WO2010134850A1 - Реагент для определения aдehoзиh-5'-tpифocфata - Google Patents

Реагент для определения aдehoзиh-5'-tpифocфata Download PDF

Info

Publication number
WO2010134850A1
WO2010134850A1 PCT/RU2010/000254 RU2010000254W WO2010134850A1 WO 2010134850 A1 WO2010134850 A1 WO 2010134850A1 RU 2010000254 W RU2010000254 W RU 2010000254W WO 2010134850 A1 WO2010134850 A1 WO 2010134850A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferase
reagent
ser
nitrate
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000254
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Наталья Николаевна УГАРОВА
Михаил Иванович КОКШАРОВ
Галина Юрьевна ЛОМАКИНА
Original Assignee
Ugarova Natalya Nikolaevna
Koksharov Mikhail Ivanovich
Lomakina Galina Yuryevna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ugarova Natalya Nikolaevna, Koksharov Mikhail Ivanovich, Lomakina Galina Yuryevna filed Critical Ugarova Natalya Nikolaevna
Publication of WO2010134850A1 publication Critical patent/WO2010134850A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase

Definitions

  • the present invention relates to the field of biochemistry, namely, to the composition of the reagent for the quantitative determination of adenosine-5'-trifocphosphate (ATP) based on the enzyme firefly luciferase.
  • ATP adenosine-5'-trifocphosphate
  • the intensity of bioluminescence that occurs in the reaction of luciferin, oxygen, and ATP catalyzed by firefly luciferase is proportional to the concentration of ATP.
  • concentration of ATP When working with ATP solutions in a wide range of concentrations (several orders of magnitude), the calibration dependence is presented in logarithmic coordinates. The dependence of the logarithm of the intensity of bioluminescence on the logarithm of the concentration of ATP is described by the linear equation:
  • Ig (I, ycld.e.) a + b-log [ATP, mol / L J, (1), where [ATP, mol / L] is the concentration of ATP in the luminometer cuvette,
  • (I, ycld.e.) is the bioluminescence intensity in arbitrary units recorded on the luminometer, and a and b are the coefficients of equation (1).
  • This reaction is widely used for analytical purposes to determine ATP, namely in medical diagnostics, in the control of microbial contamination of various products and the environment.
  • “fast microbiology” methods have been developed to control the microbiological purity of food, food raw materials, medicines, cosmetics, technological materials, water and other drinks, to assess the sterility of equipment and materials in extremely clean rooms (Ugarova HH, 1993, Applied Biochemistry and Microbiology, vol. 29, JNi- 2, pp. 180-191).
  • the disadvantage of the prototype is the insufficiently high catalytic activity of the native recombinant firefly luciferase L. typiphelis, which is used to obtain ATP reagent.
  • the disadvantage of the prototype is also the low yield of the active enzyme when biomass is increased in E. coli strain LE392, transformed with plasmid pLR encoding the native firefly luciferase Lysola typegreelis, 40-60 mg of luciferase with 1 l of culture medium.
  • a significant disadvantage of the prototype is the length of the process of multi-stage purification of the enzyme using ion exchange and distribution chromatography, which is more than three days and allows you to get diluted solutions of the enzyme with a concentration of not more than 1-2 mg / ml and specific activity of 20-100 U / ml (10 -50 U / mg protein).
  • a significant disadvantage of the prototype is the low thermal stability of the native recombinant luciferase, which leads to a noticeable decrease in luciferase activity in the process of isolation and long-term purification of the enzyme.
  • the use of trehalose as one of the stabilizers significantly increases the cost of the target product.
  • the objective of the present invention is to increase the sensitivity of the determination of ATP, reduce the consumption of the enzyme by increasing the specific activity of the reagent and increasing the thermal stability of luciferase.
  • the objective of the present invention is also to reduce the cost of the reagent by using instead of trehalose a more affordable stabilizer, sucrose, as well as by increasing the productivity of the process of producing the reagent by increasing the yield of the active enzyme while increasing biomass and increasing the concentration of luciferase in the resulting enzyme preparation and, finally, due to reduce the complexity and duration of the enzyme purification process.
  • thermostable firefly luciferase Lysiola typiphreelis with a specific activity of 3000-6000 U / ml (200 U / mg protein), isolated from recombinant E. coli cells transformed with pETL7 plasmid with mutant luciferase gene Lisiola tyggreilisa, luciferin, magnesium sulfate, a mixture of tris- (hydroxymethyl) aminomethane and acetic acid as a buffer mixture, a mixture of sodium ethylenediaminetetraacetate, dithiothreitol, bovine serum albumin and sucrose as stabilizer and water.
  • the proposed reagent contains a less concentrated buffer solution and a lower concentration of a number of other components (sodium ethylenediaminetetraacetate, dithiothreitol and bovine serum albumin), and also contains sucrose instead of trehalose.
  • a less concentrated solution and sucrose for the preparation of the reagent significantly reduces the cost of the reagent, which is an additional advantage of the invention.
  • the proposed reagent includes the mutant firefly luciferase Lysola type grigelis, which is isolated from recombinant E. coli cells transformed with pETL7 plasmid.
  • the preparation of plasmid pETL7 is carried out by random mutagenesis of plasmid pLR3 (SCQ 1) (Koksharov M.I., Ugarova HH, 2008, Biochemistry, vol. 73, p. 1071-1080) using a low precision polymerase chain reaction (Siripo P. C, Mauer K., Umeno D., 2003, Methods MoI Biol, v. 231, p. 3-9), as described in Example 1.
  • cDNA encoding the mutant firefly luciferase gene of Lisola type was integrated into the restriction sites Nhel and AfIII. with 8 substitutions in the amino acid sequence of the enzyme (CepI8Cis, CisNbSer, Lys56Apg, Ap211Lei, Tpe213Cep, Ala217 Bal, Gl356Lys, Cep364Cis), additional Met sequence -Ala-Ser-Liz at the N-terminus and the sequence Ser-Gli-Pro-Val-Glu-Gis-Gis-Gis-Gis-Gis-Gis-Gis at the C-end instead of the sequence Ala-Liz-Met (SCQ 2).
  • E. coli strain transformed with the plasmid pETL7 increasing cell biomass, isolating and purifying luciferase by metal chelate chromatography is carried out as described in Example 2.
  • the result is a solution of highly purified mutant firefly luciferase Lysiola typhgreelis with an active enzyme concentration of 15-30 mg / ml, specific activity of 3000-6000 U / ml (200 U / mg protein), the thermal stability of which exceeds the thermal stability of the starting enzyme by 65 times at 42 ° C.
  • This luciferase preparation is used to prepare the reagent.
  • the reagent for the determination of adenosine-5'-trifocphosphate contains a soluble recombinant mutant, highly purified, highly active and highly stable luciferase Lysiol-type gphelis, isolated from recombinant E. coli cells, lucentum tris- (oxymethyl) -aminomethane and acetic acid as a buffer mixture, a mixture of sodium ethyleneaminotetraacetate, dithiothreitol, bovine serum albumin and sucrose as stabilizers and water, with a trace of the following ratio of components, wt.%:
  • Bovine Serum Albumin 0.5 -1.0
  • Increasing the activity of the reagent for determining ATP using the proposed reagent is achieved by increasing the specific activity of mutant luciferase used to obtain the reagent.
  • the specific activity of luciferase is 10-50 U / mg protein, and the activity of the reagent is 0.5-5.0 U / ml.
  • a mutant luciferase according to the invention with a specific activity of 200 U / mg, a reagent with an activity of 6.0-12.0 U / ml is obtained.
  • the sensitivity of the determination of ATP increases by ⁇ 10 times: the limit of determination decreases from ⁇ 10 "12 M ATP (according to the prototype) to ⁇ 10 " 13 M ATP (according to this invention).
  • the reagent contains up to 0.01 wt.% Luciferase
  • the proposed reagent contains up to 0.006 wt.% Luciferase.
  • thermostability of luciferase is achieved by using the plasmid pETL7 with the mutant firefly luciferase gene Lysiola type digreece, which encodes eight substitutions in the amino acid sequence of the enzyme, the introduction of which leads to a 65-fold increase in luciferase stability at 42 ° C.
  • An increase in the yield of the active enzyme is achieved through the use of the plasmid pETL7 and E. coli BL21 (DE3) CodonPlus cells for biomass growth, which allows obtaining up to 230 mg of active luciferase from 1 liter of culture medium, while according to the prototype, the yield of active luciferase does not exceed 60 mg / L. Reducing the complexity and reducing the duration of the enzyme purification process is achieved by using the plasmid pETL7 encoding an enzyme with a six-histidine sequence at the C-terminus.
  • ATP reagent is obtained by adding a concentrated solution of highly purified mutant luciferase to a Tris-acetate buffer solution, pH 7.8, containing luciferin, magnesium sulfate, sodium ethylenediaminetetraacetate, dithiothreitol, bovine serum albumin and sucrose. After thorough mixing, the solution is filtered through a sterile filter into a sterile flask, poured into sterile vials, frozen, lyophilized, hermetically sealed under vacuum and stored in a refrigerator until use. Before use, a certain volume of deionized sterile water is added to each vial to obtain a reagent for measuring ATP concentration with an enzyme activity of 6.0 - 12.0 U / ml.
  • Example 1 Obtaining plasmids pETL7.
  • Plasmid pETL7 containing the mutant thermostable firefly luciferase luciferase lisifera gene, is obtained by random mutagenesis of the luciferase gene using reduced precision polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • plasmid pLR3 Fig. 1 containing the firefly luciferase gene L. typhgreelis with the point replacement Crl l ⁇ Cis is used.
  • the plasmid pLRZ has been previously described (Koksharov M.I., Ugarova H.H., 2008, Biochemistry, vol. 73, p. 1071-1080).
  • the mutant luciferase gene from the mutant plasmid pLR3 (FIG. 2) is cloned into the plasmid pET23b (FIG. 3).
  • Plasmid pLR3 (Fig. L) was isolated from E. coli cells (XLl-blu strain) using a Kaijen reagent kit and used in experiments on random mutagenesis of the Nh Canal ⁇ - ⁇ g ⁇ gene (1-1180 base pairs) and ⁇ AlbanyI- ⁇ g ⁇ (395 -1 180 base pairs), which is carried out in four cycles.
  • the luciferase gene region is amplified between the Nhe-AatP restriction sites (-1800 base pairs) using a direct Nhel primer (ATTATAGGAGGSTAGGAAAAATGG) and the reverse primer AatP
  • TGSSASSTGASGTSTAA TGSSASSTGASGTSTAA
  • 50 ⁇ l of the reaction mixture contains 10 mm Tris-Hcl, pH 8.3, 50 mm KCl, 7 mm MgCl 2 , 0.15 mm MnCl 2 , 0.2 mm dATP, 0.2 mm dGTR, 1 mm dSTR, 1 mM dTTP, 20 pmol of each primer, ⁇ 2 pmol of plasmid pLR3, 2.5 units Taq DNA polymerase.
  • PCR is carried out on a Tertsik thermocycler (DNK technology, Russia) at the following temperature conditions: incubation for 1 min at 95 ° C, then 25 incubation cycles of the mixture: 1 min at 94 ° C, 1 min at 53 ° C and 1 min at 72 ° C and, finally, incubation for 10 min at 72 ° C.
  • the amplification product was isolated from the gel using a kit of Kaygen reagents, a fragment was cut out at the sites of ⁇ réelleg- ⁇ g ⁇ , it was isolated from the gel and ligated into the plasmid pLR3, cut at the same sites, getting a mixture of plasmids containing mutant luciferase genes.
  • Cups with colonies of transformed cells are incubated overnight at 37 ° C and the bioluminescence of colonies is measured in vivo according to the method described in (Wod KV, DeLusa M., 1987, Apal. Biochem .. v. 16, p. 501-507) : Cups are poured with a solution of 1 mM luciferin in 0.1 M Na-citrate buffer (pH 5.0), shaken in the dark and photographed. The brightest colony expressing the most stable mutant ITMl enzyme, which is used in the next mutagenesis cycle, is selected.
  • the XhII-AFlP region (-1240 base pairs) is amplified using Xhol (GTATTSAGSTCGAGAAAAGGSTTASS) and AfI II reverse primer (GSTTGTGGTTTSTTAAGAATTTSTST AATTAC) as a direct primer.
  • the reaction mixture has the same composition as indicated for the first mutagenesis cycle, with the exception of the concentration of Mn 2+ , which is 0.25 mm. From the amplified fragment, a section of XhoI-BgSh (395-1180 base pairs) was excised and cloned into plasmid pLR3 (Fig. 2).
  • Cups with colonies of transformed cells are incubated overnight at 37 ° C, then for 40 minutes at elevated temperature to inactivate ipvivo insufficiently stable forms of luciferase (in the second and third cycles at 50 ° C, in the fourth at 55 0 C )
  • the most stable mutant obtained in the previous cycle is used as the initial matrix.
  • a 4TS mutant is obtained, the colonies of which retain a noticeable glow even after incubation for 20 min at 60 ° C.
  • Eight mutations are established by sequencing the resulting 4TS mutant gene, encoding the following amino acid substitutions: Serl l ⁇ Cis, Cycl46Cep, Lysl56Apg, Apr211 Lei, Tpe213Cep, Ala217 Bal, Gl356 Lys, Cep364Cis.
  • the obtained fragment of the Xhol-Sall luciferase gene encoding the sequence SerGlyProValGluGisGisGisGisGisGisGisGis at the C-terminus of the enzyme is purified by electrophoresis and isolated from the gel.
  • a BamHI-SallI fragment is obtained that encodes luciferase from the 225th amino acid residue to the end.
  • the resulting fragment was purified by electrophoresis and then isolated from the gel.
  • the pET23b vector cut at the Nhel and Xhol sites, ligates the Nhe ⁇ -BamHI fragment cut from the plasmid pLR3, which encodes 1-225 amino acid residues of luciferase, and the BamHI-SalI fragment described above.
  • the sticky ends of the SaII and Xhol sites are compatible, and after ligation both sites disappear.
  • Example 2 The preparation of highly purified thermostable mutant luciferase L.type gris.
  • Cells are pelleted by centrifugation (5500 g, 10 min, 4 0 C). The precipitate is resuspended in 20 ml of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, containing 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, 0.5% Triton X-100. Cells are destroyed on an ultrasonic disperser. Cell walls and DNA are pelleted by centrifugation (39100 g, 30 min, 4 °) and discarded.
  • the supernatant solution (-20 ml) at 4 ° C is applied to a 1 ml Ni-IDA column (AmperSam, USA), washed with 20-40 ml of 20 mM sodium phosphate buffer solution containing 0.5 M NaCl, pH 7 , 5 and 20 mM imidazole.
  • the enzyme is eluted with the same buffer solution containing 300 mM imidazole.
  • thermostable recombinant luciferase in 20 mm sodium phosphate buffer solution containing 0.5 M NaCl, pH 7.5, 0.3 M imidazole, 2 mm ethylene diamine tetraacetate, 1 mm dithiothreitol, with an activity of 3000-6000 U / ml (200 U / mg protein).
  • the yield of the active enzyme is about 230 mg per 1 liter of culture medium.
  • concentration of luciferase in the resulting solution is 15-30 mg / ml.
  • Example 3 Preparation of a reagent for the determination of ATP based on highly purified thermostable mutant luciferase a. 0.1 ml of a concentrated solution of luciferase, obtained as described in example 2, in 20 mm sodium phosphate buffer solution containing 0.5 M NaCl, pH 7.5, 0.3 M imidazole, 2 mm sodium ethylene diamine tetraacetate, 1 mm dithiothreitol with an activity of 3000 U / ml, added to 49.9 ml of 0.05 M Tris- (oximethyl) -aminomethane acetate solution, pH 7.8, containing 0.5 mM luciferin, 10 mM magnesium sulfate, 1 mM sodium ethylene diamine tetra acetate, 0.5 mm dithiothreitol, 5 mg / ml bovine serum albumin, 90 mg / ml sucrose, mix thoroughly, filter under sterile conditions (under a la
  • Example 4 The method for determining ATP
  • 0.05 ml of the reagent obtained as described in example 3 is introduced into a cylindrical microcuvette with a volume of 0.2 ml and a diameter of 7 mm
  • the cuvette is placed in the cuvette compartment of the LUM-1 luminometer and a background signal is recorded, which, as a rule, is equal to or less than 50 conventional units.
  • 0.05 ml of a known ATP solution is added.
  • the solution is rapidly mixed and the intensity of bioluminescence (I) is recorded.
  • the difference between the measured bioluminescence intensity (I) and the background signal is a value that characterizes the bioluminescence intensity of the measured ATP solution and is proportional to the concentration of ATP in the luminometer cuvette.
  • the procedure is repeated for solutions with different concentrations of ATP.
  • the concentration of ATP in an unknown sample is determined by the intensity of bioluminescence recorded for an unknown sample, as described above.
  • the numerical value of the ATP concentration is found using equation (1).
  • a comparison of equations (1) obtained for the reagents prepared according to Example 3 and 36 shows that the values of the coefficients in both equations coincide within the measurement error.
  • the detection limit of ATP using the reagent obtained in Example 3a is 9.6-10 "14 M, and when using the reagent obtained in Example 36, it is 8.2-10 " 14 M. Therefore, despite the difference in the composition of the reagents and in the activity of luciferase used to obtain them, both reagents allow you to determine the concentration of ATP in the range from 10 "13 to 5x10 " 9 mol / L.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Реагент для количественного определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa (АТФ) биолюминесцентным методом содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, содержащих плазмиду pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Lисiоlа тingrеliса, кодирующим (по сравнению с исходным ферментом, SEQ1) аминокислотную последовательность фермента с восемью заменами (CepП 8Циc, Циc146Cep, Лиз156Apг, Apг211Лeй, Tpe213Cep, Aлa217Baл, Глy356Лиз, Cep364Циc), дополнительной последовательностью Мет-Ала-Сер-Лиз на N-конце и дополнительной последовательностью Сер-Глу-Про-Вал-Глу-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис на С-конце вместо последовательности Ала- Лиз-Мет (SEQ 2), люциферин, сульфат магния, смесь тpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaнa и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этиленаминотетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и сахарозы в качестве стабилизаторов и воду. При определении aдeнoзин-5'- трифосфата реагент обеспечивает повышение чувствительности определения АТФ за счет увеличения удельной активности и термостабильности мутантной люциферазы. Снижение себестоимости реагента обеспечивается за счет использования вместо трегалозы более доступного стабилизатора - сахарозы, а также за счет повышения производительности процесса получения реагента путем увеличения выхода активного фермента при наращивании биомассы, повышения концентрации люциферазы в получаемом препарате фермента и снижения трудоемкости и длительности процесса очистки фермента.

Description

РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ AДEHOЗИH-5'-TPИФOCФATA
Настоящее изобретение относится к области биохимии, а именно, к составу реагента для количественного определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.
Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, пропорциональна концентрации АТФ. При работе с растворами АТФ в широком интервале концентраций (нескольких порядков) градуировочную зависимость представляют в логарифмических координатах. Зависимость логарифма интенсивности биолюминесценции от логарифма концентрации АТФ описывается линейным уравнением:
Ig(I, ycл.eд.) = a + b-lg[ATФ, моль/л J, (1), где [АТФ, моль/л]- концентрация АТФ в кювете люминометра,
(I, ycл.eд.) - интенсивность биолюминесценции в условных единицах, регистрируемая на люминометре, а и b - коэффициенты уравнения (1).
Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицинской диагностике, в контроле микробных загрязнений различных продуктов и окружающей среды. На основе этого метода разработаны методики «быcтpoй микробиологии » для контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и других напитков, для оценки стерильности оборудования и материалов в особо чистых помещениях (Угарова H. H., 1993, Прикладная биохимия и микробиология, т.29, JNi- 2, с. 180-191).
Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ N° 2268944, 2004, (Угарова H. H., Малошенок Л. Г. ((Реагент для определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa»), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa, включающий растворимую люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, содержащих плазмиду рLR с нативным геном люциферазы светляков Lисiоlа miпgrеliса с удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка), сульфат магния, смесь трис- (oкcимeтил)-aминoмeтaнa и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и трегалозы в качестве стабилизаторов и воду, при следующем соотношении компонентов, мac.%:
Люцифераза 0,001 - 0,01 Люциферин 0,014 - 0,028
Сульфат магния 0,5 - 0,75
Tpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн 2,4 - 4,8
Уксусная кислота 0,1 - 0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия 0, 15 - 0,22
Дитиотреитол 0,04 - 0,08
Бычий сывороточный альбумин 2 - 5
D-(+)-тpeгaлoзa 10 - 20
Вода Остальное
Недостатком прототипа является недостаточно высокая каталитическая активность нативной рекомбинантной люциферазы светляков L. тiпgrеliса, которая используется для получения АТФ-реаrента. Недостатком прототипа является также невысокий выход активного фермента при наращивании биомассы в штамме E. соli LE392, трансформированном плазмидой рLR, кодирующей нативную люциферазу светляков Lисiоlа тiпgrеliса, - 40 - 60 мг люциферазы с 1 л культуральной среды. Существенным недостатком прототипа является длительность процесса многостадийной очистки фермента с помощью ионо-обменной и распределительной хроматографии, которая составляет более трех суток и позволяет получать разбавленные растворы фермента с концентрацией не выше 1-2 мг/мл и удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка). Существенным недостатком прототипа является невысокая термостабильность нативной рекомбинантной люциферазы, что приводит к заметному уменьшению активности люциферазы в процессе выделения и длительной очистки фермента. Кроме того, использование в качестве одного из стабилизаторов трегалозы значительно увеличивает стоимость целевого продукта.
Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности определения АТФ, снижение расхода фермента за счет увеличения удельной активности реагента и повышения термостабильности люциферазы. Задачей настоящего изобретения является также снижение себестоимости реагента за счет использования вместо трегалозы более доступного стабилизатора - сахарозы, а также за счет повышения производительности процесса получения реагента путем увеличения выхода активного фермента при наращивании биомассы и повышения концентрации люциферазы в получаемом препарате фермента и, наконец, за счет снижения трудоемкости и длительности процесса очистки фермента. Для решения поставленной задачи предлагается реагент для определения АТФ, включающий мутантную термостабильную люциферазу светляков Lисiоlа тiпgrеliса с удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка), выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, трансформированных плазмидой pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса, люциферин, сульфат магния, смесь трис- (oкcимeтил)-aминoмeтaнa и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и сахарозы в качестве стабилизатора и воду.
В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент содержит менее концентрированный буферный раствор и меньшую концентрацию ряда других компонентов (этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол и бычий сывороточный альбумин), а также вместо трегалозы содержит сахарозу. Использование менее концентрированного раствора и сахарозы для приготовления реагента существенно снижает себестоимость реагента, что является дополнительным преимуществом предлагаемого изобретения.
В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент включает мутантную люциферазу светляков Lисiоlа тiпgrеliса, которую выделяют из рекомбинантных клеток Е.соli, трансформированных плазмидой pETL7. Получение плазмиды pETL7 проводят методом случайного мутагенеза плазмиды рLRЗ (SCQ 1) (Кокшаров M. И., Угарова H. H., 2008, Биохимия, т.73, с.1071 -1080) с помощью полимеразной цепной реакции пониженной точности (Сiriпо P. С, Мауеr К., Umeno D., 2003, Меthоds MoI Вiоl, v. 231, р. 3-9), как описано в примере 1. В плазмиде pETL7 по сайтам рестрикции Nhеl и AfIII встроена кДНК, кодирующая ген мутантной люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса с 8 заменами в аминокислотной последовательности фермента (CepИ8Циc, ЦисНбСер, Лизl56Apг, Apг211Лeй, Tpe213Cep, Aлa217Baл, Глy356Лиз, Cep364Циc), дополнительной последовательностью Мет-Ала-Сер-Лиз на N- конце и последовательностью Сер-Гли-Про-Вал-Глу-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис на С-конце вместо последовательности Ала-Лиз-Мет (SCQ 2). Получение штамма Е.соli, трасформированного плазмидой pETL7, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы методом металло-хелатной хроматографии проводят, как описано в примере 2. В результате получают раствор высокоочищенной мутантной люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса с концентрацией активного фермента 15-30 мг/мл, удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка), термостабильность которого превышает термостабильность исходного фермента в 65 раз при 42°C. Данный препарат люциферазы используют для приготовления реагента. Согласно изобретению реагент для определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa (АТФ) содержит растворимую рекомбинантную мутантную, высокоочищенную, высокоактивную и высокостабильную люциферазу Lисiоlа тiпgrеliса, выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, содержащих плазмиду с мутантным геном люциферазы светляков, люциферин, сульфат магния, смесь тpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaнa и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этиленаминотетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и сахарозы в качестве стабилизаторов и воду, при следующем соотношении компонентов, мac.%:
Люцифераза 0,003-0,006
Люциферин 0,014 - 0,028
Tpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн 0,605 - 1,210
Сульфат магния 0,246 - 0,492
Уксусная кислота 0, 10 - 0,20
Этилендиаминтетраацетат натрия 0,038 - 0,076
Дитиотреитол 0,008 - 0,016
Бычий сывороточный альбумин 0,5 -1,0
Сахароза 9,0 - 18,0
Вода Остальное
Повышение активности реагента для определения АТФ с помощью предлагаемого реагента достигается за счет увеличения удельной активности мутантной люциферазы, используемой для получения реагента. В случае прототипа удельная активность люциферазы составляет 10-50 Е/мг белка, а активность реагента составляет 0,5-5,0 Е/мл. С использованием по данному изобретению мутантной люциферазы с удельной активностью 200 Е/мг получают реагент с активностью 6,0 - 12,0 Е/мл. Для реагента по данному изобретению чувствительность определения АТФ повышается в ~ 10 раз: предел определения снижается от ~10"12 M АТФ (по прототипу) до ~10"13 M АТФ (по данному изобретению). При этом сокращается расход фермента: по прототипу реагент содержит до 0,01 мac.% люциферазы, а предлагаемый реагент содержит до 0,006 мac.% люциферазы. Повышение термостабильности люциферазы достигается за счет использования плазмиды pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса, кодирующим восемь замен в аминокислотной последовательности фермента, введение которых приводит к повышению стабильности люциферазы при 42°C в 65 раз.
Увеличение выхода активного фермента достигается за счет использования плазмиды pETL7 и клеток E. соli BL21(DEЗ)CodonPlus для наращивания биомассы, что позволяет получать до 230 мг активной люциферазы с 1 л культуральной среды, в то время как по прототипу выход активной люциферазы не превышает 60 мг/л. Снижение трудоемкости и сокращение длительности процесса очистки фермента достигается за счет использования плазмиды pETL7, кодирующей фермент с шестигистидиновой последовательностью на С-конце. Это позволяет проводить быструю очистку фермента с помощью металло-хелатной хроматографии и тем самым сокращать длительность очистки с трех суток (по прототипу) до 4-х часов по данному изобретению и получать раствор фермента с концентрацией 15-30 мг/мл (3000-6000 Е/мл).
Реагент для определения АТФ получают добавлением концентрированного раствора высокоочищенной мутантной люциферазы к трис-ацетатному буферному раствору, рН 7,8, содержащему люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и сахарозу. После тщательного перемешивания раствор фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью фермента 6,0 - 12,0 Е/мл.
Изобретение поясняется следующими примерами. Пример 1. Получение плазмиды pETL7.
Плазмиду pETL7, содержащую ген мутантной термостабильной люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса, получают случайным мутагенезом гена люциферазы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) пониженной точности. В качестве исходной используют плазмиду рLRЗ (фиг.l), содержащую ген люциферазы светляков L.тiпgrеliса с точечной заменой Серl lδЦис. Плазмида рLRЗ была описана ранее (Кокшаров M. И., Угарова H.H., 2008, Биохимия, т.73, с.1071-1080). Затем мутантный ген люциферазы из мутантной плазмиды рLRЗ (фиг.2) клонируют в плазмиду pET23b (фиг.З).
Ia. Получение плазмиды рLRЗ с мутантным геном термостабильной люциферазы светляков L.тiпgrеliса. Плазмиду рLRЗ (фиг. l) выделяют из клеток E. соli (штамм XLl- bluе) с помощью набора реактивов фирмы Кайджен и используют в экспериментах по случайному мутагенезу участков гена NhеΙ-ВgШ (1-1180 пар оснований) и ХhоI-ВgШ (395-1 180 пар оснований), который проводят в четыре цикла.
В первом цикле проводят амплификацию участка гена люциферазы между сайтами рестрикции NhеΙ-АаtП (-1800 пар оснований), используя прямой праймер Nhеl (АТТАТАGGАGGСТАGСААААТGG) И обратный праймер АаtП
(ТGССАССТGАСGТСТАА). При проведении ПЦР 50 мкл реакционной смеси содержат 10 мМ Тris-НСl, рН 8.3, 50 мМ KCl, 7 мМ MgCl2, 0,15 мМ MnCl2, 0,2 мМ dАТР, 0,2 мМ dGТР, 1 мМ dСТР, 1 мМ dТТР, 20 пмоль каждого праймера, ~2 фмоль плазмиды рLRЗ, 2,5 ед. Таq ДНК-полимеразы. ПЦР проводят на амплификаторе Терцик («ДHK-тexнoлoгия», Россия) при следующем температурном режиме: инкубирование 1 мин при 95°C, далее 25 циклов инкубирования смеси: 1 мин при 94°C, 1 мин при 53°C и 1 мин при 72°C и, наконец, инкубирование 10 мин при 720C. Продукт амплификации выделяют из геля с помощью набора реактивов фирмы Кайджен, вырезают фрагмент по сайтам NhеΙ-ВgШ, выделяют его из геля и лигируют в порезанную по этим же сайтам плазмиду рLRЗ, получая смесь плазмид, содержащих мутантные гены люциферазы. Штамм E. соli ХLlbluе трансформируют полученной смесью плазмид, и клетки рассеивают на чашки со средой LB с ампициллином. Чашки с колониями трансформированных клеток инкубируют в течение ночи при 37°C и регистрируют биолюминесценцию колоний iп vivо по методу, описанному в работе (Wооd K.V., DеLuса M., 1987, Апаl. Вiосhеm.. v. 16, р. 501-507): чашки заливают раствором 1 мМ люциферина в 0,1 M Nа-цитратном буфере (рН 5,0), встряхивают в темноте и фотографируют. Отбирают наиболее яркую колонию, экспрессирующую наиболее стабильный мутантный фермент ITMl, которую используют в следующем цикле мутагенеза.
Во втором-четвертом циклах проводят случайный мутагенез участка гена Хhоl- BgIII. С помощью ПЦР амплифицируют участок ХhоI-АflП (-1240 пар оснований), используя в качестве прямого праймера Хhоl (GТАТТСАGСТСGАGААААGGСТТАСС) и в качестве обратного праймера AfI II (GСТТGТGGТТТСТТААGААТТТСТСТ AATTAC). Реакционная смесь имеет тот же состав, что указан для первого цикла мутагенеза, за исключением концентрации Mn2+, которая составляет 0,25 мМ. Из амплифицированного фрагмента вырезают участок ХhоI-ВgШ (395-1180 пар оснований) и клонируют его в плазмиду рLRЗ (фиг.2).
Чашки с колониями трансформированных клеток инкубируют в течение ночи при 37°C, затем в течение 40 мин - при повышенной температуре для инактивации iп vivо недостаточно стабильных форм люциферазы (во втором и третьем цикле - при 50°C, в четвертом - при 550C). В каждом последующем цикле в качестве исходной матрицы используют наиболее стабильный мутант, полученный в предыдущем цикле. После 4-го цикла получают мутант 4TS, колонии которого сохраняют заметное свечение даже после инкубирования в течение 20 мин при 600C. Секвенированием полученного мутантного гена 4TS устанавливают наличие восьми мутаций, кодирующих следующие аминокислотные замены: Серl lδЦис, Циcl46Cep, Лизl56Apг, Apr211Лeй, Tpe213Cep, Aлa217Baл, Глy356Лиз, Cep364Циc.
16. Конструирование плазмиды pETL7 (фиг.З). С помощью ПЦР получают фрагмент ДНК, в котором изменены три последние аминокислотные остатки люциферазы и без разрыва рамки считывания добавлен сайт рестриктазы SaII. Реакционная смесь в ПЦР (50 мкл) содержит 60 мМ Тгis-НСl, рН 8.5, 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ β- меркаптоэтанол, 0,1 % Тритон X-IOO, 0,1 мМ dАТР, 0,1 мМ dGТР, 0,1 мМ dСТР, 0,1 мМ dТТР, 20 пмоль обратного мутагенного праймера СtеrmНТ
(GТGGТСGАСТGGGСССGFТТGТGGТТТСТТFFGААТТТС) И 20 пмоль прямого праймера Хhоl (GTATTC АGСТСGАGААААGGСТТ ACC), -50 нг плазмиды рLRЗ, содержащей мутантный ген 4TS, 1,25 ед. ТаqSЕ ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе Терцик (« ДНК-техно л oгия», Россия) при следующем температурном режиме: инкубирование 1 мин при 950C, далее 25 циклов инкубирования смеси: 1 мин при 94°C, 1 мин при 47°C и 2 мин при 72°C и, наконец, инкубирование 10 мин при 72°C.
Полученный фрагмент гена люциферазы Хhоl-Sаll, кодирующий последовательность СерГлиПроВалГлуГисГисГисГисГисГис на С-конце фермента, очищают с помощью электрофореза и выделяют из геля. Рестрикцией фрагмента гена Хhоl-Sаll по сайту ВаmНI получают фрагмент ВаmНI-SаlI, который кодирует люциферазу с 225-го аминокислотного остатка до конца. Полученный фрагмент очищают с помощью электрофореза и затем выделяют из геля. В вектор pET23b, разрезанный по сайтам Nhеl и Хhоl, лигируют фрагмент NhеΙ-ВаmНI, вырезанный из плазмиды рLRЗ, который кодирует 1-225 аминокислотные остатки люциферазы, и фрагмент ВаmНI-SаlI, описанный выше. Липкие концы сайтов SaII и Хhоl совместимы, и после лигирования оба сайта исчезают.
Получение компетентных клеток E. соli BL21(DEЗ)CodonPlus и трансформацию клеток E. соli BL21(DEЗ)CodonPlus плазмидой pETL7, проводят по известным методикам, описанным в (Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. 1988, M., Мир).
Пример 2. Приготовление высокоочищенной термостабильной мутантной люциферазы L.тiпgrеliса.
Термостабильную мутантную люциферазу получают культивированием клеток E. соli BL21(DEЗ)CodonPlus, содержащих плазмиду pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков L.тiпgrеliса. Клетки выращивают в 200 мл среды, содержащей 1% бакто- триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, рН 7.0, 0,5 % глицерин, 0,05% глюкозу, 0,2% моногидрат лактозы, 0,1 мг/мл ампициллин, при инкубировании на качалке ~2 ч при 37°C, 180 об/мин до A6Oo=O,2÷O,8, затем 14-16 ч при 23°C до A6oo=5÷8. Клетки осаждают центрифугированием (5500 g, 10 мин, 40C). Осадок ресуспендируют в 20 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5% Тритон X-100. Клетки разрушают на ультразвуковом диспергаторе. Клеточные стенки и ДНК осаждают центрифугированием (39100 g, 30 мин, 4°) и отбрасывают. Надосадочный раствор (-20 мл) при 4°C наносят на Ni-IDA колонку объемом 1 мл («Aмepшaм», США), промывают 20-40 мл 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, содержащего 0,5 M NaCl, рН 7,5 и 20 мМ имидазол. Фермент элюируют тем же буферным раствором, содержащим 300 мМ имидазол. В полученный раствор люциферазы (2-4 мл) добавляют 0,5 M этилендиаминтетраацетат натрия, рН 8,0, до концентрации 2 мМ, 1 M дитиотреитол в 10 мМ Nа-ацетатном буфере, рН 5,2 до концентрации 1 мМ. В результате получают раствор высокоочищенной термостабильной рекомбинантной люциферазы в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,5 M NaCl, рН 7,5, 0,3 M имидазол, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, с активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка). Выход активного фермента составляет около 230 мг на 1 л культуральной среды. Концентрация люциферазы в полученном растворе составляет 15- 30 мг/мл.
Пример 3. Приготовление реагента для определения АТФ на основе высокоочищенной термостабильной мутантной люциферазы а. 0,1 мл концентрированного раствора люциферазы, полученной, как описано в примере 2, в 20 мМ натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,5 M NaCl, рН 7,5, 0,3 M имидазол, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол с активностью 3000 Е/мл, добавляют к 49,9 мл 0,05 M тpиc-(oкcимeтил)- аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 10 мМ сульфат магния, 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 0,5 мМ дитиотреитол, 5 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 90 мг/мл сахарозу, тщательно перемешивают, фильтруют в стерильных условиях (под ламинаром) через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 2,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют 2,0 мл деионизованной стерильной воды и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 6 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мac.%:
Люцифераза 0,003
Люциферин 0,014
Tpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн 0,605 Сульфат магния 0,246
Уксусная кислота 0,10
Этилендиаминтетраацетат натрия 0,038
Дитиотреитол 0,008
Бычий сывороточный альбумин 0,5
Сахароза 9,0
Вода Остальное б. Все операции проводят, как описано в примере За, но используют концентрированный раствор люциферазы с активностью 6000 Е/мл и 49,9 мл 0,1 M трис- (oкcимeтил)-aминoмeтaнaцeтaтнoгo буферного раствора, рН 7,8, содержащего 1,0 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 180 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 12,0 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мac.%:
Люцифераза 0,006
Люциферин 0,028
Tpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн 1,210
Сульфат магния 0,492
Уксусная кислота 0,20
Этилендиаминтетраацетат натрия 0,076
Дитиотреитол 0,016
Бычий сывороточный альбумин 1 ,0
Сахароза 18,0
Вода Остальное
Пример 4. Методика определения АТФ
0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 3, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра ЛЮM-1 и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен или менее 50 усл.ед. Затем вводят 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции (I). Разность между измеренной интенсивностью биолюминесценции (I) и фоновым сигналом является величиной, которая характеризует интенсивность биолюминесценции измеряемого раствора АТФ и пропорциональна концентрации АТФ в кювете люминометра. Процедуру повторяют для растворов с различными концентрациями АТФ. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру За-Зб, показаны в таблице 1. Зависимость логарифма интенсивности биолюминесценции от логарифма концентрации АТФ описывается уравнением (1). Для реагента, получаемого по примеру За, эта зависимость описывается уравнением:
Ig[I, ycл.eд.] = 13,494 +0,9307 igfАТФ, моль/л] с величиной R2 = 0,9946. Для реагента, получаемого по примеру 36, эта зависимость описывается уравнением:
Ig[I, ycл.eд.J = 13,259 +0,8983 lg[ATФ, моль/л] с величиной R2 = 0,9943.
Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше. Численное значение концентрации АТФ находят, используя уравнение (1). Сравнение уравнений (1), полученных для реагентов, приготовленных по примеру За и 36, показывает, что величины коэффициентов в обоих уравнениях в пределах ошибки измерений совпадают. Предел обнаружения АТФ с использованием реагента, полученного по примеру За, составляет 9,6- 10"14 M, а при работе с использованием реагента, полученного по примеру 36, составляет 8,2-10"14 M. Следовательно, несмотря на различие в составе реагентов и в активности люциферазы, используемой для их получения, оба реагента позволяют определять концентрацию АТФ в интервале от 10"13 до 5x10"9 моль/л.
Таблица 1. Результаты измерения концентрации АТФ с использованием реагента, полученного по примерам За - 36
Figure imgf000013_0001

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Реагент для определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa, включающий люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, люциферин, сульфат магния, тpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн, уксусную кислоту, этиленаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, отличающийся тем, что он содержит сахарозу в качестве стабилизатора и люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е.соli, трансформированных плазмидой pETL7 с мутантным геном люциферазы светляков Lисiоlа тiпgrеliса, кодирующим (по сравнению с исходным ферментом, SEQl) аминокислотную последовательность фермента с восемью заменами (CepП8Циc, Циcl46Cep, Лизl56Apг, Apг21 1Лeй, Tpe213Cep, Aлa217Baл, Глy356Лиз, Cep364Циc), дополнительной последовательностью Мет-Ала-Сер-Лиз на N-конце и дополнительной последовательностью Сер-Глу-Про-Вал-Глу-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис-Гис на С-конце вместо последовательности Ала-Лиз-Мет (SEQ 2), при следующем соотношении компонентов, мac.%:
Люцифераза 0,003 - 0,006;
Люциферин 0,014 - 0,028;
Tpиc-(oкcимeтил)-aминoмeтaн 0,605 - 1,210;
Сульфат магния 0,246 - 0,492;
Уксусная кислота 0,10 - 0,20;
Этилендиаминтетраацетат натрия 0,038 - 0,076;
Дитиотреитол 0,008 - 0,016;
Бычий сывороточный альбумин 0,5 - 1,0;
Сахароза 9,0 - 18,0;
Вода Остальное.
2. Реагент для определения aдeнoзин-5'-тpифocфaтa по пункту 1, отличающийся тем, что он содержит мутантную люциферазу светляков Lисiоlа тiпgrеliса с удельной активностью 3000-6000 Е/мл (200 Е/мг белка).
PCT/RU2010/000254 2009-05-20 2010-05-20 Реагент для определения aдehoзиh-5'-tpифocфata WO2010134850A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009118840/10A RU2420594C2 (ru) 2009-05-20 2009-05-20 Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2009118840 2009-05-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010134850A1 true WO2010134850A1 (ru) 2010-11-25

Family

ID=43126361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000254 WO2010134850A1 (ru) 2009-05-20 2010-05-20 Реагент для определения aдehoзиh-5'-tpифocфata

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2420594C2 (ru)
WO (1) WO2010134850A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607347A (zh) * 2019-10-30 2019-12-24 浙江东鸿生物科技有限公司 Atp荧光检测试剂

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2654672C1 (ru) * 2017-06-21 2018-05-21 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет" Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата
RU2731415C2 (ru) * 2018-12-17 2020-09-02 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Способ получения альфа-фетопротеина, иммобилизованного на ПЭТ-микрочастицах

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2164241C2 (ru) * 1999-04-22 2001-03-20 Дементьева Екатерина Игоревна Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268944C2 (ru) * 2004-02-11 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
WO2007029747A1 (ja) * 2005-09-06 2007-03-15 Bioenex Inc. 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2164241C2 (ru) * 1999-04-22 2001-03-20 Дементьева Екатерина Игоревна Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268944C2 (ru) * 2004-02-11 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
WO2007029747A1 (ja) * 2005-09-06 2007-03-15 Bioenex Inc. 変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607347A (zh) * 2019-10-30 2019-12-24 浙江东鸿生物科技有限公司 Atp荧光检测试剂

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009118840A (ru) 2010-11-27
RU2420594C2 (ru) 2011-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4275715B2 (ja) 改良されたａｔｐ検出法
EP1281762B1 (en) Luciferases
US6171808B1 (en) Mutant luciferases
JP5090304B2 (ja) 突然変異体ルシフェラーゼ
CN113061591B (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
JP2007330270A6 (ja) 改良されたａｔｐ検出法
CA2891285C (en) Novel glucose oxidases derived from aspergillus niger
JP6493316B2 (ja) 変異型甲虫ルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法
JPH11239493A (ja) ルシフェラーゼおよびそれを用いる細胞内ａｔｐの測定法
WO2015099112A1 (ja) 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2011120559A (ja) ホタルルシフェラーゼ、その遺伝子、およびホタルルシフェラーゼの製造法
WO2017195765A1 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP5188771B2 (ja) 変異型ホタルルシフェラーゼ
RU2420594C2 (ru) Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
KR20180105772A (ko) 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제
CN116555204A (zh) 一种性能提升的突变荧光素酶及其应用
WO2016076364A1 (ja) 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2019081620A1 (en) IMPROVED MODIFIED / MUTANT BACTERIAL LUCIFERASES
Zhang et al. RecQ helicase-catalyzed DNA unwinding detected by fluorescence resonance energy transfer
CN110358807A (zh) 果糖基赖氨酸的测定方法
RU2268944C2 (ru) Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2210594C2 (ru) Мутантная люцифераза (варианты), днк, кодирующая указанную люциферазу, и вектор для экспрессии указанного белка
Koksharov et al. Increased thermal stability of luciferase of lighting beetles Luciola mingrelica by random mutagenesis
KR101076066B1 (ko) 신규한 베타-아가라제 및 그 용도
RU2418072C1 (ru) Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10778002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10778002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1