JP2006503580A - 改良型Sso7−ポリメラーゼ複合体タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
ポリメラーゼの活性は、配列非特異的二本鎖核酸結合ドメインを酵素またはその触媒ドメインに連結することにより改良し得る(例えばWO第0192501号を参照のこと)。そのような修飾型ポリメラーゼは、非修飾型酵素と比較して増加した伸長性を示す。しかし場合によっては、これらの改良型ポリメラーゼの伸長性をさらに修飾することが有用である場合がある。例えば、長い鋳型に対してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う場合、伸長性の高いポリメラーゼを使用することによって収量が低くなる場合が多い。したがって、ポリメラーゼの伸長性を修飾して、特定の目的、例えばロングPCRに対して酵素を最適化する必要性が存在する。
本発明は、修飾した伸長性を有するポリメラーゼを提供する。いくつかの態様において、ポリメラーゼはまたプライマー/鋳型結合特異性の増大を示す。詳細には、本発明は、表面残基の置換により、野生型Sso7-ポリメラーゼ融合物の伸長性よりも低く、かつSso7dドメインに融合していない場合のポリメラーゼドメインの伸長性よりも高い伸長性がもたらされる;SEQ ID NO:2を参照して決定される表面残基位置のアミノ酸が別のアミノ酸残基で置換された;ポリメラーゼドメインに連結された、SEQ ID NO:2と少なくとも60%の同一性を有するSso7ドメインを含むSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質を提供する。また多くの場合、表面残基の置換により、SEQ ID NO:2を含むSso7ポリメラーゼ融合タンパク質と比較して、ポリメラーゼのプライマー/鋳型結合特異性が増加する。
定義
「Sso7」または「Sso7 DNA結合ドメイン」または「Sso7様DNA結合ドメイン」という用語は、(1) SEQ ID NO:2のSso7配列と、好ましくは少なくとも約15、25、35、50、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約60%を超えるアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する;(2) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列およびその保存的に修飾された変種を含む免疫原に対して作製された抗体、例えばポリクローナル抗体に結合する;(3) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、SEQ ID NO:1のSso7核酸配列およびその保存的に修飾された変種に特異的にハイブリダイズする;(4) SEQ ID NO:1と、好ましくは少なくとも約50、100、150、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、約50%を超える、好ましくは約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する;または(5) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、
等のプライマーセットと同じ配列に特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、核酸およびポリペプチド多型変種、対立遺伝子、変異体、ならびに種間相同体を指す。本用語には、全長Sso7ポリペプチド、および配列非特異的二本鎖DNA結合活性を有するポリペプチドの断片の両方が含まれる。
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T);および
8) システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと)。
本発明は、野生型Sso7融合ポリメラーゼと比較して修飾された伸長性および/または増加した特異性を示す変種Sso7ポリメラーゼ複合体を提供する。これらのポリメラーゼ反応は、多くの場合、非修飾型ポリメラーゼまたは野生型Sso7融合ポリメラーゼと比較してより効率的であり、より多くの産物を産生する。変種融合ポリメラーゼは、ポリメラーゼドメインおよびこれに連結されたSso7結合ドメインを含む。Sso7結合ドメインは、表面位置のアミノ酸残基が既知である野生型Sso7のその位置に存在しないアミノ酸に置換されたSso7を含む。
DNAポリメラーゼは当業者に周知である。これらには、DNA依存性ポリメラーゼおよび逆転写酵素等のRNA依存性ポリメラーゼの両方が含まれる。DNA依存性DNAポリメラーゼには少なくとも5つのファミリーが周知であるが、大部分はファミリーA、B、およびCに分類される。種々のファミリー間には、構造的類似性または配列類似性がほとんどまたは全くない。大部分のファミリーAポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性、および5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含み得る一本鎖タンパク質である。ファミリーBポリメラーゼは典型的に、ポリメラーゼおよび3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する1つの触媒ドメイン、および補助因子を有する。ファミリーCポリメラーゼは典型的に、ポリメラーゼ活性および3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する複数サブユニットのタンパク質である。大腸菌(E. coli)では、3種のDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI(ファミリーA)、II(ファミリーB)、およびIII(ファミリーC)が見出されている。真核細胞では、3つの異なるファミリーBポリメラーゼ、DNAポリメラーゼα、δ、およびεが核の複製に関与しており、ファミリーAポリメラーゼ、ポリメラーゼγがミトコンドリアDNAの複製に使用される。他の種類のDNAポリメラーゼには、ファージポリメラーゼが含まれる。
本発明のポリメラーゼは、表面残基位置においてアミノ酸置換を有するSso7ポリペプチド配列を含む。Sso7dは、超好熱性古細菌スルフォロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus sulfataricus)由来の小さな(63アミノ酸、分子量 約7,000 kd)塩基性染色体タンパク質である。このタンパク質はリジンが豊富であり、高い熱、酸、および化学安定性を有する。このタンパク質は配列非依存的にDNAに結合し、結合した場合、ある条件下でDNAのTMを最高で40℃まで上昇させる(McAfee et al., Biochemistry 34:10063-10077, 1995)。Sso7dおよびその相同体は典型的に、ゲノムDNAのパッケージングおよび高温でのゲノムDNAの安定化に関与すると考えられている。
本発明で使用するための他の適切なSso7 DNA結合ドメインは、Sso7dに対する配列相同性に基づいて同定することができる。典型的には、約30アミノ酸、任意には約50〜70アミノ酸、または完全なタンパク質の長さの比較領域にわたって、既知の配列非特異的二本鎖核酸結合タンパク質と約60%のアミノ酸配列同一性、任意には、約70%、75、80、85、90、または95〜98%のアミノ酸配列同一性を有するドメインを本発明において使用することができる。配列は、以下の配列比較アルゴリズムまたは手動アラインメントおよび目視検査により、比較領域または測定する指定領域にわたって最大一致が得られるように、比較およびアラインし得る。本発明にのためには、パーセントアミノ酸同一性は、BLASTの初期設定パラメータにより決定する。
本発明において使用するためのSso7 DNA結合タンパク質はまた、既知のSso7結合ドメインに結合する抗体、好ましくはポリクローナル抗体を用いた交差反応性により同定し得る。ポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製する(例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991);Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照のこと)。次に、免疫学的交差反応性結合タンパク質であるそれらタンパク質を、種々のアッセイ法により検出し得る。使用し得る種々の型式および条件の記載については、例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, 第37巻 (Asai, ed. 1993)、Colligan, 前記、およびHarlow & Lane, 前記を参照されたい。
本発明の複合体タンパク質のSso7 DNA結合ドメインおよびポリメラーゼドメイン、例えばSso7dおよびTaqポリメラーゼは、当業者に周知の方法により連結し得る。これらの方法には、化学的手段および組換え手段が含まれる。
典型的な態様において、本発明の複合体so7-ポリメラーゼタンパク質は、当技術分野において標準的技法である、タンパク質をコードする核酸の組換え発現により産生される。そのような融合産物は、当技術分野において周知の方法により、適切なコード枠において所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を相互に連結し、当技術分野において周知の方法によりその産物を発現させることによって作製し得る。
に見出される。
融合ポリペプチドを産生するための、当業者に周知である多くの発現システムが存在する(例えば、Gene Expression Systems, Fernandex and Hoeffler, Eds. Academic Pres, 1999;Sambrook $ Russel, 前記;およびAusubel et al, 前記を参照のこと)。典型的には、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望の宿主細胞において機能するプロモーターの制御下に配置する。非常に広範な種類のプロモーターが入手でき、特定の用途に応じて、本発明の発現ベクターにおいて使用し得る。通常、選択するプロモーターはプロモーターが働くことになる細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位等の他の発現制御配列もまた、任意に含める。1つまたは複数のこれら制御配列を含む構築物を「発現カセット」と称する。これに従い、連結したポリペプチドをコードする核酸を、所望の宿主細胞において高レベル発現するように組み込む。
本発明のSso7配列は、表面残基における置換を含む。当業者は、所与の核酸配列のこれらの変更を起こすまたは変種を作製する多くの方法が存在することを認識すると考えられる。そのような周知の方法には、部位特異的突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を作製するための連結および/またはクローニングと組み合わせて)、および他の周知の技法が含まれる。Giliman & Smith, Gene 8:81-97 (1979)、Roberts, et al., Nature 328:731-734 (1987)、ならびにSambrook、Innis、およびAusubel(すべて前記)を参照されたい。
本発明の融合ポリメラーゼは、非修飾型ポリメラーゼと比較して増加した伸長性および改善されたプライマー/鋳型結合特異性の両方を含む、活性の調節を示す。活性は、当技術分野において標準的な技法により測定し得る。
実施例1:変異体Sso7-ΔTaq融合物の構築
連続PCRを用いて、SEQ ID NO:2に記載の野生型Sso7d-ΔTaqのW24をコードするコドンに点突然変異を導入した。1ラウンド目のPCRにおいて、プライマー対
を用いて、pYW1から対応する領域を増幅した(PCT公報WO第01/92501号を参照のこと)。第1 PCRの産物を精製し、2ラウンド目のPCRにおいてプライマーM13Rおよび1008Rと混合して、400 bp断片を産生した。この断片を制限酵素EcoRIおよびBstXIで消化し、pYW1の対応する部位に挿入した。プライマーW24-Tは5'末端から23位の位置に縮重ヌクレオチドを含み、そのため最終的なオリゴヌクレオチドはこの位置においてG、T、A、およびCをそれぞれ25%含む混合集団となる。結果として、コドンGNGは変異体融合タンパク質において以下の4つのアミノ酸、Gly(GGG)(SEQ ID NO:3;太字および下線);Val(GTG)(SEQ ID NO:5;太字および下線);Glu(GAG)(SEQ ID NO:7;太字および下線);またはAla(GCG)(SEQ ID NO:5;太字および下線のうちの1つのコードする。
構造研究によれば(Gao et al., Nature Struct. Boil. 5:782-786, 1998)、野生型Sso7dのW24残基は、その積み重なっていない位置において塩基の固定に関与している。本実施例では、この位置における変異により、融合タンパク質のプライマー-鋳型結合特異性が増加することを示す。
は、λDNAに対して完全に相補的である。ミスマッチプライマー
は、λDNA鋳型に相補的でない2つの塩基(5'末端から5位および6位の位置)を含む。同じ適合リバースプライマー、
を57Fまたは57F5/6とともに使用し、675 bpの単位複製配列を産生した。用いたサイクリングプログラムは以下の通りである:94℃-1分、20x(94℃-10秒、50〜74℃-30秒、72℃-1分)、72℃-10分。TE緩衝液に溶解したピコグリーン(PicoGreen)希釈物(1:200 ピコグリーン:TE)および蛍光プレートリーダーを用いて、PCR産物の最終収量を定量した。各酵素について、一方はプライマー57Fおよび732Rを使用し、もう一方はプライマー57F5/6および732Rを使用する、2つのPCR増幅を行った。
融合タンパク質の伸長性の増強にはSso7dとds DNAとの結合相互作用が重要であるため、導入した変異によって増強が消滅する可能性がある。伸長アッセイ法(WO第01/92501号を参照のこと)を用いて、Sso7dの残基W24において変異を含む融合タンパク質の伸長性を測定し、その結果を表2に要約する。3つの変異体タンパク質のうちの2つ、W24GおよびW24Vは、非修飾型タンパク質、ΔTaqよりも2倍高い伸長性を依然として維持した。W24E置換を含む変異体タンパク質は、非修飾型タンパク質と同程度の伸長性を示す。これらの結果から、この位置における異なる変異が、融合タンパク質の伸長性に対して差次的な影響を有することが示唆される。
PCR増幅において、変異体タンパク質を野生型タンパク質と比較した。比較においては2つの基準を用いた。一方は増幅の初期サイクルにおける酵素の効率を反映する、qPCR増幅における閾値サイクル(Ct)値であり、もう一方は増幅の後期サイクルにおける酵素の効率を反映するPCR産物の最終収量である。SYBRグリーンに基づくqPCR反応を用いて、ヒトゲノムDNAから2つのβアクチン単位複製配列、BA481およびBA203を増幅した。反応物は、最終濃度1x SYBRグリーンIおよび2 mM MgCl2を含んだ。55.8℃〜72.1℃のアニーリング勾配を用いた。Ct値を表3に要約する。野生型融合タンパク質およびSso7d(G)融合タンパク質に関して、非常に類似したCt値(<1サイクル相違)が得られ、初期サイクルにおける2つの酵素間に有意な相違がないことが示唆される。
Claims (36)
- 表面残基の置換により、野生型Sso7-ポリメラーゼ融合物の伸長性よりも低く、かつSso7dドメインに融合していない場合のポリメラーゼドメインの伸長性よりも高い伸長性がもたらされる、
SEQ ID NO:2を参照して決定される表面残基位置のアミノ酸が別のアミノ酸残基で置換された;ポリメラーゼドメインに連結された、SEQ ID NO:2と少なくとも60%の同一性を有するSso7ドメインを含む、Sso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。 - 表面残基位置が、24位のトリプトファン残基、26位のバリン残基、および29位のメチオニン残基からなる群より選択される、請求項1記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 表面残基位置が24位のトリプトファン残基であり、置換アミノ酸残基が、Asp、Glu、Arg、Lys、またはPro以外の任意のアミノ酸である、請求項2記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基が、グリシン、バリン、およびアラニンからなる群より選択される、請求項3記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基がグリシンである、請求項4記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基がバリンである、請求項4記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインが耐熱性ポリメラーゼ活性を有する、請求項1、2、3、4、5、または6のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがファミリーAポリメラーゼドメインである、請求項7記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがΔTaqポリメラーゼドメインである、請求項8記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがポリメラーゼBファミリーのメンバーである、請求項7記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがパイロコッカスポリメラーゼドメインである、請求項10記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- Sso7ドメインが、表面残基位置のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたSEQ ID NO:2を含む、請求項1記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- Sso7ドメインが、24位のトリプトファン残基がグリシン、アラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されたSEQ ID NO:2を含む、請求項1記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 表面残基の置換により、SEQ ID NO:2を含むSso7ポリメラーゼ融合タンパク質と比較して、ポリメラーゼのプライマー/鋳型結合特異性が増加した、請求項1記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 表面残基位置が、24位のトリプトファン残基、26位のバリン残基、および29位のメチオニン残基からなる群より選択される、請求項14記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 表面残基位置が24位のトリプトファン残基であり、置換アミノ酸残基が、Asp、Glu、Arg、Lys、またはPro以外の任意のアミノ酸である、請求項15記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基が、グリシン、バリン、およびアラニンからなる群より選択される、請求項16記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基がグリシンである、請求項17記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 置換アミノ酸残基がバリンである、請求項17記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインが耐熱性ポリメラーゼ活性を有する、請求項14、15、16、17、18、または19のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがファミリーAポリメラーゼドメインである、請求項20記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- ポリメラーゼドメインがΔTaqポリメラーゼドメインである、請求項21記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- Sso7ドメインが、表面残基位置のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたSEQ ID NO:2を含む、請求項14記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- Sso7ドメインが、24位のトリプトファン残基がグリシン、アラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されたSEQ ID NO:2を含む、請求項14記載のSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質。
- 以下の段階を含む、溶液中に存在する標的核酸に対してポリメラーゼ反応を調節する方法:
(a) 溶液が、結合ドメインの標的核酸への結合、およびポリメラーゼドメインによる標的核酸配列にハイブリダイズしたプライマーの伸長を可能にする組成物であって;
SEQ ID NO:2を参照して決定される表面残基位置のアミノ酸が、野生型Sso7タンパク質の表面残基位置に存在しないアミノ酸残基で置換され;かつ表面残基の置換により、Sso7dドメインに融合していない場合のポリメラーゼドメインの伸長性よりも高い伸長性がもたらされる;ポリメラーゼドメインに連結された、SEQ ID NO:2と少なくとも60%の同一性を有するSso7dドメインを含むSso7ポリメラーゼ複合体タンパク質と標的核酸とを接触させる段階;ならびに
(b) ポリメラーゼによってプライマーが伸長する条件下で、溶液をインキュベートする段階。 - 表面残基の置換により、SEQ ID NO:2を含むSso7ポリメラーゼ融合タンパク質と比較して、ポリメラーゼのプライマー/鋳型結合特異性が増加する、請求項25記載の方法。
- 表面残基位置が、24位のトリプトファン残基、26位のバリン残基、および29位のメチオニン残基からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
- 表面残基が24位のトリプトファン残基であり、置換残基が、トリプトファンの側鎖体積よりも小さい側鎖体積を有して中性または正電荷である、請求項27記載の方法。
- 置換アミノ酸残基が、グリシン、バリン、およびアラニンからなる群より選択される、請求項28記載の方法。
- アミノ酸残基がグリシンである、請求項29記載の方法。
- アミノ酸残基がバリンである、請求項29記載の方法。
- ポリメラーゼドメインが耐熱性ポリメラーゼ活性を有する、請求項25記載の方法。
- ポリメラーゼドメインがファミリーAポリメラーゼドメインである、請求項32記載の方法。
- ポリメラーゼドメインがファミリーBポリメラーゼドメインである、請求項32記載の方法。
- ポリメラーゼドメインがΔTaqポリメラーゼドメインである、請求項32記載の方法。
- Sso7ドメインが、24位のトリプトファン残基がグリシン、アラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されたSEQ ID NO:2を含む、請求項25記載の方法。
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