CN105874069A - 改进的dna聚合酶寡核苷酸抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明包括一种核酸聚合酶的可逆寡核苷酸抑制剂。还公开了设计所述抑制剂的方法以及在核酸的扩增和检测中使用所述抑制剂的方法，特别是通过RT‑PCR检测RNA。

Description

改进的DNA聚合酶寡核苷酸抑制剂
发明领域
本发明涉及核酸扩增领域，并且具体地，涉及通过使用聚合酶的可逆寡核苷酸抑制剂降低由热稳定性DNA聚合酶引起的非特异性扩增。
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)和实时PCR已经在研究和临床领域中被广泛接受为检测靶标核酸的快速且特异性的方法。然而，非特异性扩增的问题，即，非靶标序列的扩增，常常是实现临床应用所需的高灵敏度和特异性的限制因素。参见Mackay，I.M.(2004)，Real-timePCR in the microbiology laboratory，Clin.Microbiol.Infect.10：190。
认为非特异性扩增是与基因组中的次要的、部分互补位点退火或与交叉退火或自退火的引物退火的引物的延伸引起的。非特异性延伸产物的存在已经归因于环境温度下的聚合酶活性，在这种情况下，此类部分互补的引物-模板双链体是稳定的(Chou等，(1992)，Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplification，Nucleic Acid Res.20：1717)。因此，已经设计了抑制环境温度下聚合酶的引物延伸活性的方法。这些被称为“热启动”的方法确保只有在温度足够高使得非特异性引物-模板复合物去稳定时，聚合酶才变得完全有活性，由此避免非特异性位点的引物延伸。
一种热启动方法涉及在低温下结合并抑制聚合酶但在高温下不结合和抑制聚合酶的寡核苷酸，参见Dang和Jayasena(1996)，Oligonucleotide inhibitors of Taq DNApolymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR，J.Mol.Biol.264：268。这些寡核苷酸对靶标酶是极具特异性的并且对靶标酶具有高亲和力。
然而，热启动方法不适于逆转录PCR(RT-PCR)应用，其中逆转录酶需要低于50℃的温度。某些热稳定性DNA聚合酶具有逆转录活性，其允许在同一反应混合物中使用单一酶进行cDNA的逆转录和扩增(RT-PCR)，参见Myers和Gelfand(1991)，Reverse transcriptionand DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase，Biochemistry30：7661。然而，RNA在聚合酶活性需要的二价离子存在下在高温下是不稳定的。为此，在传统PCR热循环开始之前，在较低温度(50-60℃)下进行逆转录。典型的寡核苷酸适体具有接近60℃的解链温度并且在较低温度下没有充分释放聚合酶的抑制作用。因此，期望获得可以在较低温度下释放抑制作用的可逆聚合酶抑制剂。
发明概述
在一个实施方案中，本发明是包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸的核酸聚合酶的可逆抑制剂，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。双链二级结构在PCR混合物中在环境温度下可以是稳定的。在一些实施方案中，可逆抑制剂具有SEQ ID NO：1，其中一个或多个胸腺嘧啶碱基被尿嘧啶碱基替代，例如，SEQ ID NO：2-4。
在另一个实施方案中，本发明是设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，其包括设计具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。可以使用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从寡核苷酸混合物中选择所述寡核苷酸。
在还另一个实施方案中，本发明是可逆地抑制反应混合物中的核酸聚合酶的方法，其包括将混合物接触具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。该方法可以进一步包括将混合物接触尿嘧啶-N-糖基化酶，任选在40-65℃的温度范围中。该方法可以进一步包括将样品接触聚胺，例如，聚胺选自亚精胺、精胺和三亚甲基二胺。
在还另一个实施方案中，本发明是扩增靶标核酸的方法，其包括在扩增之前，将含有靶标核酸的反应混合物与具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸接触，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。该方法可以进一步包括在扩增之前，将样品与尿嘧啶-N-糖基化酶接触，并且任选接触聚胺，如例如，亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增靶标核酸的试剂盒，其含有核酸聚合酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。该试剂盒可以进一步包含尿嘧啶-N-糖基化酶和任选的聚胺，如例如，亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增靶标核酸的反应混合物，其含有核酸聚合酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包含至少一个尿嘧啶碱基。反应混合物可以进一步包含尿嘧啶-N-糖基化酶和任选的聚胺，如例如，亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
附图简述
图1显示了预测的寡核苷酸SEQ ID NO：1的二级结构和其中T被U替代形成SEQ IDNO：2-4的位置。
图2-5显示了在不同温度下，在SEQ ID NO：1-4存在下，引物延伸的结果。
发明详述
定义
术语“核酸”和“寡核苷酸”是指靶序列和探针。该术语不受限于长度并且通常是指脱氧核糖核苷酸(单链或双链DNA)、核糖核苷酸(RNA)和嘌呤或嘧啶碱基的任何其他N-糖苷的线性聚合物，所述碱基包括腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷以及这些碱基的修饰。
术语“常规的”或“天然的”涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，是指在描述的多核苷酸中天然产生的那些(即，对于DNA，这些是腺嘌呤或dATP、鸟嘌呤或dGTP、胞嘧啶或dCTP和胸腺嘧啶或dTTP，而对于RNA，这些是腺嘌呤或dATP、鸟嘌呤或dGTP、胞嘧啶或dCTP和尿嘧啶或UTP)。
术语“非常规的”、“非天然的”或“修饰的”涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，包括不是在自然界中发现的核酸中产生的的核酸碱基、核苷或核苷酸，而是常规碱基、核苷或核苷酸的修饰、衍生或类似物。例如，dITP和7-脱氮-dGTP不是在自然界中的核酸中产生的，但常常用于替代dGTP，并且7-脱氮-dATP可以用于替代体外DNA合成反应中的dATP，如测序。某些非常规核苷酸与常规的dNTP相比，在核糖的2’位置经修饰。核糖核苷酸是作为DNA聚合酶底物的非常规核苷酸。如本文中使用的，非常规核苷酸包括，但不限于，用作用于核酸测序终止子的化合物。示例性终止子化合物包括但不限于具有2’，3’双脱氧结构并称为三磷酸双脱氧核苷的那些化合物，例如，ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。终止子化合物的其他实例包括核糖核苷酸的2’-PO4类似物(参见，例如，美国专利No.7,947,817)。其他非常规核苷酸包括硫逐磷酸酯dNTP([[α]-S]dNTP)、5’-[α]-borano-dNTP、[α]-甲基-磷酸dNTP和三磷酸核糖核苷(rNTP)。非常规的碱基可以用放射性同位素(如32P、33P或35S)；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标记，如生物素；或酶标记，如抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白来标记。荧光标记可以包括负电荷染料，如荧光素家族的染料，或电荷中性染料，如若丹明家族的染料，或正电荷染料，如花青家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如，FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。若丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。各种染料以及用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA标记的核苷酸由Perkin-Elmer(Boston，Mass.)、Applied Biosystems(Foster City，Cal.)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，Ore.)销售。花青家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7并且由GEHealthcare Biosciences(Pittsburgh，Penn.)销售。
术语“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单位(例如，核苷酸)的核酸聚合物。寡核苷酸通常包括约六个至约175个核苷酸，更常见为约八个至约75个核苷酸，例如，约15、约20、约25、约30、约35或更多个核苷酸。寡核苷酸的确切大小将取决于许多因素，包括最终的功能或寡核苷酸的用途。存在许多用于制备寡核苷酸的方法，例如，现有或天然序列的分离，合适序列的DNA复制或扩增、逆转录、克隆和限制酶消化，或通过如下方法的直接化学合成：Narang等的磷酸三酯法(Meth.Enzyml.68：90-99，1979)；Brown等的磷酸二酯法(Meth.Enzyml.68：109-151，1979)；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(TetrahedronLett.22：1859-1862，1981)；Matteucci等的三酯法(J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191，1981)。
术语“探针”是指在合适条件下与靶标核酸选择性地杂交的寡核苷酸。
术语“靶标序列”或“靶标”是指待分析的核酸序列的区域。
术语“样品”是指含有或推测含有核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、骨髓和肿瘤，包括新鲜或新鲜冷冻的组织和福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)，以及从获自个体的细胞体外培养建立的样品，和从其分离的核酸。
术语“适体”是指如美国专利No.5,693,502中所述的，特异性地识别和结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的寡核苷酸。
术语“突变体”，在本发明的DNA聚合酶的内容中，是指多肽，通常是重组的，其相对于相应的天然产生的或未修饰的DNA聚合物，其包含一个或多个氨基酸置换。
术语“热稳定性聚合酶”是指在升高的温度下稳定的、抗热的并保持足够活性来实现随后的多核苷酸延伸反应并且在接受升高的温度持续实现双链核酸变性所需的时间时没有变成不可逆变性(灭活)的酶。来自嗜热细菌的热稳定性DNA聚合酶包括，例如，来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌种Sps17、栖热菌种Z05、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。
术语“热活性”是指在通常用于PCR反应中的退火和延伸步骤的温度下(即，45-80℃)维持其催化特性的酶。热活性酶可以是或可以不是热稳定性的。热活性DNA聚合酶可以是依赖于嗜热物种，或来自嗜温种的DNA或RNA，所述嗜温种包括，但不限，大肠杆菌(Escherichia coli.)、莫洛尼鼠白血病病毒和鸟类成骨髓瘤病毒。
在DNA聚合酶的内容中，“对应”于另一个序列(例如，序列中的区域、片段、核苷酸或氨基酸位置)是基于根据核苷酸或氨基酸位置编号的转化，然后以最大化序列同一性的方式来比对序列。因为不需要给定的“相应区域”内的全部位置是相同的，相应区域内的非匹配位置可以认为是“相应位置”。因此，如本文中使用的，涉及特定DNA聚合酶的“对应于氨基酸位置[X]的氨基酸位置”是指基于比对的其他DNA聚合酶和聚合酶家族中的相等位置。
两个或更多个核酸或多肽序列内容中的术语“同一的”或“同一性”或百分比同一性是指相同的两个或更多个序列或子序列。在比较窗口内针对最大对应进行比较和比对，或将区域指定为按照使用以下序列比较算法之一测量的或通过人工比对和视觉观察时，如果具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比(例如，特定区域内至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性)，则序列是彼此“基本上同一的”。这些定义也涉及测试序列的补体。
在两个或更多个多肽序列的内容中，术语“相似性”或“百分比相似性”是指在比较窗口内针对最大对应进行比较和比对，或将区域指定为按照使用以下序列比较算法之一测量的或通过人工比对和视觉观察时，具有特定百分比的相同或通过保守性氨基酸置换限定的相似的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列(例如，特定区域内60％相似性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相似)。如果彼此为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％相似，则序列彼此是“基本上相似的”。
如本文中使用的，“比较窗口”包括参考选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150的任一个数目的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数目的连续位置的参照序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。例如，可以通过Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)的相似性搜寻方法，或通过这些算法的计算机实施，例如，BLAST、BLASTN、GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过人工比对和视觉观察(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995增补))，来进行用于比较的序列的最优比对。
术语“CP值”或“交叉点”值，或“Ct值”或“阈值循环”值可互换使用，是指允许输入靶标核酸定量的值。例如，可以根据二阶导数最大值方法来确定Ct值，参见Van Luu-The等(2005)，Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurementsusing second derivative calculation and double correction，BioTechniques，38：287。
术语“PCR效率”是指用于完全匹配的引物模板的循环至循环扩增效率的指示。使用等式：％PCR效率＝(10(-斜率)-1)×100，针对每个条件计算PCR效率，其中使用y-轴上绘制的对数拷贝数和x-轴上绘制的Ct，通过线性回归来计算斜率。
本发明包括具有寡核苷酸形式的DNA聚合酶的可逆抑制剂。具体地，所述寡核苷酸是包括一个或多个脱氧尿苷(dU)核苷酸的DNA寡核苷酸(即，由脱氧核糖核酸组成)(含dU的抑制剂寡核苷酸)。寡核苷酸的序列能够形成包括一个或多个双链二级结构区域的二级结构。寡核苷酸在环境温度条件下在常见的反应混合物(例如，PCR混合物)中形成稳定的二级结构。根据本发明，在双链二级结构区域内放置一个或多个尿嘧啶。本发明的寡核苷酸的抑制特性不依赖于确切的核苷酸序列，而是依赖于由序列形成的二级结构的构象或形状和该结构的解链温度(Tm)。在低于Tm的温度下，例如，在常见反应混合物的环境温度下，寡核苷酸采用的形状允许其形成寡核苷酸-酶复合物。寡核苷酸可逆地抑制聚合酶，同时与寡核苷酸-酶复合物中的酶结合。
已经显示出引入非天然核苷酸可以影响由寡核苷酸形成的二级结构的形成和Tm(并且因此影响其稳定性)，并且因此影响其抑制特性。为此，已经修饰DNA寡核苷酸来含有核糖核苷酸、核苷酸类似物、具有非常规碱基的核苷酸、非核苷酸接头或其组合。(对于抑制剂寡核苷酸中的这种非天然核苷酸的描述，参见，例如，美国专利No.6,183,679)。本领域技术人员可以设计具有适用于特定酶的解链温度和形状的抑制剂寡核苷酸(包括本发明的含dU-抑制剂寡核苷酸)。
在一些实施方案中，通过在现有适体NTQ21-46A(也称为U0)(SEQ ID NO：1)中用尿嘧啶替代一个或多个胸腺嘧啶来设计含dU-抑制剂寡核苷酸。
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3’。
在这个实施方案的变化中，含dU-抑制剂寡核苷酸是以下序列之一：
U1(SEQ ID NO：2)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3’
U2(SEQ ID NO：3)
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3’
U3(SEQ ID NO：4)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3’
适体NTQ21-64A(U0)以及U1、U2和U3的预测二级结构显示于图1中。
本领域技术人员可以通过用尿嘧啶替代胸腺嘧啶或通过在寡核苷酸内(例如，在SEQ ID NO：1中)的任何其他位置或在另一个已知或新的抑制剂寡核苷酸的序列中引入尿嘧啶，而容易地设计相似的含dU抑制剂寡核苷酸。
以下实例描述了本发明的方法应用于可逆地抑制来自栖热菌种Z05的DNA聚合酶(公开于国际公开No.WO1992/06200中)。然而，该方法同样适用于其他DNA聚合酶。X-射线晶体结构的分析揭示了来自不同生物体的DNA聚合酶折叠成相似的三维结构。DNA聚合酶的整体折叠模式表示人右手并且含有三个截然不同的亚结构域，称为“手掌”、“手指”和“拇指”(参见Beese等，(1993)，Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound toduplex DNA，Science 260：352；Patel等，(1995)，Insights into DNA polymerizationmechanisms from structure and function analysis of HIV-1 reversetranscriptase，Biochemistry 34：5351)。尽管手指和拇指亚结构域的结构在大小和细胞功能不同的聚合酶之间有很大不同，但催化性手掌亚结构全部是重叠的(superimposable)。例如，基序A，其与引入的dNTP相互作用并在化学催化过程中稳定过渡态，与哺乳动物polα和原核pol I家族DNA聚合酶中的约一的平均偏差重叠(Wang等，(1997)，Crystal structure of a pal alpha family replication DNA polymerasefrom bacteriophage RB69，Cell 89：1087)。DNA聚合酶活性位点的一级氨基酸序列特别保守。例如，在基序A的情况中，序列DYSQIELR(SEQ ID NO：6)保留在通过数百万年进化分离的生物体的聚合酶中，所述生物体包括，例如，水生栖热菌、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)和大肠杆菌。
在一些实施方案中，可以设计根据本发明的含U抑制剂寡核苷酸，并且可以使用本文公开的寡核苷酸序列并进一步优化来相似地可逆地抑制其他热稳定性或热活性DNA聚合酶，例如，来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种Sps17、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶或与其至少95％相同的DNA聚合酶。
一般地说，根据本发明的含U抑制剂寡核苷酸可以设计成相似地可逆地抑制其他热稳定性或热活性酶，如连接酶、螺旋酶和核酸酶(包括DNA聚合酶的核酸酶活性)。用于这些酶的可逆寡核苷酸抑制剂已经描述于，参见，例如，美国专利No.8,470,531。这些寡核苷酸抑制剂可以变成本发明的含U寡核苷酸抑制剂，以得益于本文中所述的改善的特性。
在一些实施方案中，本发明是一种设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，包括设计具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。
可以使用美国专利No.6,183,679中所述的指数富集的配体系统进化技术(SELEX)的体外选择程序来设计和优化本发明的含U抑制剂寡核苷酸。简而言之，在SELEX方法中，将具有不同序列的寡核苷酸的混合物接触靶标，例如，酶。将结合靶标的寡核苷酸的混合物分级、扩增并接受另一轮的选择，直至鉴定出少量对靶标具有最大亲和力的寡核苷酸。
可以通过任何合适的方法，例如，通过Narang等(1979)的磷酸三酯法，Meth.Enzyml.68：90-99；Brown(1979)等的磷酸二酯法，Meth.Enzyml.68：109-151；Beaucage(1981)等的二乙基亚磷酰胺法，Tetrahedron Lett.22：1859-1862；Matteucci(1981)等的三酯法，J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191的直接化学合成；任一种自动化合成方法；或美国专利No.4,458,066的固态支持法，来制备本发明的含U抑制剂寡核苷酸。
在一些实施方案中，阻断含U抑制剂寡核苷酸的3’-端，以防止通过DNA聚合酶的延伸。在一些实施方案中，将阻断基团(化学部分)添加至寡核苷酸中的末端3’-OH或2’-OH。阻断基团的一些非限制性实例包括烷基、非核苷酸接头、磷酸酯基团、phosphothioate基团、链烷-二醇部分或氨基。在其他实例中，通过用氢替代氟或通过酯、酰胺、硫酸酯或糖苷的形成，来修饰3’-羟基基团。在还另一个实例中，用氢替代3’-OH基团(以形成二脱氧核苷酸)。
在其他实施方案中，本发明是一种通过含dU抑制剂寡核苷酸调节DNA聚合酶抑制的方法。本发明的寡核苷酸含有尿嘧啶。DNA序列中尿嘧啶的存在使得寡核苷酸成为尿嘧啶DNA糖基化酶的靶标。这些酶识别单链或双链DNA中存在的尿嘧啶，并裂解尿嘧啶碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键，留下无碱基位点，参见，例如，美国专利No.6,713,294。尿嘧啶-DNA糖基化酶，缩写为“UDG”或“UNG”，包括UNG(EC 3.2.2.3)、线粒体UNG1、核UNG2、SMUG1(单链-选择性尿嘧啶-DNA糖基化酶)、TDG(TU错配DNA糖基化酶)、MBD4(具有甲基结合结构域的尿嘧啶-DNA糖基化酶)以及其他真核和原核酶(参见Krokan H.E.等(2002)，Uracil in DNA--occurrence，consequences and repair，Oncogene 21：8935-9232)。
因此，根据本发明的方法，反应混合物不再需要加热至超过抑制性寡核苷酸的Tm的温度，以便拆开其二级结构并在寡核苷酸-酶复合物中释放酶的抑制作用。替代地，含有本发明的含U抑制剂寡核苷酸的反应混合物接触一种尿嘧啶-N-糖基化酶，如例如，UNG。方便地，UNG在标准PCR反应混合物中是有活性的。这能够将UNG添加至装配的PCR反应或甚至添加至PCR预混液(mastermix)中。在热循环开始前，将反应混合物在PCR预混液范围内对UNG活性最佳的温度(约50℃)或UNG有活性的温度范围内孵育反应混合物。UNG将裂解含dU抑制剂寡核苷酸中的尿嘧啶，留下无碱基位点。已知具有无碱基位点的DNA的主链是不稳定的，尤其是在高pH条件下的高温下。根据本发明，从UNG裂解得到的一个或多个尿嘧啶并且因此得到的一个或多个无碱基位点位于双链二级结构的区域中，所述结构将在裂解时以及随后的主链裂解时拆开。
在一些实施方案中，该方法进一步包括将反应混合物接触聚胺，如例如，亚精胺、精胺和三亚甲基二胺，如美国申请2010/0093041中所述的。在一些实施方案中，聚胺是间插胺。这组聚胺具有插入部分，能够插入核酸中的碱基对或碱基之间。聚胺上的插入部分的实例包括芳烃和聚芳烃，如萘和蒽醌。在一些实施方案中，间插部分自身也可以被一个或多个聚胺侧链取代。聚胺的添加已经显示出有助于从UNG裂解得到的无碱基DNA的降解。特别是在50℃下，降解提高1000倍。
根据本发明的方法，含U抑制剂寡核苷酸在低于之前所述的寡核苷酸抑制剂的温度下可以从稳定的二级结构转变成拆开的结构。这一特征对于涉及在释放酶抑制作用需要的温度下在常见的反应混合物中不稳定的RNA模板的反应混合物和方法中尤为有益。在较低温度下的抑制作用的释放将通过提高可用模板的含量来提高RT-PCR的逆转录步骤的效率。
通常，本发明的含U抑制剂寡核苷酸可以用于其中需要DNA聚合酶的可逆抑制的任何方法中。例如，寡核苷酸可以用于DNA测序、DNA或RNA扩增、逆转录、逆转录PCR(RT-PCR)或引物衍生中，例如，用于通过单核苷酸引物延伸检测单核苷酸多态性中。
在一些实施方案中，本发明是一种扩增和任选检测靶标核酸序列的方法，包括将反应混合物(任选含有除了DNA聚合酶以外的PCR所有组分的PCR反应混合物)中的样品接触DNA聚合酶和含U抑制剂寡核苷酸形式的可逆DNA聚合酶抑制剂。在这个实施方案的变化中，该方法进一步包括用尿嘧啶-N-糖基化酶接触并孵育反应混合物。在这个实施方案的变化中，该方法进一步包括随后同时用聚胺孵育反应混合物，所述聚胺任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。孵育可以在40-65℃下进行，或在40、45、55、60或65℃中的任一个温度或其中的任一个温度下进行，例如，在50℃下进行。该方法进一步包括通过PCR扩增和任选检测靶标核酸。
在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增靶标核酸的反应混合物，其含有核酸聚合酶的可逆抑制剂，所述可逆抑制剂包括本发明的含U抑制剂寡核苷酸，其是具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。反应混合物进一步含有尿嘧啶-N-糖基化酶，如UNG。反应混合物优选进一步含有聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。在这个实施方案的进一步变化中，试剂盒还包括用于PCR或RT-PCR的试剂，包括不限于，核酸前体(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核苷酸(引物和任选，探针)和适用于支持酶活性的缓冲剂。在一些实施方案中，靶标核酸是RNA。在一些实施方案中，聚合酶酶选自来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种Sps17、栖热菌种Z05、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是来自栖热菌种Z05或嗜热栖热菌的DNA聚合酶。
在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增靶标核酸的试剂盒，其含有核酸聚合酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包括本发明的含U抑制剂寡核苷酸，其是具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。试剂盒进一步含有尿嘧啶-N-糖基化酶，如UNG。试剂盒优选进一步含有聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。在这个实施方案的进一步变化中，试剂盒还可以包括用于PCR或RT-PCR的试剂，包括不限于，核酸前体(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核苷酸(引物和任选，探针)和适用于支持酶活性的缓冲剂。在一些实施方案中，聚合酶酶选自来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种Sps17、栖热菌种Z05、Thermuscaldophilus、热坚芽孢杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是来自栖热菌种Z05或嗜热栖热菌的DNA聚合酶。
实施例
实施例1.含U抑制剂寡核苷酸(U-适体)的设计
现有的适体NTQ21-46A(U0)(SEQ ID NO：1)
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3’，通过用dU替代dT，生成以下适体：
U1(SEQ ID NO：2)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3’
U2(SEQ ID NO：3)
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3’
U3(SEQ ID NO：4)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3’
适体的预测二级结构显示于图1中。
实施例2.U-适体的解链温度的确定
在含有50mm TrisHCl，pH8.0，100mM KCl，1mM dNTP，2.5mM MgCl2，Green I(Molecular Probes(Life Technologies，Inc.)Carlsbad，Cal.)，20nM DNA聚合酶Z05-D(在所示的情况中)和0.2μM适体之一的反应混合物中确定了U0、U1、U2和U3适体(SEQID NO：1、2、3和4)的解链温度。根据制造商的说明，在(Roche MolecularDiagnostics，Indianapolis，Ind.)中进行解链曲线分析。结果显示于表1中。该结果证明用U替代T降低了寡核苷酸二级结构的解链温度。
表1.适体的解链温度
实施例3.在UNG存在下的U-适体的解链温度的确定
在实施例1中所述的反应混合物中确定了U0、U1、U2和U3适体(SEQ ID NO：1、2、3和4)的解链温度，除了在所示的情况中，添加了0.5U/μL UNG。为了允许UNG裂解，在解链曲线分析前，将所有反应混合物在37℃下孵育。结果显示于表2中。结果证明了用U替代T并且随后用UNG裂解显著降低了寡核苷酸二级结构的解链温度。
表2.用UNG裂解后适体的解链温度
实施例4.不同温度下在U-适体和UNG存在下的引物延伸
通过在不同浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID NO：1、2、3和4)存在下的引物延伸来确定寡核苷酸抑制剂存在下的DNA聚合酶活性。使用M13mp18单链DNA(M13；GenBank登录号X02513)进行试验，用具有以下序列(SEQ ID NO：5)的寡核苷酸作为引物：
5’-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC-3’
通过将12.5μL的MgCl2添加至96-孔PCR平板中的12.5μL含有1nM引物延伸的M13模板的反应预混液中来启动反应。针对所示温度下热循环仪上的99个循环，每6秒监控引物延伸的模板的延伸。预混液含有2.5mM MgCl2，50mM Tris pH8.0，100mMKCl，所有四种dNTP的混合物，20nM Z05-D DNA聚合酶和Green I(LifeTechnologies，Carlsbad，Cal.)，其允许引物链延伸的荧光检测。测试的适体的浓度范围为0、50、200、2000nM，以确保适体以相对于Z05-D DNA聚合酶0、2.5、10或100x摩尔超量存在(参见图2-5上的图例)。通过确定随着线性范围中的时间增加的荧光的斜率来定量DNA聚合酶活性。通过标准化至每个温度下不存在适体进行的所有反应的平均斜率来计算相对活性。结果显示于图2-5中。结果证明了添加UNG显著降低了DNA聚合酶的适体抑制，特别是对于U3。
实施例5.U-适体和UNG存在下KRAS密码子12靶标的实时PCR扩增
在这个实施例中，在各种浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID NO：1、2、3和4)的存在下进行人DNA中的KRAS靶标的扩增。KRAS靶标的性质使其对引物二聚化和非特异性扩增尤为敏感。在热启动不存在的情况下，非特异性扩增遮掩了靶标浓度中的差异并且妨碍了定量分析。在这个实施例中，添加连续十倍稀释的KRAS靶标，以评价该方法的定量范围和特异性。扩增在含有3mM MgCl2，50mM Tricine pH8.0，55mM醋酸钾，200μM每种dATP，dCTP和dGTP，300μM dUTP，30μM dTTP，20nM Z05DNA聚合酶和Green I(LifeTechnologies，Carlsbad，Cal.)，以及在所指示的UNG的反应混合物中进行。LightCycle仪器中的温度概况为95℃，15秒，50个循环，50、55或60℃，40秒。通过测量不同浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID NO：1、2、3和4)存在下的Ct值，来检测扩增。测试适体的浓度范围为0、200、1000和2000nM，以确保适体以相对于Z05-D DNA聚合酶0、10、100或200x摩尔超量存在。结果显示于表3-6中。
表3.KRAS靶标(Ct)的扩增，不含UNG，60℃10×超量适体
表4.KRAS靶标(Ct)的扩增，不含UNG，60℃100×、200×超量适体
表3-4中的结果证明了需要适体来基于Ct值确定浓度，并且在60℃下在UNG不存在下，含U适体(SEQ ID NO：2、3和4)行为与亲本适体(SEQ ID NO：1)相似。
表5.KRAS靶标(Ct)的扩增，55℃
表6.KRAS靶标(Ct)的扩增，50℃、200×超量适体
表5-6中的结果证明了在较低退火温度和提高的适体浓度下，添加UNG显著降低了DNA聚合酶的含dU适体抑制，特别是对于U3，如通过较低的Ct值证明。
实施例6.在U-适体和UNG存在下的RNA的RTPCR扩增
在这个实施例中，在标准PCR条件下，按照实施例5中所述的，在含有UNG的反应混合物中，在不同浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID NO：1、2、3和4)的存在下，进行RNA靶标(HCV JP2-5，1000个拷贝/反应)的扩增。测试适体的浓度范围为相对于Z05DNA聚合酶无、100倍和200倍摩尔超量。结果显示于表7中。
表7. 55℃下HCVRNA靶标(Ct)的扩增
表7中的结果证明在较低退火温度(例如，55℃)下，在UNG存在下的含dU适体具有降低的DNA聚合酶抑制，如通过较低的Ct值证明的。

Claims (17)

1.一种核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包括具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。
2.权利要求1的可逆抑制剂，其中所述双链二级结构在PCR混合物中在环境温度下是稳定的。
3.权利要求1或2的可逆抑制剂，其包括SEQ ID NO：1，其中一个或多个胸腺嘧啶被尿嘧啶碱基替代。
4.权利要求1-3中任一项的可逆抑制剂，选自SEQ ID NO：2-4。
5.一种设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，其包括设计具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。
6.权利要求5的方法，其中使用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从寡核苷酸的混合物选择DNA寡核苷酸。
7.一种可逆地抑制反应混合物中的核酸聚合酶的方法，包括将混合物与具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸的混合物接触，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。
8.权利要求7的方法，其进一步包括将混合物与尿嘧啶-N-糖基化酶接触。
9.权利要求7或8的方法，其中所述接触在40-65℃的温度范围中发生。
10.权利要求7-9任一项的方法，进一步包括将样品与聚胺接触。
11.权利要求10的方法，其中所述聚胺选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
12.一种扩增靶标核酸的方法，其包括在扩增前，将含有所述靶标核酸的混合物与具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸接触，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。
13.权利要求12的方法，进一步包括在扩增前，将样品与尿嘧啶-N-糖基化酶接触。
14.权利要求12或13的方法，进一步包括将样品与聚胺接触。
15.权利要求14的方法，其中所述聚胺选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
16.一种用于扩增靶标核酸的试剂盒，其含有(1)核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包括具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基；(2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
17.一种用于扩增靶标核酸的反应混合物，其含有(1)核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包括具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基；(2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。
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