CN104450867A - 一种蛋白激酶的活性检测方法及其抑制剂筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。本发明所述RIP3蛋白激酶活性检测方法无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作。利用本发明所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法，能够高效特异地筛选RIP3蛋白激酶抑制剂，并发现索拉菲尼和威罗菲尼具有RIP3蛋白激酶抑制活性。本发明所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒具有特异性高，使用方法简便的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RIP3蛋白激酶的活性检测方法以及RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法。
背景技术
受体相互作用蛋白家族(receptor-interacting proteins，RIPs)是蛋白激酶家族的一个重要分支，其功能上具有特异的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶活性，属于Ser/Thr蛋白激酶家族。，目前用于蛋白激酶活性检测的方法主要包括以下几类：
1.基于抗原抗体原理的ELISA方法，通过用蛋白激酶底物包被多孔板板底，加入激酶及反应液反应后，分别用针对磷酸化底物的抗体（一抗）以及针对一抗的抗体（二抗）进行孵育，通过化学发光等方式检测激酶催化底物磷酸化的程度，从而评价其活性并用于抑制剂筛选。但受蛋白纯化程度以及底物自身磷酸化影响，无法排除非特异性磷酸化的干扰，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性。此外该方法价格昂贵、耗时长、操作步骤多，制约了化合物的高通量筛选。
2.放射性同位素标记法，蛋白激酶可催化P32标记的ATP反应从而将P32基团转移到底物对其进行标记，通过放射自显影检测底物被P32标记的程度评价酶活及抑制剂对酶促反应的抑制程度。该方法特异性程度高，但缺点显著，包括对研究场所有严格限制，易造成环境污染，对研究者健康有潜在危害，且难以实现抑制剂的高通量筛选。
该方法是目前用于RIP3（受体相互作用蛋白-3）酶活检测及抑制剂筛选的唯一方法。具体方法为从Jurkat细胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋白，在反应液中和10μCi[32P]γ-ATP和5μg MBP在30℃孵育30分钟，随后进行放射自显影。反应液成分为：20mM HEPES[pH7.5]，2mM DTT，1mM NaF，1mM Na3VO4，20mMβ-glycerophosphate，20mM MgCl2，20mM MnCl2，1mM EDTA，300μM ATP。
3.ATP消耗法，该方法主要包括两步反应，第一步反应是蛋白激酶催化酶促反应消耗反应体系中的ATP用于磷酸化底物，该反应中部分ATP被转化为ADP；第二步反应是利用荧光素酶消耗特定激酶酶促反应后剩余的ATP氧化荧光素氧同时发出荧光。其作用原理如图1所示，将一定量的特定蛋白激酶与底物置于反应缓冲液中，加入ATP后在一定条件下进行酶促反应，反应一定时间后，终止激酶反应并启动荧光素酶消耗ATP的氧化反应以释放荧光。在一定范围内酶促反应后ATP剩余量与荧光强度成线性正相关，而特定激酶催化的酶促反应程度又与ATP剩余量成线性负相关。若荧光强度强，表明激酶催化反应后体系中剩余ATP多，说明酶促反应消耗掉的ATP较少，酶促反应程度弱。若荧光强度弱，表明激酶催化反应后体系中剩余ATP少，说明酶促反应消耗ATP多，酶促反应程度强。因而荧光强度与酶促反应成线性负相关，可通过检测荧光强度来评价酶促反应的程度。但由于蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性和精确性。
ATP消耗法被用于多种激酶检测，但目前针对RIP3蛋白(受体相互作用蛋白-3)仍有以下问题未解决：1.RIP3蛋白属于RIP蛋白家族，为丝苏氨酸激酶，与其它家族丝苏氨酸激酶相比，一级结构具有显著差异，并且目前晶体结构未知。除放射性同位素法外，至今尚无其它酶活检测方法报道；2.ATP消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，此外包括底物浓度、ATP浓度、反应温度、反应时间等因素，均会影响目标蛋白酶活，因而无法直接用于抑制剂筛选；3.目前尚未发现针对RIP3的抑制剂。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是针对目前RIP3蛋白激酶活检测方法较为局限，ATP消耗法方法无法直接用于RIP3蛋白激酶抑制剂筛选的问题，提供了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之一为：一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其中所述筛选方法包括以下步骤：
（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；
（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。
其中步骤（1）所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1mM；较佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM，MgCl25mM，MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM，二硫苏糖醇0.05mM，所述反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白的浓度更佳地为30ng/μl，ATP的浓度更佳地为10μM。
其中步骤（1）所述反应体系溶液pH更佳地为7.0，反应温度更佳地为25℃，震荡速度较佳地为50～100RPM，更佳地为100RPM，反应时间更佳地为75分钟。
其中步骤（2）所述检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度的方法为本领域常规方法，较佳地为利用荧光信号进行检测。所述的方法较佳地包括以下步骤：向步骤（1）所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶并检测发光信号。该检测方法可以利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒。根据所得发光值计算特异性反应率，所得特异性反应率%=（无MBP时的发光值-有MBP时的发光值）/无MBP时的发光值×100%。
步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法较佳地包括以下步骤：反应结束后将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。
为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之二为：一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒，其中所述试剂盒包括RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白、反应缓冲液、ATP、荧光素和荧光素酶。
其中所述反应缓冲液较佳地包括以下组分：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM，MgCl25mM，MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM，二硫苏糖醇0.05mM，所述反应缓冲液pH较佳地为7.0。筛选RIP3蛋白激酶抑制剂时，在缓冲液中加入RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白和待测RIP3蛋白酶抑制剂，之后加入ATP，从而制备反应溶液体系，该反应溶液体系中ATP的浓度较佳地为10μM，髓鞘碱性蛋白的浓度较佳地为30ng/μl，RIP3蛋白激酶的浓度较佳地为5U/μl，25℃摇床反应75min后加入荧光素和荧光素酶并检测发光值。发光值的检测方法为：利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒，检测方法具体请参见该试剂盒的说明书内容。
特异性反应率的检测方法为：反应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相比较，特异性反应率=（空白组发光值-反应组发光值）/空白组发光值×100%。
待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的计算方法较佳地为：将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。
为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之三为：一种RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入待测RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；
（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性。
步骤（1）所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1mM。
其中步骤（2）所述检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度的方法为本领域常规方法，较佳地为利用荧光信号检测ATP浓度。所述的方法较佳地包括以下步骤：向步骤（1）所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶，检测发光信号。该检测方法可以利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒，具体步骤请参见该试剂盒的说明书。
步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括以下步骤：反应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相比较，反映RIP3蛋白激酶活性的特异性反应率=（空白组发光值-反应组发光值）/空白组发光值×100%。
为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之四为：威罗菲尼或索拉菲尼在制备RIP3蛋白激酶抑制剂中的用途。
其中所述威罗菲尼（Vemurafenib）的制备方法为本领域常规方法，或者市售可得。
其中所述索拉菲尼的化学名为：4-{4-[3-（4-氯-3-三氟甲基-苯基）-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸盐。其分子式为：C21H16ClF3N4O3分子量为：464.8249496，所述索拉菲尼的制备方法为本领域常规方法，或者市售可得。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的方法具有无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作的优点，本发明所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法具有特异性强，灵敏度高，信号检出率高的优点。
与放射性同位素法相比，本发明所述筛选方法的优点在于：1.显而易见的无污染性和高安全性。2.高通量，能够使用384孔微孔板筛选RIP3抑制剂，单人人工操作2h内可实现300个化合物以上的筛选通量，而同等条件下放射性同位素法化合物筛选量少于60个。
利用本发明所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法和试剂盒，筛选出索拉菲尼和威罗菲尼具有很强的RIP3蛋白激酶抑制活性，可以用于制备RIP3蛋白激酶抑制剂。
附图说明
图1为ATP消耗法反应原理示意图。
图2为RIP3重组蛋白纯化的各组分SDS-PAGE检测结果示意图。其中泳道a为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液；b为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得上清；c为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得沉淀；d、e、f为清洗缓冲液；g、h、i为溶解缓冲液；M为Marker。
图3为RIP3重组蛋白特异性抗体检测结果示意图。其中泳道a和c为同一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果，泳道b和d为另一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果。
图4为不同用量的RIP3重组蛋白进行反应所测得发光值检测结果示意图。
图5为不同浓度的ATP进行反应发光值检测结果示意图。
图6为不同温度下进行反应发光值检测结果示意图。
图7为不同时间检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。
图8为不同pH值检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。
图9为不同化合物对RIP3抑制作用的检测结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
主要实验材料和试剂：
质粒
RIP3全长cDNA载体质粒为pGEM-T，购自北京义翘神州生物技术有限公司（货号HG11267-G）。PfastBac-GST表达载体购自Invitrogen公司，该载体带有GST-Tag编码序列，编码产物位于融合蛋白N端。
菌种和细胞
大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10Bac以及Spodoptera frugiperda9(sf9)昆虫细胞均购自Invitrogen公司；
DNA引物由Invitrogen公司合成；
髓鞘碱性蛋白（MBP蛋白）、Bacmid抽提试剂盒（PureLinkTMHiPurePlasmid DNA Miniprep Kit），IPTG，Glutathione，Bluo-gal，以及转染试剂CELLFECTINTM购自Invitrogen公司；
DNA聚合酶（KOD–Plus）购自Toyobo公司；
质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶电泳DNA片段回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自QIAGEN公司；
限制性内切酶Sal I-HF及Hind III购自New England Biolabs公司；
连接酶DNA Ligation Kit购自Takara公司；
蛋白定量试剂盒GST tag ELISA Detection Kit购自Genescript公司；
TMN-FH培养基、酵母浸出膏（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）购自Sigma-Aldrich公司；
anti-RIP3抗体购自R&D公司（货号MAB7604）；
anti-GST抗体购自Santa Cruz Biotech公司；
Glutathione Sepharose4B购自GE Healthcare公司；
Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂（购自Thermo公司）；
MOPS，MnCl2，MgCl2，EDTA，EGTA，β-glycerol-phosphate，DTT（二硫苏糖醇）等普通分析纯化学试剂购自百灵威公司。
主要实验仪器
4℃高速离心机Centrifuge5810R（Eppendorf公司）；
PCR反应仪Mastercycler nexus X1（Eppendorf公司）；
紫外凝胶成像系统GelVue UV Transilluminator（Syngene公司）；
蛋白垂直电泳装置Mini-PROTEAN3Cell（Bio-Rad公司）；
微孔板（White Opaque384-well MicroPlate，PerkinElmer公司）；
微孔板酶标仪SpectraMax340PC384（Molecular Device公司）；
Envision多标记微孔板检测仪（2104Multilabel Reader，PerkinElmer公司）。
实施例1RIP3重组蛋白的表达和检测以及RIP3蛋白激酶活性检测实验条件优化
1、RIP3重组蛋白的表达和检测
以pGEM-T-RIP3质粒为模板，扩增RIP3的cDNA全长片段，使用引物序列如下：
正向引物：5’-TACGTCGACTATGTCGTGCGTCAAGTTATG-3’(下划线部分为Sal I-HF酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
反向引物：5’-GACAAGCTTTTATTTCCCGCTATGATTATACC-3’(下划线部分为Hind III酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
用KOD-Plus多聚酶进行PCR反应；
PCR反应体系为（50μl）：10×KOD-Plus-缓冲液5μl，2mM dNTP加5μl，25mM MgSO4加2μl，10μM正向引物1.5μl，10μM反向引物1.5μl，质粒模板50ng，KOD-Plus DNA聚合酶1μl，ddH2O加38μl。
PCR反应程序为：
（1）94℃，2min（2）94℃，15sec，（3）60℃，30sec，（4）68℃，1.5min，步骤（2）～（4）重复30个循环，（3）72℃，5min。反应产物经过纯化后用内切酶Sal I-HF和Hind III进行双酶切，37℃反应2h，反应体系为：
| 10×NEB缓冲液2 | 2μl |
| Hind III | 1μl |
| Sal I-HF | 1μl |
| PCR产物 | 16μl |
| ddH2O | - |
pFastBac GST载体质粒用限制性内切酶Sal I-HF和Hind III进行双酶切，37℃反应2h，反应体系为：
| 10×NEB缓冲液2 | 2μl |
| Hind III | 1μl |
| Sal I-HF | 1μl |
| 质粒 | 2μl |
| ddH2O | 14μl |
采用DNA Ligation Kit连接线性质粒片段和PCR产物片段（反应体系包含5μl Solution I，4μl PCR酶切产物和1μl质粒酶切产物），16℃连接40min。
将10μl连接产物加入100μl DH5α菌株的感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min，加入500μl无抗生素的LB培养液，37℃摇床150rpm/min，40min后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上。37℃过夜，挑选克隆菌落并测序，获得序列正确的pFastBac GST-RIP3重组质粒。
取2μl测序正确的pFastBac GST-RIP3重组质粒加入50μl DH10Bac感受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入500μl无抗生素的LB培养液，37℃摇床250rpm/min，4h后涂布于LB固体培养基上（LB固体培养基含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/mlBluo-gal，和40μg/ml IPTG），37℃培养48h，蓝白斑筛选白色克隆并鉴定。对正确克隆进行扩增后用试剂盒（PureLinkTMHiPure Plasmid DNA MiniprepKit，按说明书进行操作）抽提重组Bacmid DNA。
将抽提的Bacmid DNA用CELLFECTINTM转染试剂转染Sf9细胞，收集培液上清中的第一代昆虫杆状病毒，用其再次感染新鲜Sf9细胞，获得第二代昆虫杆状病毒。Sf9细胞生长密度为1×106个/ml时加入适量第二代病毒，72h后收集细胞并于-80℃保存，用于蛋白提取及纯化。
取108个Sf9细胞加入20ml4℃预冷的裂解液重悬细胞，裂解液成分为0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.001%PMSF（苯甲基磺酰氟），0.004%DTT，0.004%EDTA(PH=7.5)。将细胞冰上超声破碎后于10000g离心30min(4℃)，收集上清。
取Glutathione Sepharose4B用2倍体积的预冷PBS洗涤三次后，每10ml上清中加入300μl Glutathione Sepharose4B，以100rpm/min旋转2h(4℃)，充分混合均匀。将混合液以500g离心5min(4℃)，分别收集GlutathioneSepharose4B离心沉淀和上清组分。用5倍体积预冷的洗涤液洗涤沉淀，洗涤液成分为0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.001%PMSF，0.004%DTT，0.004%EDTA(PH=7.5)。用800μl预冷洗脱液洗脱沉淀两次，洗脱液成分为0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.31%glutathione，0.001%PMSF，0.004%DTT，0.003%EDTA(PH=7.5)。收集重组蛋白并加入甘油（终浓度为25%体积百分比），于-80℃冻存。
常规SDS-PAGE蛋白电泳后，用考马斯亮蓝R-250染色，与标准品比较鉴定重组蛋白分子量大小，其结果如图2所示（其中泳道a为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液；b为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得上清；c为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得沉淀；d、e、f为清洗缓冲液；g、h、i为溶解缓冲液；M为Marker9+-）。
用常规蛋白免疫印记(Western Blot)方法，使用针对RIP3蛋白的特异性抗体和针对GST蛋白的特异性抗体检测带GST标签的重组RIP3蛋白，所得结果如图3所示（其中泳道a和c为一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果，泳道b和d为另一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果）。所用方法为常规Western Blot法，具体步骤如下：
（1）用含十二烷基磺酸钠和二硫苏糖醇的裂解液混合蛋白纯化洗脱液，95℃加热10min，收集蛋白样品；
（2）10%SDS-PAGE凝胶电泳后蛋白转至硝酸纤维素膜；
（3）10%脱脂牛奶封闭1h；
（4）R&D公司RIP3抗体（货号MAB7604）1∶500比例，GST抗体按1:4000比例，4℃孵育过夜或室温孵育4h；含3‰吐温20的TBS洗涤5次，每次5min；
（5）二抗（Goat Anti-Mouse IgG和Goat Anti-Rabbit IgG均购自R&D公司）按1∶2000比例室温孵育1h；含3‰吐温20的TBS洗涤5次，每次5min；
（6）用Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂处理3-5min，X胶片暗室显影。
用蛋白定量试剂盒GST tag ELISA Detection Kit测定纯化获得的重组蛋白中融合标签蛋白GST-Tag浓度，即获得RIP3重组蛋白，蛋白浓度为100μg/ml。
2、RIP3蛋白激酶活性检测实验条件优化
将上述步骤制备所得的含有RIP3蛋白的酶混合液定义为溶液A（RIP3蛋白浓度为100μg/ml），将不含RIP3蛋白的空白昆虫细胞中获得的阴性对照溶液定义为溶液B，将所述溶液用于后续酶活反应条件优化及抑制剂筛选实验。反应结束后用Promega公司Kinase-Glo试剂盒(货号：V6711)按使用说明在Envision多标记微孔板检测仪检测发光值。
（1）确定RIP3重组蛋白的适宜用量
采用以下条件检测RIP3重组蛋白酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在所得缓冲溶液中加入底物MBP，不同浓度的RIP3重组蛋白（RIP3重组蛋白的浓度见表1所示）和ATP进行反应，其中MBP浓度为50ng/μl，ATP浓度为10μM；30℃摇床反应100RPM，反应90min。
待RIP3酶促反应90分钟后，使用试剂盒（购自promega，货号V6711）检测ATP浓度，按试剂盒使用说明书操作。具体步骤为：使用试剂盒提供的缓冲液溶解试剂盒提供的底物，混匀后按10μl/孔加入RIP3酶促反应液中，5-10min后使用Envision多标记微孔板检测仪检测发光值。所测发光值（2104Multilabel Reader）如图4所示。根据发光值计算RIP3特异性酶促反应发生程度，特异性反应率%=（无MBP时的发光值-有MBP时的发光值）/无MBP时的发光值×100%。根据上述公式计算RIP3蛋白用量所对应的信号值，结果如表1所示：
表1RIP3重组蛋白反应率
表1结果说明：RIP3蛋白激酶在酶促反应液中的浓度为0.5ng/μl～4ng/μl时其酶促反应率大于30%，从经济角度考虑选择0.5ng/μl～1.5ng/μl为适宜用量。下述酶促反应液中的RIP3蛋白激酶的浓度均为1ng/μl。
(2)确定底物MBP的适宜用量
采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在反应缓冲液中加入RIP3蛋白、不同浓度的底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度均为1ng/μl，ATP的浓度为10μM，摇床震荡速度50RPM，30℃反应90min。
选取不同用量的底物MBP（MBP用量分别为：30ng、60ng、150ng、300ng、600ng和900ng）进行反应，反应进行90min后利用上述方法检测荧光值，结果表明：发光值变化量随MBP用量增加而增加，表明酶促反应程度随MBP用量增加而增加，呈线性动力学关系。在MBP用量为30ng/μl时达到最大，在大于30ng/μl用量时酶促反应程度不再显著增加，因此选择15ng/μl～30ng/μl的蛋白用量为适宜底物用量。
(3)确定ATP的适宜用量
采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP，和不同浓度的ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度为25ng/μl，摇床震荡速度为100RPM，30℃反应90min。
选取不同浓度ATP进行反应（ATP浓度分别为：1.25μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM和80μM）。反应90min后，使用试剂盒（购自promega，货号V6711）检测ATP浓度≤10μM时的反应，使用Plus试剂盒（购自promega，货号V3771）检测ATP浓度大于10μM且≤100μM时的反应，按试剂盒使用说明书操作。具体步骤为：待RIP3酶促反应90min后，使用试剂盒提供的缓冲液配制底物，混匀后按10μl/孔加入RIP3酶促反应液中，5-10min后使用多标记微孔板检测仪检测发光值。结果如图5所示，在上述条件下达最大反应速率一半时的ATP浓度约为15μM(Km值)，此时ATP浓度值与发光值变化值间存在线性相关且处于线性中段，对抑制剂作用敏感。对不同ATP浓度的特异性反应率进行计算，结果如表2所示：
表2ATP特异性反应率
| ATP(μM) | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 |
| 特异性反应率(%) | 80.9 | 68.1 | 54.2 | 47.9 | 45.6 | 19.4 | 15.5 |
该结果显示在ATP浓度为10～20μM时其特异性反应率接近50%，鉴于promega试剂盒在不同ATP浓度时有应用局限性，并且较低浓度ATP时对抑制剂较为敏感，因而确定10μM为适宜浓度。
(4)确定适宜反应温度
采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度为25ng/μl，ATP浓度为10μM，选取不同温度进行反应，摇床震荡速度为50RPM，反应90min。
选取不同温度进行反应（16℃，20℃，25℃，30℃和37℃），利用上述用试剂盒检测反应液荧光值，结果如图6所示，不同温度下特异性酶促反应率有显著差异：其中温度在20℃～30℃时反应率≥40%，在25℃时达到最大反应率，约为50%；在30℃时反应率约为45%，与25℃时反应率接近；温度在37℃时反应率已不足25%。因此，该酶促反应适宜温度为20℃～30℃。考虑到25℃为室温而无需其它特殊温控仪器设备，易于开展抑制剂筛选，因而推荐使用25℃。
(5)确定适宜反应时间
采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度为25ng/μl，ATP浓度为10μM，25℃摇床震荡速度为50RPM，选取不同反应时间的产物进行测量。
于不同时间（30～90分钟），利用上文所述用试剂盒检测反应进行程度并比较特异性反应率大小，其结果如图7所示，结果显示特异性反应率随反应时间增加而增加，75min内呈线性相关。反应时间少于45min时特异性反应率低于40%，60min时约为45%，在90min时约为50%。因此抑制剂筛选时反应时间在60～90min均适用，选择75min线性关系好并节省时间。
(6)确定适宜反应pH值
采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS（pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mMβ-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度为25ng/μl，ATP浓度为10μM，摇床震荡速度为50RPM，25℃反应75min，其间使用HCl或NaOH调节pH值至所需值。
于不同pH值反应液中（pH分别为6.5，6.75，7.0，7.25）检测反应进行程度并比较特异性反应率大小，检测方法如前所述，所得结果如图8所示，结果显示特异性反应率随反应液pH值上升而增加，pH值在6.5-7.0范围内特异性反应率最为稳定，而当pH值高于7.0后特异性反应率显著下降，因此抑制剂筛选时反应液适宜pH值为6.5-7.0。
（7）确定RIP3的活性单位以及抑制剂筛选反应条件
1个活性单位定义为在10μl反应液里，25℃下反应75min消耗100nM的ATP所需要的酶量。抑制剂筛选模型的反应体系为：384孔板每孔10μl的反应液里，含50单位（U）RIP3重组蛋白，底物MBP蛋白250ng，ATP10μM，于25℃反应75min。
实施例2RIP3抑制剂的筛选
采用以下条件初步检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS，2.5mMβ-glycerol-phosphate，5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，1mM EGTA，0.4mMEDTA，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP，待测蛋白激酶抑制剂和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为5U/μl，底物MBP的浓度为25ng/μl，ATP浓度为10μM，摇床震荡速度为100rpm，25℃反应75min，所得反应液的pH值为6.8。
用不同浓度索拉菲尼（索拉菲尼浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和100μM）、舒尼替尼（舒尼替尼浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和100μM）和威罗菲尼（Vemurafenib，其浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和100μM）分别加入反应体系，上述三种化合物均购买自Selleck Chemicals公司。反应结束后与未加药反应组相比较，抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。上述反应体系反应进行75min后，利用上述试剂盒及检测方法检测反应液的发光值，测试结果如图9所示，所得结果显示索拉菲尼显示出浓度依赖的抑制活性，显示出阳性作用，半数抑制浓度约为20μM；Vemurafenib在100μM浓度下抑制率约为90%，半数抑制浓度约为2.4μM；舒尼替尼在100μM浓度下抑制率不足5%，显示出阴性作用。由于目前尚未发现RIP3蛋白激酶的抑制剂，应用本发明首次发现多靶点抑制剂索拉菲尼和威罗菲尼（Vemurafenib）分子具有RIP3蛋白激酶抑制活性，而多靶点抑制剂舒尼替尼未能产生抑制作用，上述实验结果表明本发明所述针对RIP3蛋白激酶的抑制剂筛选方法具有选择性和特异性。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；
（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。
2.如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1）所述反应缓冲液的组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1mM。
3.如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法包括以下步骤：反应结束后加入荧光素和荧光素酶并检测特异性反应率，将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。
4.如权利要求1所述的RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1）所述反应缓冲液的pH值为7.0，反应温度为25℃，震荡的速度为50～100RPM，反应时间为75分钟。
5.一种RIP3蛋白激酶抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白、反应缓冲液、荧光素和荧光素酶。
6.如权利要求5所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，其中所述反应缓冲液组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM，MgCl25mM，MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM，二硫苏糖醇0.05mM，所述反应缓冲液pH值为7.0。
7.一种RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入待测RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；
（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性。
8.如权利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述反应缓冲液的组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1mM。
9.如权利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括以下步骤：反应结束后加入荧光素和荧光素酶并检测发光值，将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相比较，RIP3蛋白激酶活性的特异性反应率=（空白组发光值-反应组发光值）/空白组发光值×100%。
10.威罗菲尼或索拉菲尼在制备RIP3蛋白激酶抑制剂中的用途。
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