CN108445217B - 一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡 - Google Patents

一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定量检测牛奶中β‑内酰胺酶残留的荧光微球检测卡及其制备方法，具体步骤为：（1）抗β‑内酰胺酶配对单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（2）β‑内酰胺酶残留的荧光微球定量检测检测卡及其制备方法，包括荧光微球抗β‑内酰胺酶单克隆抗体的制备、微球垫处理、喷膜、C，T线确定、性能测定。本发明检测牛奶中β‑内酰胺酶残留的最低检测限为1×10‑ 6U/mL(U/g)，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，可以快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β‑内酰胺酶残留。

Description

一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡
技术领域
本发明属于生物技术领域以及食品安全定量检测技术领域，具体涉及一种半定量快速定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球定量检测检测卡及其制备方法。
背景技术
β-内酰胺酶（β-lactamase）是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶。β-内酰胺酶的产生是细菌对(β-内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌，在各种耐药机制中占80%。β-内酰胺酶因可以分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，掩盖抗生素痕迹，故被列入《食品中可能违法添加的非食用物质》名单，中国不允许在牛奶中添加。
目前，定量检测牛奶中β-内酰胺酶的方法，包括微生物法、碘量法、头孢菌素显色法、酸度法和高效液相色谱法。液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)定量检测方法利用活性β-内酰胺酶能够酶解青霉素族药物的特性，在原乳中加入适量氨苄青霉素，酶解1h后，定量检测原乳中氨苄青霉素酶解率，定性定量检测活性目标物。试样中氨苄青霉素经乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱净化和浓缩后，RRLC-MS/MS多反应监测模式定性与定量分析，该方法对活性β-内酰胺酶检出限为4U/mL。牛奶中β-内酰胺酶残留的检测方法改进有Charm试剂盒，结果显示，β-内酰胺酶在快速检测法中的最低检出限为1.5×10-4～1.6×10-3U/mL(U/mL)。发明专利申请CN201310001684.2公开了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，应用重组β-内酰胺酶免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到15株β-内酰胺酶单克隆抗体，15株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并进行两两配对，以JN2011-03、JN2011-04分别为包被抗体和酶标抗体，以β-内酰胺酶为标准品建立了β-内酰胺酶的夹心ELISA分析方法，LOD为1.22ng/mL，线性范围为10-100ng/mL。发明专利CN201310293739.1公开了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒，包含包被有青霉素结合蛋白的酶标板、标记物偶联β-内酰胺类抗生素、底物对照1为β-内酰胺类抗生素浓度为0ppb的脱脂奶粉冻干品、底物对照2为含标定浓度β-内酰胺类抗生素的脱脂奶粉冻干品、β-内酰胺类抗生素标准品，所述试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，可检出大约0.5U/ml浓度的β-内酰胺酶，线性检出范围为1U/ml～16U/ml。发明专利申请CN201110162413.6公开了一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测装置及其检测方法，包括检测试纸条、标准比色卡；标准比色卡由9个色块组成，从浅到深分别对应于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-内酰胺酶浓度；检测试纸条由过滤层、显色层、吸水材料层和基板组成，以2,2'-联喹啉乙醇溶液作为显色剂和CuSO4作为络合剂制备而成，根据待测样品显色程度与标准比色卡的对比，快速判定β-内酰胺酶的含量范围。
以上定量检测方式均存在检测时间长，有的需要大型仪器辅助测试，检测费用高等缺点。本研究利用免疫微球定量检测原理，研制出一种新型的快速定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡及其制备方法，为快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留减少了时间和成本。
发明内容
本发明提供了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡及其制备方法，本发明为快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留减少了时间和成本，并提升了灵敏度。
为实现上述目地，本发明的技术方案如下：
一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、聚酯纤维6613膜，其特征在于，所述聚酯纤维6613膜上有加样区和微球区，微球区载有第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体时间分辨荧光微球，所述基膜上设置有检测线（T线）和质控线（C线），所述检测线（T线）上包被有第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体，质控线（C线）上包被有羊抗鼠IgG的抗体。
优选的，所述第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO. C2017278的杂交瘤细胞株13E4分泌得到或保藏编号为CCTCC NO. C2017279的杂交瘤细胞株18B9分泌得到；所述第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO. C2017278的杂交瘤细胞株13E4分泌得到或保藏编号为CCTCC NO. C2017279的杂交瘤细胞株18B9分泌得到，所述第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体或第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体不同时相同。
优选的，所述吸水垫为吸水纸，所述基膜为硝酸纤维素膜。
优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为200-600nm。
优选的，所述时间分辨荧光微球的制备是采用抗β-内酰胺酶的单抗包被醛基修饰的荧光微球，时间分辨荧光微球的悬浮保存液配方组成为pH 8.5的0.01M Tris缓冲液，内含3%蔗糖、10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
检测线（T线）抗体终浓度为0.5mg/mL，质控线（C线）终浓度0.5mg/mL；检测线T与质控线C喷膜液量都为0.5μL/cm；所述时间分辨荧光微球喷膜量为10μL/cm。
检测线（T线）包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M Tris缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠；质控线（C线）包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M PBS缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
所述定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡采用双抗体夹心法模式的免疫层析定量检测；所述检测卡为定量检测，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10- 6U/mL，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程。
所述分泌抗β-内酰胺酶的配对杂交瘤细胞株13E4与18B9于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别对应为CCTCC NO.C2017278和CCTCCNO.C2017279，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
所述抗β-内酰胺酶配对单克隆抗体的制备是将β-内酰胺酶与501佐剂按体积比1：1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行腿部肌肉注射免疫得到的。
所述定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡的保存方式为常温保存，保质期为36个月。
本发明具体通过以下技术方案实现：
（1）抗β-内酰胺酶配对单克隆抗体的制备
①免疫：将β-内酰胺酶与501佐剂按体积比1：1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，腿部肌肉注射，每隔两周免疫一次。
②细胞融合：将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20：0.5-1.5的比例混合，按照常规方法进行融合。
③杂交瘤筛选及克隆化：待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，直到亚克隆至100%阳性为止。
④抗体制备及纯化：单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法；
单克隆抗体的纯化：采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得本发明抗β-内酰胺酶单克隆抗体。
（2）定量检测β-内酰胺酶残留检测卡的制备方法
①检测用抗β-内酰胺酶单克隆抗体荧光微球的制备：将SPA纯化的抗β-内酰胺酶单克隆抗体包被到醛基修饰的荧光微球上。
②微球垫处理：选择聚脂纤维6613 作为微球结合垫。将微球垫浸泡在处理液A（0.01M PBS，pH 7.4，0.2% Triton X-100）5min，取出37℃烘干，备用。
③喷膜：将抗β-内酰胺酶单克隆抗体时间分辨荧光微球用专用悬浮保存液悬浮，喷到聚脂纤维6613膜上的微球区，液悬浮配方组成为pH 8.5的0.01MTris缓冲液，内含3%蔗糖、10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
④检测T线、质控C线的确定：分别用检测线包被缓冲液与质控线包被缓冲液配将检测线抗体配制成终浓度 0.5mg/mL，质控线终浓度 0. 5 mg/mL ；检测线T与质控线C喷膜液量为 0.5μL/cm，依次划线到硝酸纤维素膜上。
（3）定量检测β-内酰胺酶残留检测卡的性能测定
①最低检测限：取3批检测卡，每批检测卡检测空白牛奶、0.3×10-6U/mL、1×10- 6U/mL、2×10-6U/mL标准添加样品、3×10-6U/mL标准添加样品，确定该检测卡的最低检测限。
②假阳性率、假阴性率：
假阳性就是本来是阴性的样本因为某些条件的干扰而使实验呈现出阳性的结果。反之为假阴性。根据相关规定假阳性率允许5%以下，假阴性为0%。
取3批检测卡，每批检测卡检测空白牛奶、0.3×10-6U/mL、1×10-6U/mL、2×10-6U/mL标准添加样品，确定该检测卡的假阳性率、假阴性率，结果表明假阳性率为2%，假阴性为0%。
③特异性：特异性通常用交叉反应率来表示，交叉反应指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应，交叉反应率越低表明特异性越强。
取3批检测卡，每批检测卡检测分别添加有1U/mL的β-内酰胺酶、辣根过氧化物酶等其他酶，确定该检测卡的特异性，结果表明只有检测添加有β-内酰胺酶的样品显示数值，其他均为0。
④稳定性：取3批检测卡，分别放置-20℃ 10天 ，37℃ 10天，常温3年，通过37℃加速破坏实验发现，该检测卡的保质期为常温3年。
（4）定量检测β-内酰胺酶残留检测卡的应用：
本发明所述的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡的应用，所述检测卡通过双抗体夹心原理测定牛奶中β-内酰胺酶的免疫层析检测，所述检测卡为定量检测，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10-6U/mL，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，检测过程为10分钟。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
首先，本发明突破现有技术的记载，运用双抗夹心的检测原理制备得到准确性更高的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡，并且发明人通过大量的试验得到配对效果最佳的抗β-内酰胺酶的配对杂交瘤细胞株13E4与18B9，所述杂交瘤细胞株能够高效、稳定地分泌高特异性的抗β-内酰胺酶单克隆抗体，并运用于β-内酰胺酶残留量的检测。并且，所述的抗β-内酰胺酶单克隆抗体特异性高，检测灵敏度高，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10-6U/mL(U/g)，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，检测过程为10分钟。
其次，相比传统的胶体金检测卡仅能实现定性检测，本发明的检测卡运用荧光微球技术，配合相应的仪器，还能够实现β-内酰胺酶残留量的定量检测，方便检测者确定β-内酰胺酶残留量的相关情况，进而确定乳品质量。
总而言之，本发明运用双抗夹心的原理，结合荧光微球技术，制备得到定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡，该检测卡特异性高，检测灵敏，能够实现牛奶等样品中β-内酰胺酶残留量的快速、准确的检测，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10-6U/mL，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，检测过程为10分钟。
附图说明：
图1：本发明牛奶中β-内酰胺酶残留快速检测卡结构示意图；其中：1为聚脂纤维6613膜、2为PVC板、3为微球区聚脂纤维6613膜、4为检测线、5为质控线、6为NC膜、7为吸水垫。其中箭头表示层析方向。
图2：定量检测标准曲线的绘制，纵坐标对应检测信号值，横坐标对应检测对象中的β-内酰胺酶残留量，单位为U/mL。
具体实施方式
实施例1：抗β-内酰胺酶配对单克隆抗体的制备
1.1免疫程序：
将β-内酰胺酶（sigma，货号 P0389 ）与501佐剂（山东绿都生物科技有限公司，货号LD003）按体积比1：1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）进行免疫，腿部肌肉注射，50μg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍；
1.2细胞融合：
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20：1的比例混合，800rpm离心7min，弃去上清，于30S内加入1mL50%PEG（W/W），静置1min，在第一个1min内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基（购自Gibico公司，货号H390），在第二个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个1min内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个1min内缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心10min，弃上清，用含20%小牛血清（购自Gibico公司，货号H1565）的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6×105个/mL铺于含饲养细胞（2-6×104个/mL）的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
杂交瘤筛选及克隆化
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清定量检测，最终选取6株抗β-内酰胺酶杂交瘤细胞株13E4、18B9，5G6，5B5，13A3，12F2，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，经过后期配对测试，分泌抗β-内酰胺酶的配对杂交瘤细胞株13E4与18B9于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别对应为CCTCC NO.C2017278和CCTCC NO.C2017279，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
抗体制备及纯化
单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法；
单克隆抗体的纯化：采用SPA柱（购自杭州纽龙生物科技有限公司）法对腹水进行纯化，即得本发明抗β-内酰胺酶单克隆抗体。
实施例2：定量检测β-内酰胺酶残留快速检测卡的制备
2.1检测用抗β-内酰胺酶单克隆抗体荧光微球的制备
向20mL 醛基修饰的荧光微球（苏州为度生物技术有限公司，货号6634中加入 10μl 20% 的 Tween-20 溶液、2 mg SPA柱纯化的13E4株抗β-内酰胺酶单克隆抗体以及20 μl的 NaCNBH3（25 mg/mL，0.1 M pH6.0 的 MES 缓冲液配制，现配现用），37℃避光旋转反应2 h；加 300 μl N,O- 双三甲硅基乙酰胺（100 mg/mL，0.1 M pH6.0 的 MES 缓冲液配制）溶液，37℃避光旋转反应6 h；4℃ 12000 rpm 离心 30 分钟；弃上清，用10 mL pH 6.0 的MES 缓冲液再洗两次；用2ml检测微球悬浮保存液悬浮，配方组成为pH8.5的0.01M Tris缓冲液，内含3%蔗糖、10% 牛血清白蛋白、0.5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
微球垫处理：
选择聚脂纤维6613 作为微球结合垫。将微球垫浸泡在处理液A（0.01M PBS，pH7.4, 0.2%Triton X-100）5min，取出37℃烘干，备用。
喷膜：
将抗β-内酰胺酶单克隆抗体荧光检测微球用专用悬浮保存液悬浮，喷到聚脂纤维6613膜上的微球区，喷膜量为 10μL/cm。
检测T线、质控C线的确定
分别用检测线包被缓冲液与质控线包被缓冲液配将检测线抗体配制成终浓度0.5mg/mL，质控线终浓度0.5mg/mL；检测线T与质控线C喷膜液量为0.5μL/cm，依次划线到硝酸纤维素膜上，检测线包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M Tris缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠；质控线包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M PBS缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
检测卡定量检测结果判定
在制备好的试纸条加样区中加入不同浓度的β-内酰胺酶标准品（ 取五个不同的浓度，分别为1×10-6U/mL、3×10-6U/mL、9×10-6U/mL、27×10-6U/mL、81×10-6U/mL，分别滴加到检测卡的加样孔区， 10 分钟以后，采用深圳华科瑞科技有限公司的全自动金标分析仪（HR-201）进行检测分析，读取 C，T 线信号，并绘制标准曲线，见图2。读数数值越大，表明样品中含有的β-内酰胺酶含量越高。
实施例3：定量检测β-内酰胺酶残留检测卡的性能测定
3.1最低检测限的确定
取3批检测卡，每批检测卡检测空白牛奶、0.3×10-6U/mL(U/g)、1×10-6U/mL(U/g)、2×10-6U/mL(U/g)标准添加样品、3×10-6U/mL(U/g)标准添加样品，确定该检测卡的最低检测限，当酶含量大于等于1×10-6U/mL(U/g)时，读卡仪显示数值，故该检测卡的最低检测限为1×10-6U/mL(U/g)。
表1：试纸条灵敏度试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3.2假阳性率、假阴性率
假阳性就是本来是阴性的样本因为某些条件的干扰而使实验呈现出阳性的结果。反之为假阴性。根据相关规定假阳性率允许5%以下，假阴性为0%。
取3批检测卡，每批检测卡检测空白牛奶、0.3×10-6U/mL、1×10-6U/mL、2×10-6U/mL标准添加样品，确定该检测卡的假阳性率、假阴性率均为0。
特异性
特异性通常用交叉反应率来表示，交叉反应指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应，交叉反应率越低表明特异性越强。
取3批检测卡，每批检测卡检测分别添加有1U/mL的β-内酰胺酶、辣根过氧化物酶、对头孢菌素酶等其他酶，确定该检测卡的特异性良好，与辣根过氧化物酶无交叉反应。
表2试纸条特异性试验结果
检测样品 空白牛奶 β-内酰胺酶 溶菌酶 辣根过氧化物酶 对头孢菌素酶
检测结果 - + - - -
3.4 稳定性
取3批检测卡，分别放置-20℃ 10天 ，37℃ 10天，常温3年，通过37℃加速破坏实验发现，该检测卡的保质期为常温3年。
准确性
同时使用本产品和β-内酰胺酶ELISA检测试剂盒、微生物法对580份样品包括230份阴性样本和350份阳性样本进行检测，检测结果表明本产品与β-内酰胺酶ELISA检测试剂盒的结果符合率为99%。
表3 试纸条准确性试验结果
检测方法 阳性 弱阳性 阴性 样本总数
本发明 320 30 230 580
ELISA 法 268 77 235 580
微生物法 242 88 250 580
对于以上试验中存疑的结果，即三者检测中任一种检测结果为阳性，而其他二中方法不为阳性的样品进行了反复试验，并同时还采用了市售的试纸条进行检测，最终确定检测结果，结果表明，本发明的试纸条检测结果中没有假阳性和假阴性检测结果的出现，而ELISA方法和微生物方法均存在一定的假阳性和假阴性结果。以上试验结果表明，本发明的方法具有较高的准确性。
实施例4：定量检测β-内酰胺酶残留检测卡的应用
本发明公开了β-内酰胺酶时间分辨荧光免疫层析定量检测检测卡的应用，本发明的检测卡可通过双抗体夹心原理测定牛奶中β-内酰胺酶的免疫层析检测。该检测卡为定量检测，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10-6U/mL，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，检测过程为10分钟。

Claims (9)

1.一种定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、聚酯纤维6613膜，其特征在于，所述聚酯纤维6613膜上有加样区和微球区，微球区载有第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体时间分辨荧光微球，所述基膜上设置有检测线T线和质控线C线，所述检测线T线上包被有第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体，质控线C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体；所述第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO. C2017278的杂交瘤细胞株13E4分泌得到或保藏编号为CCTCC NO. C2017279的杂交瘤细胞株18B9分泌得到；所述第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO. C2017278的杂交瘤细胞株13E4分泌得到或保藏编号为CCTCC NO. C2017279的杂交瘤细胞株18B9分泌得到，所述第一抗β-内酰胺酶单克隆抗体和第二抗β-内酰胺酶单克隆抗体不同时相同。
2.根据权利要求1所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：所述吸水垫为吸水纸，所述基膜为硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：所述时间分辨荧光微球的粒径范围为200-600nm。
4.根据权利要求3所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：所述时间分辨荧光微球的制备是采用抗β-内酰胺酶的单抗包被醛基修饰的荧光微球，时间分辨荧光微球的悬浮保存液配方组成为pH 8.5的0.01M Tris缓冲液，内含3%蔗糖、10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
5.根据权利要求1所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：检测线T线抗体终浓度为0.5mg/mL，质控线C线终浓度0.5mg/mL；检测线T与质控线C喷膜液量都为0.5μL/cm；所述时间分辨荧光微球喷膜量为10μL/cm。
6.根据权利要求1所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：检测线T线包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M Tris缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠；质控线C线包被缓冲液配方成分为pH 7.0的0.01M PBS缓冲液，内含10% 牛血清白蛋白、0. 5%聚乙二醇20000、0.1%叠氮钠。
7.根据权利要求1所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，其特征在于：所述定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡采用双抗体夹心法模式的免疫层析定量检测；所述检测卡为定量检测，检测牛奶中β-内酰胺酶残留的最低检测限为1×10-6U/mL，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程。
8.一种牛奶中β-内酰胺酶残留量的检测方法，其特征在于：采用权利要求1-7中任意一项所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡进行检测，所述牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程。
9.权利要求1-7中任意一项所述的定量检测β-内酰胺酶残留的检测卡，在牛奶检测中的应用。
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