CN107490694A - 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法 - Google Patents

一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107490694A
CN107490694A CN201710341429.0A CN201710341429A CN107490694A CN 107490694 A CN107490694 A CN 107490694A CN 201710341429 A CN201710341429 A CN 201710341429A CN 107490694 A CN107490694 A CN 107490694A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
detection
gold
collaurum
test strips
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710341429.0A
Other languages
English (en)
Inventor
于国萍
范美婧
陈媛
藏小丹
岳崇慧
刘鹏
孙琪
董良伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Agricultural University filed Critical Northeast Agricultural University
Priority to CN201710341429.0A priority Critical patent/CN107490694A/zh
Publication of CN107490694A publication Critical patent/CN107490694A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法，用于检测牛奶中的β‑内酰胺酶，具体制备方法如下：采用Frens方法制备胶体金，利用目测法、紫外扫描、透射电镜鉴定胶体金颗粒的大小、均匀度、分散性；通过Mey氏稳定化实验确定最适抗体添加量及最适pH值；低温高速离心法制备金标抗体，利用目测法、紫外扫描、斑点金免疫渗滤试验进行鉴定；确定检测线和质控线上一抗、二抗的稀释倍数；筛选制备试纸条的材料及处理液；对制备好的试纸条进行灵敏度及稳定性检测，确定最低检测限及保存时间；本发明适用于大规模检测的初筛工作，检测可在15min内完成。

Description

一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β-内酰胺酶 的方法
技术领域
本发明涉及一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β-内酰胺酶的方法，属于食 品检测技术领域。
背景技术
当前，牛奶中抗生素超标已成为影响牛奶食用安全的一个因素，一些不法商贩将β-内酰 胺酶加入牛奶中，β-内酰胺酶能水解β-内酰胺类抗生素的结构活性中心-内酰胺环使其失去活 性，掩盖其抗生素超标的事实，这可能会使消费者对抗生素类药物耐药性增高，并且其水解 产物青霉噻唑酸会使有过敏体制的人出现不适反应。目前在我国易滥用的食品添加剂品种和 违法添加的非食品用物质名单中就有β-内酰胺酶。
β-内酰胺酶分为4种(A-D类)，TEM型β-内酰胺酶是最早被发现的一种β-内酰胺酶，属于 A类β-内酰胺酶，并且已经成为肠杆菌科中发现的最常见的β-内酰胺酶，能够有效地水解青霉 素。
为了提高我国乳制品的竞争力，加强乳制品安全性检测，有必要建立快速有效的方法来 检测乳制品中的β-内酰胺酶。乳中β-内酰胺酶的检测方法已有较多的研究，但这些方法的使 用均有一定的局限性。微生物法灵敏度高，但检测时间长，操作技术要求高；碘量法的重现 性不好；酸定量法易受环境温度影响；高效液相色谱的样品前处理复杂且成本较高；头孢噻 唑酚显色法成本也较高。
胶体金现已广泛用于农业、食品等领域，例如用作免疫分析系统的标识物，应用于制备 免疫层析试纸条。免疫层析试纸条检测因为其敏感性、快速性等优势而适用于进行现场检测 的筛选工具。在快速检测方面，张立静等制备单克隆抗体和多克隆抗体，采用双抗夹心法制 备了胶体金免疫层析试纸条。因为考虑到单克隆抗体的特异性较高，所以本文主要选取成对 的单克隆抗体，采用双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸条用于检测TEM型β-内酰胺酶，为 不同种类乳制品中β-内酰胺酶的检测方法的建立提供参考依据。
发明内容
为完善现有的技术，本发明提供了一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β- 内酰胺酶的方法，用于检测牛奶中β-内酰胺酶，本课题利用免疫胶体金分析法制备胶体金免 疫层析试纸条，优化试纸条的制备过程，确定试纸条的灵敏度。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明制备了β-内酰胺酶胶体金免疫层析试纸条，用于检测牛奶中的β-内酰胺酶。采用 Frens方法制备胶体金，利用目测法、紫外扫描、透射电镜鉴定胶体金颗粒的大小、均匀度、 分散性。通过Mey氏稳定化实验确定能使胶体金溶液稳定的最适抗体浓度及最适pH值，确 定好后进行低温高速离心制备金标抗体，利用目测法、可见光分光光度法、斑点金免疫渗滤 试验鉴定金标抗体标记效果及是否具备活性，优化金标抗体的制备过程。确定检测线和质控 线上一抗二抗的稀释倍数，在NC膜上划线检测。选择四种常见的NC膜进行性能测试，金 标垫、吸水纸、PVC板和样品垫做统一选择。
组装试纸条，用划膜仪在试纸条NC膜上进行划线，划线量为1μL/cm，T/C线距离5mm， 划线后烘干处理，切成3mm宽的试纸条。样品检测时，复溶的金标抗体与样品反应3min制 备成混合物，再用试纸条插入混合物中，检测试纸条的灵敏度检测及稳定性，确定最低检测 限及保存时间。
附图说明
图1胶体金透射电镜图
图2最适标记pH值的确定
图3最适标记抗体添加量的确定
图4紫外扫描图
图5β-内酰胺酶试纸条的灵敏度(IU/mL)
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明 的保护范围中。
一、胶体金的制备及鉴定
目测制得的胶体金颜色呈酒红色，透明无沉淀，质量较好。从紫外扫描图图4可知，最 大吸收峰峰值为523nm，根据最大吸收波长和粒径之间的公式Y＝0.4271X+514.56(X： λmax,Y：纳米金平均粒径)，计算出平均直径为20nm。如图1为透射电镜下(200nm)观察到 的胶体金颗粒，大小基本一致,且分散性比较好，没有聚集现象，最终测得胶体金颗粒平均直径约为20.6nm，与紫外测得结果基本一致。
二、金标抗体的制备与纯化
目测K2CO3添加量为1μL/孔的颜色仍为红色。图2为最适标记pH值的确定，可知K2CO3的最适添加量为1μL/孔，每孔中有胶体金100μL，所以K2CO3的添加量为10μL/mL。
目测当抗体的添加量为0.6、0.7、0.8μL时，即浓度为12、14、16μg/mL时，微孔颜色为红色。从图3为最适标记抗体添加量的确定，可知抗体添加量为14μg/mL和16μg/mL的 两个孔溶液的吸光值差异不显著。由于抗体比较珍贵，所以尽量选择添加量为14μg/mL，与 目测法结果一致，最适抗体用量为在此基础上再加上10％-20％即为实际抗体用量：14μg/mL× (1+10％)＝15.4μg/mL～14μg/mL×(1+20％)＝16.8μg/mL，即为15.4～16.8μg/mL，取16μg/mL。
制得的金标抗体离心纯化后进行紫外扫描，结果如图4所示，胶体金(A)最大吸收峰 为523nm，金标抗体(B)的最大吸收峰为528nm，最大吸收峰前移，因为蛋白质与胶体金发生结合，结果与Seema Naraa研究结果一致，表明已标记成功。经斑点金免疫渗滤试验鉴定，制得的金标抗体有活性(未列出)。
三、条件的优化
1、金标抗体复溶液的确定
用四种复溶液复溶离心纯化后的金标抗体，铺金、烘干，组装试纸条，结果发现只有第 一种复溶液(1％BSA、5％蔗糖、0.05％Tween-20、0.02％叠氮钠)效果较好，其他均出现假 阳性，背景不清晰等现象。
表1复溶液的确定(％)
注：“－”代表未添加
2、抗体包被液及浓度的确定
基于抗体的灵敏度，不稀释显色正常，所以对于T线上的单克隆抗体选择不稀释，二抗 的显色效果较好，但是稀释倍数增大，会出现假阳性，最终选择二抗稀释四倍。
3、材料及处理液的选择
所选择的几种材料中WhatmanAE99、Millipore 135层析速度较慢，这会利于抗体-抗原 复合物与NC膜上包被的单抗结合，但是Whatman AE99灵敏度较低。Sartorius CN140质 地较软，贴在PVC板上的贴合效果不好，不利于划线。Pall vivid 170层析结束，背景略深， 有拖带现象，故选用Millipore 135。金标垫是ahlstrom8964金标垫，使用前用5％蔗糖处理， 37℃烘1h，取出喷涂金标抗体，再37℃烘1h放入干燥的密封袋内备用，GF2-Ⅱ样品垫用 PBS缓冲溶液(内含1％BSA、0.5％tween-20、0.05％NaN3)处理，37℃烘干，密封袋备用。
四、试纸条性能的检测
1、灵敏度的确定
将样品与复溶的金标抗体混合反应3min，然后将试纸条插入混合物中进行检测，8min 时，检测结果如图5所示，当β-内酰胺酶的浓度为5IU/mL时，检测线(T线)不清晰，难以准确判断是否为阳性，所以本实验制得的试纸条的最低检测线为6IU/mL。
2、重复性和稳定性检测
对三个批次的试纸条进行重复性检测，结果如表2所示，三个批次的试纸条检测线相同， 重复性良好。
表2β-内酰胺酶试纸条的重复性
稳定性结果如表3，常温干燥环境能储存一个月，超过一个月时，检测线升高，但试纸 条没有失效，而4℃干燥环境储存四个月时检测线不变，第五个月检测线升高，结果表明储 存环境的温度影响试纸条的稳定性。根据实验结果，选择4℃条件贮存，至少可以储存四个 月。
表3β-内酰胺酶试纸条的稳定性
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应 该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β-内酰胺酶的方法，其特征在于所述方法步骤如下：步骤一：胶体金的制备及鉴定；步骤二：金标抗体的制备与纯化；步骤三：条件的优化；步骤四：试纸条性能的检测。
2.按照权利要求1所述的测序方法，其特征在于步骤一中所述的目测制得的胶体金颜色呈酒红色，透明无沉淀，质量较好；紫外扫描计算得出胶体金颗粒平均直径为20nm；透射电镜下(200nm)观察到的胶体金颗粒，大小基本一致，且分散性比较好，没有聚集现象，最终测得胶体金颗粒平均直径约为20.6nm，与紫外测得结果基本一致。
3.按照权利要求1所述的测序方法，其特征在于步骤二中所述的最适标记pH值通过添加K2CO3的量来确定，添加量为10μL/mL；最适标记抗体添加量为16μg/mL，制得的金标抗体离心纯化后进行紫外扫描，胶体金的最大吸收峰为523nm，金标抗体的最大吸收峰为528nm，最大吸收峰前移，因为蛋白质与胶体金发生结合，表明已标记成功且金标抗体有活性。
4.按照权利要求1所述的测序方法，其特征在于步骤三中所述的金标抗体复溶液选择第一种复溶液(1％BSA、5％蔗糖、0.05％Tween-20、0.02％叠氮钠)；单克隆抗体选择不稀释，羊抗鼠二抗稀释四倍；NC膜选用Millipore 135；金标垫选择ahlstrom8964金标垫，使用前用5％蔗糖处理；样品垫选择GF2-Ⅱ样品垫，处理液为PBS缓冲溶液(内含1％BSA、0.5％tween-20、0.05％NaN3)。
5.按照权利要求1所述的测序方法，其特征在于步骤四中所述的本实验制得的试纸条的最低检测线为6IU/mL，重复性良好，选择4℃条件贮存，至少可以储存四个月。
CN201710341429.0A 2017-05-16 2017-05-16 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法 Pending CN107490694A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710341429.0A CN107490694A (zh) 2017-05-16 2017-05-16 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710341429.0A CN107490694A (zh) 2017-05-16 2017-05-16 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107490694A true CN107490694A (zh) 2017-12-19

Family

ID=60643270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710341429.0A Pending CN107490694A (zh) 2017-05-16 2017-05-16 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107490694A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108445217A (zh) * 2018-03-08 2018-08-24 山东绿都生物科技有限公司 一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108445217A (zh) * 2018-03-08 2018-08-24 山东绿都生物科技有限公司 一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡
CN108445217B (zh) * 2018-03-08 2021-12-10 山东绿都生物科技有限公司 一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paugam et al. Characteristics and consequences of airway colonization by filamentous fungi in 201 adult patients with cystic fibrosis in France
CN103257233B (zh) 一种同时可视化检测多种抗生素、非法添加剂及生物毒素的生物芯片及方法
CN103123319B (zh) 心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法
CN103575889B (zh) 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN101949944A (zh) 三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒及其制备方法
CN108333368A (zh) 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法
CN108918884A (zh) 定量检测犬c反应蛋白的免疫层析试纸条及其制备方法
Zhang et al. Development of an immunochromatographic strip test for rapid detection of lily symptomless virus
CN101368966A (zh) 一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫分析测定试剂盒
Segal et al. Invasive infection with Fusarium chlamydosporum in a patient with aplastic anemia
Badiee et al. Comparison of histopathological analysis, culture and polymerase chain reaction assays to detect mucormycosis in biopsy and blood specimens
Cherkaoui et al. Ampicillin-resistant Haemophilus influenzae isolates in Geneva: serotype, antimicrobial susceptibility, and β-lactam resistance mechanisms
CN105974110A (zh) 免疫侧向层析检测系统及其制备方法和应用
CN105866418A (zh) 一种乳腺癌三联检诊断试剂盒
CN114441766A (zh) 一种定量检测抗pla2r抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN108640850A (zh) 一种孔雀石绿半抗原、人工抗原及其在荧光定量免疫层析中的应用
CN106855575B (zh) 一种乳腺癌三联快速检测试剂盒
CN101666802A (zh) 定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条
CN101650365A (zh) 一种快速检测结核杆菌的方法和试剂盒
CN107490694A (zh) 一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法
CN102279264A (zh) 48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法
CN110244049A (zh) 致病性念珠菌检测和鉴定方法
CN110133292A (zh) 一种抗除草剂蛋白Bar的胶体金免疫层析速测卡
Ehara et al. A novel method for rapid detection of Streptococcus pneumoniae antigen in sputum and its application in adult respiratory tract infections
CN102539768A (zh) EB 病毒 Zta IgA 抗体胶体金检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171219

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication