或其功能性片段。天然存在的抗体一般包括四聚体(tetramer)，通常由至少二重(H)链及至少二轻(L)链所组成。每个重(H)链包含一重链可变(heavy chain variable，以下简称为VH)域及一重链恒定(heavy chain constant，CH)域，其中重链恒定域包含CH1、CH2及CH3等三个恒定域。轻链可变(light chainvariable，以下简称为VL)域。重链可为任何一种的同型(isotype)，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(IgA1及IgA2亚型)、IgM以及IgE。每个轻链则包含轻链可变(lightchain variable，以下简称为VL)域以及一轻链恒定(light chain constant，CL)域。轻链包括kappa(κ)链以及lambda(λ)链。VH域及VL域的结合一般负责辨识抗原，而CH域则可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典途径的补体系统的第1补体成分(C1q)。VH与VL域可再细分成高度可变(hypervariability)区，亦称为互补性决定区(complementaritydetermining regions，CDRs)，而CDRs之间另穿插着更保守的抗体骨架区(framework regions，FRs)。每个VH与VL域分别由三个CDRs及四个FRs所构成，其顺序从N端到C端安排如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重链及轻链可变区含有结合域，以与抗原交互作用。
「抗体片段」或「其特定结合片段」一词是指抗体的完整结构或一部分，可包含Fab片段片段、Fab’、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段及双硫键连结的Fv片段；单链可变区片段(single chain variable fragment，scFv)、单链可变区片段二聚体〔(scFv)2，亦称为二价抗体(diabodies)〕、单链可变区片段三聚体〔(scFv)3，亦称为三价抗体(triabodies)单链可变区片段四聚体〔(scFv)4，亦称为四价抗体(tetrabodies)；单域抗体(single domainantibodies，dAb)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、以及由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。其次，「抗体片段」或「其特定结合片段」一词亦可指单株抗体、多株抗体、由至少二个抗体片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人类抗体、人源化抗体、骆驼源化的(camelized)抗体、嵌合抗体或鼠类抗体。
此处所述「抗体药物复合体(antibody drug conjugate，ADC)」或「免疫复合体(immunoconjugate)」一词是指抗体或其抗原结合片段连接另一种药剂，例如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针(imaging probe)等。连接方式可为共价键、或例如通过静电力的非共价性的交互作用。可使用本领域已知的各种连接基团，以形成抗体药物复合体。此外，抗体药物复合体的型式亦可为由编码免疫复合体的聚核苷酸表现而得的融合蛋白。此处所述的「融合蛋白」是指将原本各自编码不同的蛋白(包括胜肽及多肽)的基因或基因片段，经连接二或二个以上的基因或基因片段所产生的蛋白。融合基因经转译后产生单一蛋白具有由原本蛋白所衍生的多个功能特性。
「单离」一词是指免疫球蛋白、抗体或多肽，视情况可以是存在于物理环境中，但不同于自然界存在者。
「抗原表位(epitope)」或「抗原决定位(antigenic determinant sites)」一词是指抗原分子的一部份，用来负责与抗体的抗原结合位置进行专一性交互作用。抗原结合位置可由一或多的抗体可变域所提供。将单株抗体(mAb)的VH与VL域分离，经过多次的重组及筛选，可获得功能性抗原结合片段。
「互补性决定区(complementarity determining regions，CDRs)」一词是定义为抗体可变链的多个部分，以键结至其专一性的抗原。在本揭露内容中，重链的CDRs一般是指CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，轻链的CDRs一般是指CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。上述CDRs从N端到C端的方向依序编号。
此处所述单株抗体或其抗原结合片段是指由cDNA-来源、重组RNA-来源或任何合成的来源、或结合上述部分的来源，所产生的蛋白或胜肽，也包括以下任何一种来源或衍生的来源所产生的蛋白或胜肽：(1)与自然界发现的蛋白无关；(2)不含相同来源的其他蛋白质，例如不含鼠类蛋白；(3)由不同物种的细胞所表达者；或(4)自然界并不存在者。
此处所述「抗硫酸吲哚酚的单株抗体(anti-IS mAb)」是指专一性结合硫酸吲哚酚的抗体型式及/或其片段的上位用语。
其次，本发明亦提供产生单离抗-IS的单株抗体及/或其片段的方法。再者，前述单离抗-IS的单株抗体是以二株单株抗体LG303及LG332为例示，其是根据生产抗体的融合瘤细胞株的名称分别命名。
另外，本发明亦提供编码上述抗-IS的单株抗体可变域的聚核苷酸序列，其是由重链可变(heavy chain variable，VH)域及轻链可变(light chain variable，VL)域所组成。举例而言，抗体LG303及LG332的VH域分别为序列辨识编号(SEQ ID NOs)：1及11，而抗体LG303及LG332的VL域分别为SEQ ID NOs：6及16。
本发明亦提供由上述聚核苷酸序列转译的氨基酸序列。举例而言，抗体LG303及LG332的VH域分别为序列辨识编号(SEQ ID NOs)：2及12，而抗体LG303及LG332的VL域分别为SEQ ID NOs：7及17。上述抗体的VH域内的互补性决定区CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3以及VL域内的互补性决定区CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3亦经确认。
在一具体实施例中，抗体LG303及LG332对应的上述CDRs的氨基酸序列如下所述：CDR-H1选自于序列辨识编号(SEQ ID NO)：1或11的任一者；CDR-H2选自于SEQ ID NO：2或12的任一者；CDR-H3选自于SEQ ID NO：3或13的任一者；CDR-L1选自于SEQ ID NO：6或16的任一者；CDR-L2选自于SEQ ID NO：7或17的任一者；以及CDR-L3选自于SEQ ID NO：8或18的任一者。
「序列相似度(sequence identity)百分比(％)」或「同源性(homology)」一词是定义为候选序列与参考序列经比对序列并引入间隙后，候选序列与参考序列相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，如有必要，可达到序列相似度百分比上限值，且排除核酸保守性的取代。除了手动方式外，通过习知的区域性相似度算法或使用这些算法的计算机程序(例如BLAST P)，以产生较佳的序列比对。
再者，上述核酸序列及氨基酸序列是列于所附的序列表中。
又，本发明提供利用上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体作为诊断硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的方法。
另，本发明亦提供利用上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体作为治疗硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的方法。
次则，本发明亦提供利用上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体作为取代IS的试剂的方法，以用于体外清洁的生物流体。
再者，本发明亦提供上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体用于免疫分析、元件组成物(device composition)的方法。
此外，本发明亦提供开发上述免疫分析、元件组成物及药学组成物的方法。
另则，本发明亦提供包含上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体的免疫分析，借此定性及定量检测生物样本的硫酸吲哚酚。
又，本发明亦提供利用前述免疫分析以诊断硫酸吲哚酚相关疾病的方法。
再则，本发明亦提供包含上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体的元件组成物，从而于体外去除受试对象体液中的硫酸吲哚酚或减少尿毒负担。
另外，本发明亦提供去除硫酸吲哚酚或减少尿毒负担的方法，其是施以含有效剂量的上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体的药学组成物。
在一实施例中，当上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体用于免疫分析或元件组成物时，上述单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体可结合至固相以作为实体支持。
在一实施例中，上述药学组成物可施用于降低受试对象伴随CVD而需要降低肾衰竭或CVD风险。
在一实施例中，上述药学组成物可与其他药物结合，前述药物即口服球状碳吸收剂、血管收缩素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)、血管收缩素受体阻断剂(angiotensin receptor blockers，ARB)及活性维生素D。
此处所述的「元件组成物」是指用于在特定设备中实现的组成物。在一实施例中，上述元件组成物可整合至血液透析(hemodialysis)或血浆去除(plasmapheresis)系统，以降低受试对象伴随CVD而需要降低肾衰竭或CVD风险。
在一实施例中，上述元件组成物可与用于体外清洁血液的装置结合，其中血液可将分成第一清洁部分及第二清洁部分。去除与蛋白键结的毒素及/或溶解在血浆中的毒素后，产生第二清洁的部分。
在一实施例中，上述待分析的生物样本(或液体)包括血液、血清、血浆、腹膜液、尿液及活体组织检体(biopsy specimen)。
在一实施例中，上述生物样本包括白蛋白。
以下利用数个示范实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有公知常识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
专一性结合硫酸吲哚酚(IS)的组成物
此实施例提供结合分子，其可为单离单株抗体及/或其抗原结合片段(以下亦称为抗-IS单株抗体或抗-IS mAb)，可专一性辨识/结合硫酸吲哚酚(IS)。抗-IS单株抗体包含重链可变(heavy chain variable，VH)域，其包含多个互补性决定区(complementaritydetermining regions，CDR)CDR-H1、CDR-H2与CDR-H3，以及轻链可变(light chain variable，VL)域，其包含多个互补性决定区CDR-L1,CDR-L2及CDR-L3。上述互补性决定区(CDRs)包含以下一或多个氨基酸序列：CDR-H1选自于序列辨识编号(SEQ IDNO)：1或11的任一者；CDR-H2选自于SEQ ID NO：2或12的任一者；CDR-H3选自于SEQ ID NO：3或13的任一者；CDR-L1选自于SEQ ID NO：6或16的任一者；CDR-L2选自于SEQ ID NO：7或17的任一者；以及CDR-L3选自于SEQ ID NO：8或18的任一者。
在一些实施例中，抗-IS单株抗体的VH域的氨基酸序列可为SEQ ID NO：4或14，或者与SEQ ID NO：4或14的序列相似度(identity)呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。此外，抗-IS单株抗体的VL域的氨基酸序列可为SEQID NO：9或19，或者与SEQ ID NO：9或19的序列相似度(identity)呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。
用于检测及定量IS的免疫分析及临床诊断
「免疫分析(immunoassay)」一词是指一种检测样本中的分析物的方法，其涉及令样本与专一性结合至分析物的抗体接触，以及检测抗体与分析物的键结。此处所述的免疫分析可应用至利用前述单株抗体引起的抗体-抗原反应的各种形式的免疫或生化诊断技术。前述分析方法包括但不限于放射免疫分析(radioimmunoassay)、免疫组织化学分析(immunohistochemistry assay)、原位杂合分析(in situ hybridization assay)、竞争型结合分析(competitive-binding assay)、西方墨点分析(Western Blot analyses)以及ELISA分析。其次，前述分析技术包括(a)利用荧光抗体或利用染料(例如荧光染料)经化学染色法，标定于前述单株抗体，以使前述单株抗体与抗原的结合是肉眼可观察的；(b)利用酶取代荧光染料，经酶-抗体方法标定于前述单株抗体；(c)利用蛋白标定的二级抗体进行ELISA法，以测量抗原等的含量；(d)同位素标定的单株抗体的放射免疫分析法；以及(e)利用抗体-抗原反应引起凝集反应的免疫沉淀法。
本发明是有关于一种免疫分析法，定性及定量检测生物样本的IS，包括判断正常及异常的水平。在一些实施例中，生物样本可为血液、血清、血浆、腹膜液、尿液、生物检体样本等。其次，待分析的生物样本在血浆蛋白，即白蛋白的存在下仍可分析。在又一实施例中，本发明提供的免疫分析法包含上述单离抗IS的单株抗体，其可用于诊断异常或疾病，此乃通过从受试对象收集的生物样本浓度而估计。前述的病理生理的状况或临床症状的一具体例可为尿毒症或CKD。
去除IS的元件组成物
根据本揭露内容的一实施例，提供去除或减少IS的元件组成物。在一些实施例中，前述单离抗-IS的单株抗体是连接至固相，以作为实体支持，其中此固相是例如琼脂糖、玻璃、塑料或磁性的树脂珠，透析膜以及中空纤维管。其次，上述连接至单离抗-IS的单株抗体的透析膜或中空纤维管可整合至血液透析或血浆置换(plasmapheresis)的系统。
关于移除病患血液中与白蛋白键结的尿毒素的方法是记载于美国专利公告号(U.S.Pat.No.)第8,206,591B2号专利中。此方法包括在血液中导入置换物质(displacersubstance)，使置换物质取代白蛋白键结的尿毒素。接着，在血液回到病人体内之前，利用体外肾取代治疗(extracorporeal renal displacement)移除未键结的尿毒素。前述置换物质可例如上述单离抗-IS的单株抗体。此方法建议可并用其他药物，即口服球状碳吸收剂、血管收缩素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)、血管收缩素受体阻断剂(angiotensin receptor blockers，ARB)及活性维生素D。
在又一具体实施例中，单离抗-IS的单株抗体可进行还原胺化反应(reductiveamination reaction)，以连接至琼脂糖珠，再将单株抗体连接的珠体填入空管柱中，以形成IS移除管柱。利用蠕动帮浦(peristaltic pump)使生物液体流经IS移除管柱两次。利用定量质谱仪〔quantitative mass spectrometry，例如液相层析串联质谱仪(liquidchromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)〕分析未处理及已处理的血浆样本，以评估IS去除率。利用算式([未处理组的IS]-[已处理组的IS])/[未处理组的IS]×100％，计算出IS去除百分比(％)。
去除或减少受试对象的IS的药学组成物
根据本揭露内容的一实施例，提供去除或减少受试对象的IS的药学组成物。治疗IS相关异常的临床领域的公知常识者可轻易判断投予抗-IS单株抗体的剂量及疗法。在一或多个应用中投以预设剂量可获致预设结果。根据本发明的实施例，可提供单位剂型的药学组成物。药学组成物可在任何适当的药学载剂中投药。前述药学组成物可以任何形式投予，以预防、缓解、避免或治疗人或动物病患的尿毒症的情况。应用到本实施例时，单离抗-IS的单株抗体可以药学组成物的形式提供，其包含药学上可接受的载体或稀释剂，而活性成分则为单离抗-IS的单株抗体及/或其结合片段。此组成物含有单离抗-IS的单株抗体，其剂量足以完全或部分拮抗IS的细胞毒性，或拮抗IS与尿毒素的细胞生物受体的天然结合，在需要上述拮抗作用的病患中，上述受体可例如阴离子运输蛋白(anion transporters，OATs)(10)或芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhRs)(11)。此药学组成物包含上述单离抗-IS的单株抗体的至少一者。其次，上述药学组成物可并用其他药物，即口服球状碳吸收剂、血管收缩素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)、血管收缩素受体阻断剂(angiotensin receptor blockers，ARB)及活性维生素D。在一些具体例中，上述药物可例如活性碳吸收剂，例如AST-120。
单离抗IS的单株抗体可变区的聚核苷酸及多肽序列
根据本揭露内容的一实施例，提供编码上述单离抗IS的单株抗体及/或抗原结合片段的聚核苷酸序列或区段(segment)。在一些实施例中，上述编码SEQ ID NO：4的VH域的聚核苷酸序列可为SEQ ID NO：5的序列，或者与SEQ ID NO：5的序列相似度呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。同时，上述编码SEQ ID NO：9的VL域的聚核苷酸序列可为SEQ ID NO：10的序列，或者与SEQ ID NO：10的序列相似度呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。
另一种方式，上述编码SEQ ID NO：14的VH域的聚核苷酸序列可为SEQ ID NO：15的序列，或者与SEQ ID NO：15的序列相似度呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。同时，上述编码SEQ ID NO：19的VL域的聚核苷酸序列可为SEQ ID NO：20的序列，或者与SEQ ID NO：20的序列相似度呈现至少80％、90％、95％或99％(或介于上述数值的任何百分比)的任何序列。
在此实施例中，上述聚核苷酸序列包括实质等同于编码上述氨基酸序列的多肽。实质等同序列包含突变序列，包括含有沉默突变(silent mutations)的序列。突变可包含一或多个核苷酸残基的变异、一或多个核苷酸残基的缺失、或者一或多个额外核苷酸残基的插入。基于核酸密码(nucleic acid code)的简并性(degeneracy)，实质等同序列也包含在上述揭露的氨基酸序列中，在预定氨基酸位置上编码相同氨基酸的各种核苷酸序列。上述编码单离抗IS的单株抗体及/或其抗原结合片段的聚核苷酸序列可利用任何习知方法获得。举例而言，倘若已知一抗体的核苷酸序列，则编码该抗体的聚核苷酸序列可由多段化学合成的寡核苷酸序列组合而成。上述寡核苷酸序列可涉及例如合成含有编码该抗体序列部分的重叠寡核苷酸序列，黏合并连接前述寡核苷酸序列，然后利用PCR扩增前述连接的寡核苷酸序列(12)。
概言之，上述编码单离抗IS的单株抗体及/或其抗原结合片段的聚核苷酸序列可重组至表现载体中，作为开放读序框架(open reading frame)的片段。在一些应用中，上述表现载体可导入受试对象或寄主细胞(例如原核细胞的大肠杆菌BL21、真核细胞的CHO细胞)中，以产生可专一性辨识IS的蛋白质产物，如前述实施例所提供者。详而言之，此实施例的聚核苷酸序列片段为重组DNA或RNA，在一些案例中，这些片段可被非编码调控的元件(non-coding regulatory elements)或内含子(introns)隔开。较佳地，上述单离核酸可为cDNA分子。为了产生scFv基因，编码VH及VL的DNA片段在操作上可连接至另一片段，另一片段可编码弹性连接符，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(如SEQ ID NO:21所示)，使VH及VL序列表现成连续的单链蛋白，其中VH区域及VL区域以弹性连接符连接。对于利用噬菌体展示技术(phage display techniques)获得的抗体而言，带有如前述实施例提供的单离抗IS的单株抗体及/或其抗原结合片段的单离核酸的噬菌体株可经筛选噬菌体展示库(library)回收获得(13)。前述揭露的聚核苷酸亦可从任何其他适合来源的核酸产生，例如抗体cDNA库，或由表现该抗体的任何组织或细胞(例如从选定表现一抗体的融合瘤细胞中)分离的cDNA库。
在一些实施例中，上述揭露的聚核苷酸序列的任一者可嵌入表现载体中，在预设的启动子的控制下进行表现。适用于人类及动物细胞类型中表现的习知载体为本技术领域所熟知。适用的寄主细胞可包括但不限于HEK293、CHO、酵母菌(Pichia)、SF9、E.coli BL21及或其他人类或非人类细胞株。在一些实施例中，只要培养上述细胞，即可将表现载体的所述核酸以短暂或稳定的方式表现出来，而前述产生抗IS的单株抗体及/或抗原结合片段的方法则揭露于本发明中。
5/6肾切除手术(5/6Nx)的大鼠慢性肾病(CKD)模式及治疗
典型CKD动物模式有单侧输尿管阻塞(unilateral ureteral obstruction，UUO)、艾霉素(Adriamycin，ADR)肾病变以及5/6肾切除手术。UUO的模式可快速且完全阻塞肾小管，且呈现不同病理阶段及纤维化的特征，包括发炎细胞浸润、肾小管细胞凋亡、肌纤维母细胞(纤维母细胞)活化、纤维连结蛋白及第I型胶原蛋白沉积。ADR肾病变的模式目前常用于仿真人类肾丝球疾病，其特征在于大量的蛋白尿(proteinuria)、肾小管圆柱体(renaltubular casts)、肾小管塌陷(renal tubular collapse)、局部节段型肾丝球硬化症〔focal segmental glomerulosclerosis，FSGS；亦称为进展式局部节段型硬化症(progressive focal segmental sclerosis)〕以及肾丝球硬化症，严重肾间质及发炎形成。5/6肾切除手术的模式的特征则是动脉高血压、蛋白尿以及肾丝球硬化症。在上述可行的实验模式中，5/6肾切除手术的大鼠最常用于研究进展式肾病，乃因这个实验方法的特点与人类观察到的CKD，二者具有共通性。5/6肾切除手术也已被建立用于测试新的治疗方式，且已证实其具有临床相关性(14,15)。
肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis)通常与CKD具有病理相关性，并呈现共通的特征，包括持续性发炎细胞浸润；间质细胞数量随着肌纤维母细胞表现细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的出现而增加；肾小管萎缩及上皮细胞凋亡；围绕肾小管的微血管(peritubular capillaries)完全受损；以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的累积(16)。在正常肾脏中，不同胶原蛋白分子是在不同区域生产的，管状上皮细胞(tubular epithelial cells，TECs)作为主要生产第IV型胶原蛋白的细胞，而常驻的纤维母细胞则生产第I型及第III型胶原蛋白。在肾小管间质纤维化中，较显著的是间质胶原蛋白累积，常驻的纤维母细胞转分化为α-SMA阳性的肌纤维母细胞，使得ECM扩张。此外，通常在肾丝球及管状基底膜表现的第IV型胶原蛋白，不再受限，在间质中也可观察到。5/6肾切除手术的大鼠因肾损伤，诱导细胞凋亡，进而使近端的肾小管细胞及足细胞(podocytes)释放出凋亡蛋白酶裂解的细胞角蛋白(caspase-cleavedcytokeratin)18(M30)，因此不同区域的M30可视为治疗方案的药效动力学的生物标记。由于第I型及第IV型胶原蛋白与过量的ECM沉积有关，α-SMA可评估肾丝球硬化症，而M30可作为肾丝球细胞凋亡的指数，利用组织染色及特殊的免疫组织化学(IHC)检验，应可阐明抗IS的单株抗体干预IS相关组织萎缩的效果。
以下利用数个实施例以说明本发明单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体及/或其抗原结合片段的应用。
具体实施例
实施例1、制备抗原性IS共轭物
为了由半抗原(hapten)IS制备完整抗原，将IS的钾盐(Santa CruzBiotechnology)以化学性耦合至具有下列载体材料的平板上，其中载体材料包括蓝色载体蛋白(blue carrier protein，BCP；商品名：ImjectTM Blue CarrierTM Protein；制造商：BCP,Thermo Scientific)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA；制造商：ThermoScientific)以及与二氨基二丙基胺(diaminodipropylamine；DADPA)交联的琼脂糖凝胶珠(商品名：CarboxyLinkTM Coupling Gel；制造商：Thermo Scientific)。简言之，将1mL的IS〔10mg/mL的磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline，PBS)〕，在试管中分别与1mL的上述三种载体材料(三种载体材料皆为10mg/mLPBS)混合。将0.25mL的甲醛(formaldehyde，37％)或戊二醛(glutaraldehyde，50％)加入2mL的混合物中，于50℃进行72小时的曼尼希式反应(Mannich-type reaction)(17)。在前述耦合反应后，IS-载体蛋白复合体(IS-carrier protein conjugates)利用Sephadex G-25树脂管柱(GE Healthcare)的层析法进行纯化，其浓度利用布拉德福(Bradford)试剂(Bio-Rad)测定。至于IS-DADPA琼脂糖复合体(IS-DADPA agarose conjugates)，利用去离子水将耦合的凝胶珠清洗三次后，重新配制于5mL的PBS中。
实施例2、利用融合瘤技术生产抗-IS的单株抗体
小鼠(8至10周大，雌性BALB/c)利用上述制备的抗原性的IS复合体，以下述2种免疫途径进行免疫。其中一种免疫途径是传统的腹腔内(intraperitoneal，IP)免疫。在此途径中，IS-BCP/IS-BSA复合体(50μg/100μL PBS)或IS-DADPA琼脂糖复合体(100μL)与等体积的完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA；制造商：Sigma-Aldrich)或不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant，IFA；制造商：Sigma-Aldrich)混合。每只小鼠在4周内接受4次免疫，包括第一次的促发(priming)免疫及3次补强(boosters)免疫。另一种免疫途径则是直接脾脏免疫(direct spleen immunization)。第一次注射可利用34G号的针将5μg的IS-BCP复合体(配制于5μL PBS)注入5只小鼠的胰脏。若可成功引发抗原反应，这些小鼠后续将经由皮下(subcutaneous，SC)注射IS-BCP复合体(50μg，配制于200μL的IFA中)以进行三次的补强免疫。结合IS的脾细胞在与骨髓瘤细胞融合前，先将结合IS的脾细胞贴附于涂覆IS复合体的培养盘(直径10cm；商品名：NuncTM；制造商：Thermo Scientific)上，并用培养液冲洗未贴附的细胞，借此浓缩(enrich)这些细胞。上述两种途径在每次免疫前，利用ELISA或流式细胞仪监控小鼠的血清力价(serum titers)，当达到预设力价时，牺牲小鼠以筛选融合瘤。筛选的标准是从分布的细胞中，挑选出其上清液可辨识游离型IS者，经限制性稀释(limiting dilution)培养建立单一细胞株。然而，只辨识IS复合体但不与游离型IS反应或者与未连结的载体反应的细胞则舍弃。将分离的融合瘤细胞株注射至BALB/c小鼠的腹腔后，收集所得的腹水。上述收集的腹水利用蛋白A(protein A)管柱(制造商：GEHealthcare)的层析法进行纯化，借此萃取出预设的抗体。抗体的浓度上限值为10mg/mL。
实施例3、利用竞争型ELISA检测抗-IS的单株抗体的专一性
在此处所述的竞争型ELISA中，抗-IS的单株抗体或IS复合体可互换作为游离的分析物或固定化的捕获子(catcher)。至于上述两个反应物的角色所指为何，端视实验设计而定。
在抗-IS的单株抗体作为游离的分析物的例子中(即IS复合体涂覆于微量滴定盘上)，例如抗小鼠IgG.Fcγ片段的HRP-连接山羊IgG的二级抗体可作为报导子(reporter)。IS复合体涂覆在微量滴定盘的浓度可为50ng/mL至50μg/mL。抗IS的单株抗体的浓度可为10pg/mL至10μg/mL。
当抗IS的单株抗体经固定化为捕获子时，IS分析物可连接至酵素报导子(enzymereporter)(本案即为HRP)借此绘制出标准曲线。可利用前述章节的曼尼希式加成反应制备IS-HRP复合物，其操作浓度为10ng/mL至10μg/mL。可使用1pg/mL至500μg/mL的IS参考标准品绘制标准曲线。
为了初步测试候选单株抗体的专一性，利用竞争型ELISA比较各抗体对于抗IS、吲哚、L-色氨酸及3-吲哚乙酸(上述化合物皆购自于Sigma-Aldrich)的活性。ELISA培养盘(制造商：Corning Costar)的各孔以IS-BSA复合物(0.5μg/mL，每孔100μL)涂覆，4℃下隔夜培养，并以300μL含3％BSA的PBST(PBS含0.05％20，在37℃进行1小时的阻隔反应1小时，接着利用PBST润洗三次。在涂覆抗原的各孔中，于上述阻隔缓冲溶液中加入二倍序列稀释(16～128ng/mL)的粗萃取的候选单株抗体、20μg/mL的各化合物或空白控制组。在室温下反应30分钟至60分钟，吸出各孔并以300μL的PBST润洗三次。而后，每孔加入100μL的HRP-连接的山羊IgG抗-小鼠IgG(制造商：伟乔生医股份有限公司)作为二级抗体(1:5000，溶于PBST)，在室温下反应30分钟。各孔以PBST润洗六次后，加入四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB)受质溶液(KPL)进行呈色反应。当成色反应达可区别的程度时，加入0.1N硫酸停止反应，并利用微量盘读取仪器(microtiter plate reader；制造商：Molecular Devices)检测450nm的吸光度，以分析候选单株抗体的活性。待测候选物的相对键结活性百分比是以下式计算：B/B0×100％[(加入化合物的各孔平均吸光度)/(空白控制组的各孔平均吸光度)]。倘若吲哚、L-色氨酸及3-吲哚乙酸等竞争物对于IS的键结活性，显著胜过待测候选物(判断标准：BIS/B0<30％；B竞争物/B0>70％)，则这类待测候选物则不入选。
实施例4、二株抗-IS的单株抗体的定性
经过连二轮筛选，从数十株候选抗体中选出对IS亲和力及专一性较佳的二株抗体，抗体LG303及抗体LG332。抗体LG303及抗体LG332的力价曲线及预估的Kd值(平衡解离常数)如图1A及图1B所示，且此两种单株抗体对于IS具有斯卡查德键结亲和力(Scatchardbinding affinity)。
利用小鼠单株抗体分型套组(mouse mAb isotyping kit；制造商：ThermoFisher)鉴定亚型，分别鉴定出抗体LG303属于IgG1/κ亚型，而抗体LG332属于IgG2a/κ亚型。并用反转录-PCR及小鼠Ig引子组(制造商：Merck Millipore)，可由融合瘤细胞的mRNA萃取物解出抗体可变区的基因序列。抗体LG303的VH域的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:5)转录成如SEQ ID NO:4所示的多肽序列，而其三个CDR序列分别为SEQ ID NO:1(CDR-H1)、SEQ ID NO:2(CDR-H2)及SEQ ID NO:3(CDR-H3)。抗体LG303的VL域的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:10)转录成如SEQ ID NO:9所示的多肽序列，而其三个CDR序列分别为SEQ ID NO:6(CDR-L1)、SEQID NO:7(CDR-L2)及SEQ ID NO:8(CDR-L3)。抗体LG332的VH域的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:15)转录成如SEQ ID NO:14所示的多肽序列，而其三个CDR序列分别为SEQ ID NO:11(CDR-H1)、SEQ ID NO:12(CDR-H2)及SEQ ID NO:13(CDR-H3)。抗体LG332的VL域的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:20)转录成如SEQ ID NO:19所示的多肽序列，而其三个CDR序列分别为SEQ IDNO:16(CDR-L1)、SEQ ID NO:17(CDR-L2)及SEQ ID NO:18(CDR-L3)。
利用竞争型ELISA再度检测纯化的抗体LG303及抗体LG332(100ng/mL)的键结亲和力，其中抗-IS的单株抗体是涂覆于培养盘上，而IS-HRP复合物则作为分析物。以浓度0.125、5、20以及100μg/mL的四种化合物竞争，比较抗体LG303及抗体LG332的键结活性，其结果如图2A(IS)、图2B(L-色氨酸)、图2C(吲哚)及图2D(3-吲哚乙酸)所示。上述结果显示，抗体LG303及抗体LG33键结至IS具有高度专一性，然而对于L-色氨酸及其他代表性的生化代谢物则无显著反应。
实施例5、检测生物样本中的IS
为了判断单离抗-IS的单株抗体可否检测生物样本中的抗原目标物，尤其是生物样本中存在血浆蛋白的干扰时可否检测，故于人类血清及血浆中加入不同浓度的IS，然后利用竞争型ELISA进行评估。在此评估中，抗体LG332是涂覆在微量培养盘的孔表面作为捕获抗体。请参阅图3，其是绘示利用竞争型ELISA法在序列浓度的硫酸吲哚酚下，检测单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体LG332的空白试验极限(limit of blank，LoB)与检测极限(limitof detection，LoD)的标准曲线图。图3的结果显示抗体LG332的LoB与LoD，且LoD约25.2ng/mL。
表1是显示人类血清及血浆的抗体LG332回收率，结果显示单离抗-IS的单株抗体的结合力不受人类血浆蛋白(例如白蛋白)的干扰，被视为可吸收血流中循环的IS。
表1、从人类血清及血浆回收的抗体LG332
实施例6、去除生物样本中的IS
抗体LG303及抗体LG332是连接至乙二醛琼脂糖凝胶(glyoxal agarose gel；制造商：BioScience Bead Division of Colloidal Science Solutions,Inc.)管柱，以检测上述抗体是否可以从血浆中移除IS。在此实施例中，将IS加入二个健康捐赠者的血浆样本中，其最终浓度约40μg/mL，而IS与PCS的总量则由长庚纪念医院检验医学部提供LC-MS/MS定量的服务。请参阅表2及表3，抗体332对IS的去除率优于抗体LG303。出乎意料地，经抗-IS的单株抗体处理后，另一个重要的蛋白质结合尿毒素PCS的浓度亦下降了。由于PCS与IS在人类血清白蛋白上竞争相同键结点(18)，当血清白蛋白键结的IS大部分被抗-IS的单株抗体取代时，PCS与IS这二种有害物质之间或许存在不明的关系，留待商榷。
表2、血浆样本的IS总浓度
表3、血浆样本的PCS总浓度
实施例7、单离抗-IS的单株抗体在5/6肾切除(5/6Nx)大鼠内的功效
诚如上述，血液透析无法有效移除与蛋白结合的尿毒素。关于抗-IS的单株抗体应用于治疗的潜力，可在5/6肾切除(5/6Nx)大鼠中探讨，因为在人类CKD病人观察到许多病理生理学的特征，在5/6Nx大鼠的实验动物中亦可观察到。因此，5/6Nx大鼠应可作为适合的受试对象，以研究例如抗-IS的单株抗体对肾脏形状或其他组织坏死的效果有无差异。
简言之，将雄性斯普拉格-道利(Sprague)品是的大鼠(体重～300公克)分成五组，包括健康控制组、5/6肾切除(5/6Nx)组、利用控制抗体处理的5/6肾切除(5/6Nx)组、利用抗体LG303处理的5/6Nx组、利用抗体LG332处理的5/6Nx组。所有实验根据成功大学生物化学及分子生物学系进行。除了健康控制组以外，所有动物组在第0周进行肾脏手术后休息1周。接着，暴露出左肾，其上下两端绑上聚乙醇酸缝线，然后切除右肾(rightnephrectomy)。在缝合腹膜及皮肤后，将动物关回各自的笼子内。从第1周至第5周，根据大鼠的组别，以每公斤体重10mg抗体的剂量，每周由腹腔注射一次。实验结束时，所有大鼠以过量的硫喷妥钠(sodium thiopental)予以安乐死后，于左心室灌注磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline(PBS，pH 7.4；0.1M)，接着再利用甲醛溶液进行固定，移除肾脏，清除结缔组织并以石蜡包埋。之后，委由立众生技有限公司(Litzung BiotechnologyInc.)进行肾脏及心脏组织学的分析。
请参阅图4，其是绘示根据本发明的慢性肾病动物模式的实验策略流程图。如图4所示，大鼠经历5/6肾切除(5/6Nx)或是假处理的控制组。让大鼠休息一周后，接着注射如上所述的小鼠IgG、抗体LG303及抗体LG332。在第42天(6周)，牺牲所有大鼠，收集有兴趣的活体组织检体(biopsy specimen)进行分析。
请参阅图5A与图5B，其是显示根据本发明一实施例的试验动物的肾脏(图5A)及心脏(图5B)切片经苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色的组织切片影像。在图5A中，黄色箭头指的是肾丝球硬化(glomerular sclerosis)，红色箭头指的是管状空泡(tubular vacuoles)，浅蓝色箭头指的是间质纤维化(interstitial fibrosis)，绿色箭头指的是促发炎细胞浸润(pro-inflammatory cell infiltration)。在图5B中，绿色箭头指的是心肌细胞(cardiomyocytes)的重分布，而黄色箭头指的是免疫细胞浸润。在图5A与图5B的结果中，可以发现利用抗体LG303处理的实验组，其病理变化少于其他实验组。如图5A所示，5/6Nx大鼠具有肾丝球硬化、管状空泡扩张、间质纤维化以及免疫细胞浸润。利用控制IgG及抗体LG332处理的大鼠与5/6Nx大鼠的现象类似。有趣的是，结果显示抗体LG303对5/6Nx大鼠有利，也发现大幅减少促发炎细胞浸润及其他病理变化。其次，相较于利用控制IgG及抗体LG332处理的结果(如图5B所示)，在经抗体LG303处理后，可减少心肌重新分布(cardiac rearrangement)。
为了进一步判定5/6Nx大鼠体内的抗体LG303的抗纤维化效果，以天狼星红(Sirius red)对心脏及肾脏组织的活体组织检体(biopsy specimen)进行染色。请参阅图6，其是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经天狼星红(Sirius red)染色观察胶原蛋白表现形态的组织切片影像。请参阅图7，其是绘示本发明一实施例的利用第IV型胶原蛋白抗体对试验动物的肾脏及心脏切片的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)影像，其中大鼠肾脏及心脏切片利用第IV型胶原蛋白抗体进行IHC，借此具体观察胶原蛋白。相较于利用控制抗体及健康假处理(sham)的动物组，图6及图7的结果认为，接受抗-IS的单株抗体处理的大鼠显示第I型与第IV型胶原蛋白的表现量有下降的趋势。请参阅图8，其是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)抗体检测的IHC影像，以确认纤维母细胞转分化为肌纤维母细胞(红色箭头所指的深棕色区域)。如图8所示，抗-IS的单株抗体处理后，α-SMA表现量显著下降，而抗体LG303的效果比抗体LG332更佳。图6及图7观察到抑制胶原蛋白过量沈积的活性，同为抗体LG303的表现优于抗体LG332。
图9是绘示本发明一实施例的试验动物的肾脏及心脏切片经M30抗体检测细胞凋亡区域的IHC影像，其中试验动物的肾损伤可造成肾脏及心脏病变，而M30抗体可用于检测细胞凋亡(如红色箭头所示)。根据M30抗体免疫染色结果，只有在肾脏切片确认出细胞凋亡，心脏则无，而且针对肾丝球细胞特别是上皮细胞而言，抗IS的单株抗体防止可产生非计划性的细胞凋亡。一旦上述单株抗体用于临床，可保留或挽救CKD病人的肾功能。
综言之，对选定的CKD动物模式投予单离抗-IS的单株抗体，对肾脏及心脏的细胞发挥显著的抗纤维化及抗细胞凋亡的效果，此可由上述实验结果获得支持。其次，上述结果指出，可望通过专一性单株抗体中和IS，减缓IS相关的病理症状。
虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有公知常识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。
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序列表
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<120> 单离抗硫酸吲哚酚的单株抗体及/或其抗原结合片段的组成物及其使用
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Gly Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Thr Phe
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Ala Arg Arg Pro Leu Tyr Gly Tyr Val Glu Tyr Phe Asp Val Trp Gly
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tca
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<223> 连接子(linker)
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 10 15
Claims (13)
1.一种抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其特征在于，包含：
一重链可变(VH)域，包含多个互补性决定区(CDR)CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及
一轻链可变(VL)域，包含多个互补性决定区CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且
其中所述抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段的一者的所述重链可变(VH)域是如SEQ ID NO：4所示、所述轻链可变(VL)域是如SEQ ID NO：9所示，所述者的所述互补性决定区包含以下多个氨基酸序列：
如序列辨识编号(SEQ ID NO)：1所示的CDR-H1；
如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2；
如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3；
如SEQ ID NO：6所示的CDR-L1；
如SEQ ID NO：7所示的CDR-L2；以及
如SEQ ID NO：8所示的CDR-L3；及/或
所述抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段的另一者的所述重链可变(VH)域是如SEQ ID NO：14所示、所述轻链可变(VL)域是如SEQ ID NO：19所示，所述另一者的所述互补性决定区包含以下多个氨基酸序列：
如SEQ ID NO：11所示的CDR-H1；
如SEQ ID NO：12所示的CDR-H2；
如SEQ ID NO：13所示的CDR-H3；
如SEQ ID NO：16所示的CDR-L1；
如SEQ ID NO：17所示的CDR-L2；以及
如SEQ ID NO：18所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其特征在于，其中该单离单株抗体及/或其抗原结合片段为一单离人类抗体、一嵌合抗体、一人源化抗体、一合成抗体、一重组抗体及/或其抗原结合片段的一全长免疫球蛋白分子、一单链可变区片段、一可变区片段、一Fab片段、一Fab'片段、一多特异性结合分子或上述的任意组合。
3.根据权利要求1所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其特征在于，其中该单离单株抗体及/或其片段为经化学性修饰或与一药学上可接受的载体混合。
4.一种硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段在制备诊断硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的用途，其特征在于，所述试剂包含根据权利要求1所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段，所述抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段涂覆在微量培养盘的孔表面作为捕获抗体，借此定性或定量检测一生物样本的硫酸吲哚酚的一浓度。
5.根据权利要求4所述的硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段在制备诊断硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的用途，其特征在于，其中该生物样本包括血液、血清、血浆、腹膜液、尿液及活体组织检体。
6.根据权利要求4所述的硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段在制备诊断硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的用途，其特征在于，其中该生物样本包括白蛋白，且该试剂是利用酵素连结免疫吸附法、免疫组织化学法、西方墨点法及免疫沉淀法分析。
7.根据权利要求4所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段在制备诊断硫酸吲哚酚相关疾病的试剂的用途，其特征在于，其中该硫酸吲哚酚相关疾病包含尿毒症、慢性肾病、末期肾脏病及心血管疾病。
8.一种用于体外清洁血液的装置，其特征在于，所述用于体外清洁血液的装置包含根据权利要求1所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的用于体外清洁血液的装置，其特征在于，其中该抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段是结合至一固相载体。
10.一种去除或减少受试对象的硫酸吲哚酚的药学组成物，其特征在于，该药学组成物包含如权利要求1所述的抗硫酸吲哚酚的单离单株抗体及/或其抗原结合片段做为活性成分、一药学上可接受的吸附剂以及一药学上可接受的载体或稀释剂。
11.根据权利要求10所述的去除或减少受试对象的硫酸吲哚酚的药学组成物，其特征在于，其中该药学上可接受的吸附剂包括一活性碳吸收剂。
12.一种单离聚核苷酸区段，该单离聚核苷酸区段编码抗硫酸吲哚酚的一单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其特征在于，该单离单株抗体及/或其抗原结合片段的一者包含以下多个多肽序列：
如SEQ ID NO：4所示的一VH域；以及
如SEQ ID NO：9所示的一VL域；及/或
该单离单株抗体及/或其抗原结合片段的另一者包含以下多个多肽序列：
如SEQ ID NO：14所示的一VH域；以及
如SEQ ID NO：19所示的一VL域。
13.一种单离聚核苷酸区段，该单离聚核苷酸区段编码抗硫酸吲哚酚的一单离单株抗体及/或其抗原结合片段，其特征在于，该单离单株抗体及/或其抗原结合片段的一者的重链可变(VH)域是如SEQ ID NO：4所示、轻链可变(VL)域是如SEQ ID NO：9所示，所述者包含以下多个多肽序列：
如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1；
如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2；
如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3；
如SEQ ID NO：6所示的CDR-L1；
如SEQ ID NO：7所示的CDR-L2；以及
如SEQ ID NO：8所示的CDR-L3；及/或
该单离单株抗体及/或其抗原结合片段的另一者的重链可变(VH)域是如SEQ ID NO：14所示、轻链可变(VL)域是如SEQ ID NO：19所示，所述另一者包含以下多个多肽序列：
如SEQ ID NO：11所示的CDR-H1；
如SEQ ID NO：12所示的CDR-H2；
如SEQ ID NO：13所示的CDR-H3；
如SEQ ID NO：16所示的CDR-L1；
如SEQ ID NO：17所示的CDR-L2；以及
如SEQ ID NO：18所示的CDR-L3。
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