RU2268943C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата - Google Patents
Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2268943C2 RU2268943C2 RU2004104777/13A RU2004104777A RU2268943C2 RU 2268943 C2 RU2268943 C2 RU 2268943C2 RU 2004104777/13 A RU2004104777/13 A RU 2004104777/13A RU 2004104777 A RU2004104777 A RU 2004104777A RU 2268943 C2 RU2268943 C2 RU 2268943C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reagent
- atp
- tris
- luciferase
- magnesium sulfate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине, экологии, фармацевтике и пищевой промышленности. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата представляет собой водный раствор люциферазы светляков, содержащий люциферин, сульфат магния, трис(оксиметиламинометан), уксусную кислоту, этилендиаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и стабилизатор, выбранный из группы, включающей полибрен, поливинилпирролидон, N-фталилхитозан и сахарозу. Применение изобретения позволяет повысить точность и воспроизводимость определения АТФ. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Description
Изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.
Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, прямо пропорциональна концентрации АТФ. Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицине, промышленности и экологии. С использованием реагента для определения аденозин-5'-трифосфата разработаны методики быстрого контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и напитков. Расчеты показывают, что потребности в определении АТФ для этих целей могут достигать миллионов определений в год, если стоимость реагента будет достаточно низкой, а активность и стабильность реагента будут достаточно высокими.
Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ №2164241, 1999, (Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата"), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза иммобилизованная | 0,05-0,20 |
| Люциферин | 0,014-0,056 |
| Сульфат магния | 0,2-0,3 |
| Трис-(оксиметил)-аминометан | 0,12-0,60 |
| Уксусная кислота | 0,01-0,60 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,04-0,08 |
| Дитиотреитол | 0,05-0,10 |
| Бычий сывороточный альбумин | 0,05-0,20 |
| D-(+)-трегалоза | 5,0-20,0 |
| Вода | Остальное |
Недостатком прототипа является невысокая каталитическая активность иммобилизованной люциферазы, поскольку при иммобилизации теряется около 80% активности фермента, что делает необходимым использовать для анализа АТФ относительно высокие количества реагента и тем самым увеличивает расход реагента для определения АТФ. Недостатком прототипа также является неоднородность суспензии иммобилизованной люциферазы, что приводит к довольно высокой погрешности результатов при определении ультрамалых концентраций АТФ. Недостатком прототипа является, кроме того, и то, что иммобилизация усложняет процедуру получения реагента, при этом используют дорогостоящий импортный носитель, а в качестве одного из дополнительных стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы.
Задачей настоящего изобретения является повышение активности реагента для определения АТФ, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ, снижение расхода фермента для получения реагента, упрощение процедуры приготовления реагента, а также использование более доступных и эффективных дополнительных стабилизаторов.
Для решения поставленной задачи предлагаются реагенты для определения АТФ, включающие 0,001-0,01 мас.% растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис-(оксиметил)-аминометана, 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминтетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, воду, а также дополнительный стабилизатор в количестве, эффективном для стабилизации композиции, в качестве которого используют или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%.
Преимуществом предлагаемых реагентов является снижение расхода фермента при приготовлении, повышение активности, упрощение процедуры получения реагентов, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ и использование в качестве дополнительных стабилизаторов более доступных по сравнению с трегалозой веществ.
Получение плазмид, штаммов E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы проводят по методу, описанному в прототипе. Реагенты получают добавлением к концентрированному раствору люциферазы, содержащему 20-100 Е/мл активного фермента, определенного объема трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, и в качестве дополнительного стабилизатора - или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%. После тщательного перемешивания раствор в стерильных условиях фильтруют через бактериальный фильтр, разливают во флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5-5 Е/мл.
Изобретение поясняется следующими примерами, которые имеют иллюстративный, но не ограничительный характер.
Пример 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы святляков
а. К 1 мл раствора люциферазы, полученной, как описано в прототипе, с активностью 20 Е/мл в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, добавляют 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 0,002 мг/мл полибрен, тщательно перемешивают, фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон с лиофилизованным реагентом добавляют 1,0 мл деионизованной стерильной воды. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,001 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис(оксиметил аминометан) | 4,8 |
| Уксусная кислота | 0,2 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 1,0 |
| Полибрен | 0,0002 |
| Вода | Остальное |
б. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл полибрен. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,001 |
| Люциферин | 0,028 |
| Сульфат магния | 0,75 |
| Трис(оксиметил аминометан) | 4,8 |
| Уксусная кислота | 0,2 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,22 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 |
| Полибрен | 0,02 |
| Вода | Остальное |
в. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 1 мл раствора люциферазы с активностью 100 Е/мл и 19 мл 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,01 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис-(оксиметил аминометан) | 2,4 |
| Уксусная кислота | 0,1 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,08 |
| Бычий сывороточный альбумин | 1,0 |
| N-Фталил-хитозан | 0,02 |
| Вода | Остальное |
г. Все операции проводят, как описано в примере 1в, но для приготовления реагента используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 1 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,01 |
| Люциферин | 0,028 |
| Сульфат магния | 0,75 |
| Трис(оксиметиламинометан) | 4,8 |
| Уксусная кислота | 0,2 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,22 |
| Дитиотреитол | 0,08 |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 |
| N-Фталил-хитозан | 0,1 |
| Вода | Остальное |
д. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 5 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,001 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис(оксиметиламинометан) | 2,4 |
| Уксусная кислота | 0,1 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 1,0 |
| Поливинилпирролидон | 0,5 |
| Вода | Остальное |
е. Все операции проводят, как описано в примере 1д, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 10 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Люцифераза растворимая | 0,001 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис(оксиметиламинометан) | 2,4 |
| Уксусная кислота | 0,1 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 |
| Поливинилпирролидон | 1,0 |
| Вода | Остальное |
ж. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют люциферазу с активностью 50 Е/мл и 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 100 мг/мл сахарозу и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:
| Люцифераза растворимая | 0,005 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис(оксиметиламинометан) | 4,8 |
| Уксусная кислота | 0,2 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 1,0 |
| Сахароза | 10,0 |
| Вода | Остальное |
з. Все операции проводят, как описано в примере 1ж, но используют буферный раствор, содержащий 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 200 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:
| Люцифераза растворимая | 0,005 |
| Люциферин | 0,014 |
| Сульфат магния | 0,5 |
| Трис(оксиметиламинометан) | 4,8 |
| Уксусная кислота | 0,2 |
| Этилендиаминтетраацетат натрия | 0,15 |
| Дитиотреитол | 0,04 |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 |
| Сахароза | 20,0 |
| Вода | Остальное |
Пример 2. Методика измерения концентрации АТФ
0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 1, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен 0. Добавляют 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции. Операцию повторяют не менее двух раз. Измерения повторяют для растворов АТФ различной концентрации. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 1, показаны в таблице 1. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10-13 до 10-8 М. По полученным данным строят градуировочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше, используя градуировочный график. При работе с концентрациями АТФ от 10-11 Ми выше предпочтительнее использовать реагент, описанный в примерах 1д-1з, с концентрациями АТФ от 10-12 М и выше - реагент, описанный в примерах 1в и 1 г, а с концентрациями АТФ от 10-13 М и выше - реагент, описанный в примерах 1а и 1б.
Пример 3. Испытание стабильности реагента
Раствор реагента, приготовленного, как описано в примере 1, инкубируют при 20°С и через определенные интервалы времени отбирают пробу и определяют интенсивность биолюминесценции, как описано в примере 2, для раствора АТФ с фиксированной концентрацией. Из данных зависимости интенсивности биолюминесценции от длительности инкубации определяют полупериод инактивации реагента в растворе. Результаты приведены в таблице 2.
| Таблица 1 | ||||||||
| Результаты измерения концентрации АТФ с использованием реагента, полученного по примерам 1а-1з | ||||||||
| Концент- рация АТФ в кювете, М |
Интенсивность биолюминесценции, усл.ед. | |||||||
| Реагент по примеру 1а | Реагент по примеру 1б | Реагент по примеру 1в | Реагент по примеру 1 г | Реагент по примеру 1д | Реагент по примеру 1e | Реагент по примеру 1ж | Реагент по примеру 1з | |
| Активность люциферазы, Е/мл → | 0,5 | 0,5 | 5,0 | 5,0 | 0,5 | 0,5 | 1,25 | 1,25 |
| 1×10-8 | 5800 | 6615 | 10986 | 11662 | 2405 | 2544 | 4890 | 5060 |
| 5×10-9 | 3560 | 3570 | 4956 | 6156 | 1265 | 1538 | 2350 | 2421 |
| 1×10-9 | 1373 | 1374 | 1290 | 1190 | 269 | 401 | 468 | 455 |
| 5×10-10 | 894 | 1100 | 559 | 659 | 116 | 132 | 256 | 260 |
| 1×10-10 | 370 | 412 | 140 | 127 | 29 | 30 | 41 | 42 |
| 5×10-11 | 280 | 240 | 48 | 49 | 15 | 16 | 22 | 25 |
| 1×10-11 | 125 | 137 | 19 | 18 | 4 | 5 | 5 | 6 |
| 5×10-12 | 85 | 90 | 6 | 6 | 1 | 1 | 2 | 2,1 |
| 1×10-12 | 40 | 51 | 2 | 2 | ||||
| 1×10-12 | 9 | 10 | ||||||
| Таблица 2 | |
| Испытание стабильности реагента | |
| Реагент по способу | Полупериод инактивации, дни |
| Прототип | 2,0 |
| Реагент, предлагаемый по примерам: | |
| 1а-1б | 3,2 |
| 1в-1г | 2,5 |
| 1д-1е | 2,2 |
| 1ж-1з | 3,0 |
Claims (5)
1. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,0002-0,02% полибрена и воду.
2. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,5-1,00 мас.% поливинилпирролидона и воду.
3. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,02-0,1 мас.% N-фталилхитозана и воду.
4. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 10-20 мас.% сахарозы и воду.
5. Реагент по пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве люциферазы используют люциферазу, выделенную из клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004104777/13A RU2268943C2 (ru) | 2004-02-19 | 2004-02-19 | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004104777/13A RU2268943C2 (ru) | 2004-02-19 | 2004-02-19 | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004104777A RU2004104777A (ru) | 2005-07-27 |
| RU2268943C2 true RU2268943C2 (ru) | 2006-01-27 |
Family
ID=35843337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004104777/13A RU2268943C2 (ru) | 2004-02-19 | 2004-02-19 | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2268943C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2654672C1 (ru) * | 2017-06-21 | 2018-05-21 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет" | Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата |
-
2004
- 2004-02-19 RU RU2004104777/13A patent/RU2268943C2/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2654672C1 (ru) * | 2017-06-21 | 2018-05-21 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет" | Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004104777A (ru) | 2005-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eldred et al. | Transfer of amino acid from a transfer ribonucleic acid synthetase-aminoacyl adenylate complex to transfer ribonucleic acid | |
| EP0794260A1 (en) | Bioluminescence reagent and method for quantitative determination of adenosine phosphate ester using the reagent | |
| US20060246052A1 (en) | Means for stabilization of thrombin and compositions | |
| JP2539225B2 (ja) | グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法 | |
| US3778350A (en) | Diagnostic agent and method for determining glucose | |
| Dı́az et al. | Horseradish peroxidase sol–gel immobilized for chemiluminescence measurements of alkaline-phosphatase activity | |
| RU2268943C2 (ru) | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата | |
| JPH06125791A (ja) | 乳清及び乳清含有物質中の細菌数を測定するための方法及び分析キット | |
| Kelley et al. | Purification of an altered DNA polymerase from an E. coli strain with a pol mutation | |
| RU2420594C2 (ru) | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата | |
| US4629696A (en) | Process for the selective production of reduced oxygen species | |
| JP4542541B2 (ja) | 安定化コリンエステラーゼ基質溶液 | |
| Luzzana et al. | Milk lactose and lactulose determination by the differential pH technique | |
| Yagi et al. | Change of Absorption Spectrum of Flavin Adenine Dinucleotide byits Binding with both D-Amino Acid Oxidase Apo-Protein and Benzoate | |
| US3990946A (en) | Substrate for the determination of desoxy-ribonuclease | |
| Campanella et al. | Determination of inorganic phosphate in drug formulations and biological fluids using a plant tissue electrode | |
| RU2268944C2 (ru) | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата | |
| US4247633A (en) | Reagent for colorimetric determination of creative phosphokinase | |
| US3527331A (en) | Reagent for assaying aldolase | |
| Eggleston et al. | Permeability of Escherichia coli to ribose and ribose nucleotides | |
| RU2164241C2 (ru) | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата | |
| SU1041568A1 (ru) | Реагент дл определени аденозин-5-трифосфата | |
| Petkov et al. | Amidase Activity of Urokinase I. Hydrolysis of aN-Acetyl-L-Lysine p-Nitroanilide | |
| Jacobson et al. | Ouabain inhibition of adenosine triphosphatase in erythrocyte membranes from dystrophic hamsters | |
| Tian et al. | Study of refolding of calf intestinal alkaline phosphatase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060220 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20070219 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180220 |