CN109863250A - 可用于纳米孔检测的标记的核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及包含带负电荷的聚合物部分的化合物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。本公开提供了制备所述化合物的方法及其作为纳米孔可检测标记物、特别是用于基于纳米孔的核酸检测和测序的用途。
Description
领域
本申请涉及包含带负电荷的聚合物部分的化合物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。本公开提供了制备化合物的方法及其作为纳米孔可检测标记物、特别是用于基于纳米孔的核酸检测和测序的用途。
序列表的引用
序列表的正式拷贝作为ASCII格式的文本文件与说明书同时提交，其具有“04338-542WO1_SL_ST25.txt”的文件名，2017年8月11日的创建日期，和10,771字节的大小。与此提交的序列表是说明书的一部分，并且以其整体通过引用并入本文。
背景
用于使用纳米孔检测核酸(例如DNA)或其他分子的许多方法是本领域已知的。一种常见方法涉及穿过纳米孔施加电场以诱导核酸进入纳米孔并部分阻断纳米孔，并在分子快速进入孔并易位通过孔时测量电流水平和电流阻断的持续时间。电流水平和阻断的持续时间两者都可以揭示关于分子(通常是聚合物分子，诸如DNA)的信息。这种类型的纳米孔检测方法也已使用聚合聚乙二醇(PEG)分子实施，并且发现聚合物的长度影响电流水平和停留时间。参见例如，Joseph W. F. Robertson, Claudio G. Rodrigues, Vincent M.Stanford, Kenneth A. Rubinson, Oleg V. Krasilnikov, 和John J. Kasianowicz,Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA,104; 8207 (2007)。
使用纳米孔观察分子的另一种方法是将大体积的部分连接至分子，使得其不能穿过或不能快速穿过孔。一个实例是使用紧密结合生物素的相对大体积的蛋白链霉抗生物素蛋白，并且生物素可以很容易共价连接至DNA。在DNA保持在电场的拉力和大体积的蛋白之间的情况下，其可以保持在纳米孔中的固定位置，其足够长以准确测量孔电流(数毫秒至数秒)。然后可以释放它(例如通过关闭或反转电场)并再次使用孔用于另一测量。除了链霉抗生物素蛋白外，其他蛋白和分子也可用作易位阻断剂。例如，可以使用结合特定配体或酶如DNA聚合酶的抗体。甚至双链DNA也可太大而不能穿过α-溶血素孔，并且它也可以用于在电场的拉力下将DNA(或其他聚合物)保持在纳米孔中的固定位置。
核酸测序是用于确定核酸的核苷酸序列的方法。这种序列信息可有助于诊断和/或治疗受试者。例如，受试者的核酸序列可以用于鉴定、诊断遗传性疾病和潜在地开发遗传性疾病的治疗。作为另一个实例，对病原体的研究可以导致接触传染性疾病的治疗。由于一些疾病的特征在于在数百万个核苷酸的链中的少至一个核苷酸差异，所以非常准确的测序是必要的。
已经开发了使用纳米孔的单分子边合成边测序(SBS)技术。参见例如，美国专利公开号2013/0244340 A1、2013/0264207 A1、2014/0134616 A1。纳米孔SBS涉及使用DNA聚合酶(或其他链延伸酶)来合成与靶序列模板互补的DNA链，和并行地随着每个核苷酸单体添加至生长中的链而确定其身份，由此确定所述靶序列。通过在合成所述链时随时间监测通过位于聚合酶活性部位附近的纳米孔的离子流导致的信号，检测每个添加的核苷酸单体。获得准确的信号要求将聚合酶活性部位适当定位在纳米孔附近和在每个添加的核苷酸上使用标记物，所述标记物可以进入纳米孔并提供通过所述孔的离子流的可鉴定的变化。其还需要控制DNA聚合酶链延伸反应的参数，包括核苷酸单体结合速率、持续合成能力、转变速率和总体阅读长度。为了提供准确的纳米孔测序，对于所述标记物而言重要的是，进入纳米孔并在其中停留足够量的时间(即，“停留时间”)，并当在所述纳米孔中停留时，提供与通过所述纳米孔的离子流相关的充分地可检测的和可鉴定的信号，使得与所述标记物结合的特定核苷酸可以与其他标记的核苷酸明确地区分开。
Kumar等人, (2012)“PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection forSingle Molecule DNA Sequencing by Synthesis,”Scientific Reports, 2:684; DOI:10.1038/srep00684, 描述了使用纳米孔来区分经由末端5’-氨基磷酸(5’-phosphoramidate)连接至dG核苷酸的四种不同长度PEG-香豆素标记物，并分别证实了DNA聚合酶对这四种PEG-香豆素标记的dG核苷酸的有效和准确掺入。也参见，美国专利申请公开US 2013/0244340 A1(2013年9月19日公开)、US 2013/0264207 A1(2013年10月10日公开)和US 2014/0134616 A1(2014年5月14日公开)。
WO 2013/154999和WO 2013/191793描述了标记的核苷酸用于纳米孔SBS的用途，并公开了连接至包含支链PEG链的单个标记物的单个核苷酸的可能用途。
WO 2015/148402描述了标记的核苷酸用于纳米孔SBS的用途，所述标记的核苷酸包含连接至单个标记物的单个核苷酸，其中所述标记物包含具有30个单体单元或更长的长度的任何或一系列寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)。
上述先前公开内容教导了标记的核苷酸结构，其具有连接至单个标记物或支链标记物的单个核苷酸部分。这些公开内容的一般方法是增加标记物的大小和结构可变性，且由此促进SBS的更好的纳米孔检测。然而，这些先前公开的标记的核苷酸的增加的大小通过降低可以实现的底物浓度而对它们对SBS的效用产生了进一步障碍。
上述先前公开内容未能教导这样的特异性标记的核苷酸结构，其可以提供足够高的底物浓度以在有效SBS所需的速率下驱动聚合酶延伸反应，特别是在其中溶液体积最小且分子浓度关键的的纳米孔设置中。因此，仍然需要可以用于改进纳米孔SBS和其他测序技术中的效力和通量的标记的核苷酸组合物和方法。
概述
本公开提供了包含带负电荷的聚合物部分的化合物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。由于它们增加通过纳米孔的正离子流的能力，所述化合物可以用作纳米孔可检测标记物。此外，所述化合物增加正离子流的能力提供了高于没有标记物存在的纳米孔的“开放通道”(“O.C.”)电流信号的纳米孔可检测信号，或低于O.C.电流信号并且是已知纳米孔可检测标记物典型的“阻断(blocking)”或“阻断(blockade)”信号。本公开的离子扩增化合物提供高于O.C.电流的纳米孔可检测信号的这种能力允许改进的检测的灵敏度和动态范围，且由此允许增加的纳米孔检测和测序应用的准确度。
因此，本公开还提供了标记核苷酸化合物，其包含能够作为聚合酶的底物的核苷-5'-寡磷酸部分和标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物非常适用于任何核酸边合成边测序系统，其利用标记的核苷酸作为聚合酶底物，并通过纳米孔检测聚合酶延伸反应的标记的副产物鉴定未知序列。因此，本公开还提供了制备和使用此类离子流扩增化合物、标记核苷酸化合物的方法，以及在核酸的纳米孔检测和纳米孔测序中使用这些化合物的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了包含带负电荷的聚合物部分的化合物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。在一些实施方案中，所述化合物进一步包含核苷-5’-寡磷酸部分，其能够作为与聚合物部分共价连接的聚合酶的底物。
在一些实施方案中，本公开提供了结构式(I)的化合物
其中，N是核苷；P是共价连接至所述核苷的5’-O基团的寡磷酸，其中所述寡磷酸由3至12个磷酸基团组成；L是共价连接至所述寡磷酸的末端磷酸基团的接头；且T是共价连接至所述接头的标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在一些实施方案中，式(I)的化合物具有结构式(II)
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；且标记物是带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。在式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，所述接头包含选自以下的化学基团：酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)及任何其组合。
在一些实施方案中，式(II)的化合物具有结构式(III)
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；LB-X-LA是接头，其中(a) LA和LB各自独立地包含选自以下的化学部分：直链(C1-C12)烷基、直链(C1-C12)烯烃、直链(C1-C12)炔烃、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)及其组合；且(b) X包含选自以下的化学部分：酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑和二氢哒嗪；且标记物是带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在一些实施方案中，结构式(III)的化合物具有结构式(IIIa)
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；p是2至10；且标记物是带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。在一些实施方案中，结构式(IIIa)的化合物是这样的化合物，其中R = H，n = 4，且p = 5。
通常，本公开的离子流扩增化合物共有带负电荷的聚合物部分的特征，所述带负电荷的聚合物部分能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。本公开提供了一系列结构和功能参数，其表征本文公开的化合物的带负电荷的聚合物部分。
在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含150至900个原子的共价连接链，其中带负电荷的基团以每3至20个原子的间隔、任选地每3至10个原子的间隔连接至链原子。在一些实施方案中，150至900个原子的共价连接链包含选自磷酸二酯、肽、酯、醚、烷基、烯基、炔基、全氟化烷基及其任何组合的化学基团。在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分具有约80埃至约250埃的分子长度和小于约15埃的分子直径，任选地小于约12埃的分子直径，或任选地小于约10埃的分子直径。在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分每10埃分子长度具有至少一个负电荷，任选地每7.5埃分子长度具有至少一个负电荷，或每3.5埃分子长度具有至少一个负电荷。在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分具有(-25)至(-50)的总负电荷，任选地(-30)至(-40)的总负电荷，或任选地(-31)至(-37)的总负电荷。
在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含20至50个单体单元、任选地25至40个单体单元或任选地27至35个单体单元的共价连接的链。在一些实施方案中，所述单体单元包含与3至20个原子的共价连接的链、任选地3至10个原子的链连接的带负电荷的基团。在一些实施方案中，所述单体单元包含选自磷酸二酯、肽、酯、醚、烷基、烯基、炔基、全氟烷基及其任何组合的共价连接。在一些实施方案中，所述单体单元包含带负电荷的基团，所述带负电荷的基团选自磷酸根、硫酸根、羧酸根及其任何组合。在一些实施方案中，所述单体单元选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)、(1m)、(2a)、(2b)、(2c)、(3a)、(3b)、(3c)及其任何组合的结构。
在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)n的寡核苷酸，其中A是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且n是10至40，任选地n是20至40，n是25至35，或n是27至35。在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)m-(B)n-(C)p-(D)q的寡核苷酸，其中A、B、C和D是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且m、n、p和q各自是0至40，且m+n+p+q是10至40，任选地m+n+p+q是20至40，m+n+p+q是25至35，或m+n+p+q是27至35。在一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含选自以下的寡核苷酸：-TT-(SpC2)28- (SEQ ID NO:1)，-TT-(SpC3)28- (SEQ ID NO:2)，-(SpC3)31- (SEQ ID NO:3)，-TT-(dSp)26-TT- (SEQ ID NO:4)，-TT-(SpC4-F4)28- (SEQ ID NO:5)，-TT-(SpC7-Pra2)28- (SEQ ID NO:6)，-(SpC2)8-T6-(SpC2)16- (SEQ ID NO:12)，-(SpC2)8-(N3CEdT)7-(SpC2)15- (SEQ ID NO:13)，-(SpC2)6-TT-(BHEB)-T-(SpC2)20- (SEQ ID NO:14，-(SpC2)9-T-(BHEB)2-T-(SpC2)17- (SEQ ID NO:15)和-(SpC2)8-(S500)3-(SpC2)17- (SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，由带负电荷的聚合物部分诱导的增加的离子流导致穿过纳米孔的测量电流比O.C.电流更大，任选地比O.C.电流大至少5%，比O.C.电流大至少10%，比O.C.电流大至少25%，或比O.C.电流大至少50%。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含至少一种离子流扩增化合物的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含化合物的集合，其中所述集合中的每种化合物包含不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，并且所述集合的至少一种化合物是包含带负电荷的聚合物部分(如本文所提供)的化合物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加，且由此导致穿过纳米孔的测量电流大于O.C.电流。在所述组合物的一个实施方案中，所述化合物的集合包含标记的核苷酸化合物dA6P-(接头)-T30-C3；dC6P-(接头)-TT-(dSp)26-TT-C3；dG6P-(接头)-TT-(SpC2)28-生物素；dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素；其中，“(接头)”是指式(XVd)的接头
。
本公开还提供了使用离子流扩增化合物的方法。因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于确定核酸的序列的方法，其包括：(a)提供纳米孔测序组合物，其包含：膜，在所述膜的顺侧和反侧上的电极，其孔通过所述膜延伸的纳米孔，与两个电极接触的包含正离子的电解质溶液，位于所述纳米孔附近的活性聚合酶，和与所述聚合酶形成复合物的引物链；(b)使所述纳米孔测序组合物与以下物质接触：(i)核酸链；和(ii)化合物的集合，所述化合物各自包含共价连接至标记物的不同的核苷-5’-寡磷酸部分，其中所述化合物的集合中的每个成员具有不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，并且不同标记物中的至少一种包含带负电荷的聚合物部分，其在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加；并且(c)随时间检测由不同标记物进入纳米孔中导致的不同正离子流，并与所述聚合酶掺入的不同的化合物(其与所述核酸序列互补)各自关联，且由此确定所述核酸序列。
附图简要说明
图1描绘了使用纳米孔阵列装置在边合成边测序中随时间检测的一系列离子流扩增标记信号(高于开放通道电流)的图，所述纳米孔阵列装置包含如实施例2中所述的缀合至α-溶血素纳米孔的Pol6聚合酶。
详述
对于在本文中的描述和所附权利要求，单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。因此，例如，对“一种蛋白”的提及包括超过一种蛋白，且对“一种化合物”的提及表示超过一种化合物。“包含”和“包括”的应用是可互换的，且无意成为限制性的。还应当理解，在各个实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员会理解，在一些具体情况下，可以可替换地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”描述一个实施方案。
在提供值的范围的情况下，除非上下文另外清楚地指明，否则应当理解，在该范围的上限与下限之间的所述值的每个居间整数和所述值的每个居间整数的每个十分之一(除非上下文另外清楚地指明)以及该所述范围内的任何其他所述值或居间值均被包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也被包括在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的(i)任一个或(ii)两个限值的范围也被包括在本发明中。例如“1-50”包括“2-25”、“5-20”、“25-50”、“1-10”等。
应当理解，前述一般描述(包括附图)和下述详述仅仅是示例性的和解释性的，且不是本发明的限制。
定义
如本文所用，“核酸”是指一个或多个核酸亚基的分子，所述核酸亚基包含核碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之一或其变体。核酸可以是指核苷酸(例如，dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)的聚合物，也被称作多核苷酸或寡核苷酸，且包括单链和双链形式的DNA、RNA，以及它们的杂合体。
如本文所用，“核苷酸”是指核苷-5’-寡磷酸化合物或核苷-5’-寡磷酸的结构类似物，其能够充当核酸聚合酶的底物或抑制剂。示例性的核苷酸包括、但不限于：核苷-5’-三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP)；具有5’-寡磷酸链的核苷(例如，dA、dC、dG、dT和dU)，所述5’-寡磷酸链具有4个或更多个磷酸的长度(例如，5’-四磷酸磷酸、5’-五磷酸磷酸、5’-六磷酸磷酸、5’-七磷酸磷酸、5’-八磷酸磷酸)；和核苷-5’-三磷酸的结构类似物，其可以具有经修饰的碱基部分(例如，被取代的嘌呤或嘧啶碱基)、经修饰的糖部分(例如，O-烷基化的糖)和/或经修饰的寡磷酸部分(例如，包含硫代磷酸、亚甲基和/或磷酸之间的其他桥的寡磷酸)。
如本文所用，“核苷”是指包含与糖部分(例如，核糖或脱氧核糖)连接的天然存在的或非天然存在的核碱基的分子部分。
如本文所用，“寡磷酸”是指包含磷酸基团的寡聚体的分子部分。例如，寡磷酸可以包含2-20个磷酸的寡聚体、3-12个磷酸的寡聚体、3-9个磷酸的寡聚体。
如本文所用，“聚合酶”是指能够催化聚合反应(诸如核苷酸单体的聚合)以形成核酸聚合物的任何天然的或非天然存在的酶或其他催化剂。可以用在本公开的组合物和方法中的示例性聚合酶包括核酸聚合酶诸如DNA聚合酶(例如，EC 2.7.7.7类的酶)、RNA聚合酶(例如，EC 2.7.7.6或EC 2.7.7.48类的酶)、逆转录酶(例如，EC 2.7.7.49类的酶)和DNA连接酶(例如，EC 6.5.1.1类的酶)。
如本文所用，“部分”是指分子的一部分。
如本文所用，“接头”是指任何分子部分，其提供与两个或更多个分子、分子基团和/或分子部分之间的一些空间的键合连接。
如本文所用，“标记物”是指分子的部分或部分，其实现或增强直接或间接检测和/或鉴定与标记物偶联的分子或分子复合物的能力。例如，所述标记物可以提供可检测的特性或特征，诸如空间效应或体积、静电电荷、电化学电势、光学和/或光谱特征。
如本文所用，“纳米孔”是指在膜或其他屏障材料中形成的或以其他方式提供的具有约1埃至约10,000埃的特征宽度或直径的孔、通道(channel)或通道(passage)。纳米孔可以由天然存在的孔形成蛋白(诸如来自金黄色葡萄球菌(S. aureus)的α-溶血素)，或野生型孔形成蛋白的突变体或变体(无论是非天然存在的(即，经工程改造的)诸如α-HL-C46，还是天然存在的)制成。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或由非天然存在的聚合材料制成的合成膜。所述纳米孔可以设置在传感器、传感电路或与传感电路(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路)偶联的电极邻近或附近。
如本文所用，“纳米孔可检测的标记物”是指这样的标记物：其可以进入纳米孔中，变成定位在纳米孔中，被纳米孔捕获，通过纳米孔易位和/或横过纳米孔，并由此导致通过所述纳米孔的电流的可检测变化。示例性的纳米孔可检测的标记物包括、但不限于天然的或合成的聚合物，诸如聚乙二醇、寡核苷酸、多肽、碳水化合物、肽核酸聚合物、锁核酸聚合物，其中任一种可以任选地用化学基团(诸如染料部分或荧光团)修饰或与其连接，所述化学基团可以导致可检测的纳米孔电流变化。
如本文所用，“离子流”是指由于电动势(诸如阳极和阴极之间的电势)，离子(通常在溶液中)的移动。离子流通常可以测量为电流或静电势的衰减。
如本文在纳米孔检测的上下文中所用，“离子流扩增”或“离子流增强”是指导致通过纳米孔的离子流增加大于其“开放通道”(O.C.)状态下的通过纳米孔的离子流的特征。
如本文所用，“开放通道电流”、“O.C.电流”或“背景电流”是指，当施加电势且纳米孔开放(例如，在纳米孔中不存在标记物)时，穿过纳米孔测量的电流水平。
如本文所用，“标记电流”是指，当施加电势且标记物存在于纳米孔中时，穿过纳米孔测量的电流水平。通常，纳米孔中标记物的存在导致通过纳米孔的离子流的阻断，和所得测量标记电流水平的降低。然而，当存在于纳米孔中时，本公开的离子流扩增标记物导致穿过纳米孔测量的标记电流水平中所示的离子流增加大于O.C.电流。
本文中在纳米孔中捕获标记物的上下文中使用的“停留时间”是指，通过标记电流检测到的所述标记物在纳米孔中度过的时间。
如本文所用，“分子长度”是指当分子(或部分)处于其平均溶液构象时，分子(或部分)在其最长轴向尺寸处的平均长度。
如本文所用，“分子直径”是指当分子(或部分)处于其平均溶液构象时，分子(或部分)在其最短轴向尺寸处的平均长度。
如本文所用，“总电荷”是指构成分子(或部分)的带正电荷和带负电荷的化学基团的总和。例如，包含具有30个磷酸二酯基团(其各自在pH 7下具有(-1)的电荷)的30个单体单元的聚合物的标记部分是具有(-30)的总电荷的带负电荷的聚合物。
如本文在标记部分的上下文中所用的“带负电荷的”是指具有总负电荷的标记部分。
各个实施方案的详述
概述：离子流扩增标记物和纳米孔测序
本公开描述了离子流扩增标记核苷酸化合物的组合物和可用于核酸的纳米孔检测和测序的有关的方法、装置和系统。离子流扩增标记核苷酸化合物可以用在方法中以准确地检测核酸聚合酶向生长中的链中掺入的与模板核酸链互补的单个核苷酸。
通常，基于纳米孔的核苷酸测序使用可以通过酶掺入生长中的链中的四种核苷酸类似物(例如，dA6P、dC6P、dG6P和dT6P)的混合物。每种核苷酸类似物具有共价连接的标记部分，当用纳米孔检测时，所述共价连接的标记部分提供可鉴定和可区分的特征。链延伸酶(例如，DNA聚合酶)特异性结合标记的核苷酸化合物，其与模板核酸链互补，所述模板核酸链在其活性位点与生长中的核酸链杂交。所述链延伸酶然后将标记的核苷酸化合物的互补核苷酸部分催化地偶联(即，掺入)至生长中的核酸链的末端。催化掺入事件的完成会导致标记部分和寡磷酸部分(减去掺入生长中的链中的一个磷酸)的释放，其然后穿过邻近的纳米孔。但是，甚至在它经历将它从掺入的核苷酸释放的催化过程之前，标记的核苷酸化合物的标记部分在施加的电势下进入纳米孔的孔中，且由此改变通过纳米孔的背景正离子流。通常，纳米孔中标记部分的存在导致减少(或阻断)通过纳米孔的正离子流。该“阻断电流”被检测为信号，所述信号是由通过没有标记部分存在的纳米孔的正离子流导致的“开放通道”(或“O.C.”)电流(或以下)的百分比。迄今为止，已经改变标记部分的多种分子性质(例如，质量、体积、3-D结构、静电荷)，并且发现其影响与所述孔的相互作用，由此允许纳米孔检测辨别其各自都可对应于不同核苷酸的不同标记部分。多种纳米孔系统和关于使用它们检测标记的分子(包括标记的核苷酸)用于核酸测序的方法是本领域已知的。参见，例如，2009年5月18日提交的Ju等人的美国专利申请号12/308,091；2013年6月14日提交的Ju等人的美国专利申请号13/994,431；2013年9月19日公开的美国专利申请公开US 2013/0244340A1，2013年10月10日公开的US 2013/0264207 A1，和2014年5月14日公开的US 2014/0134616 A1；2013年4月8日提交的Ju等人的PCT申请号PCT/US13/35635；和2013年4月8日提交的Ju等人的PCT申请号PCT/US13/35640，PCT国际公开号WO2015/148402，2015年9月30日提交的美国临时专利申请号62/235,551，和2015年9月10日提交的美国临时专利申请号62/216,634，其各自在此以其整体通过引用并入本文。
然而，用于纳米孔检测的所有先前已知的标记部分导致由通过纳米孔的正离子流减少导致的“阻断”电流信号。由本公开提供的令人惊讶的结果是包含带负电荷的聚合物的某些标记部分结构能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。这些离子流扩增标记部分结构提供了整个新范围的纳米孔可检测信号用于本领域已知的检测，其发生在高于开放通道电流且低于“阻断”信号范围。
标记的核苷酸化合物结构
本公开提供了可用作标记物的离子流扩增化合物，以及可以通过一系列结构和子结构表征的离子流扩增标记化合物实施方案(例如，标记核苷酸)。通常，本公开的离子流扩增标记化合物包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
通常，本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物包含共价连接至核苷-5'-寡磷酸部分的离子流扩增标记部分，其中所述标记部分包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。在一些实施方案中，所述离子流扩增标记核苷酸包含离子流扩增化合物(例如，离子流扩增标记物)，并且还包含核苷-5'-寡磷酸部分，其能够作为共价连接至聚合物部分的聚合酶的底物。
如本文别处所述，本公开的离子流扩增标记部分导致技术优势，包括用于标记化合物(例如，标记核苷酸)的纳米孔检测的增加的动态范围和灵敏度，因为它们能够导致大于O.C.信号的测量电流信号。在一些实施方案中，增加的离子流导致穿过纳米孔的测量电流比穿过纳米孔的O.C.信号增加至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、75%、90%或更大。
尽管本公开描述了其中本公开的离子流扩增标记部分可以用于标记的核苷酸化合物中用于基于纳米孔的边合成边测序(SBS)方法的许多实施方案，但还考虑所述离子流扩增标记部分可以与其他类型的化合物缀合，并且在涉及纳米孔检测标记化合物的任何方法中用作标记物。考虑使用标记化合物的纳米孔检测的任何测定可以容易地适应于使用离子流扩增标记部分。因此，普通技术人员可以使用本文公开的合成方法来制备离子流扩增标记核苷酸化合物，以使用本文公开的离子扩增标记部分结构制备其他标记的化合物。
在一些实施方案中，本公开提供了结构式(I)的离子流扩增标记核苷酸化合物
其中，N是核苷；P是共价连接至所述核苷的5’-O基团的寡磷酸，其中所述寡磷酸由3-12个磷酸基团组成；L是共价连接至所述寡磷酸的末端磷酸基团的接头；且T是共价连接至所述接头的标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
核苷(N)可以是，当所述核苷共价地偶联至寡磷酸(P)(诸如三磷酸)时，能够被链延伸酶(诸如聚合酶)掺入的任何核苷。所述核苷可以包含天然存在的或非天然存在的核碱基和天然存在的或非天然存在的糖部分，诸如核糖或脱氧核糖基团。在一些实施方案中，所述核碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷。所述糖部分应当提供在某个位置的游离羟基(例如，3’-OH基团)，当被链延伸酶催化地掺入时，所述游离羟基可以与生长中的多核苷酸链形成磷酸二酯键。所述核苷糖部分还应当提供允许寡磷酸部分的共价连接的基团(例如，5’-O基团)。
在一些实施方案中，本公开提供了结构式(II)的离子流扩增标记核苷酸化合物
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在一些实施方案中，所述核碱基(“碱基”)可以是任何天然地或非天然地存在的(例如，化学修饰的)碱基，其能够被链延伸酶(诸如聚合酶)掺入。在一些实施方案中，所述核碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷。
离子流扩增标记核苷酸化合物的寡磷酸(P)部分可以是任何寡磷酸，其当连接至核苷的5’-O时允许所得的核苷酸仍然能够被链延伸酶(诸如聚合酶)掺入。通常，链延伸酶(诸如聚合酶)能够掺入包含寡磷酸的核苷酸，所述寡磷酸具有3-12个磷酸基团的链。因此，在本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，结构式(I)或(II)的化合物)中，所述寡磷酸(P)基团可以包含3-12个磷酸基团。
如在结构式(II)的化合物中所示，3-12个磷酸基团的寡磷酸可以由n = 1至n =10的值表示。因此，在本公开的一些实施方案中，离子流扩增标记核苷酸化合物包含含有3-9个磷酸基团(或对于式(II)，n = 1-7)的寡磷酸(P)基团。在一些实施方案中，所述寡磷酸磷酸基团包含4-6个磷酸基团(或对于式(II)，n = 2-4)。在一些实施方案中，所述寡磷酸磷酸基团包含6个磷酸基团(或对于式(II)，n = 4)。
在其他实施方案中，本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物可以包含4-20个磷酸、4-12个磷酸、4-9个磷酸、4-6个磷酸的寡磷酸链，其中所述链连接在核苷的5’位置(例如，5’-四磷酸、5’-五磷酸、5’-六磷酸、5’-七磷酸、5’-八磷酸、5’-九磷酸、5’-十磷酸等)。
进一步考虑本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物可以包括寡磷酸部分，其包含经修饰的磷酸基团、磷酸类似物或其他非-磷酸化学基团，条件是当将寡磷酸连接至核苷的5’-O时，此类磷酸基团的包含不会防止所得的离子流扩增标记的核苷酸被链延伸酶掺入。通常，被链延伸酶掺入要求在α-位置处的天然存在的磷酸基团和在寡磷酸的α-位置和β-位置之间的磷酸二酯键。因此，在一些实施方案中，所述寡磷酸可以包含硫代磷酸基团。另外，考虑所述寡磷酸可以包括磷酸或具有一个或多个非-磷酸基团(诸如亚甲基，和/或在两个或更多个磷酸基团之间的桥连基)的磷酸-类似物基团的寡聚体。
接头
考虑可以使用宽范围的接头将本公开的离子流扩增标记部分共价偶联至期望被标记用于纳米孔检测的化合物(例如，标记的核苷酸化合物)。通常，所述接头可以包含能够在所述化合物和期望用于特定纳米孔检测方法的标记部分之间提供共价偶联和间距或结构的任何分子部分。此类接头参数可以由普通技术人员使用本领域已知的方法常规确定。
在一些实施方案中，可以为离子流扩增标记核苷酸化合物的具体应用选择和优化期望的间距或结构。例如，可以选择接头，其提供这样的间距，所述间距当多个标记的核苷酸中的任一个与邻近聚合酶形成三元复合物时允许离子流扩增标记部分进入纳米孔并在其中停留。通常，所述离子流扩增标记部分的带负电荷的聚合物结构应采用窄且细长的棒状构象，使得其能够进入其长度近似跨越纳米孔长度的纳米孔。取决于聚合酶如何与纳米孔偶联，可以选择稍微更短或更长的接头，以允许当标记的核苷酸在聚合酶活性位点处形成适当的三元复合物时离子流扩增标记部分达到该纳米孔跨越位置(并提供最佳离子流增强相关信号)。
通常，可与本发明的离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，式(I)和(II)的化合物)一起使用的接头包含2-100个原子的共价键合链。在一些实施方案中，2-100个原子的接头链包含一个或多个选自以下的化学部分：直链(C1-C12)烷基、直链(C1-C12)烯烃、直链(C1-C12)炔烃、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)和其组合。在本文中描述和例举了多种接头，其包含在本公开的离子流扩增标记的化合物中有用的一系列化学部分。
通常，在本公开的离子流扩增标记的核苷酸实施方案中，在结构式(I)或(II)的化合物的制备期间，在将寡磷酸部分的末端磷酸(或磷酸类似物)共价偶联至标记物或连接至或可共价连接至标记物的接头部分的化学反应中，形成接头。更具体地，该化学反应通常涉及用反应性接头形成基团修饰的标记部分和包含寡磷酸部分的核苷酸，其中所述寡磷酸的末端也用反应性接头形成基团修饰。这种类型的形成接头的化学反应可以描绘于式(III)的标记的核苷酸化合物中，如在方案1中所示。
方案1
如在方案1中所描绘，XA和XB是反应性接头形成基团，且LA和LB是在式(III)的标记的核苷酸化合物中发现的结构-LB-X-LA-的最终形成的接头的前体接头部分。因此，XA和XB是能够发生化学反应的化学部分，所述化学反应导致所述多核苷酸之一和所述标记物之间的共价偶联。接头形成基团XA和XB之间的每个共价偶联反应的产物是包含一般结构-LB-X-LA-的接头。因此，在本公开的一些实施方案中，在式(I)和(II)的化合物中的接头“L”或“接头”是如在方案1中所描绘的结构式“-LB-X-LA-”的接头。
结构式(III)的化学部分，(“-LB-X-LA-”的)“X”是在接头形成反应中产生的新的化学接头部分。特定化学基团X的名称经常用于表示接头的类型，尽管由LA和LB提供的接头的其他部分可以实质上促成所述接头的总结构。在一些实施方案中，所述接头包含在接头形成试剂XA和XB之间的接头形成反应中产生的化学部分X，其中X是选自酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯和聚乙二醇(PEG)的化学部分。
化学部分LA和LB是可以有效地充当核苷-5’-寡磷酸部分或所述标记部分和它们的接头形成试剂基团XA和XB之间的接头或间隔基的化学基团。通常，LA和LB是不会在接头形成反应中反应、但是为最终的形成的接头提供另外间距或结构的化学部分。所述LA和LB部分可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，LA或LB可以比另一个长得多或短得多，和/或提供不同的结构特征，例如导致或多或少构象柔性的特征。因此，在一些实施方案中，在本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物中有用的LA和LB部分包含2-100个原子的共价键合链，和任选地，一个或多个选自以下的化学部分：直链(C1-C12)烷基、直链(C1-C12)烯烃、直链(C1-C12)炔烃、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)和其组合。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了结构式(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；LB-X-LA是接头，其中(a) LA和LB各自独立地包含选自以下的化学部分：直链(C1-C12)烷基、直链(C1-C12)烯烃、直链(C1-C12)炔烃、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)及其组合；且(b) X包含选自以下的化学部分：酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑和二氢哒嗪；在一些实施方案中，LA和LB；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在一些实施方案中，特征性接头部分X是三唑基团。这种三唑基团可以在叠氮化物接头形成试剂和炔烃接头形成试剂之间的“点击”反应中形成。此外，考虑包含三唑基团X的结构式(III)的化合物中的接头可进一步包括在三唑基的一侧或两侧的直链烷基和/或酰胺基。因此，在一个实施方案中，本公开提供了结构式(IIIa)的离子流扩增标记核苷酸化合物
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；p是2至10；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。在结构式(IIIa)的标记核苷酸化合物的一些实施方案中，所述化合物包含结构参数R是H，n = 4和p = 5，产生式(IIId)的化合物
。
示例性的接头形成基团XA和XB、接头前体部分LA和LB和它们形成的所得的式-LA-X-LB-的接头显示在下面表1中。
表1例举了一系列接头和对应的反应性接头形成基团，所述反应性接头形成基团经历产生共价偶联接头的反应。这些各种接头和反应是本领域众所周知的。普通技术人员将能够鉴定这些反应所需的试剂，并合成它们或商业得到它们。例如，用于将多肽(或蛋白)与其他生物分子缀合或交联的试剂可以用作接头形成基团以制备本公开的离子流扩增标记核苷酸结构(参见例如，可得自Thermo Scientific, USA(在www.piercenet.com)或Sigma-Aldrich, USA(在www.sigmaaldrich.com)的“交联剂”目录)。类似地，末端磷酸修饰的核苷和/或用于这种修饰的具有叠氮化物或炔烃基(或其他接头形成基团)的试剂是商购可得的(参见例如，Jena Bioscience Gmbh, Jena, 德国)。另外，可以用在自动化的多肽固相合成中的宽范围的用叠氮化物或炔烃基(或其他接头形成基团)修饰的FMOC-保护的氨基酸残基是商购可得的(参见例如，AnaSpec, Fremont, California, USA)。
考虑结构式(IVa) - (XVIIa)和(IVb) - (XVIIb)的接头形成基团对中的任一对可以以任一种构型用于制备本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，式(III)的化合物)中有用的接头。也就是说，接头形成基团XA和XB中的任一种可以用在标记物或核苷酸上，只要所述接头形成基团配对以提供形成接头部分X的接头反应。因此，结构式(IVa) -(XVIIa)的接头形成基团中的任一种可以连接至标记物或核苷酸，且结构式(IVb) -(XVIIb)的缀合物接头形成基团可以连接至另一种。因此，在表1中在R1-LA-X-LB-R2形式的接头中描绘的基团R1和R2可以分别代表标记物和核苷酸、或核苷酸和标记物。因此，在一些实施方案中，本公开提供了式(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物，其中所述化合物包含式R1-LA-X-LB-R2的化合物，其中R1和R2分别是核苷酸和标记物，或R1和R2分别是标记物和核苷酸，且-LA-X-LB- 包含选自表1中的结构式(IVc) - (XVIIc)的部分的化学部分。
如上所述，构成接头的化学部分LA和LB可以各自独立地包含化学部分，包括直链(C1-C12)烷基、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、聚乙二醇(PEG)和其组合。类似于接头形成基团XA和XB，考虑构成接头的化学部分LA和LB中的任一种可以各自独立地与接头形成基团中的任一种一起使用，并且可以用在标记物或核苷酸上。另外，考虑化学部分LA和LB可以是相同的或不同的。
在一个实施方案中，式(III)的标记核苷酸化合物中使用的接头是式(XVc)中的接头，其包含三唑基团X，其在两侧具有部分LA和LB，产生下面所示的式(XVd)的接头。
在式(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物的一些实施方案中，LA和LB化学部分包含独立地选自表2中的式(XVIIIa) – 式(XVIIId)的部分结构的化学部分。
尽管方案1描绘了形成为与标记物分开的部分的“-LB-X-LA-”接头，但考虑在一些实施方案中，所述接头可以在与可以构成标记物的一部分的接头形成基团的反应中形成。例如，所述标记物可以包含寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括用炔丙基或其他炔基(其可以经由叠氮化物-炔烃“点击”反应共价地偶联至所需核苷酸(或核苷酸类似物))修饰的单体单元。也可以被认为是标记物的一部分的该炔丙基可以充当接头形成基团(即，“XB”)，并经历与连接至核苷酸的接头形成基团的接头形成反应。
支链或树枝状接头
除了具有能够与多个分子部分共价偶联的两个反应性末端的宽范围的接头之外，本公开的离子流扩增标记的核苷酸通常包括至少一个“支链”或“树枝状”接头，其是具有三个或更多个反应性末端的一种类型的接头部分。包含支链或树枝状接头部分的接头的使用促进单个标记物与两个或更多个核苷酸的共价偶联。具有改进特性的标记核苷酸化合物中的此类接头作为聚合酶底物的用途描述于2016年5月27日提交的题为“Tagged Multi-Nucleotides Useful For Nucleic Acid Sequencing”的美国临时申请62/342,796，其在此通过引用并入本文。
能够提供三个或更多个可用于本公开的标记的核苷酸化合物中的反应性末端的支链或树枝状接头部分是本领域中众所周知的。参见例如，Shchepinov等人,“Oligonucleotide dendrimers:synthesis and use as polylabelled DNA probes,”Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 22, 4447–4454。提供三种或更多个可用于本公开的化合物中的反应性末端的支链或树枝状接头部分可从各种DNA合成试剂的供应商(例如，Glen Research (Virginia, USA; www.glenresearch.com))商业获得。
因此，在一些实施方案中，本公开的离子流扩增标记的多核苷酸化合物(例如，结构式(I)和(II))可以包含接头，其中所述接头包含能够与三个或更多个分子部分形成共价键的支链或树枝状部分。
可用于制备本公开的离子流扩增标记的多核苷酸化合物(其中所述接头包含支链或树枝状部分)的示例性试剂包括如下所示的保护的亚磷酰胺试剂化合物(19)和(20)。
化合物(19)和(20)的支链或树枝状亚磷酰胺“双倍体”和“三倍体”单元容易连接至寡核苷酸链的末端，以在寡核苷酸上产生能够连接2个或更多个分子部分的接头末端。因此，包含天然和/或非天然单体单元的寡核苷酸可用作用于离子流扩增标记的核苷酸的标记物。
在本公开的一些实施方案中，所述离子流扩增标记的多核苷酸化合物包含支链或树枝状“双倍体”接头部分且具有结构式(IIIb)：
其中，“碱基”是天然存在或非天然存在的核碱基；R选自H和OH；m是2至12；p是2-10；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在本公开的一些实施方案中，所述离子流扩增标记核苷酸化合物包含支链或树枝状“三倍体”接头部分且具有结构式(IIIc)：
其中，“碱基”是天然存在或非天然存在的核碱基；R选自H和OH；m是2至12；p是2-10；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
此外，化合物(19)的支链或树枝状亚磷酰胺“双倍体”单元和化合物(20)的“三倍体”单元可以容易地组合以产生能够将单个分子部分(例如，标记物)共价偶联至4、6、8、9、12或更多个核苷酸的接头。例如，标记物可以经由标准亚磷酰胺合成方法连接至化合物(19)，且然后连接至化合物(20)，以产生化合物(21)，其能够进一步连接至至少六个额外分子部分，诸如六个核苷酸。
化合物(19)的三末端亚磷酰胺“双倍体”单元也可以用一个DMT保护基团和一个FMOC保护基团制备(或商业获得)。然后可以使用具有两个不同保护基团的该“双倍体”单元来随后连接两个不同的支链或树枝状单元。例如，化合物(19)的“双倍体”单元和化合物(20)的“三倍体”单元可以以连续方式共价连接至具有DMT和FMOC保护基团的“双倍体”单元，所述“双倍体”单元先前连接至单个标记物。这种组合提供了具有接头部分的单个标记物，所述接头部分能够进一步连接至至少五个额外分子部分，诸如五个核苷酸。
普通技术人员将立即认识到，化合物(19)和(20)的支链或树枝状亚磷酰胺单元，或其他此类支链或树枝状接头部分可以以多种方式组合以产生本公开的离子流扩增标记的多核苷酸化合物。
离子流扩增标记物
如本文别处所示，用于在进入纳米孔后纳米孔检测的先前已知标记部分引起通过纳米孔的正离子流减少，其导致穿过纳米孔测量的“阻断”电流信号低于O.C.信号。本公开的标记部分在进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加的令人惊讶的技术效果。这种增加的正离子流导致穿过纳米孔的测量的标记电流信号高于没有任何标记物存在的纳米孔的O.C.信号。因此，本文公开的离子流扩增标记部分不产生“阻断”电流信号，而是产生离子流扩增标记电流信号。离子流扩增的这种令人惊讶的技术效果打开了高于O.C.信号的整个新范围纳米孔可检测信号。在该检测范围内，通常存在比低于O.C.信号的范围更小的背景噪声。因此，所述离子流扩增标记物表现出以下两者的优点：将动态范围增加至高于和低于O.C.信号，并且由于在检测该范围内的标记电流信号中较低的背景噪声而提供较高的灵敏度。因此，在可用于本公开的化合物和标记核苷酸的离子流扩增标记物的一些实施方案中，增加的正离子流导致穿过纳米孔的测量电流比O.C.电流更大，任选地比O.C.电流大至少5%，比O.C.电流大至少10%，比O.C.电流大至少25%，或比O.C.电流大至少50%。
通常，本公开的离子流扩增标记的结构包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。不希望受到所提出的机制的束缚，据信此类标记物的长的、延伸的薄的聚阴离子结构能够快速结合纳米孔装置的顺侧上的许多正离子，且然后当标记物被施加的电势拉入纳米孔中时，其有效地将正离子递送至装置的反侧 - 比它们可以自身移动通过纳米孔更快速。
如上所示，所述离子流扩增标记部分应当具有包含带负电荷的聚合物的结构，所述带负电荷的聚合物可以在水溶液中采用窄的、细长的棒状构象，并且具有能够近似跨越纳米孔的长度的分子长度。通常，标准DNA链每10个核苷酸具有3.4 nm(或34埃)的分子长度，或每30个核苷酸具有约102埃的分子长度。天然核苷酸T具有约18埃的分子直径，而非天然无碱基核苷酸诸如“Sp2”、“Sp3”、“dSp”(在寡核苷酸合成领域中也称为“间隔基”)具有约10埃(或更小)的较窄的分子直径。
因此，可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物通常包含带负电荷的聚合物部分，其具有约80埃至约250埃的分子长度，和约8埃至约18埃的分子直径。在一些实施方案中，所述标记核苷酸包含带负电荷的聚合物部分，所述带负电荷的聚合物部分具有约80埃至约250埃的分子长度，和小于约15埃的分子直径，任选地小于约12埃或小于约10埃的分子直径。
本公开的离子流扩增标记物具有沿其长度规则分布的负电荷，以允许正离子合适有效地运输通过纳米孔。因此，在一些实施方案中，可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物通常包含带负电荷的聚合物部分，其中所述带负电荷的聚合物部分每10埃分子长度具有至少一个负电荷，任选地每7.5埃分子长度具有至少一个负电荷，或每3.5埃分子长度具有至少一个负电荷。
或者，可以在聚合物链中每原子数的负电荷的方面来描述离子流扩增标记结构上的负电荷的密度。因此，在一些实施方案中，可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物包含带负电荷的聚合物部分，所述带负电荷的聚合物部分包含150至900个原子的共价连接链，其中带负电荷的基团以每3至20个原子的间隔、任选地每3至10个原子的间隔连接至链原子。在一些实施方案中，150至900个原子的共价连接链包含选自磷酸二酯、肽、酯、醚、烷基、烯基、炔基、全氟化烷基及其任何组合的化学基团。在一些实施方案中，所述带负电荷的基团选自磷酸根、膦酸根、硫代磷酸根、硫酸根、磺酸根、羧酸根及其任何组合。
通常，所述离子扩增标记物的总负电荷可以基于标记物的长度和长度上的电荷分布而变化。可以改变此类参数以改变标记电流信号。在可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物的一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分具有(-20)至(-60)的总负电荷，任选地，(-25)至(-50)的总负电荷，任选地，(-30)至(-40)的总负电荷，或任选地(-31)至(-37)的总负电荷。
所述离子流扩增标记物通常包含带负电荷的聚合物结构。该聚合物结构可以在其构成单体单元的数目和类型方面进一步描述。通常，可用于本公开的标记物的带负电荷的聚合物部分中的单体单元包含带负电荷的基团，所述带负电荷的基团与3至20个原子的共价连接的链、任选地3至10个原子的链连接的带负电荷的基团。因此，在可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物的一些实施方案中，所述带负电荷的聚合物部分包含10至60个单体单元，任选地20至50个单体单元，任选地25至40个单体单元，或任选地27至35个单体单元的共价连接的链。
通常，所述单体单元在其在聚合物部分内的共价连接结构的方面进行描述。因此，在一些实施方案中，所述聚合物部分的单体单元包含选自磷酸二酯、肽、酯、醚、烷基、烯基、炔基、全氟烷基及其任何组合的共价连接。在一些实施方案中，所述单体单元包含带负电荷的基团，所述带负电荷的基团选自磷酸根、硫酸根、羧酸根及其任何组合。
可用作本公开的离子流扩增标记物的带负电荷的聚合物部分的组分的特定单体单元提供于表3中。因此，在一些实施方案中，可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物包含带负电荷的聚合物部分，所述带负电荷的聚合物部分包含单体单元，其中所述单体单元独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)、(1m)、(2a)、(2b)、(2c)、(3a)、(3b)、(3c)及其任何组合的结构。
寡核苷酸标记物
如背景和本文别处所示，已经制备宽范围的寡核苷酸并使用标记部分用于纳米孔检测。然而，仅知道这些先前已知的寡核苷酸标记物产生低于O.C.信号的标记电流信号，表明它们导致正离子流的减少。本公开提供了能够扩增离子流的寡核苷酸标记物。通常，所述离子流扩增寡核苷酸标记物包含25至35个单体单元的聚合物，所述单体单元是非天然无碱基核苷酸类似物结构。这些亚酰胺试剂经由标准自动化的亚酰胺偶联化学容易地合成为聚合物，并用于制备本公开的离子流扩增标记核苷酸。此类单体单元结构在表3中显示为式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的结构。因此，在一些实施方案中，可用于本公开的化合物和标记核苷酸中的离子流扩增标记物包含带负电荷的聚合物，其中所述聚合物包含选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)、(1m)及其任何组合的结构的单体单元。
表3的包含磷酸二酯键的单体结构和各种各样的其他此类非天然无碱基核苷酸类似物(通常也称为间隔基单元)可以亚酰胺试剂形式(例如，亚磷酰胺或亚膦酰胺)商业可得(来自例如，Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA, USA)。考虑可以使用包含该范围的磷酸二酯连接的单体单元的额外的离子流扩增标记物，其使用这些亚酰胺试剂和标准的自动化亚酰胺合成方法制备。
对应于表3的具有磷酸二酯键的单体单元的亚酰胺试剂可用于经由标准亚酰胺偶联化学法制备具有聚合物结构的离子流扩增标记物。也就是说，亚磷酰胺(或亚膦酰胺)试剂各自将在亚酰胺偶联反应中与核苷酸聚合物(例如，寡核苷酸)反应，以将具有其特定结构的单体单元插入聚合物中。这种所得的聚合物结构将具有与聚合物中相邻单体单元的磷酸酯(或膦酸酯)键。此类聚合物然后可用于经由本文公开且技术人员众所周知的连接化学法制备本公开的离子流扩增标记核苷酸。因此，本公开提供了离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，具有结构式(I)、(II)或(III))，其中所述标记物包含具有至少一个单体单元的带负电荷的聚合物结构，所述单体单元由对应于表3的单体单元的亚酰胺试剂的反应产生。
通常，在本文公开的离子流扩增标记核苷酸化合物的任何实施方案中，所述标记物可以包含至少10-聚体、15-聚体、20-聚体、25-聚体、30-聚体、35-聚体、40-聚体、50-聚体、60-聚体或更多单体单元长度的寡核苷酸；任选地，其中所述寡核苷酸包含选自表3的单体单元。
普通技术人员将认识到，表3中公开的一些单体单元在商业寡核苷酸合成目录中也称为“间隔基”(例如，“SpC3”，“dSp”)。普通技术人员还将认识到，本文所述的一些寡核苷酸标记物(包括在实施例中)是使用众所周知的寡核苷酸合成命名法来提及(对于通常使用的寡核苷酸合成命名法的进一步描述，参见例如，www.idtdna.com的Integrated DNATechnologies的网站)。例如，在本文别处公开的寡核苷酸实施方案的上下文中，表3的磷酸二酯连接的单体单元结构，式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的结构在本文中通过表4的寡核苷酸合成相关的名称来提及。
在一些实施方案中，本公开提供了离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，结构式(I)、(II)或(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物)，其中所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)m-(B)n-(C)p-(D)q的寡核苷酸，其中A、B、C和D是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且m、n、p和q各自是0至40，且m+n+p+q是10至40，任选地m+n+p+q是20至40，m+n+p+q是25至35，或m+n+p+q是27至35。
在一些实施方案中，本公开提供了离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，结构式(I)、(II)或(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物)，其中所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)n的寡核苷酸，其中A是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且n是10至40，任选地n是20至40，n是25至35，或n是27至35。
在一些实施方案中，本公开提供了离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，结构式(I)、(II)或(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物)，其中所述带负电荷的聚合物部分包含选自表5的寡核苷酸。
离子流扩增标记核苷酸化合物(其中所述标记物包含寡核苷酸)，包括化合物，也在实施例中公开和例举。
可用作离子流扩增化合物的示例性带负电荷的聚合物部分通常具有约80埃至约150埃的分子长度，和小于约15埃的分子直径。
考虑包含寡核苷酸的带负电荷的聚合物部分可以进一步包含3’末端基团。已知此类3’末端基团起作用以保护标记物免于在聚合酶存在的情况下消化。参见例如如WO 2015/148402中所公开的保护性3’末端基团。可用于本公开的离子流扩增标记物中的示例性3’末端基团包括丙醇(“C3”)和生物素，然而，普通技术人员将认识到可获得许多其他基团。
本公开为普通技术人员提供了工具以制备具有标记部分的离子流扩增标记核苷酸，所述标记部分提供在宽范围的纳米孔装置和检测系统可用的离子流扩增特征。
制备离子流扩增标记核苷酸的方法
标准合成方法可以用于制备本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物(例如，结构式(I)、(II)、(III)的化合物)。在上面(例如，(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)的化合物)和在实施例中描述了标准的叠氮基-炔烃点击反应。表1和2举例说明了可以用于制备本公开的离子流扩增标记核苷酸的一系列接头和接头形成基团反应。在一个实施方案中，在表1中所示的结构式(IVa) - (XVIIa)的接头形成基团中的任一种可以连接至与标记物连接的支链或树枝状接头或核苷酸的末端磷酸，且结构式(IVb) - (XVIIb)的相应的缀合物接头形成基团可以彼此连接。所得的形成多核苷酸-寡磷酸-接头-标记化合物的共价接头结构由表1中的结构式(IVc) - (XVIIc)例举。共价键且包括由反式-环辛烯(XVIIa)和四嗪(XVIIb)接头形成基团的点击反应产生的二氢吡啶(dihydropyrazidine)基团结构(XVIIc)。
因此，本公开提供了制备离子流扩增标记核苷酸的方法，所述方法包括：(a)提供(i)具有连接至其5’-位置的3-12个磷酸的核苷酸，其中所述末端磷酸偶联至第一接头形成基团(例如，XA或XB)；和(ii)离子流扩增标记物，其中所述标记物偶联至第二接头形成基团(例如，XB或XA)的支链或树枝状接头，所述第二接头形成基团能够与所述第一接头形成基团反应以形成接头(例如，-X-)；和(b)使所述第一接头形成基团与第二接头形成基团反应以形成离子流扩增标记核苷酸。在上面表1中例举了能够反应以形成接头的第一和第二接头形成基团。因此，在所述方法的一些实施方案中，所述第一接头形成基团选自结构式(IVa)- (XVIIa)的化合物，且所述第二接头形成基团是结构式(IVb) - (XVIIb)的对应的反应性化合物；或可替换地，所述第一接头形成基团选自结构式(IVb) - (XVIIb)的化合物，且所述第二接头形成基团是结构式(IVa) - (XVIIa)的对应的反应性化合物。
在一些实施方案中，本公开提供了制备结构式(II)的离子流扩增标记核苷酸化合物的方法
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；m是2至12；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的离子流扩增标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加；且所述方法包括以下步骤：
(a)提供(i)具有连接至其5’-位置的3至12个磷酸的核苷酸，其中末端磷酸与第一接头形成基团偶联；和(ii)离子流扩增标记物，其中所述标记物包含能够产生可检测信号的分子部分，所述分子部分包含至少第二接头形成基团，所述第二接头形成基团能够与所述第一接头形成基团反应以在所述核苷酸和所述标记物之间形成共价接头；
其中
(1) 所述第一接头形成基团选自结构式(IVa) - (XVIIa)的化合物，且所述第二接头形成基团是结构式(IVb) - (XVIIb)的对应的反应性化合物；或者
(2) 所述第一接头形成基团选自结构式(IVb) - (XVIIb)的化合物，且所述第二接头形成基团是结构式(IVa) - (XVIIa)的对应的反应性化合物；
和
(b)使所述第一接头形成基团与所述第二接头形成基团反应，由此形成核苷酸和离子流扩增标记物之间的共价键。
在制备离子流扩增标记核苷酸化合物的方法的一些实施方案中，连接至末端磷酸的第一接头形成基团是叠氮化物基团，且连接至标记物的第二接头形成基团是炔烃。在其他实施方案中，连接至末端磷酸的第一接头形成基团是炔烃基，且连接至标记物的第二接头形成基团是叠氮化物。
在制备离子流扩增标记多核苷酸的方法的一些实施方案中，连接至末端磷酸的第一接头形成基团是四嗪，且连接至标记物的第二接头形成基团是反式-环辛烯。在其他实施方案中，连接至末端磷酸的第一接头形成基团是反式-环辛烯，且连接至标记物的第二接头形成基团是四嗪。
如本文别处所述，在制备标记核苷酸的方法的一些实施方案中，支链或树枝状的接头结构可用于形成用单个离子流扩增标记物进行标记的多核苷酸。例如，可以使用化合物(19)或(20)的双倍体或三倍体接头单元产生接头结构。在一些实施方案中，双倍体或三倍体接头单元可以以连续方式连接以产生具有四个或更多个可用的反应性接头形成基团的支链或树枝状接头(例如，如在化合物(21)中)。
标记的核苷酸在纳米孔测序中的用途
本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物可以用在已知的纳米孔测序方法中，其中随着互补核苷酸被链延伸酶(例如，聚合酶、连接酶)掺入(或在它被掺入和释放以后)，纳米孔检测与互补核苷酸连接的标记物的存在，所述链延伸酶位于所述纳米孔近侧且正在延伸靶核酸序列的互补引物。使用标记的核苷酸实施纳米孔测序的一般方法、材料、装置和系统描述于美国专利公开号2013/0244340 A1、2013/0264207 A1、2014/0134616 A1、2015/0119259A1和USSN 14/666,124(2015年3月23日提交)，其各自在此通过引用并入本文。本公开的离子流扩增标记核苷酸可以用在使用标记的核苷酸进行核酸的纳米孔测序的这些一般方法中。实际上，如本文实施例中所举例说明，本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物具有增加离子流连同导致纳米孔可检测标记电流高于纳米孔的开放通道(O.C.)电流的改进特征。高于O.C.信号的这些在检测范围内，所述检测范围表现出较低的噪声，且由此允许比相应的非离子流扩增标记核苷酸化合物更准确的纳米孔测序中的序列读数。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了用于确定核酸的序列的方法，其包括：(a)提供纳米孔测序组合物，其包含：膜，在所述膜的顺侧和反侧上的电极，其孔通过所述膜延伸的纳米孔，与两个电极接触的电解质溶液，位于所述纳米孔附近的活性聚合酶，和与所述聚合酶形成复合物的引物链；(b)使所述纳米孔测序组合物与以下物质接触：(i)核酸链；和(ii)化合物的集合，所述化合物各自包含共价连接至标记物的不同的核苷-5’-寡磷酸部分，其中所述化合物的集合中的每个成员具有不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，并且不同标记物中的至少一种包含带负电荷的聚合物部分，其在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加；并且(c)随时间检测由不同标记物进入纳米孔中导致的不同正离子流，并与所述聚合酶掺入的不同的化合物(其与所述核酸序列互补)各自关联，且由此确定所述核酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了用于确定核酸的序列的方法，其包括：(a)提供纳米孔测序组合物，其包含：膜，在所述膜的顺侧和反侧上的电极，其孔通过所述膜延伸的纳米孔，与两个电极接触的电解质溶液，位于所述纳米孔附近的活性聚合酶，和与所述聚合酶形成复合物的引物链；(b)使所述纳米孔测序组合物与以下物质接触：(i)核酸链；和(ii)各自具有不同标记物的标记核苷酸的集合，其中每个不同标记物当其位于纳米孔中时引起穿过电极的不同的标记电流水平，并且所述集合包含至少一种结构式(I)的化合物
其中，N是核苷；P是共价连接至所述核苷的5’-O基团的寡磷酸，其中所述寡磷酸由3-12个磷酸基团组成；L是共价连接至所述寡磷酸的末端磷酸基团的接头；m是2-12且指示N-P-L部分的数目；且T是共价连接至N-P-L部分的离子流扩增标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加；并且(d)随时间通过检测穿过电极的电流水平而检测通过纳米孔的正离子流，并与所述聚合酶掺入的不同的标记核苷酸(其与所述核酸序列互补)各自关联，且由此确定所述核酸序列。
在确定核酸的序列的方法的一些实施方案中，所述标记的核苷酸(各自具有不同的标记物)的集合包含至少一种包含式(II)的结构的离子流扩增标记化合物：
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；m是2至12；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
当用在确定核酸的序列的方法中时，包含式(I)或(II)的结构的离子流扩增标记核苷酸化合物可以包括在本文别处公开的任何范围的化合物实施方案。例如，式(I)的核苷(N)可以是当所述核苷共价地偶联至寡磷酸(P)(诸如三磷酸)时能够被链延伸酶(诸如聚合酶)掺入的任何核苷；且所述核苷可以包含天然存在的或非天然存在的核碱基和天然存在的或非天然存在的糖部分，诸如核糖或脱氧核糖基团。
标记的核苷酸的集合
如本文别处所述，使用纳米孔检测确定核酸的序列的方法通常需要标记的核苷酸化合物的集合，每种标记的核苷酸化合物能够为链延伸酶的底物且每种标记的核苷酸化合物包含不同的与期望被检测的核苷酸结合的标记物。在用于对DNA链测序的标准实施方案中，所述方法需要至少四种标准脱氧核苷酸dA、dC、dG和dT的集合，其中每种不同核苷酸连接至不同的标记物，所述标记物能够在所述核苷酸被近侧链延伸酶掺入后被检测到，且此外其中每种标记物的纳米孔可检测信号(例如，标记电流)可与其他三种标记物中的每一种的纳米孔可检测信号区分开，由此允许被所述酶掺入的具体核苷酸的鉴定。通常，集合中的每种不同标记的核苷酸通过标记物在通过链延伸酶掺入新的互补链中时产生的独特可检测信号来区分。
可用于区分纳米孔检测方法中的标记核苷酸的单独或组合的可检测信号特征是由纳米孔中标记物的存在引起的离子流的变化，其进而导致穿过纳米孔检测系统的电极的电流水平测量值的变化(在DC或AC电势下)。因此，在一些实施方案中，本公开提供了标记的核苷酸的集合，每种标记的核苷酸具有不同的标记物，其中每种不同的标记物当它位于所述纳米孔中时引起通过孔的不同的离子流，导致穿过所述电极的不同的可检测标记电流水平，且所述集合包含至少一种结构式(I)的化合物
其中，N是核苷；P是共价连接至所述核苷的5’-O基团的寡磷酸，其中所述寡磷酸由3-12个磷酸基团组成；L是共价连接至所述寡磷酸的末端磷酸基团的接头；m是2至12且指示N-P-L部分的数目；且T是共价连接至N-P-L部分的标记物，T是共价连接至N-P-L部分的离子流扩增标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
在各自具有不同标记物的离子流扩增标记核苷酸的集合的一些实施方案中，所述集合包含至少一种包含式(II)的结构的化合物：
其中，碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；R选自H和OH；n是1至4；接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；m是2至12；且标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加。
考虑本公开的离子流扩增标记核苷酸可以用于标记的核苷酸的集合(其也包括标记的核苷酸，其阻断而非扩增通过纳米孔的离子流)，和/或具有标记的核苷酸的集合，其具有不同类型的标记物，诸如寡核苷酸标记物和多肽标记物。例如，在一些实施方案中，离子流扩增标记核苷酸的集合可以包含结构式(I)、(II)或(III)的离子流扩增标记核苷酸，并且所述集合中的其他标记核苷酸可以包含核苷酸，其连接至寡核苷酸标记物，其不扩增离子流并且导致标记电流信号低于纳米孔O.C.信号水平。导致标记电流信号低于纳米孔O.C.信号水平的此类寡核苷酸标记核苷酸是本领域已知的，并且可以与本文公开的离子流扩增标记核苷酸一起使用。(参见例如，2015年3月23日提交的美国专利公开号2013/0244340A1、2013/0264207 A1、2014/0134616 A1、2015/0119259 A1和USSN 14/666,124，其各自在此通过引用并入本文)。
或者，在一些实施方案中，标记核苷酸集合可以包括来自穿过一系列负电荷聚合物部分结构的离子流扩增标记核苷酸，诸如使用表3的单体单元可得的那些 - 例如寡核苷酸标记物、多肽标记物和/或聚乙二醇标记物。
一些实施方案中，所述标记的核苷酸的集合包含至少两种、至少三种或至少四种结构式(I)、(II)或(III)的离子流扩增标记核苷酸化合物，其中所述集合中的至少两种、至少三种或至少四种离子流扩增标记核苷酸化合物的每种不同标记物产生可与所述集合中的其他化合物区分开的纳米孔可检测信号。用于确定纳米孔可检测信号特征(诸如标记电流和/或停留时间)的方法和技术是本领域已知的(参见例如，美国专利公开号2013/0244340 A1、2013/0264207 A1、2014/0134616 A1、2015/0119259 A1和USSN 14/666,124(2015年3月23日提交)，其各自在此通过引用并入本文)。此类方法包括使用纳米孔阵列在AC电压电势下的纳米孔测序实验，如在本文实施例中所述。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了标记核苷酸的集合，其包含至少两种不同的离子流扩增标记核苷酸，其各自具有不同标记物，其中所述至少两种不同标记物表现出可区分的扩增的正离子流水平，导致不同可测量标记电流水平高于纳米孔O.C.电流水平。在一些实施方案中，至少两种不同的离子流扩增标记核苷酸包含结构(I)、结构(II)或结构(III)的化合物。在一些实施方案中，所述至少两种不同的离子流扩增标记核苷酸各自包含不同的带负电荷的聚合物部分，任选地，每个聚合物部分包含选自表3或表4的单体单元的不同序列。在一些实施方案中，所述至少两种不同的标记物表现出相差至少10%、至少25%、至少50%或至少75%的高于O.C.电流水平的标记电流水平。使用任意合适的纳米孔检测方法可以做出标记电流水平之间的差异的测量。例如，可以在纳米孔测序实验中测量至少两种不同的离子流扩增标记核苷酸中的每一种的标记电流水平电流，通常如在本文实施例中所述。
在一些实施方案中，所述至少两种不同的离子流扩增标记核苷酸包含以下四种标记核苷酸化合物的集合：dA6P-(接头)-T30-C3；dC6P-(接头)-TT-(dSp)26-TT-C3；dG6P-(接头)-TT-(SpC2)28-生物素；和dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素；其中，“(接头)”是指式(XVd)的接头(参见上文)。
纳米孔装置
纳米孔装置以及制备它们的方法和在使用本公开的离子流扩增标记核苷酸的纳米孔检测应用(诸如纳米孔测序)中使用它们的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号7,005,264 B2；7,846,738；6,617,113；6,746,594；6,673,615；6,627,067；6,464,842；6,362,002；6,267,872；6,015,714；5,795,782；和美国公开号2015/0119259、2014/0134616、2013/0264207、2013/0244340、2004/0121525和2003/0104428，其各自在此通过引用整体并入)。在本文公开的实施例中也描述了可用于测量纳米孔检测的纳米孔装置。通常，所述纳米孔装置包含被包埋在脂质双层膜中的孔形成蛋白，其中所述膜被固定化至或附着至包含孔或蓄池的固体基底。所述纳米孔的孔通过所述膜延伸，建立所述膜的顺侧和反侧之间的流体连接。通常，所述固体基底包含选自聚合物、玻璃、硅和其组合的材料。另外，所述固体基底包含邻近纳米孔的传感器、传感电路或与传感电路(任选地，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路)偶联的电极。通常，在所述膜的顺侧和反侧上存在电极，其允许穿过所述膜设定DC或AC电压电势，所述电压电势通过所述纳米孔的孔产生基线电流(或O.C.电流水平)。标记物(诸如本公开的离子流扩增标记物)的存在导致通过纳米孔的正离子流的变化，且由此生成穿过电极的电流水平相对于纳米孔的O.C.电流的可测量的变化。
考虑本公开的离子流扩增标记多核苷酸化合物可以与宽范围纳米孔装置一起使用，所述纳米孔装置包含由天然存在的和非天然存在的(例如，经工程改造的或重组的)孔形成蛋白产生的纳米孔。本领域已知宽范围的可以用于产生纳米孔的孔形成蛋白，所述纳米孔可用于本公开的离子流扩增标记物的纳米孔检测。代表性的孔形成蛋白包括、但不限于α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素、气单胞菌溶素、溶细胞素、杀白细胞素、蜂毒肽、MspA孔蛋白和孔蛋白A。孔形成蛋白，来自金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)的α-溶血素(在本文中也被称作“α-HL”)，是孔形成蛋白类别中被研究得最多的成员之一，且已经广泛地用于制备纳米孔装置(参见例如，美国公开号2015/0119259、2014/0134616、2013/0264207和2013/0244340)。α-HL还已经被测序，克隆，使用宽范围的技术(包括定点诱变和化学标记)在结构上和在功能上广泛地表征(参见例如，Valeva等人(2001)，和其中引用的参考文献)。考虑本文所述的化合物可以与α-HL七聚体纳米孔一起使用，所述α-HL七聚体纳米孔由天然存在的α-HL孔形成蛋白、非天然存在的α-HL孔形成蛋白或其组合形成。在一个实施方案中，天然存在的(即野生型)α-HL孔形成蛋白亚基的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:22(其是适合于确定本文所述的取代位置的成熟序列，且因此不包括初始的甲硫氨酸残基)。非天然存在的α-HL孔形成蛋白包括但不限于包含以下取代中的一个或多个的变体孔多肽：H35G、H144A、E111N、M113A、D127G、D128G、T129G、K131G、K147N和V149K。其他合适的α-HL孔多肽描述于美国公开专利申请号2017-0088588以及美国专利申请号15/492,214、15/274,770和15/638,273中，其各自在此通过引用并入本文。
α-HL单体的七聚体复合物自发地形成纳米孔，其嵌入脂质双层膜中并通过其建立孔。已经显示，包含6:1比率的天然α-HL:突变α-HL的α-HL七聚体可以形成纳米孔(参见例如，Valeva等人(2001) “Membrane insertion of the heptameric staphylococcalalpha-toxin pore - A domino-like structural transition that is allostericallymodulated by the target cell membrane,” J. Biol. Chem. 276(18):14835-14841，和其中引用的参考文献)。此外，已经用插入在众多位置的半胱氨酸残基取代来工程改造α-HL，允许通过马来酰亚胺接头化学法对蛋白的共价修饰(同上)。例如，经工程改造的α-溶血素-C46 (“α-HL-C46”)包含K46C氨基酸残基取代，其允许使用普通点击反应化学法用接头修饰，所述接头可以用于共价连接链延伸酶(诸如聚合酶)。或者，使用SpyCatcher/SpyTag缀合方法，可以用DNA-聚合酶共价地修饰α-HL七聚体，如WO 2015/148402中所述，其在此通过引用并入本文(还参见Zakeri和Howarth (2010), J. Am. Chem. Soc. 132:4526-7。
在一个实施方案中，所述七聚体α-HL纳米孔包含至少一个天然存在的蛋白(即，野生型)和至少一个非天然存在的蛋白。在另一个实施方案中，所述非天然存在的蛋白包含H144A氨基酸取代。在一个其他实施方案中，所述纳米孔包含一个野生型蛋白和六个具有H144A取代的蛋白。在其他实施方案中，所述非天然存在的蛋白包含H144A氨基酸取代和H35G取代。在一些实施方案中，所述纳米孔包含一个野生型蛋白和六个具有H144A和H35G取代的蛋白。在另一个实施方案中，所述七聚体α-HL纳米孔包含多于一个非天然存在的蛋白。在一个实施方案中，所述纳米孔包含第一和第二非天然存在的蛋白。在一个其他实施方案中，第一非天然存在的蛋白包含H144A、H35G、E111N、M113A、K147N、D127G、D128G、T129G、K131G和V149K取代。在另一个实施方案中，第二非天然存在的蛋白包含E111N、M113A、K147N、D127G、D128G、T129G和K131G取代。在一些实施方案中，所述纳米孔包含六个第一非天然存在的蛋白和一个第一非天然存在的蛋白。
因此，在一些实施方案中，本公开的离子流扩增标记化合物可以与纳米孔装置一起使用，其中所述纳米孔包含七聚体α-HL复合物，其具有6:1的天然α-HL:α-HL的修饰或工程改造的形式，其中所述修饰的α-HL共价地缀合至链延伸酶，诸如DNA聚合酶。例如，可以用接头修饰工程改造的α-HL-C46，允许使用四嗪-反式-环辛烯点击化学将DNA聚合酶的Bst2.0变体共价连接至七聚体6:1纳米孔。这样的一个实施方案描述在2015年3月9日提交的美国临时申请号62/130,326以及美国公开专利申请号2017-0175183中，其各自在此通过引用并入本文。
本文中提供的离子流扩增标记核苷酸、有关的组合物和方法可以与宽范围的链延伸酶(诸如本领域已知的聚合酶和连接酶)一起使用。
DNA聚合酶是一种酶家族，其使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链。DNA聚合酶将游离核苷酸添加至新形成的链的3′末端，导致新链以5′-至-3′方向延伸。大多数DNA聚合酶也具有核酸外切活性。例如，许多DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性。此类多功能DNA聚合酶可以识别错误掺入的核苷酸，并使用3′→5′核酸外切酶活性来切除不正确的核苷酸，被称为校对的活性。核苷酸切除后，聚合酶可以重新插入正确的核苷酸，并且链延伸可以继续。一些DNA聚合酶也具有5′→3′核酸外切酶酶活性。
DNA聚合酶用于许多DNA测序技术、包括基于纳米孔的边合成边测序中。然而，DNA链可以快速移动通过纳米孔(例如，以每个碱基1至5μs的速率)，这可以使每个聚合酶催化的掺入事件的纳米孔检测难以测量并且易于产生高背景噪声，这可以导致难以获得单核苷酸分辨率。在边合成边测序期间，特别是当使用纳米孔检测时，控制DNA聚合酶活性的速率以及增加来自正确掺入的信号水平的能力是重要的。如实施例中所示，本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物提供了更宽范围的高于O.C.信号的可检测的标记电流信号，其提供更好的信号分离和更低的噪声水平，且由此允许更准确的基于纳米孔的核酸检测和测序。
可以与本公开的离子流扩增标记核苷酸化合物和方法一起使用的示例性聚合酶包括核酸聚合酶诸如DNA聚合酶(例如，EC 2.7.7.7类的酶)、RNA聚合酶(例如，EC 2.7.7.6或EC 2.7.7.48类的酶)、逆转录酶(例如，EC 2.7.7.49类的酶)和DNA连接酶(例如，EC6.5.1.1类的酶)。
在一些实施方案中，可与离子流扩增标记核苷酸一起使用的聚合酶是9oN聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、细菌噬菌体T4 DNA聚合酶、测序酶、Taq DNA聚合酶、9oN聚合酶(外-)A485L/Y409V或Phi29 DNA聚合酶(φ29 DNA聚合酶)。
在一些实施方案中，掺入离子流扩增标记核苷酸的链延伸酶包含来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶。在一些实施方案中，是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)的DNA聚合酶的大片段。在一个实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶Bst 2.0 (可商业得自New England BioLabs, Inc., Massachusetts,USA)。
在一些实施方案中，所述聚合酶是Pol6 DNA聚合酶，或Pol6的核酸外切酶缺陷型变体，诸如具有突变D44A的Pol6。可与本公开的离子流扩增标记核苷酸一起使用的一系列额外Pol6变体描述于2016年11月17日提交的美国专利公开号2016/0333327 A1，其在此通过引用并入本文。
实施例
在以下代表性实施例中举例说明了本公开的各种特征和实施方案，它们意图是说明性的，而不是限制性的。本领域技术人员将容易地理解，具体实施例仅仅举例说明在此后的权利要求中更完全地描述的发明。在申请中描述的每个实施方案和特征应当理解为可互换的且可与其中所含的每个实施方案组合。
实施例1：离子流扩增标记核苷酸化合物的制备
本实施例举例说明用于制备结构式(IIId)的标记核苷酸化合物的一般方法，其中所述化合物包含核苷-5'-六磷酸，其中末端磷酸基团与包含寡核苷酸的离子流扩增标记物连接。更具体地，本实施例描述了表6中所示的以下三种离子流扩增标记核苷酸化合物的制备。
合成方法使用标准Cu催化的叠氮基-炔烃点击反应将作为寡核苷酸的离子流扩增标记物的5'-末端共价偶联至核苷酸六磷酸(dN6P)的末端磷酸基团，如通常方案2中所示。
方案2
下面描述方案2的该合成方法用于制备特定离子流扩增标记核苷酸，dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素(即式(IIIa)的化合物，其中碱基是T且标记物是寡核苷酸，TT-(SpC3)28-生物素。这种相同的方法用于制备表6中列出的其他标记的核苷酸。
A. dT6P-叠氮化物(化合物(1))的合成
11-叠氮基-1-十一烷醇的制备：根据下面的反应方案3和程序制备11-叠氮基-1-十一烷醇：
方案3
在干燥的圆底烧瓶中，将叠氮化钠(1.44 g, 22 mM)加入11-溴-1-十一烷醇(1.84 g,7.38 mmol)于无水DMF (40 mL)中的溶液中。将所得白色悬浮液在氮气气氛下在环境温度下搅拌过夜。将悬浮液过滤并用DCM (50 mL)冲洗。将溶液在真空下浓缩，以得到淡黄色油状物。该化合物无需进一步纯化即可用于以下步骤中。
11-叠氮基-1-十一烷基三磷酸酯的制备：根据下面的反应方案4和程序制备11-叠氮基-1-十一烷基三磷酸酯：
方案4
在干燥的圆底烧瓶中，将11-叠氮基-1-十一烷醇(0.20 g, 0.94 mmol)溶解于无水DMF(2.0 mL)中。以一份加入氯代亚磷酸水杨酯(0.20 g, 1.03 mmol)。将所得溶液在环境温度在氮气下搅拌45分钟。在另一个烧瓶中，制备焦磷酸三丁胺(0.566, 1.03 mmol)于无水DMF和三丁胺(1.39 g, 7.51 mmol)中的溶液，且然后加入反应溶液中。将所得混合物搅拌1小时，并用20 mM碘溶液(80 mL, 1.55 mmol)氧化，得到环状偏三磷酸中间体，其可通过质谱仪分析。再搅拌一小时后，将反应物首先用Na2SO3 (10%, 4 mL)淬灭，使其搅拌20分钟，随后用TEAB (0.10 M, 20 mL)淬灭。将所得混合物在环境温度下搅拌过夜。将粗产物通过TeleDyne CombiFlash RF+柱系统使用30 g HP C18柱纯化，用CH3CN/0.1TEAA (16分钟内0%至50% CH3CN)洗脱。将产物在真空下浓缩并在冻干机上干燥。
dT6P-叠氮化物(化合物(1))的制备：根据下面的反应方案5和程序制备dT6P-叠氮化物：
方案5
将叠氮基-1-十一烷基三磷酸酯(0.091 g, 0.12 mmol)溶解于无水DMF (1.5 mL)中，并在环境温度下用羰基二咪唑(“CDI”) (0.078 g, 0.48 mmol)活化4小时。将过量CDI用甲醇(0.029 mL, 0.72 mmol)淬灭，再搅拌30分钟。然后加入dTTP+3Bu4N (0.20 g, 0.17mmol)于无水DMF (2.0 mL)中的溶液，随后加入MgCl2 (0.114 g, 1.20 mmol)。将所得浆液溶液在环境温度下搅拌24-36小时。将反应物用TEAB 0.1 M (20 mL)淬灭，搅拌30分钟。粗化合物(1)通过离子交换色谱法(30分钟内0.1 M至1 M)纯化，随后通过RP-C18 HPLC(35分钟内10-45% CH3CN)纯化，以得到15-30 µmol产物。化合物(1)的形成通过质谱法证实(对于负离子，计算值917.06，观察值916.03)。
B. 5’-炔丙基-TT-(Sp3)28-生物素寡核苷酸(化合物(2))的合成
在ABI 3900 DNA合成仪上使用标准固相亚磷酰胺化学方案和商业可得的试剂，包括无碱基3碳间隔基亚酰胺、“SpC3”和生物素亚酰胺试剂(可得自例如Glen Research, 22825Davis Drive, Sterling, VA, USA)，合成用作标记物的5'-炔丙基-TT-(SpC3)28-生物素寡核苷酸。在最终的自动化寡核苷酸合成步骤中，将炔丙基-C5-亚磷酰胺接头添加至倒数第二个T核苷酸的5'-磷酸，产生化合物(2)的炔丙基修饰的寡核苷酸。
C. 点击反应以形成标记的核苷酸，dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素
根据方案2的反应和以下程序实施形成离子流扩增标记核苷酸化合物、dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素的点击反应。将dT6P-叠氮化物(化合物(1))(300 nmol)和5'-炔丙基-TT-(Sp3)28-生物素寡核苷酸(化合物(2))(100 nmol)在DI-水(100 µL)中混合。根据标准文献程序，使用Cu(I)溴化物(6000 nmol)和THPTA (4000 nmol)在DMSO/叔丁醇(3:1)的混合溶液中，起始铜催化的叠氮基-炔烃点击反应。将反应溶液在环境温度下在振荡器上混合过夜。通过RP C18-HPLC (0.1M TEAA/CH3CN)纯化粗混合物。通过质谱仪证实期望的缀合产物dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素的形成(对于负离子，MS计算值5939.8；MS实测值5940.9)。
表6的其他两个标记的核苷酸的形成也通过质谱仪如下证实：dC6P-(接头)-TT-(dSp)26-TT-C3 (对于负离子，MS计算值7037.7; MS实测值7038.0)；dG6P-(接头)-TT-(SpC2)28-生物素(对于负离子，MS计算值5571.9; MS实测值5573.0)。
实施例2：使用离子流扩增标记核苷酸用于纳米孔测序
本实施例举例说明可以通过聚合酶掺入的对应于四种经典核苷酸A、C、T和G中的每一种的四种不同标记的核苷酸化合物(显示于表7中)的集合的改进的纳米孔检测特征。
在该集合中，核苷酸六磷酸化合物dC6P、dG6P和dT6P各自用不同的离子流增强标记物进行标记。这三种中的每一种包含经由如实施例1中所述形成的三唑接头共价偶联至核苷酸六磷酸的末端磷酸的30个磷酸二酯连接的单体单元(即，寡核苷酸)的带负电荷的聚合物。该集合中的第四标记的核苷酸六磷酸是用T30-C3寡核苷酸标记的dA6P。已知该标记的核苷酸不会导致通过纳米孔的离子流增加，而是导致阻断电流低于O.C.，表明离子流减少。
简言之，使用各自缀合至Pol6聚合酶的α-HL纳米孔的阵列进行四种标记的核苷酸的集合的纳米孔检测。α-HL-Pol6纳米孔缀合物被嵌入在可单独寻址的集成电路芯片的阵列上形成的膜中。该α-HL-Pol6纳米孔阵列暴露于DNA模板和三种表7中所示的用不同的离子流增强标记物进行标记的不同的核苷酸底物的集合。由于捕获与DNA模板互补的特异性标记的核苷酸并与Pol6聚合酶活性位点结合，离子流扩增标记部分变得位于缀合在附近的α-HL纳米孔中。在施加的AC电势下，孔中标记物的存在引起通过纳米孔的正离子流增加，导致在纳米孔装置电极处测量的独特电流大于O.C.电流(即纳米孔中没有标记物的电流)。当不同标记部分在互补DNA延伸链的Pol6合成期间进入纳米孔时测量的独特的高于O.C.的电流可用于检测和鉴定DNA模板。
纳米孔检测系统：使用包含CMOS微芯片的纳米孔阵列微芯片进行纳米孔离子流测量，所述CMOS微芯片具有在浅孔内的128,000个银电极的阵列(由Genia Technologies,Mountain View, CA, USA制造的芯片)。用于制造和使用此类纳米孔阵列微芯片的方法还可见于美国专利申请公开号2013/0244340 A1、US 2013/0264207 A1和US2014/0134616A1，其各自在此通过引用并入本文。使用标准的CMOS工艺制造所述阵列中的每个孔，其中进行表面修饰以允许与生物学试剂和传导性盐的恒定接触。每个孔可以支持磷脂双层膜，其具有嵌入其中的纳米孔-聚合酶缀合物。在每个孔处的电极可通过计算机接口单独寻址。使用计算机控制的注射泵将使用的所有试剂引入在阵列微芯片上面的简单流动室中。所述芯片支持模拟至数字转换并以超过1000点/秒的速率独立地报告来自所有电极的电测量值。可以在所述阵列中在128K个可寻址的含有纳米孔的膜中的每一个处以每毫秒(msec)至少一次异步地做出纳米孔阻断电流测量，并记录在接口的计算机上。
脂质双层在芯片上的形成：使用1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(AvantiPolar Lipids)制备在芯片上的磷脂双层膜。将脂质粉末以15 mM溶解在癸烷中，且然后将其在芯片上的孔上涂层。然后通过穿过阵列孔的顺侧泵送空气开始薄化工艺，因此将多层脂质膜减小至单个双层。
α-HL-Pol6缀合物在膜中的插入：在阵列芯片的孔上形成脂质双层后，将0.1 μM的6:1 α-HL-Pol6纳米孔-聚合酶缀合物、0.4 μM的所需DNA模板(全部在3 mM MgCl2、20 mMHEPES和300 mM K-Glu, pH 8的缓冲溶液中)在20℃下加入芯片的顺侧。混合物中的纳米孔-聚合酶缀合物电泳或自发地插入脂质双层中。非聚合酶修饰的α-HL纳米孔(即6:1七聚体的6个亚基)包括H144A突变。
DNA模板是哑铃环形模板，其具有以下序列：
。
纳米孔离子流测量：在将复合物插入膜中后，在20℃下，将顺侧的溶液替换为300mM谷氨酸钾，pH 8，3 mM MgCl2，10 mM LiCl，20 mM HEPES，5mM TCEP，10 μM 4种不同标记的核苷酸(其中3种用不同的离子流增强标记物进行标记)的集合，10μM一种用离子阻断标记物进行标记的核苷酸。反侧缓冲溶液是：380 mM谷氨酸钾，3 mM MgCl2，10 mM LiCl，20mM HEPES，pH 8。这些缓冲溶液用作用于纳米孔离子流测量的电解质溶液。使用Pt/Ag/AgCl电极设置并在50 Hz下施加-10 mV至200 mV方波的AC电流。AC电流对于纳米孔检测而言具有某些优点，因为它允许标记物被重复地导入纳米孔且然后从纳米孔排出，由此提供测量由通过纳米孔的离子流导致的信号的更多机会。而且，在正和负AC电流周期期间的离子流相互抵消以降低来自顺侧的离子耗尽的净速率，以及可能的由该耗尽导致的对信号的不利影响。
从四种标记的核苷酸的集合观察到代表四种独特的离子流事件的标记电流信号，因为它们被用DNA模板引发的α-HL-Pol6纳米孔-聚合酶缀合物捕获。随时间记录这些事件的图表并进行分析。通常，持续超过10ms的事件表明与聚合酶掺入与模板链互补的正确碱基一致的生产性核苷酸捕获。
结果
如图1中所示，从四种标记的核苷酸的集合观察到代表三种独特的离子流增强事件和离子流阻断事件的信号，因为它们被用DNA模板引发的α-HL-Pol6纳米孔-聚合酶缀合物捕获。用标记的核苷酸的集合进行的相关纳米孔阵列的平均标记电流值测量值显示于表8中。
如图1的图表和表8中的结果所示，三种离子流扩增标记核苷酸(dC6P-(接头)-TT-(dSp)26-TT-C3；dT6P-(接头)-TT-(SpC3)28-生物素；和dG6P-(接头)-TT-(SpC2)28-生物素)表现出高于纳米孔的开放通道电流的标记电流信号水平，表明纳米孔中标记物的存在导致正离子流增加。存在的第四种标记的核苷酸dA6P-(接头)-T30-C3表现出低于开放通道电流(即阻断电流)的标记电流信号水平，表明纳米孔中标记物的存在导致通过纳米孔的正离子流减少。提供高于开放通道的标记电流信号的能力为标记物的纳米孔检测提供了更宽的动态范围。由该标记物的集合导致的离子流事件之间的宽范围和广泛分离允许使用纳米孔装置检测和/或测序核酸的更高准确性。
实施例3：离子流扩增标记核苷酸
纳米孔检测实验可用于鉴定额外标记核苷酸化合物，其具有允许高于开放通道的检测的离子流扩增特征。
根据实施例2中描述的一般方法实施的纳米孔检测实验鉴定表9中所示的标记的核苷酸。这些标记的核苷酸可以通过聚合酶掺入并提供高于开放通道的标记电流信号。
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的在此以其整体通过引用并入，其程度等同于每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指明出于所有目的通过引用并入。
尽管已经举例说明和描述了各个具体实施方案，但应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 可用于纳米孔检测的标记的核苷酸
<130> P33726-WO
<150> US 62/380,059
<151> 2016-08-26
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
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<223> 乙基亚酰胺
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<222> (3)..(30)
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 丙基亚酰胺
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 丙基亚酰胺
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30
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cagtcagtag agagagatat ctctctcaaa aacggaggag gaggacagtc agtagagaga 60
gatatctctc tcaaaaacgg aggaggagga 90
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nnnnnnnntt ttttnnnnnn nnnnnnnnnn 30
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<212> DNA
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<221> 修饰的碱基
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> 乙基亚酰胺
<220>
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<223> 1,4-双-丁基-苯
<220>
<221> misc_feature
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<223> 乙基亚酰胺
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 29
<210> 22
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<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
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Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn
20 25 30
Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His
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Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp
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Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr
100 105 110
Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp
115 120 125
Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His
130 135 140
Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro
145 150 155 160
Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn
165 170 175
Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp
195 200 205
Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe
210 215 220
Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys
225 230 235 240
Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr
245 250 255
Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp
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Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys
275 280 285
Glu Glu Met Thr Asn Gly Leu Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
290 295 300
Lys
305
Claims (16)
1.结构式(I)的化合物
其中，
N是核苷；
P是共价连接至所述核苷的5’-O基团的寡磷酸，其中所述寡磷酸由3至12个磷酸基团组成；
L是共价连接至所述寡磷酸的末端磷酸基团的接头；且
T是共价连接至所述接头的标记物，其中所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，其能够进入纳米孔并且在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过所述纳米孔的正离子流增加。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有结构式(II)
其中，
碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；
R选自H和OH；
n是1至4；
接头是包含2至100个原子的共价键合链的接头；且
标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有结构式(III)
其中，
碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；
R选自H和OH；
n是1至4；
LB-X-LA是接头，其中(a) LA和LB各自独立地包含选自以下的化学部分：直链(C1-C12)烷基、直链(C1-C12)烯烃、直链(C1-C12)炔烃、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑、二氢哒嗪、磷酸二酯、聚乙二醇(PEG)及其组合；且(b) X包含选自以下的化学部分：酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、方酸酯、噻唑、噻唑烷、腙、肟、三唑和二氢哒嗪；在一些实施方案中，LA和LB；且
标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物。
4.权利要求3的化合物，其中所述化合物具有结构式(IIIa)
其中，
碱基选自腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷；
R选自H和OH；
n是1至4；
p是2至10；且
标记物是包含带负电荷的聚合物部分的标记物。
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中所述带负电荷的聚合物部分包含20至50个单体单元、任选地25至40个单体单元或任选地27至35个单体单元的共价连接的链。
6.权利要求5的化合物，其中所述单体单元选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)、(1m)、(2a)、(2b)、(2c)、(3a)、(3b)、(3c)及其任何组合的结构
。
7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)m-(B)n-(C)p-(D)q的寡核苷酸，其中A、B、C和D是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且 m、n、p和q各自是0至40，且m+n+p+q是10至40，任选地m+n+p+q是20至40，m+n+p+q是25至35，或m+n+p+q是27至35。
8.权利要求1-6中任一项的化合物，其中所述带负电荷的聚合物部分包含式(A)n的寡核苷酸，其中A是独立地选自式(1a)、(1b)、(1c)、(1d)、(1e)、(1f)、(1g)、(1h)、(1i)、(1j)、(1k)、(1l)和(1m)的单体单元结构的单体单元，且n是10至40，任选地n是20至40，n是25至35，或n是27至35。
9.权利要求1-6中任一项的化合物，其中所述带负电荷的聚合物部分包含选自以下的寡核苷酸：-TT-(SpC2)28- (SEQ ID NO:1)，-TT-(SpC3)28- (SEQ ID NO:2)，-(SpC3)31-(SEQ ID NO:3)，-TT-(dSp)26-TT- (SEQ ID NO:4)，-TT-(SpC4-F4)28- (SEQ ID NO:5)，-TT-(SpC7-Pra2)28- (SEQ ID NO:6)，-(SpC2)8-T6-(SpC2)16- (SEQ ID NO:12)，-(SpC2)8-(N3CEdT)7-(SpC2)15- (SEQ ID NO:13)，-(SpC2)6-TT-(BHEB)-T-(SpC2)20- (SEQ IDNO:14，-(SpC2)9-T-(BHEB)2-T-(SpC2)17- (SEQ ID NO:15)和-(SpC2)8-(S500)3-(SpC2)17- (SEQ ID NO:16)。
10.权利要求1-6中任一项的化合物，其中所述带负电荷的聚合物部分包含使用表3中所示的单体单元的亚酰胺试剂形式通过亚磷酰胺合成形成的寡核苷酸。
11.权利要求5的化合物，其中所述单体单元包含肽共价连接，其中所述单体单元选自式(2a)、(2b)、(2c)及其任何组合的结构。
12.包含化合物的集合的组合物，所述集合中的每种化合物包含不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，其中所述集合的至少一种化合物是根据权利要求1-11中任一项所述的化合物。
13.包含化合物的集合的组合物，所述集合中的每种化合物包含不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，其中所述化合物中的至少一种包含标记物，所述标记物包含带负电荷的聚合物部分，所述带负电荷的聚合物部分导致正离子流增加，由此导致穿过纳米孔的测量电流大于O.C.电流。
14.权利要求13的组合物，其中所述集合的化合物中的至少一种包含选自以下的带负电荷的聚合物部分：-TT-(SpC2)28- (SEQ ID NO:1)，-TT-(SpC3)28- (SEQ ID NO:2)，-(SpC3)31- (SEQ ID NO:3)，-TT-(dSp)26-TT- (SEQ ID NO:4)，-TT-(SpC4-F4)28- (SEQID NO:5)，-TT-(SpC7-Pra2)28- (SEQ ID NO:6)，-(SpC2)8-T6-(SpC2)16- (SEQ ID NO:12)，-(SpC2)8-(N3CEdT)7-(SpC2)15- (SEQ ID NO:13)，-(SpC2)6-TT-(BHEB)-T-(SpC2)20- (SEQ ID NO:14，-(SpC2)9-T-(BHEB)2-T-(SpC2)17- (SEQ ID NO:15)和-(SpC2)8-(S500)3-(SpC2)17- (SEQ ID NO:16)。
15.权利要求13的组合物，其中所述化合物的集合包含以下：
其中，“(接头)”是指式(XVd)的接头
。
16.用于确定核酸的序列的方法，其包括：
(a) 提供纳米孔测序组合物，其包含：膜，在所述膜的顺侧和反侧上的电极，其孔通过所述膜延伸的纳米孔，与两个电极接触的包含正离子的电解质溶液，位于所述纳米孔附近的活性聚合酶，和与所述聚合酶形成复合物的引物链；
(b) 使所述纳米孔测序组合物与以下物质接触：(i)核酸链；和(ii)化合物的集合，所述化合物各自包含共价连接至标记物的不同的核苷-5’-寡磷酸部分，其中所述化合物的集合中的每个成员具有不同的标记物，当标记物进入纳米孔时，所述不同的标记物导致通过纳米孔的不同正离子流，并且不同标记物中的至少一种包含带负电荷的聚合物部分，其在正离子存在的情况下进入纳米孔后导致通过纳米孔的正离子流增加；并且
(c) 随时间检测由不同标记物进入纳米孔中导致的不同正离子流，并与所述聚合酶掺入的与所述核酸序列互补的不同的化合物各自关联，且由此确定所述核酸序列，其中所述集合的至少一种化合物是根据权利要求1–15中任一项所述的化合物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115052882A (zh) * | 2020-02-06 | 2022-09-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 减少模板穿入纳米孔的组合物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2018189214A1 (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | A method for labeling of aldehyde containing target molecules |
| WO2019197590A1 (en) * | 2018-04-13 | 2019-10-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for detection and analysis of analytes |
| EP3814531A4 (en) | 2018-06-29 | 2022-04-06 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERING MOLECULES AND COMPLEXES TO REACTION SITES |
| JP2021536261A (ja) * | 2018-09-07 | 2021-12-27 | オンテラ インコーポレイテッド | ナノ細孔デバイスを使用して分子を検出するためのセンシング組成物、方法、およびデバイス |
| EP3898643B1 (en) | 2018-12-19 | 2024-04-17 | Roche Diagnostics GmbH | 3' reversibly protected nucleotides for sequencing by synthesis using nanopores |
| CN112898575B (zh) * | 2019-12-03 | 2022-10-21 | 深圳清华大学研究院 | 树杈状大分子修饰的核苷酸的制备方法 |
| CN115843309A (zh) * | 2020-07-02 | 2023-03-24 | 成都今是科技有限公司 | 核酸测序方法及装置 |
| WO2022033998A1 (en) | 2020-08-11 | 2022-02-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleoside-5'-oligophosphates tagged with positively-charged polymers, nanopores incorporating negative charges, and methods and systems using the same |
| EP4355757A1 (en) | 2021-06-17 | 2024-04-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Nucleoside-5 -oligophosphates having a cationically-modified nucleobase |
| EP4355912A1 (en) * | 2021-06-17 | 2024-04-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Engineered nanopore with a negatively charged polymer threaded through the channel |
| WO2023278750A1 (en) * | 2021-07-02 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Polynucleotide sequencing using ionophores |
| WO2023213766A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods that reduce prussian blue formation during nanopore sequencing |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013154999A2 (en) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of preparation of nanopore and uses thereof |
| US20140309144A1 (en) * | 2009-04-10 | 2014-10-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nanopore sequencing using charge blockade labels |
| WO2015148402A1 (en) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York | Chemical methods for producing tagged nucleotides |
| CN105874069A (zh) * | 2013-12-20 | 2016-08-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 改进的dna聚合酶寡核苷酸抑制剂 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5795782A (en) | 1995-03-17 | 1998-08-18 | President & Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
| US6362002B1 (en) | 1995-03-17 | 2002-03-26 | President And Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
| US6267872B1 (en) | 1998-11-06 | 2001-07-31 | The Regents Of The University Of California | Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same |
| US7056661B2 (en) | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| US6464842B1 (en) | 1999-06-22 | 2002-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Control of solid state dimensional features |
| US6627067B1 (en) | 1999-06-22 | 2003-09-30 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular and atomic scale evaluation of biopolymers |
| WO2001018251A1 (en) | 1999-09-07 | 2001-03-15 | The Regents Of The University Of California | Methods of determining the presence of double stranded nucleic acids in a sample |
| US20030104428A1 (en) | 2001-06-21 | 2003-06-05 | President And Fellows Of Harvard College | Method for characterization of nucleic acid molecules |
| JP4318296B2 (ja) | 2001-08-29 | 2009-08-19 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | 標識ヌクレオシドポリホスフェート |
| US7005264B2 (en) | 2002-05-20 | 2006-02-28 | Intel Corporation | Method and apparatus for nucleic acid sequencing and identification |
| US6870361B2 (en) | 2002-12-21 | 2005-03-22 | Agilent Technologies, Inc. | System with nano-scale conductor and nano-opening |
| WO2005017025A2 (en) | 2003-08-15 | 2005-02-24 | The President And Fellows Of Harvard College | Study of polymer molecules and conformations with a nanopore |
| US7462452B2 (en) | 2004-04-30 | 2008-12-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Field-switch sequencing |
| US8889348B2 (en) | 2006-06-07 | 2014-11-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by nanopore using modified nucleotides |
| CN103282518B (zh) | 2010-12-17 | 2016-11-16 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序 |
| BR122019001001B1 (pt) | 2011-10-26 | 2019-08-27 | Monsanto Technology Llc | sais herbicidas de auxina, mistura de aplicação herbicida compreendendo os mesmos para uso na eliminação e controle do crescimento de plantas indesejadas, bem como métodos de controle de plantas indesejadas e de plantas suscetíveis ao herbicida de auxina |
| CN107828877A (zh) | 2012-01-20 | 2018-03-23 | 吉尼亚科技公司 | 基于纳米孔的分子检测与测序 |
| EP2864502B1 (en) | 2012-06-20 | 2019-10-23 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules |
| US9605309B2 (en) | 2012-11-09 | 2017-03-28 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
| CN107109479B (zh) | 2014-10-31 | 2021-07-06 | 吉尼亚科技公司 | 具有改变的特征的α-溶血素变体 |
| WO2016144973A1 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pore-forming protein conjugate compositions and methods |
| US10526588B2 (en) | 2015-05-14 | 2020-01-07 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Polymerase variants and uses thereof |
| WO2017024049A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single-molecule nanofet sequencing systems and methods |
| EP4303314A3 (en) | 2015-09-10 | 2024-04-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Polypeptide tagged nucleotides and use thereof in nucleic acid sequencing by nanopore detection |
| CN108137656A (zh) | 2015-09-24 | 2018-06-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | α-溶血素变体 |
| US10351908B2 (en) | 2016-04-21 | 2019-07-16 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Alpha-hemolysin variants and uses thereof |
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| WO2018002125A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Long lifetime alpha-hemolysin nanopores |
| WO2018026855A1 (en) | 2016-08-01 | 2018-02-08 | Roswell Biotechnologies, Inc. | Modified nucleotide triphosphates for molecular electronic sensors |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140309144A1 (en) * | 2009-04-10 | 2014-10-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nanopore sequencing using charge blockade labels |
| WO2013154999A2 (en) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of preparation of nanopore and uses thereof |
| CN105874069A (zh) * | 2013-12-20 | 2016-08-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 改进的dna聚合酶寡核苷酸抑制剂 |
| WO2015148402A1 (en) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York | Chemical methods for producing tagged nucleotides |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CARL W FULLER等: "Real-time single-molecule electronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanopore array", 《PROC NATL ACAD SCI USA》 * |
| 刘鹤: "硒化物纳米材料的制备及其在生物传感器中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115052882A (zh) * | 2020-02-06 | 2022-09-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 减少模板穿入纳米孔的组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |