CN103076412B - 非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法 - Google Patents
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Abstract
非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，记录不同条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。该方法优于以往研究膜蛋白转运功能的同位素示踪法，主要表现在其安全性，简便易行，以及成本低。
Description
技术领域
本发明涉及膜蛋白质功能判别技术领域，尤其涉及一类非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法。
背景技术
膜蛋白结构与功能的研究作为研究药物靶向性的基础对治疗疾病的发展是必不可少的。目前研究膜蛋白功能的普遍方法主要是以结构为基础的功能性研究，并且生物信息学技术作为核心方法被广泛的应用到对蛋白的结构以及功能方面进行预测。首先，通过在数据库中搜索目标蛋白的序列信息并且进行比对，包括同源序列，拓扑结构，功能团，进化，具体功能相关序列分析等。在预测结构的基础上，膜蛋白的功能研究还主要依赖各种现代生物物理仪器，包括质谱仪，核磁共振仪，X射线仪，红外/紫外/光散射光谱仪等。但是，由于膜蛋白不易于过表达，纯化甚至是结晶，再加上无法确保膜蛋白的天然构象，因此在其转运功能方面的研究还是面临很大的困难的。
目前已经有很多文献通过应用放射性元素示踪的方法报道和研究了相关膜蛋白的转运功能，主要的研究方法是利用脂质体结构的特性模拟细胞膜结构，将目的蛋白插入到脂质体结构的表面。首先用做好的带有转运蛋白的膜结构包裹放射性元素标记的底物。在该混合物的基础上添加放射性元素标记的底物交换物。允许转运反应发生一段时间后应用蛋白抑制剂停止膜蛋白上的转运活动。最后，通过比较同位素标记的底物以及被交换物与各自标准含量的差别从而判断蛋白转运的情况。
同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，其主要原理是利用核探测器随时追踪放射性同位素不断地放出的特征射线，从而示踪同位素在体内或体外的位置、数量及其转变等。目前应用比较广泛的是放射性同位素法。该方法的优点在于其灵敏度高，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点。稳定同位素因作为一种不释放射线的示踪剂，其灵敏度较低，可获得的种类少，而且价格较昂贵导致它的应用范围受到限制。就该方法的优点而言，膜蛋白上的转运活动的确能够准确的定位以及定量，但是，即便采取放射防护措施，放射性元素的对机体的损害也是难以避免的。操作者的损害程度与放射照射量，放射照射时间，以及放射射线种类都有直接关系。放射可以导致机体组织器官发生病变直至诱发癌变，并且会引发遗传缺陷。更重要的是放射性污物会污染环境进而影响他人的身体健康。除了健康隐患外，该方法不仅价格昂贵，操作需要的用量以及操作形式都需要谨慎。更重要的是该方法对实验环境的要求很高，需要在对周围环境没有污染的，严格密闭的条件下进行操作，并切配备先进的生物物理仪器。同位素失踪法已经为研究膜蛋白转运功能方面提供了不可小视的贡献，但是就该方法的推广性以及安全性而言，该方法也有它不可避免的弊端。
除了同位素示踪法，另外一种被广泛应用研究膜蛋白转运功能的方法是通过检测在线粒体上转运后的物质与其他胞内物质反应后的生成物从而判断是否转运的方法。例如研究腺甘酸转运体（ANT4）转运ATP/ADP的功能，通过添加不同浓度的ADP，并且在不同浓度条件下检测NADPH的生成而判断ATP的生成。该方法虽然在体外水平能够保持天然膜蛋白的功能，但是实验准备条件苛刻，耗时长，需要大量培养细菌并且以及提取新鲜的线粒体。
在大多数的哺乳动物细胞中，线粒体作为主要的ATP合成场所，通过线粒体内膜上的氧化磷酸化反应为胞质以及其他内源性器官提供能量。线粒体是是由外膜，内膜，膜间隙以及基质四个功能区构成的双模封闭的亚细胞器。内膜较外膜因含有高含量的蛋白质和心磷脂具有低通透性，并且其向内折叠的结构称作线粒体嵴，有关特异性分子运输，相关的氧化磷酸化反应以及ATP的合成都在内膜上发生。内膜仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和质子需要特殊的转运系统。由内膜包裹的基质较细胞质基质黏稠，主要含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质。大约95%的细胞生命活动是由线粒体支持的。它主要是在结合能量代谢和自由基代谢的基础上把氧化底物产生的自由能转化为细胞可以利用的ATP形式。线粒体基质中的三羧酸循环和脂肪酸β-氧化过程生成NADH，通过在线粒体内膜上的电子传递链进行氧化磷酸化。而胞浆中糖酵解生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下通过线粒体膜结构进入基质参与氧化呼吸链的反应。在合成ATP的过程中会产生少量活性氧自由基，这些氧化作用会导致膜转运孔道开放，使得外膜释放细胞色素C，自由基渗透到基质中损伤线粒体自身的DNA等。造成线粒体基质内的高渗透压，线粒体内外质子梯度消失，呼吸链脱偶联，从而使能量产生中断。同时，线粒体内的氧化应激对引起细胞凋亡起着决定性的作用，例如：外膜释放的细胞色素C可与凋亡因子结合形成凋亡体，内膜蛋白调控的紊乱以及胞浆钙水平升高均可引发细胞凋亡。线粒体还参与细胞中钙离子的缓冲。在其内膜电位的驱动下运输钙离子进入基质。当释放钙离子时产生的膜电位差能够激活一些第二信使系统蛋白协调诸如突触中神经递质的释放以及内分泌细胞中急速的分泌等。
ANT是线粒体内膜上一种含量丰富负责转运ADP和ATP的载体蛋白。它通过参与偶联线粒体内膜上的氧化磷酸化过程催化转运内膜上生成的ATP与胞质中ADP的交换。ANT不仅是一种能量转运，而且它也是参与凋亡诱导的双重功能蛋白。它是组成线粒体膜通透性转换孔复合物mitochondrial permeability–transition pore complex (PTPC)的主要组分，通过与Bcl2家族蛋白结合从而参与线粒体介导的细胞凋亡。ANT家族的蛋白共同包含一段能够识别并转运ATP和ADP的氨基酸序列RRRMMM。人类的ANT有四种异构体(ANT1, ANT2, ANT3 和 ANT4)，它们的表达是基于发育阶段，增殖状态，组织以及细胞类型的。已经有文献报道通过应用ANT抑制剂证明了ANT的确能够转运ATP/ADP。ANT3在所有组织中广泛表达，并且表达量是直接与氧化代谢水平向关联的。ANT1在包括骨骼肌，心脏，以及大脑这些终端分化组织中高度表达。另外，ANT2只在未分化的细胞或组织中特异性表达，例如淋巴，肾脏和肝脏。最近已有文献报道ANT参与上调激素依赖性的癌症。过表达ANT1 和3能够诱导细胞的凋亡，伴随膜电位降低，细胞色素C的释放，caspase被激活以及DNA降解。但是，ANT2缺乏这种特性。抑制ANT2的表达会导致细胞生长停滞以及线粒体膜电位升高。ANT4主要在肝脏，睾丸和脑组织中表达，该蛋白最早发现于哺乳动物以及雄性成年鼠的精细胞当中。并且它在鼠精原细胞无丝分裂过程中起着重要的作用。
脂质体背景及工作原理
脂质体是一种人造微囊结构，在疏水作用下它的疏水部分聚集在一起避开水相，而亲水部分磷脂分子则暴露于水相使之形成圆形封闭的磷脂单或双分子层式囊泡结构。脂质体大小一般在25到1000nm之间，可以根据其组成成分，结构，所带电荷以及性能分为好多种。脂质体被广泛的用于生物化学以及制药方面，根据其可以与细胞膜融合的特性，脂质体可以作为药物载体包裹小分子药物，蛋白质，核苷酸甚至是质粒，再通过设计需要将药物送到细胞内部。脂质体的组成主要是磷脂和胆固醇。天然磷脂以卵磷脂（PC）为主，主要来源于蛋黄和大豆。其他合成磷脂例如二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC等均属氢化磷脂类，具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点，是目前国外首选的辅料。胆固醇具有调节膜流动性的特点，与磷脂共同构成脂质体膜结构的基础。根据其应用的需要，脂质体可以被分为普通型，带电荷型，靶向型等。通过采用不同种类的磷脂分子以及一些亲脂衍生物从而对所需脂质体进行修饰和改造。
分子筛层析/凝胶渗透层析（G50，G75 resin column, HPLC仪）
凝胶过滤层析法是利用凝胶分子筛的特殊结构特点按照分子大小以及形状分离的方法。层析柱中填充的凝胶主要是多孔交联的聚糖，例如葡聚糖或琼脂糖。根据目标分子的大小可以选用特定型号的凝胶，例如：SephadexG-50, 属于葡聚糖凝胶，能够分离肽或球状蛋白分子量在1500到30000道尔顿之间。一般大分子物质先流出层析柱，小分子物质可以进入凝胶珠从而延缓了流出的速度。凝胶层析法的优点在于其操作条件温和，填充物吸附力弱属惰性载体，方便使用等。该方法区别于以下要介绍的高效液相色谱法（HPLC）法主要在于该方法的操作均是按照实验需要人工准备的小体积层析柱，并且是为下面应用HPLC仪分析做准备。
在凝胶分离层析原理的基础上，采用HPLC仪从而进一步分析转运混合物的成分以及含量，通过分析大分子物质相对分子质量的分布并且比对滞留时间确定样品成分，根据峰面积计算样品浓度。该方法的优点在于其高速，高效，高灵敏度，高自动化。并且已被广泛应用于分析生物学和医药学相关重要的分子物质，例如蛋白质，核酸，多糖类，高聚物，药物等。该方法的普遍工作过程首先是高压泵将储液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器储液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后记录仪将紫外或荧光检测器送出的信号记录从而得到液相色谱图。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，该方法优于以往研究膜蛋白转运功能的同位素示踪法，主要表现在其安全性，简便易行，以及成本低。
技术方案：非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，步骤为：
将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿，用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体；
将膜蛋白与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为：去污剂 10%wt TritonX-114：8%，100mg/mL超声制备的微脂体：14%，10mg/mL心磷脂：8%，0.3μg/μL 膜蛋白：13%，0.1m M 底物（ATP）： 1%，0.1M PIPES 缓冲液：9%， 超纯水： 47%；
将Amberlite XAD-2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；至少分三个时间点，用膜蛋白活性抑制剂：吡哆醛-5'-磷酸停止反应；
将样品添加到G50凝胶层析柱上，进行转运反应后脂蛋白体的纯化收集；
最后，将收取的脂蛋白体与乙醇以及氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层，取上层液400-600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC仪，应用HPLC仪分析得到在至少三个反应时间条件下ADP和ATP量的变化，在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。根据由HPLC可以得到在各个反应时间点的ATP 和ADP量化指标，进而可以得到它们各自在反应过程中升高或降低的趋势。
所述膜蛋白为腺嘌呤核苷酸转移酶4（ANT4）或解偶联蛋白UCP2。
所述三个反应时间为转运反应的5s、15s和30s。
有益效果：
1）、本发明用到的是天然大豆蛋黄卵磷脂，其成本低，易购买；
2）、本发明用的凝胶层析柱是人工制作，可重复性操作，内添树脂价格便宜；
3）、本发明对人身体无害，并且无污染，操作时间短，为直接在体外研究膜蛋白转运功能提供了捷径。
附图说明
图1为实施例1的HPLC图谱结果；
图2为pET-22b的质粒图谱；
图3为UCP2转运后的结果分析图。
具体实施方式
本发明是一种非放射性判别膜蛋白质转运的方法。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
1．ANT4蛋白质的过表达和提纯
转染pET-22b ANT4（野生型）质粒于大肠杆菌C41并扩增细胞提取ANT4。
1.1 ANT4蛋白质的表达与细菌扩增
克隆ANT4基因到pET-22b（图2）（Novagen公司）载体上后将携带有ANT4基因的质粒转染到大肠杆菌感受态C41（DE3）（Avidis公司）中进行表达。
重组质粒的构建：携带ANT4基因的pET-22b（图2）（Novagen公司）的载体构建方法参照文献：Comparative transcriptomic profile analysis of fed-batch cultures expressing different recombinant proteins in Escherichia coli，Ashish K Sharma, Shubhashree Mahalik, Chaitali Ghosh, Anuradha B Singh and Krishna J Mukherjee，AMB Express 2011, 1:33.
将构建好的携带有ANT4基因的质粒转染到大肠杆菌感受态C41（DE3）（Avidis公司）中进行表达。具体质粒转染以及细菌扩增步骤如下：
1）质粒转染
首先，将2-10μL pET-22b-ANT4质粒与50μL C41（DE3）菌液混合并且放置冰上30分钟；其次，将其转移到42 ℃水浴锅中置90秒后再转移至冰上5分钟；添加1mL 液体培养基并且混匀后在37 ℃恒温震动箱(250rpm)中培育15分钟到1个小时；3000g离心培育好的细胞后移走上清液，将余留的50-100μL的菌液涂于带有氨苄抗性的固体培养基平板表面后置37 ℃恒温培养箱中过夜培养；
2）大肠杆菌扩增
在固体培养基上挑取单个菌落于15mL无菌EP管中，并且添加按照1000:1的质量体积比混合的液体培养基(mL)和氨苄青霉素(mg)。在37℃恒温震荡培养箱中培养不超过12小时；重复该步骤一次，扩增用的菌液体积可根据个人需要选择不同体积的无菌管。
1.2 ANT4蛋白质提纯以及定量分析
1）扩增菌体直至吸光值在600nm时达到1时停止；3000g离心15分钟扩增后的细菌，用PBS（pH7.4）缓冲液悬浮沉淀；应用功率为130w/频率为20KHz的Sonics vibra-cell 3mm探头超声波仪在9KHz45%功率下操作细菌。每操作1分钟停歇30秒于冰上，以防止超声产热致使蛋白变性。该步骤持续大约30分钟；之后在10000g条件下离心10分钟后弃上清，并且在依次更换不同的缓冲液的条件下重复此步骤后最终得到包涵体（表格1）。
| TE缓冲液 | 洗涤2次 |
| 3%wtTritonX-114/1m M EDTA/10m M PIPES (pH7)缓冲液 | 洗涤2次 |
| 10m M PIPES/50m M NaCl (pH7)缓冲液 | 洗涤1次 |
表格1：ANT蛋白提纯过程中用到的三种缓冲液
将包涵体悬浮于1mL 1.8%wt Sarkosyl/0.1m M EDTA/ 10m M PIPES/1m M DTT 溶液中。放置37 ℃水浴锅中5分钟后，12000g离心10分钟，转移上清液约900μL于EP管中并且分装冻存于-20℃冰箱。
2）提纯ANT4蛋白的定量分析
使用BSA蛋白浓度测定试剂盒，分别制备浓度梯度BSA标准液和工作液。首先将工作液与待测样品按照20:1的体积比例混合约1分钟，在室温下放置30分钟后在波长为562nm条件下检测BSA标准液以及样品的吸光值。利用光谱仪上的软件画出BSA浓度标准曲线，并且参照标准曲线，根据所测蛋白质样品的矫正吸光值在标准曲线的线性范围内读出样品的蛋白浓度0.23μg/μL。
2 脂质体的制备
利用传统的薄膜摇振法，将100mg天然大豆蛋黄卵磷脂溶解于1mL氯仿，均匀混合后利用氮气将溶解的大豆蛋黄卵磷脂沿玻璃试管或瓶壁均匀吹干形成白色脂质薄层。然后用1mL超纯水再一次溶解贴壁的脂质膜，摇匀震荡使脂质在水溶液中自动形成多层脂双层之微脂体。利用微脂体破裂后可重新密合的特性，借用机械性力量，例如超声波震荡方法，130w的Sonics vibra-cell 3mm探头在7KHz 35%功率下对微脂体进行破裂重组处理，最终得到大小较均匀（100-1000nm）的单层微脂体。
3包裹底物的脂质体的筛选以及样品处理
3.1 脂蛋白体重组的制备以及底物的包裹：
按照以下表格中各个成分占总体积的比例依次添加并混匀（表格2）。其中，10%wt TritonX-114可嵌入于脂膜间隙稳定脂膜。心磷脂的添加可以降低膜脂的流动性进一步稳定膜脂结构。本方法对反应条件没有严格的要求，所有步骤均在室温下进行操作。
| 去污剂 10%wt TritonX-114 | 8 |
| 100mg/mL超声制备的微脂体 | 14 |
| 10mg/mL心磷脂 | 8 |
| 0.3μg/μL 膜蛋白质（ANT） | 13 |
| 0.1m M 底物（ATP） | 1 |
| 0.1M PIPES 缓冲液 | 9 |
| 超纯水 | 47 |
表格2：制备脂蛋白重组提所需配方
将制备好的脂蛋白体重组混合物与Amberlite XAD-2大孔树脂按照大约2:1体积比混合15分钟，之后再将脂蛋白重组体回收。该步骤主要用来初步去除脂蛋白重组体表面黏连的底物以及过量的去污剂。为了进一步得到脂蛋白重组体包裹底物的结构，将初步纯化的脂蛋白重组体加样于G75凝胶层析柱。由于脂蛋白重组混合液呈乳白色，流经凝胶层析柱比较容易辨别，因此，当近似乳白色液体流出柱体时收取液体400-600μL。分离的主要原理是脂蛋白重组体包裹底物后的分子量较其他不包裹的，以及包裹微量的重组体结构大，因此会在靠后的时间段流出来。
然后，把收集的包裹了底物ATP脂蛋白重组体分装于不同的除菌小管中，将底物交换物ADP与各分装的脂蛋白重组体按照1:10的体积比例混合进行转运反应。根据每个时间点（5s, 15s, 30s）应用膜蛋白转运抑制剂吡哆醛-5'-磷酸（PLP）终止转运反应。在此基础上，为了得到转运后包裹底物ATP和底物交换物ADP的脂蛋白重组体，将各个反应时间点的混合物加样于G50凝胶层析柱，析出液体按照每100μL体积收取。根据HPLC仪分析发现收取的第9组100μL体积是纯化的转运后脂蛋白体。
得到的转运后脂蛋白体需要进行进一步样品处理。利用有机溶剂能够溶解脂类分子的原理，将收取的100μL脂蛋白体与200μL乙醇以及600μL氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层。取上层液400-600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存。
4 HPLC分析ADP/ATP含量以及数据分析
为了检测转运后的脂微粒中包裹的ATP和ADP各自的含量，首先，分别将纯品ATP 和ADP（加样浓度与准备脂蛋白重组体时用的一样）加样于HPLC仪并且根据出锋时间（参照结果图1）进行样品个体确定。在此基础上，将各个反应时间点（5s, 15s, 30s）得到的分离物依次加样于HPLC仪从而得到ATP 和ADP的含量数据（表格3）。表格中的峰面积百分比值被用来表示ATP 和ADP的含量。
以下是应用HPLC仪分析得到的在三个反应时间条件下（5s，15s，30s）ADP和ATP量的变化图谱。通过对照纯品的出峰时间从而判定哪个是 ADP和ATP。在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，这代表其相关的量值（表格3）。
| 反应时间（s) | 保留时间min | 峰宽min | 峰面积mAU*S | 峰高mAU | 峰面积% | |
| 5s | ADP | 4.288 | 0.1208 | 256.95798 | 32.29251 | 91.683 |
| 15s | ATP | 3.531 | 0.0964 | 3.29651 | 5.17E-01 | 0.72 |
| ADP | 4.288 | 0.1192 | 432.67032 | 55.35801 | 94.5061 | |
| 30s | ATP | 3.515 | 0.1458 | 5.3919 | 4.92E-01 | 2.8491 |
| ADP | 4.191 | 0.1301 | 54.05866 | 6.92555 | 28.5643 |
表格3：HPLC数据
根据ADP，ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量。结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，如图1所示。从该图上可以看出，随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可推断，伴随反应时间的增长，在野生型ANT4蛋白质上，脂蛋白重组体中包裹的ATP逐渐外流的同时外界的ADP会进入脂蛋白体内。因此可以证明该野生型ANT4是可以转运ADP/ATP的。如果想进一步研究转运的动力学，可以反复实验，取多个反应时间点，从而对转运反应的饱和时间，动力学参数进行计算。
实施例2：
检测野生型解偶联蛋白UCP2是否有转运GTP和GDP的功能
该野生型UCP2的表达，纯化，以及在脂蛋白重组体中的应用均与野生型ANT4的操作方法相同。UCP2的转运功能研究是通过制备以GDP为底物的脂蛋白重组体，在此基础上添加GTP。最后通过HPLC仪分析转运后GDP 和GTP各自的含量从而推断UCP2的转运功能。以下是UCP2转运后的结果分析。从结果图（图3）可以看出，伴随转运反应时间的增长，GDP的含量逐渐减少到的同时GTP的含量相应的增加。由于该实验操作的是6个时间点，因此可以看出在UCP2上的转运主要是在5s到30s之间。30s之后转运反应达到饱和几乎不再有变化。
实施例3
非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，步骤为：将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿，用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体；将膜蛋白：腺嘌呤核苷酸转移酶4（ANT4）或解偶联蛋白UCP2与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为：去污剂 10%wt TritonX-114：8%，100mg/mL超声制备的微脂体：14%，10mg/mL心磷脂：8%，0.3μg/μL 膜蛋白：13%，0.1m M 底物（ATP）： 1%，0.1M PIPES 缓冲液：9%， 超纯水： 47%；将Amberlite XAD-2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；分三个时间点5s、15s和30s，用膜蛋白活性抑制剂：吡哆醛-5'-磷酸停止反应；将样品添加到G50凝胶层析柱上，进行转运反应后脂蛋白体的纯化收集；最后，将收取的脂蛋白体与乙醇以及氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层，取上层液400-600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC仪，应用HPLC仪分析得到在三个反应时间（5s、15s和30s）条件下ADP和ATP量的变化，在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。根据由HPLC可以得到在各个反应时间点的ATP 和ADP量化指标，进而可以得到它们各自在反应过程中升高或降低的趋势。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。
Claims (3)
1.非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于步骤为：
将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿，用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体；
将膜蛋白与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为：去污剂 10%wt TritonX-114：8%，100mg/mL超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体：14%，10mg/mL心磷脂：8%，0.3μg/μL 膜蛋白：13%，0.1m M 底物（ATP）： 1%，0.1M PIPES 缓冲液：9%， 超纯水： 47%；
将Amberlite XAD-2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；至少分三个时间点，用膜蛋白活性抑制剂：吡哆醛-5'-磷酸停止反应；
将样品添加到G50凝胶层析柱上，进行转运反应后脂蛋白体的纯化收集；
最后，将收取的脂蛋白体与乙醇以及氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层，取上层液400-600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC仪，应用HPLC仪分析得到在至少三个反应时间条件下ADP和ATP量的变化，在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。
2.根据权利要求1所述的非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于所述膜蛋白为腺嘌呤核苷酸转移酶4（ANT4）或解偶联蛋白UCP2。
3.根据权利要求1所述的非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于所述三个反应时间为转运反应的5s、15s和30s。
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| 模拟高原缺氧大鼠脑线粒体UCP活性与含量的变化及其对线粒体能量合成的影响;郜攀等;《第三军医大学学报》;20061130;第28卷(第21期);2127-2129 * |
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| 线粒体腺苷酸转运蛋白;王燕萍等;《细胞生物学杂志》;20051231;第27卷;273-276 * |
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