JP7006599B2 - 試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法及びペリオスチン測定の感度の改善方法 - Google Patents

Description

本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の測定試薬、測定用前処理剤、測定方法及び測定の感度の改善方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。

ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのＮ末端側よりＣ末端側にかけて順に、ＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域及びＣ末端領域よりなるものであるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した（特許文献２参照。）。
そして、出原らは、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることを見出し（特許文献３参照。）、更に、出原らは、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等を見出した（特許文献４参照。）。

なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献５参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献６参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献７参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献８参照。）。

しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、測定の感度の改善が望まれていた。

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Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，９８～１０４頁，２００６年発行

前述した、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、その測定の感度は十分なものではなかった。
このため、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、更なる測定の感度の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、感度が改善された高感度な測定試薬、測定用前処理剤、及び測定方法を提供すること、並びに試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法を提供することである。
なお、本発明において、感度とは、被測定量の変化量（被測定量の変化に対する応答の大きさの割合）のことである。

本発明者らは、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定について検討を重ねたところ、当該ペリオスチンと還元剤を接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）ペリオスチンに特異的に結合する抗体を含む、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、還元剤を含有することを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬。
（２）ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、還元剤を含有することを特徴とする、ペリオスチン測定用の前処理剤。
（３）ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定方法。
（４）ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法。

本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。
これにより、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法は、その測定において測定値として大きなシグナルを得ることができるものである。
よって、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、ごく低濃度のペリオスチンまで測定が可能となるものである。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、試薬盲検（試薬ブランク）は変わらないものの、感度が向上するため、正確なペリオスチンの測定を行うことができるものである。
更に、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、測定値として得られるシグナルが大きいので、これにより試料を高い希釈倍率で希釈することが可能となり、その結果、血清等の試料のマトリックス成分による測定への干渉の度合いを低減させることができるものである。

血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

〔１〕抗ペリオスチン抗体
１．抗体
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、ペリオスチンに特異的に結合する抗体（以下、「抗ペリオスチン抗体」ということがある）を用い、試料に含まれていたペリオスチンと抗原抗体反応を行わせる（又は当該抗原抗体反応のために用いる）。

本発明において、抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であれば特に限定はない。

この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)_２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。

なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。

そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。

また、本発明においては、２種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。

２．免疫原
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。

前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。

また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１～２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。

前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。

なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。

例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３～７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ） まず、ペリオスチン（ポリヌクレオチドの塩基配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。

（ｂ） すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５－ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。

（ｃ） Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。

また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ－ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２～２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。

更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。

なお、ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８～２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４～１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

また、ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域又はＲ３領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

また、ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。

更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。

ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。

なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。

免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ－サクシミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。

３．ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。

このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。

前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。

その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。

このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１～１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。

ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ～５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。

なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。

初回免疫後、１～２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２～６回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。

この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。

以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）を得ることができる。

ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。

この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。

４．モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。

このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５～４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン－バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。

更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２～５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。

なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。

（１） まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。

その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。

このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１～１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。

ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ～５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。

（２） 初回免疫後、１～２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２～６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。

（３） 初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。

（４） この最終免疫の３～５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。

（５） この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク〔ＪＣＲＢ〕９０８５）、Ｐ３－ＮＳ１－１－Ａｇ４－１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ－Ａｇ－１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。

細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。

（６） このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等（例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい）のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）」を産生するハイブリドーマを選択することができる。

（７） このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。

（８） このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。

（９） このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。

（１０）なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。

（１１） この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記（７）～（９）のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。

なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。

〔２〕．界面活性剤
１．総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

そして、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定用の前処理剤においては、界面活性剤又は還元剤を含有することにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

また、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における当該ペリオスチンと界面活性剤の接触であるが、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させること等を挙げることができる。

２．本発明における界面活性剤
本発明における界面活性剤としては、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

この界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン型両性界面活性剤、グリシン型両性界面活性剤、アミンオキシド型両性界面活性剤若しくは２－アルキルイミダゾリンの誘導型両性界面活性剤などの両性界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン－脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン－脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；硫酸エステル塩、スルホン酸塩、脂肪酸塩、リン酸エステル塩若しくはアミノ酸型界面活性剤などの陰イオン性界面活性剤；又はアミン塩型、トリメチル型、ジアルキル型若しくはベンジル型などの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

なお、両性界面活性剤であるカルボキシベタイン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン又は脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酸ベタイン等を挙げることができる。
そして、このアルキルジメチルアミノ酢酸ベタインとしては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等を挙げることができる。

また、グリシン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジアミノエチルグリシン又はジアルキルジアミノエチルグリシン等を挙げることができる。

また、アミンオキシド型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド等を挙げることができる。

また、２－アルキルイミダゾリンの誘導型両性界面活性剤としては、例えば、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等を挙げることができる。

なお、両性界面活性剤である、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインはニッサンアノン（登録商標）ＢＬ又はニッサンアノン（登録商標）ＢＬ－ＳＦという商品名で、ヤシ油ジメチル－アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン（登録商標）ＢＦという商品名で、ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン（登録商標）ＢＤＦ－Ｒ又はニッサンアノン（登録商標）ＢＤＦ－ＳＦという商品名で、パーム核油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン（登録商標）ＢＤＣ－ＳＦという商品名で、ラウリン酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン（登録商標）ＢＤＬ－ＳＦという商品名で、ラウリルジアミノエチル－グリシンナトリウム液はニッサンアノン（登録商標）ＬＧ－Ｒという商品名で、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチル－イミダゾリニウムベタイン（イミダゾリン型）はニッサンアノン（登録商標）ＧＬＭ－Ｒ又はニッサンアノン（登録商標）ＧＬＭ－Ｒ－ＬＶ（粘性改良タイプ）という商品名で、そしてラウリルアミノジ酢酸－モノナトリウムはニッサンアノン（登録商標）ＬＡ又はニッサンアノン（登録商標）ＬＡパウダーという商品名で、それぞれ日油株式会社（日本国）より市販されている。

なお、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンノニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、若しくはポリオキシエチレンベヘニルエーテル）、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキルエーテル等を挙げることができる。

また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル〔４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール［商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００］、ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル［商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５］等〕、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルフェニルエーテル、若しくはポリオキシエチレンステアリルフェニルエーテル）、又はポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。

また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン－脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖脂肪酸エステル（例えば、ラウリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリオキシエチレン、オレイン酸ポリオキシエチレン、若しくはヤシ油脂肪酸ポリオキシエチレン）、ポリオキシエチレンの分岐鎖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル（例えば、オクチル安息香酸ポリオキシエチレン、ノニル安息香酸ポリオキシエチレン、ラウリル安息香酸ポリオキシエチレン、若しくはステアリル安息香酸ポリオキシエチレン）、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステル等を挙げることができる。

なお、陰イオン性界面活性剤である硫酸エステル塩としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩等を挙げることができる。

そして、このアルキル硫酸エステル塩としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム）、アルキル硫酸エステル－トリエタノールアミン塩又は２－エチルヘキシル－硫酸エステルナトリウム塩等を挙げることができる。

また、このポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン等を挙げることができる。

なお、陰イオン性界面活性剤であるスルホン酸塩としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸メチルエステル塩、α－オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩又はその他のスルホン酸塩等を挙げることができる。

そして、このアルキルベンゼンスルホン酸塩としては、例えば、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸又はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。

また、ジアルキルスルホコハク酸塩としては、例えば、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム又はジ２－エチルヘキシル－スルホコハク酸ナトリウム等を挙げることができる。

また、その他のスルホン酸塩としては、例えば、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム又はアルカンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。

なお、陰イオン性界面活性剤である脂肪酸塩としては、例えば、アルキルエーテルカルボン酸塩等を挙げることができる。

なお、陰イオン性界面活性剤であるアミノ酸型界面活性剤としては、例えば、アシル－Ｎ－メチルタウリン、脂肪酸メチルタウリン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリン酸－ナトリウム塩、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルタウリン酸－ナトリウム塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチル－β－アラニンナトリウム塩、 Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチル－β－アラニントリエタノールアミン塩、α－スルホ脂肪酸メチル－エステルナトリウム塩、脂肪酸アミドエーテル硫酸－エステルナトリウム塩、Ｎ－オレイル－Ｎ－メチルグリシン又はＮ－ラウロイル－Ｎ－メチルグリシン－ナトリウム塩等を挙げることができる。

なお、前記の各界面活性剤は、日油株式会社（日本国）、花王株式会社（日本国）、日光ケミカルズ株式会社（日本国）又は和光純薬工業株式会社（日本国）等より市販されている。

３．濃度
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法において、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させる際の当該界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時に、０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。

なお、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは０．１２％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上である。

また、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると２０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。

なお、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

また、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させる場合には、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬又はペリオスチン測定用の前処理剤に界面活性剤を含有させて、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させても良い。
この場合、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等した際の当該界面活性剤の濃度が、前記の濃度となるよう、界面活性剤を当該測定試薬又は当該前処理剤に含有させることが好ましい。

なお、例えば、当該測定試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第２試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第１試薬に含有させればよい。（なお、この第１試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。）また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第２試薬に含有させればよい。

また、例えば、当該測定試薬が第１試薬、第２試薬、第３試薬、第４試薬及び第５試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第４試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第１試薬、第２試薬及び／又は第３試薬に含有させればよい。（なお、これらの当該第１試薬、第２試薬及び／又は第３試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。）また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第４試薬に含有させればよい。

また、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる場合には、ペリオスチン測定用の前処理剤（例えば、試料の希釈液等であっても良い）に界面活性剤を含有させて、当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させても良い。
この場合、当該前処理剤と試料を混合等し、抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる際の当該界面活性剤の濃度が、前記の濃度となるよう、界面活性剤を当該前処理剤に含有させることが好ましい。

４．界面活性剤の使用等
本発明において、界面活性剤は、１種類のものを使用して測定を行ってもよく、又は複数種類のものを使用して測定を行ってもよい。

本発明において、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善する目的のためには、界面活性剤としては、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤が好ましい。

両性界面活性剤としては、ベタイン型両性界面活性剤が好ましく、アルキルジメチルベタイン型両性界面活性剤がより好ましく、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインが特に好ましい。

また、陰イオン性界面活性剤としては、硫酸エステル塩が好ましく、アルキル硫酸エステル塩がより好ましく、ラウリル硫酸ナトリウムが特に好ましい。

〔３〕．還元剤
１．総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

そして、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定用の前処理剤においては、界面活性剤又は還元剤を含有することにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

また、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における当該ペリオスチンと還元剤の接触であるが、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと還元剤を接触させること等を挙げることができる。

２．本発明における還元剤
（１）総論
本発明における還元剤としては、特に限定はなく、還元能力を有するものであればよい。

この還元剤としては、例えば、チオール化合物、或いは「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」等を挙げることができる。

（２）チオール化合物
本発明において、このチオール化合物としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、チオグリセロール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化２－アミノエチルイソチオウロニウム、２－チオグルコース、チオグリコール酸、２－メルカプトエタノール、Ｎ－グアニル－Ｌ－システイン、メルカプト酢酸、メルカプトコハク酸、２－メルカプトエタンスルホン酸、又はシステアミン等のＳＨ基を有する化合物を挙げることができる。

（３）硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩
本発明において、この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」としては、例えば、スルホキシル酸〔Ｈ_２ＳＯ_２〕、亜硫酸〔Ｈ_２ＳＯ_３〕、チオ亜硫酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_２〕、チオ硫酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_３〕、亜ジチオン酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_４〕、二亜硫酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_５〕、ジチオン酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_６〕、二硫酸〔Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_７〕、又はポリチオン酸〔Ｈ_２ＳｘＯ_６（ｘ＝３、４‥‥）〕等を挙げることができる。
また、この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」の「これらの塩」とは、前記の「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸」のプロトンとして解離しうる水素の一部又は全部がアルカリ金属、アルカリ土類金属、その他の金属又は塩基性基で置換された化合物のことである。
例えば、このアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム又はセシウム等を挙げることができ、アルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム又はバリウム等を挙げることができ、そして塩基性基としては、アンモニウム基等を挙げることができる。

３．濃度
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法において、試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させる際の当該還元剤の濃度は、特に限定されないが、当該ペリオスチンと還元剤との接触時に、０．００１ｍＭ以上であることが好ましい。

なお、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．０１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．０５ｍＭ以上である。

また、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５０ｍＭ迄で十分である。

なお、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。

また、試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させる場合には、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬又はペリオスチン測定用の前処理剤に還元剤を含有させて、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと還元剤を接触させても良い。
この場合、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等した際の当該還元剤の濃度が、前記の濃度となるよう、還元剤を当該測定試薬又は当該前処理剤に含有させることが好ましい。

なお、例えば、当該測定試薬が第１試薬及び第２試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第２試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第１試薬に含有させればよい。（なお、この第１試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。）また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第２試薬に含有させればよい。

また、例えば、当該測定試薬が第１試薬、第２試薬、第３試薬、第４試薬及び第５試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第４試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第１試薬、第２試薬及び／又は第３試薬に含有させればよい。（なお、これらの当該第１試薬、第２試薬及び／又は第３試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。）また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第４試薬に含有させればよい。

また、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させる場合には、ペリオスチン測定用の前処理剤（例えば、試料の希釈液等であっても良い）に還元剤を含有させて、当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと還元剤を接触させても良い。
この場合、当該前処理剤と試料を混合等し、抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させる際の当該還元剤の濃度が、前記の濃度となるよう、還元剤を当該前処理剤に含有させることが好ましい。

４．還元剤の使用等
本発明において、還元剤は、１種類のものを使用して測定を行ってもよく、又は複数種類のものを使用して測定を行ってもよい。

また、本発明において、還元剤と界面活性剤を組み合わせて使用し、測定を行ってもよい。

本発明において、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善する目的のためには、還元剤としては、チオール化合物が好ましく、ジチオスレイトール、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、チオグリセロール、還元型グルタチオン、システイン又はジチオエリスリトールがより好ましく、ジチオスレイトール、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン又はチオグリセロールが更に好ましく、ジチオスレイトールが特に好ましい。

〔４〕．試料
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。

なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。

また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。

また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
例えば、試料を抗ペリオスチン抗体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ５～ｐＨ１０の範囲にあることが好ましい。

また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。

〔５〕．測定対象物質
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における測定対象物質はペリオスチンである。

この本発明における測定対象物質としてのペリオスチンとしては、特に限定はなく、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン等を挙げることができる。

この測定対象物質としてのペリオスチンとしては、ヒトのペリオスチンが特に好ましい。

〔６〕．ペリオスチンの測定試薬
１．総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

本発明のペリオスチンの測定試薬は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

２．抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定試薬
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものであるが、このようなものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９－２２９９３６号公報及び特開平１０－１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７～７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。

そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

本発明のペリオスチンの測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。
この場合、抗ペリオスチン抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
また、この場合、界面活性剤（又は還元剤）も、その一つの測定試薬に含有される。

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
この場合、抗ペリオスチン抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
また、この場合、界面活性剤又は還元剤も、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。このとき、当該界面活性剤又は当該還元剤を含有する測定試薬は本発明のペリオスチン測定用前処理剤であってよい。

例えば、本発明のペリオスチンの測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、抗ペリオスチン抗体は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
また、例えば、本発明のペリオスチンの測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、界面活性剤又は還元剤は、第１試薬にのみ含有させてもよく、あるいは第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５～ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。

また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、抗ペリオスチン抗体等の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；又は、非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。

なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１～１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。

前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。

ところで、本発明のペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤及び水系溶媒を含有する第１試薬と、抗ペリオスチン抗体を含有する第２試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。なお、この場合、当該第１試薬は本発明のペリオスチン測定用前処理剤であってよい。

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、水系溶媒を含有する第１試薬と、抗ペリオスチン抗体並びに界面活性剤又は還元剤を含有する第２試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。

３．抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法の測定試薬においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを含有してもよい。

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれもの抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤を含有するものである。

なお、この標識抗体を用いた免疫学的測定試薬において用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
なお、前記の抗ペリオスチン抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗体を固相担体に固定化することができる。

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチン抗体と固相担体を接触させたりすること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

標識物質としては、酵素免疫測定法の測定試薬の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の測定試薬の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法の測定試薬においては、ＮＡＤＨ－ＦＭＮＨ_２－ルシフェラーゼ系、ルミノール－過酸化水素－ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。

抗ペリオスチン抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。

測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。（例えば、この「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる。）

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。

具体的には、酵素免疫測定法の測定試薬の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の測定試薬の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の測定試薬の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

なお、標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の詳細については、後記「〔８〕．ペリオスチンの測定方法」の「４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法」に記載した通りである。

５．凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤を含有するものである。

また、前記の凝集反応法を測定原理とする場合、本発明のペリオスチンの測定試薬は、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する。

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」は、第２試薬に含有させることが好ましい。
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬以外の試薬、すなわち、「抗ペリオスチン抗体」も「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」も含有しない試薬は、例えば前記の水系溶媒を含有する試薬等であってよい。

なお、前記の凝集反応法による測定試薬においては、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

抗ペリオスチン抗体を固相担体に固定化させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。

抗ペリオスチン抗体を固相担体に固定化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗ペリオスチン抗体と固相担体を接触させたりすること等により行うことができる。

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

なお、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４～１μｍであることが好ましい。

また、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチン抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。

しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗ペリオスチン抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応時（測定反応時）に、「抗ペリオスチン抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５～１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。

また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１～１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５～１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１～１０の範囲内にあることが好ましく、１～２の範囲内にあることがより好ましい。

なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」若しくは「還元剤」を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」若しくは「還元剤」を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。［同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）が接触する。］
または、「界面活性剤」（若しくは「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」（抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…）を測定する。

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

なお、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法の詳細については、後記「〔８〕．ペリオスチンの測定方法」の「５．凝集反応法による免疫学的測定方法」に記載した通りである。

〔７〕．ペリオスチン測定用の前処理剤
１．総論
本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

２．ペリオスチン測定用の前処理剤
本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものであるが、このようなものであれば、特に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９－２２９９３６号公報及び特開平１０－１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７～７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。

そして、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法にも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、用手法に適用してもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行う測定に適用してもよい。

本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、界面活性剤若しくは還元剤を含むものであってもよく、又は界面活性剤若しくは還元剤そのものであってもよい。

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、液体であってもよく、又固体等であってもよい。

なお、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤が液体の場合、その溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５～ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤には、界面活性剤の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；又は、非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。

なお、これらを本発明のペリオスチン測定用の前処理剤に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１～１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定用の前処理剤は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。

なお、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、試料に添加又は試料と混合等することにより、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることができる。

〔８〕．ペリオスチンの測定方法
１．総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

本発明のペリオスチンの測定方法は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法においては、前記の「〔６〕．ペリオスチンの測定試薬」の項に記載した測定試薬、及び前記の「〔７〕．ペリオスチン測定用の前処理剤」の項に記載した前処理剤を使用することができる。

２．抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定方法
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものであるが、この抗ペリオスチン抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９－２２９９３６号公報及び特開平１０－１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７～７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。

そして、本発明のペリオスチンの測定方法における測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定方法における測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

３．抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定方法においては、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

なお、本発明のペリオスチンの測定方法において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチン抗体である必要がある。

本発明においては、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。

測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。［例えば、この「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。］

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。

具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

５．凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

本発明においては、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させる。

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。［同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）が接触する。］

または、「界面活性剤」（若しくは「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（若しくは還元剤）を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」（抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…）を測定する。

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。

〔ａ〕抗原抗体反応の前に接触させる場合
（１） まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
ペリオスチン測定用前処理剤［界面活性剤（又は還元剤）を含有する緩衝液（水系溶媒）］
第２試薬：
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液

（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応の前に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）

（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。

〔ｂ〕抗原抗体反応時に接触させる場合
（１） まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
緩衝液（水系溶媒）
第２試薬：
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」、並びに「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する緩衝液

（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）

（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。［これにより、更に、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。］
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。

〔９〕．ペリオスチン測定の感度の改善方法
１．総論
本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、前記の「〔６〕．ペリオスチンの測定試薬」の項に記載した測定試薬、及び「〔７〕．ペリオスチンの測定用の前処理剤」の項に記載した前処理剤を使用することができる。

２．抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定
本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものであるが、この試料に含まれるペリオスチンの測定は抗ペリオスチン抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

本発明において、この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９－２２９９３６号公報及び特開平１０－１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７～７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。

そして、本発明におけるペリオスチンの測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

３．抗ペリオスチン抗体
本発明におけるペリオスチンの測定においては、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ） ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

なお、本発明におけるペリオスチンの測定において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

４．標識抗体を用いた免疫学的測定
本発明におけるペリオスチンの測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチン抗体である必要がある。

本発明においては、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤若しくは還元剤を接触させる。

測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。［例えば、この「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤（若しくは還元剤）を接触させる。］

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。

具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

５．凝集反応法による免疫学的測定
本発明におけるペリオスチンの測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

本発明においては、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤若しくは還元剤を接触させる。

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」並びに「界面活性剤」（若しくは「還元剤」）を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」（若しくは「還元剤」）を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」並びに「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。［同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は「還元剤」）が接触する。］

または、「界面活性剤」（若しくは「還元剤」）を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（若しくは還元剤）を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」（抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…）を測定する。

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。

〔ａ〕抗原抗体反応の前に接触させる場合
（１） まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
ペリオスチン測定用前処理剤［界面活性剤（又は還元剤）を含有する緩衝液（水系溶媒）］
第２試薬：
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液

（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応の前に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）

（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。

〔ｂ〕抗原抗体反応時に接触させる場合
（１） まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
緩衝液（水系溶媒）
第２試薬：
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」、並びに「界面活性剤」（又は「還元剤」）を含有する緩衝液

（２） 血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）

（３） 一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。［これにより、更に、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤（又は還元剤）を接触させる。］
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

（４） そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

（５） そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

〔実施例１〕（本発明の効果の確認－１）［界面活性剤］
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、ペリオスチンの測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法の効果を確かめた。

１．ペリオスチンの調製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。

具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５－ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡとした。

次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。

次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。

そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。

次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。

２．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－１回目
以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（１回目）

（１） 前記１で調製したペリオスチン溶液１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を１容量の割合で混合した。

（２） 次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、１０～５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日～２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、１０～５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット〔雌、６～８週齢〕（日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市）を用いた。

（３） 最終免疫より３～４日後に、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。

具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ_２存在下で培養した。

生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７～１４日後、免疫原に使用した前記のペリオスチンを固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。

このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの前記のペリオスチンを９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固相化させた。
この固相化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。

融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。

この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。

生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１８Ａ株と命名した。

（４） この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ_２インキュベータ内３７℃で培養した。

培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。

溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。

すなわち、ＳＳ１８Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」という）を得ることができた。

〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－２回目
前記〔１〕とは別の時に、前記〔１〕の（１）～（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（２回目）

その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株と命名した。

そして、ＳＳ１７Ｂ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」という）を得ることができた。

３．試料
両性界面活性剤であるラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン〔商品名：ニッサンアノン（登録商標）ＢＬ〕をそれぞれ０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、又は２％（ｗ／ｖ）の濃度で含み、かつ０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、ペリオスチン測定用前処理剤とした。

これらの３種類のペリオスチン測定用前処理剤それぞれの６．０ｍＬに対して、ヒト血清４２検体それぞれの５．０μＬを添加、混合した。

なお、このペリオスチン測定用前処理剤とヒト血清試料を添加、混合した時、すなわち、この抗原抗体反応の前にペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の各々の当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度は、ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）のときは０．５％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が１％（ｗ／ｖ）のときは１％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が２％（ｗ／ｖ）のときは２％（ｗ／ｖ）である。

また、０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、これをラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤とした。

このラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤の１．０ｍＬに対して、前記ヒト血清４２検体それぞれの５．０μＬを添加、混合した。
以上の操作により、計１６８種類の血清試料を調製した。

４．測定
前記３の血清試料それぞれに含まれるペリオスチンについて、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、以下の通り測定した。

（１） 前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。

（２） 次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の液を除いた後、ブロッキング液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。

（３） 次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを洗浄液〔０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕で３回洗浄した。

（４） 次に、前記３の血清試料それぞれについて、その１００μＬを前記（３）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８～２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固相化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。

（５） 次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で５回洗浄した。

（６） 前記２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させ標識したＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。

これにより、前記の固相化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。

（７） 次に、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で５回洗浄した。

（８） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（７）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。

（９） その後、前記（８）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。

（１０） 次に、分光光度計を用いて、前記（９）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。

なお、この吸光度差の値は、血清試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。

５．測定結果
前記４における血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を図１に示した。

この図において、横軸はペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度［単位：％（ｗ／ｖ）］を表し、縦軸は血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果〔４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］〕を当該界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）の時の当該吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］で除した値〔相対感度［単位：％］〕を表す。

この図より、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させない場合［すなわち、界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）］に比べ、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させた場合は、測定で得られた吸光度が増加しており、つまり測定の感度が上昇していることが分かる。

よって、本実施例における測定結果より、本発明において、試料に含まれるペリオスチンの測定の感度を改善することができることが確かめられた。

〔実施例２〕（本発明の効果の確認－２）［界面活性剤］
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、ペリオスチンの測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法の効果を確かめた。

１．試料
両性界面活性剤であるラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン〔商品名：ニッサンアノン（登録商標）ＢＬ〕をそれぞれ０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、又は５％（ｗ／ｖ）の濃度で含み、かつ０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、ペリオスチン測定用前処理剤とした。

これらの６種類のペリオスチン測定用前処理剤それぞれの６．０ｍＬに対して、ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。

なお、このペリオスチン測定用前処理剤とヒト血清試料を添加、混合した時、すなわち、この抗原抗体反応の前にペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の各々の当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度は、ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）のときは０．５％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が１％（ｗ／ｖ）のときは１％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が２％（ｗ／ｖ）のときは２％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が３％（ｗ／ｖ）のときは３％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が４％（ｗ／ｖ）のときは４％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が５％（ｗ／ｖ）のときは５％（ｗ／ｖ）である。

また、０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、これをラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤とした。

このラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤の１．０ｍＬに対して、前記ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。
以上の操作により、計７種類の血清試料を調製した。

２．測定
前記１の血清試料それぞれに含まれるペリオスチンについて、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、前記実施例１の測定４の（１）－（１０）の記載の通りに測定を行った。

３．測定結果
前記１における血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表１に示した。

この表においては、ペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の当該界面活性剤（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）の濃度［単位：％（ｗ／ｖ）］各々における、血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果〔４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］〕、及びこの吸光度差の値を当該界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）の時の当該吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］で除した値〔相対感度［単位：％］〕をそれぞれ表す。

この表より、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させない場合［すなわち、界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）］に比べ、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させた場合は、測定で得られた吸光度が増加しており、つまり測定の感度が上昇していることが分かる。

例えば、ペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の界面活性剤の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）のときの相対感度は１７１％であり、界面活性剤の濃度が３％（ｗ／ｖ）のときの相対感度は３９９％であり、上昇している。

よって、本実施例における測定結果より、本発明において、試料に含まれるペリオスチンの測定の感度を改善することができることが改めて確かめられた。

〔実施例３〕（本発明の効果の確認－３）［界面活性剤］
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法の効果を確かめた。

１．試料
陰イオン性界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウムをそれぞれ０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、又は０．１２％（ｗ／ｖ）の濃度で含み、かつ０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、ペリオスチン測定用前処理剤とした。

これらの３種類のペリオスチン測定用前処理剤それぞれの１．０ｍＬに対して、ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。

なお、このペリオスチン測定用前処理剤とヒト血清試料を添加、混合した時、すなわち、この抗原抗体反応の前にペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の各々の当該界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）の濃度は、ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）の濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）のときは０．０４％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が０．０８％（ｗ／ｖ）のときは０．０８％（ｗ／ｖ）であり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該界面活性剤の濃度が０．１２％（ｗ／ｖ）のときは０．１２％（ｗ／ｖ）である。

また、０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、これをラウリル硫酸ナトリウム濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤とした。

このラウリル硫酸ナトリウム濃度が０％（ｗ／ｖ）であるペリオスチン測定用前処理剤の１．０ｍＬに対して、前記ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。
以上の操作により、計４種類の血清試料を調製した。

２．測定
前記１の血清試料それぞれに含まれるペリオスチンについて、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、前記実施例１の測定４の（１）－（１０）の記載の通りに測定を行った。

３．測定結果
前記１における血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表２に示した。

この表においては、ペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の当該界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）の濃度［単位：％（ｗ／ｖ）］各々における、血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果〔４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］〕、及びこの吸光度差の値を当該界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）の時の当該吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］で除した値〔相対感度［単位：％］〕をそれぞれ表す。

この表より、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させない場合［すなわち、界面活性剤の濃度が０％（ｗ／ｖ）］に比べ、血清試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させた場合は、測定で得られた吸光度が増加しており、つまり測定の感度が上昇していることが分かる。

例えば、ペリオスチンと界面活性剤を接触させた時の界面活性剤の濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）のときの相対感度は１５１％であり、界面活性剤の濃度が０．０８％（ｗ／ｖ）のときの相対感度は３７７％であり、上昇している。

よって、本実施例における測定結果からも、本発明において、試料に含まれるペリオスチンの測定の感度を改善することができることが確かめられた。

〔実施例４〕（本発明の効果の確認－４）［還元剤］
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の試料中のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、ペリオスチンの測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法の効果を確かめた。

１．試料
還元剤であるジチオスレイトールをそれぞれ０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、又は１．０ｍＭの濃度で含み、かつ０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、ペリオスチン測定用前処理剤とした。

これらの５種類のペリオスチン測定用前処理剤それぞれの６．０ｍＬに対して、ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。

なお、このペリオスチン測定用前処理剤とヒト血清試料を添加、混合した時、すなわち、この抗原抗体反応の前にペリオスチンと還元剤を接触させた時の各々の当該還元剤（ジチオスレイトール）の濃度は、ペリオスチン測定用前処理剤における当該還元剤（ジチオスレイトール）の濃度が０．０１ｍＭのときは０．０１ｍＭであり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該還元剤の濃度が０．０５ｍＭのときは０．０５ｍＭであり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該還元剤の濃度が０．１ｍＭのときは０．１ｍＭであり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該還元剤の濃度が０．５ｍＭのときは０．５ｍＭであり、当該ペリオスチン測定用前処理剤における当該還元剤の濃度が１．０ｍＭのときは１．０ｍＭである。

また、０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）を調製し、これをジチオスレイトール濃度が０ｍＭであるペリオスチン測定用前処理剤とした。

このジチオスレイトール濃度が０ｍＭであるペリオスチン測定用前処理剤の１．０ｍＬに対して、前記ヒト血清１検体の５．０μＬを添加、混合した。
以上の操作により、計６種類の血清試料を調製した。

２．測定
前記１の血清試料それぞれに含まれるペリオスチンについて、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により、前記実施例１の測定４の（１）－（１０）の記載の通りに測定を行った。

３．測定結果
前記２における血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表３に示した。

この表においては、ペリオスチンと還元剤を接触させた時の当該還元剤（ジチオスレイトール）の濃度［単位：ｍＭ］各々における、血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果〔４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］〕、及びこの吸光度差の値を当該還元剤の濃度が０ｍＭの時の当該吸光度差の値［単位：ΔＡｂｓ．］で除した値〔相対感度［単位：％］〕をそれぞれ表す。

この表より、血清試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させない場合［すなわち、還元剤の濃度が０ｍＭ］に比べ、血清試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させた場合は、測定で得られた吸光度が増加しており、つまり測定の感度が上昇していることが分かる。

例えば、ペリオスチンと還元剤を接触させた時の還元剤の濃度が０．０１ｍＭのときの相対感度は１３１％であり、還元剤の濃度が０．０５ｍＭのときの相対感度は８２７％であり、還元剤の濃度が０．５ｍＭのときの相対感度は１０６４％であり、上昇している。

よって、本実施例における測定結果より、本発明において、試料に含まれるペリオスチンの測定の感度を改善することができることが確かめられた。

Claims (4)

1. ペリオスチンに特異的に結合する抗体を含む、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、還元剤を含有することを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬。
2. ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、還元剤を含有することを特徴とする、ペリオスチン測定用の前処理剤。
3. ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定方法。
4. ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法。

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