ES2344892T3 - Proteinas conjugadas de ss07-polimerasa mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Una proteína conjugada de Sso7-polimerasa que comprende un dominio Sso7 que tiene una identidad de al menos el 60% con la SEC ID Nº 2 unido a un dominio polimerasa; en la que un aminoácido en una posición del dominio Sso7 que es una posición de resto superficial según se determina con respecto a la SEC ID Nº 2 se sustituye con un resto aminoacídico diferente, en el que los restos superficiales son restos expuestos en la superficie del dominio Sso7 que interacciona con el ADN; en el que la sustitución del resto superficial da como resultado una capacidad de procesamiento que es inferior a la capacidad de procesamiento de una fusión de Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está fusionado a un dominio Sso7.
Description
Proteínas conjugadas de
Sso7-polimerasa mejoradas.
La actividad de una polimerasa puede mejorarse
uniendo un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario
inespecífico de secuencia a la enzima, o su dominio catalítico
(véase, por ejemplo, el documento WO0192501). Dichas polimerasas
modificadas presentan una capacidad de procesamiento mejorada en
comparación con las enzimas no modificadas. En algunos casos, sin
embargo, puede ser útil modificar adicionalmente la capacidad de
procesamiento de estas polimerasas mejoradas. Por ejemplo, cuando
se realizan reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para moldes
largos, el uso de polimerasas de alta capacidad de procesamiento con
frecuencia da como resultado menores rendimientos. Por lo tanto,
existe la necesidad de modular la capacidad de procesamiento de
polimerasa para optimizar la enzima para fines específicos, por
ejemplo PCR larga.
Además, la modificación de polimerasa con un
dominio de unión a ácido nucleico bicatenario inespecífico de
secuencia puede en algunos casos disminuir la discriminación de la
polimerasa entre cebadores/moldes emparejados erróneamente y
cebador/molde emparejado apropiadamente. Por lo tanto, también puede
existir la necesidad de aumentar la especificidad de una polimerasa
por el molde de cebador.
La presente invención aborda ambas necesidades,
es decir, la necesidad de modular la capacidad de procesamiento y
la especificidad de unión a cebador/molde. La invención proporciona
un conjugado de polimerasa que comprende un dominio de unión a ADN
mutado tal como Sso7d, Sac7d o dominios relacionados unidos a la
polimerasa o al dominio catalítico de la polimerasa. El dominio de
unión mutado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un
resto de superficie de la secuencia polipeptídica del dominio de
unión a ADN. Estas polimerasas de fusión sustituidas presentan
capacidades de rendimiento aumentadas en reacciones de polimerasas,
por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
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Esta invención proporciona polimerasas que
tienen una capacidad de procesamiento modulada. En algunas
realizaciones, la polimerasa también presenta una especificidad de
unión cebador/molde aumentada. En particular, la invención
proporciona una proteína conjugada de Sso7 polimerasa que comprende
un dominio Sso7 que tiene una identidad de al menos el 60% con la
SEC ID Nº: 2 unida a un dominio polimerasa; en la que un aminoácido
en una posición del dominio Sso7 que es una posición de resto de
superficie según se determinó con respecto a la SEC ID Nº: 2 se
sustituye con un resto aminoacídico diferente, en el que los restos
superficiales son restos expuestos en la superficie del dominio
Sso7 que interacciona con el ADN; en el que la sustitución del resto
superficial da como resultado una capacidad de procesamiento que es
inferior a la capacidad de procesamiento de una fusión de
Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la
capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está
fusionado con un dominio Sso7d. Con frecuencia, la sustitución del
resto superficial también aumenta la especificidad de unión a
cebador/molde de polimerasa en comparación con una proteína de
fusión de Sso7-polimerasa que comprende la SEC ID
Nº: 2.
En algunas realizaciones, la posición de resto
superficial se selecciona del grupo que consiste en un resto
triptófano en posición 24, un resto valina en posición 26 y un resto
metionina en posición 29. En realizaciones particulares, la
posición de resto superficial es un resto triptófano en posición 24
y el resto aminoacídico de sustitución es cualquier aminoácido
distinto de Asp, Glu, Arg, Lys o Pro. Con frecuencia, el resto
aminoacídico de sustitución es glicina, valina o alanina.
En realizaciones preferidas, el dominio
polimerasa de los conjugados tiene una actividad polimerasa
térmicamente estable. El dominio polimerasa puede ser un dominio
polimerasa de familia A, por ejemplo un dominio polimerasa de
Thermus o un dominio polimerasa de familia B, por ejemplo, un
dominio polimerasa de Pyrococcus. Con frecuencia, el dominio
de polimerasa es un dominio de \DeltaTaq polimerasa.
En otras realizaciones, el dominio Sso7
comprende la SEC ID Nº: 2, en la que un aminoácido en una posición
que es una posición de resto superficial se sustituye por un
aminoácido diferente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el
dominio Sso7 comprende la SEC ID Nº: 2, en la que un resto
triptófano en posición 24 se sustituye con un resto aminoacídico
seleccionado de un grupo que consiste en glicina, alanina y
valina.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método de realización de una reacción de polimerasa en un ácido
nucleico diana presente en una solución, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto el ácido nucleico diana con una proteína
conjugada de Sso7-polimerasa como se ha descrito
anteriormente; en el que la solución es de una composición que
permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico diana y el
dominio polimerasa extienda un cebador que hibride con la secuencia
de ácido nucleico diana; y (b) incubar la solución en condiciones en
las que el cebador se extiende por la polimerasa.
La descripción también proporciona métodos de
preparación y uso de los conjugados de polimerasa descritos en este
documento para modular una reacción de polimerasa.
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La Figura 1 representa los resultados de una
reacción de PCR que compara
Sso7d(G)-\DeltaTaq con la proteína de
fusión de tipo silvestre Sso7d-\DeltaTaq. Los
productos de PCR finales se analizaron en un gel de agarosa al 1%
para evaluar los rendimientos relativos.
La Figura 2 muestra un alineamiento de Sac7e
(SEC ID Nº: 10) y Sso7 (SEC ID Nº: 9). Péptidos de consenso = SEC ID
Nº: 11-14.
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Las expresiones "Sso7" o "dominio de
unión de ADN Sso7" o "dominio de unión a ADN tipo Sso7" se
refieren a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos
interespecie de polipéptido y ácido nucleico que: (1) tienen una
secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de
aminoácidos superior a aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, preferiblemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o
99% o una identidad de secuencias de aminoácidos superior,
preferiblemente sobre una región de al menos aproximadamente 15, 25,
35, 50 o más aminoácidos con la secuencia de Sso7 de la SEC ID Nº:
2; (2) se unen a anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales
generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y variantes modificadas de forma
conservativa de la misma; (3) hibridan específicamente en
condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de ácido
nucleico de Sso7 de la SEC ID Nº: 1 y variantes modificadas de
forma conservativa de la misma; (4) tienen una secuencia de ácido
nucleico que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos
superior a aproximadamente el 50%, preferiblemente superior a
aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98% o 99%, preferiblemente sobre una región de al menos
aproximadamente 50, 100, 150 o más nucleótidos con la SEC ID Nº: 1;
o (5) se amplifican por cebadores que hibridan específicamente en
condiciones de hibridación rigurosas con la misma secuencia que un
conjunto de cebadores tal como 5'GCAACAG
TAAAGTTCAAGTACAAAGG 3' (SEC ID Nº: 15) (directo) y 5' CTAACATTTGTAGTAGTTCTTTTGGAGCG 3' (SEC ID Nº: 16), (inverso). El término influye tanto polipéptidos Sso7 de longitud completa como fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de unión a ADN bicatenario inespecífica de secuencia.
TAAAGTTCAAGTACAAAGG 3' (SEC ID Nº: 15) (directo) y 5' CTAACATTTGTAGTAGTTCTTTTGGAGCG 3' (SEC ID Nº: 16), (inverso). El término influye tanto polipéptidos Sso7 de longitud completa como fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de unión a ADN bicatenario inespecífica de secuencia.
El término "dominio" se refiere a una
unidad de una proteína o complejo proteico que comprende una
subsecuencia polipeptídica, una secuencia polipeptídica completa o
una pluralidad de secuencias polipeptídicas en las que la unidad
tiene una función definida. La función se entiende que está definida
ampliamente y puede ser unión al ligando, actividad catalítica o
puede tener un efecto estabilizante sobre la estructura de la
proteína.
El término "idéntico" en el contexto de dos
secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas se refiere a los
restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para
una correspondencia máxima, según se mide usando "algoritmos de
comparación de secuencias" descritos en la sección a continuación
titulada "Identificación de dominios Sso7 basándose en la
homología".
Un "Sso7 de tipo silvestre" se refiere a
una proteína Sso7 de origen natural. Una "secuencia de aminoácidos
de Sso7 de tipo silvestre" se refiere a la secuencia de
aminoácidos de origen natural.
Un "conjugado de
Sso7-polimerasa" se refiere a una polimerasa
modificada que comprende al menos un dominio de unión a ADN Sso7
unido a un dominio polimerasa o una subunidad catalítica del dominio
polimerasa. Un "conjugado de Sso7-polimerasa
sustituido" se refiere a un conjugado en el que al menos un resto
aminoacídico de posición superficial se sustituye con un resto
aminacídico que no aparece en esa posición en una secuencia Sso7
nativa. Un "conjugado de Sso7-polimerasa"
puede comprender múltiples dominios de unión a Sso7.
El término "eficacia" en el contexto de una
enzima modificadora de ácido nucleico de esta invención se refiere
a la capacidad de la enzima de realizar su función catalítica en
condiciones de reacción específicas. Típicamente, la
"eficacia" como se define en este documento está indicada por
la cantidad de producto generado en condiciones de reacción
dadas.
El término "aumenta" en el contexto de una
enzima se refiere a mejorar la actividad de la enzima, es decir,
aumentar la cantidad de producto por unidad de enzima por unidad de
tiempo.
El término "fusionado" se refiere a la
unión por enlace covalente.
El término "heterólogo", cuando se usa con
referencia a porciones de una proteína indica que la proteína
comprende dos o más dominios que no se encuentran en la misma
relación entre sí en la naturaleza. Dicha proteína, por ejemplo,
una proteína de fusión, contiene dos o más dominios de proteínas no
relacionadas organizadas para generar una nueva proteína
funcional.
El término "unir" se refiere a cualquier
método conocido en la técnica para conectar funcionalmente dominios
proteicos, incluyendo sin limitación fusión recombinante con o sin
dominios intermedios, fusión mediada por inteína, asociación no
covalente y formación de enlaces covalentes, incluyendo formación de
enlaces disulfuro; formación de enlaces de hidrógeno; formación de
enlaces electroestáticos; y formación de enlaces conformacionales,
por ejemplo, asociaciones de antígeno-anticuerpo y
biotina-avidina.
Un resto aminoacídico ``que tiene un volumen de
cadena lateral que es inferior al volumen de cadena lateral del
triptófano se refiere a un resto aminoacídico con una cadena lateral
que es menos voluminosa que la del triptófano. Dicha cadena lateral
típicamente tiene un volumen de menos de aproximadamente 170
\ring{A}^{3}.
El término "polimerasa" se refiere a una
enzima que realiza una síntesis dirigida por molde de
polinucleótidos. El término incluye tanto el polipéptido de longitud
completa como un dominio que tenga actividad polimerasa.
La "capacidad de procesamiento" se refiere
a la capacidad de una polimerasa para permanecer unida al molde o
sustrato y realizar la síntesis de ADN. La capacidad de
procesamiento se mide por el número de acontecimientos catalíticos
que tienen lugar por acontecimiento de unión.
La expresión "polimerasa térmicamente
estable" como se usa en este documento se refiere a cualquier
enzima que cataliza síntesis de polinucleótidos por adición de
unidades de nucleótido a una cadena de nucleótidos usando ADN o ARN
como molde y tiene una actividad óptima a una temperatura por encima
de 45ºC.
La "polimerasa de Thermus" se
refiere a una ADN polimerasa de familia A aislada de cualquier
especie de Thermus incluyendo sin limitación Thermus
aquaticus, Thermus brockianus y Thermus thennophilus;
cualesquiera enzimas recombinantes procedentes de especies de
Thermus y cualquier derivado funcional de las mismas, ya se
obtenga por modificación genética o modificación química u otros
métodos conocidos en la técnica.
La expresión "reacción de amplificación" se
refiere a cualquier medio in vitro para multiplicar las
copias de una secuencia diana de ácido nucleico. Dichos métodos
incluyen pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), reacción en cadena de la ADN ligasa (véanse las Patentes de
Estados Unidos 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), (LCR),
ARN replicasa de QBeta y reacciones de amplificación basadas en
transcripción de ARN (tal como TAS y 3SR) así como otras conocidas
por los expertos en la materia.
El término "amplificar" se refiere a una
etapa de someter una solución a condiciones suficientes para
permitir la amplificación de un polinucleótido si todos los
componentes de la reacción están intactos. Los componentes de una
reacción de amplificación incluyen, por ejemplo, cebadores, un molde
polinucleotídico, polimerasa, nucleótidos y similares. El término
"amplificar" se refiere típicamente a un aumento
"exponencial" en ácido nucleico diana. Sin embargo, el término
"amplificar" como se usa en este documento también puede
referirse a aumentos lineales en el número de una secuencia de
ácido nucleico diana seleccionada, tal como se obtiene con
secuenciación cíclica.
La expresión "mezcla de reacción de
amplificación" se refiere a una solución acuosa que comprende los
diversos reactivos usados para amplificar un ácido nucleico diana.
Éstos incluyen enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores de
amplificación, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato.
Dependiendo del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de reacción
de amplificación completa o incompleta.
La "reacción en cadena de la polimerasa" o
"PCR" se refiere a un método por el que un segmento específico
o subsecuencia de un ADN bicatenario diana se amplifica en una
progresión geométrica. La PCR es bien conocida por los expertos en
la materia; véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos
4.683.195 y 4.683.202; y PCR Protocols: Guide to Methods and
Applications, Innis et al., eds, 1990. Las condiciones de
reacción de PCR ejemplares comprenden típicamente ciclos de dos o
tres etapas. Los ciclos de dos etapas tienen una etapa de
desnaturalización seguida de una etapa de hibridación/elongación.
Los ciclos de tres etapas comprenden una etapa de desnaturalización
seguida de una etapa de hibridación seguida de una etapa de
elongación separada.
La expresión "PCR larga" se refiere a la
amplificación de un fragmento de ADN de 5 kb o más largo de
longitud. Se realiza una PCR larga típicamente usando polimerasas
especialmente adaptadas o mezclas de polimerasas (véase, por
ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.436.149 y 5.512.462)
que son distintas de las polimerasas usadas convencionalmente para
amplificar productos más cortos.
Un "cebador" se refiere a una secuencia
polinucleotídica que hibrida con una secuencia en un ácido nucleico
diana y sirve como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico.
Los cebadores pueden ser de una diversidad de longitudes y con
frecuencia son de menos de 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo
de 12-30 nucleótidos de longitud. La longitud y
secuencias de cebadores para su uso en PCR puede diseñarse basándose
en principios conocidos por los expertos en la materia, véase por
ejemplo, Innis et al., anteriormente.
Un "perfil de temperatura" se refiere a la
temperatura y duraciones de tiempo de las etapas de
desnaturalización, hibridación y/o extensión de una reacción de
secuenciación cíclica o PCR. Un perfil de temperatura para una
reacción de secuenciación cíclica o PCR consiste típicamente en de
10 a 60 repeticiones de perfiles de temperatura más cortos
idénticos o similares; cada uno de estos perfiles más cortos puede
definir típicamente un ciclo de dos etapas o tres etapas. La
selección de un perfil de temperatura se basa en diversas
consideraciones conocidas por los expertos en la materia, véase,
por ejemplo Innis et al., anteriormente. En reacción de PCR
larga como se describe en este documento, el tiempo de extensión
necesario para obtener un producto de amplificación de 5 kb o de una
longitud superior se reduce en comparación con mezclas de polimerasa
convencionales.
La "sensibilidad" de PCR se refiere a la
capacidad para amplificar un ácido nucleico diana que está presente
a baja concentración. La "baja concentración" se refiere a
10^{4}, con frecuencia 10^{3}, 10^{2}, 10^{1} o menos
copias de la secuencia diana por microlitro en la muestra de ácido
nucleico a amplificar.
La expresión "especificidad de unión a
cebador/molde de polimerasa" como se usa en este documento se
refiere a la capacidad de una polimerasa de fusión con Sso7 para
discriminar entre cebadores/moldes correctamente emparejados y
cebadores/moldes emparejados erróneamente. Un "aumento en la
especificidad de unión de cebador/molde de polimerasa" en este
contexto se refiere a una capacidad aumentada de polimerasas de
fusión con variante de Sso7 de la invención para discriminar entre
cebador/molde emparejado en comparación con una proteína de fusión
de Sso7-polimerasa de tipo silvestre que comprende
SEC ID Nº: 2.
Un "molde" se refiere a una secuencia
polinucleotídica bicatenaria que comprende el polinucleótido a
amplificar flanqueado por sitios de hibridación de cebador. Por lo
tanto, un "molde diana" comprende la secuencia polinucleotídica
diana flanqueada por sitios de hibridación para un cebador 5' y un
cebador 3'.
Una "polimerasa mejorada" incluye un
dominio de unión a ADN bicatenario inespecífico de secuencia unido a
la polimerasa o dominio polimerasa. Una "polimerasa no
mejorada" o "polimerasa no modificada" es una polimerasa que
no tiene un dominio de unión a ADN bicatenario inespecífico de
secuencia.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan indistintamente en este documento para
referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos se
aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos
aminoacídicos son un mimético químico artificial de un aminoácido de
origen natural correspondiente así como polímeros de aminoácidos de
origen natural y polímeros de aminoácidos no naturales.
El término "aminoácido" se refiere a
aminoácidos sintéticos y de origen natural así como análogos de
aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una forma
similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de
origen natural son los codificados por el código genético, así como
los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo
hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y
O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se
refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica
que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono \alpha
que se une a un hidrógeno, a un grupo carboxilo, un grupo amino, y
un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de
metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen
grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas
principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma
estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los
miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que
tienen una estructura que es diferente de la estructura química
general de un aminoácido pero que funciona de forma similar a un
aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos pueden denominarse en este
documento por cualquiera de sus símbolos de tres letras o por los
símbolos de una letra comúnmente conocidos recomendados por la
ICTPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Así
mismo los nucleótidos, pueden denominarse por sus códigos de una
sola letra comúnmente aceptados.
La expresión "variantes conservativamente
modificadas" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de
ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico
particulares, las variantes conservativamente modificadas se
refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de
aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la
degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos
funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por
ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el
aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que una
alanina está especificada por un codón, el codón puede modificarse
hacia cualquiera de los codones correspondientes descritos sin
modificar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido
nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de
variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido
nucleico en este documento que codifica un polipéptido también
describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un
experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto
AUG, que es comúnmente el único codón para metionina, y TGG, que es
comúnmente el único codón para triptófano) puede modificarse dar
una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada
variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En lo que se refiere a las secuencias de
aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones
o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico,
péptido, polipéptido o proteína que altere, añada o delecione un
solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la
secuencia codificada es una "variante conservativamente
modificada" cuando la alteración da como resultado la sustitución
de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas
de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos
funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas
variantes conservativamente modificadas son además de y no excluyen
las variantes polimórficas, homólogos interespecie y alelos de la
invención.
Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones en
las que un aminoácido alífático (G, A, I, L, o V) se sustituye con
otro miembro del grupo. De forma similar, un grupo polar alifático
sin carga tal como C, S, T, M, N, o Q, puede sustituirse con otro
miembro del grupo; y restos básicos, por ejemplo, K, R, o H, pueden
sustituirse unos por otros. En algunas realizaciones, un aminoácido
con una cadena lateral ácida E o D, puede sustituirse con su
homólogo sin carga Q o N, respectivamente; o viceversa. Cada uno de
los siguientes ocho grupos contiene otros aminoácidos ejemplares que
son sustituciones conservativas unos de otros:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),
Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano
(W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M)
(véase, por ejemplo Creighton, Proteins
(1984)).
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La presente invención proporciona conjugados de
Sso7-polimerasa variantes que presentan una
capacidad de procesamiento modulada y/o una especificidad aumentada
respecto a una polimerasa de fusión con Sso7 de tipo silvestre.
Estas reacciones de polimerasa con frecuencia son más eficaces y
producen más producto en comparación con polimerasas no modificadas
o polimerasas de fusión con Sso7 de tipo silvestre. Las polimerasas
de fusión variantes comprenden un dominio polimerasa con un dominio
de unión Sso7 unido al mismo. El dominio de unión Sso7 comprende un
Sso7 en el que los restos aminoacídicos en posiciones superficiales
se sustituyen con un aminoácido que no aparece en esa posición en un
Sso7 de tipo silvestre conocido.
Los expertos en la materia apreciarán que pueden
introducirse sustituciones para modular la capacidad de
procesamiento en el dominio de unión a ácido nucleico de una
polimerasa que comprende un dominio de unión a ácido nucleico
bicatenario inespecífico de secuencia heterólogo distinto de Sso7.
Por ejemplo pueden introducirse una o más sustituciones en
posiciones particulares (por ejemplo las que interaccionan con ADN)
del dominio de unión de ADN de una polimerasa quimérica que tiene
un dominio de unión
hélice-horquilla-hélice (HhH)
inespecífico de secuencia fusionado al dominio polimerasa (por
ejemplo, Pavlov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:
13510-13515, 2002).
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Las ADN polimerasas son bien conocidas por los
expertos en la materia. Incluyen tanto polimerasas dependientes de
ADN como polimerasas dependientes de ARN, tal como la transcriptasa
inversa. Se conocen al menos cinco familias de ADN polimerasas
dependientes de ADN aunque la mayoría se incluyen en las familias A,
B y C. Existe poca o ninguna similitud de secuencia o estructura
entre las diversas familias. La mayoría de polimerasas de la
familia A son proteínas de cadena sencilla que pueden contener
múltiples funciones enzimáticas incluyendo la polimerasa, actividad
exonucleasa de 3' a 5' y actividad exonucleasa de 5' a 3'. Las
polimerasas de familia B típicamente tienen un solo dominio
catalítico con actividad polimerasa y exonucleasa 3' a 5', así como
factores accesorios. Las polimerasas de la familia C son
típicamente proteínas multisubunidad con actividad polimerizante y
exonucleasa 3' a 5'. En E. coli, se han descubierto tres
tipos de ADN polimerasas, ADN polimerasas I (familia A), II
(familia B), y III (familia C). En células eucarióticas, tres
polimerasas de familia B diferentes, las ADN polimerasas \alpha,
\delta y \varepsilon, están implicadas en la replicación nuclear
y una polimerasa de la familia A, polimerasa \gamma, se usa para
la replicación de ADN mitocondrial. Otros tipos de ADN polimerasas
incluyen polimerasas de fagos.
De manera similar, las ARN polimerasas incluyen
típicamente ARN polimerasas eucariotas I, II y III y ARN polimerasas
bacterianas así como polimerasas virales y de fagos. Las ARN
polimerasas pueden ser dependientes de ADN y dependientes de
ARN.
En realizaciones específicas, se incorporan
dominios de Taq polimerasa en la proteína de fusión. En variantes
de polimerasas particulares tales como \DeltaTaq, que es una
versión genéticamente modificada de la ADN polimerasa Taq
convencional que carece de la actividad exonucleasa 5' a 3' (Lawyer
et al., J Biol Chem 264: 6427-6437 (1989)),
se usan con frecuencia en la construcción de las polimerasas de
fusión de la invención. Otras polimerasas de la familia A que
actúan de forma similar a Taq, por ejemplo, la polimerasa de
Thermus brockianus, que tiene una similitud de
aproximadamente el 90% con la Taq polimerasa, así como la polimerasa
de Thermus flavus y la polimerasa de Thermus
thermophilus, que tienen la actividad transcriptasa inversa,
también pueden usarse. Además, es probable que demuestren utilidad
polimerasas menos extremadamente termófilas tales como la
polimerasa de la familia A de Bacillus stearothermophilus,
así como polimerasas mesófilas tales como Pol I de E. coli y
sus derivados delecionados.
Las polimerasas de la familia B tales como las
polimerasas de Pyrococcus por ejemplo polimerasa de
Pfu también pueden usarse como dominio polimerasa que se
fusiona a un dominio Sso7 sustituido.
La actividad de una polimerasa puede medirse
usando ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Por
ejemplo, una actividad enzimática de procesamiento, tal como una
actividad polimerasa, puede medirse determinando la cantidad de
ácido nucleico sintetizado en una reacción, tal como una reacción en
cadena de la polimerasa. Como determinación de la eficacia relativa
de la enzima, la cantidad de producto obtenido por una polimerasa
que contiene un dominio de unión a ADN bicatenario inespecífico de
secuencia puede compararse después con la cantidad de producto
obtenido con la enzima polimerasa normal, que se describirá en más
detalle a continuación y en los ejemplos.
Un dominio polimerasa adecuado para su uso en la
invención puede ser la propia enzima o el dominio catalítico, por
ejemplo Taq polimerasa o un dominio de Taq con actividad polimerasa.
El dominio catalítico puede incluir aminoácidos adicionales y/o
puede ser una variante que contiene sustituciones, deleciones, o
adiciones de aminoácidos pero todavía conserva la actividad
enzimática.
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Las polimerasas de la invención comprenden una
secuencia polipeptídica Sso7 que tiene sustituciones de aminoácidos
en posiciones de restos superficiales. Sso7d es una proteína
cromosómica básica pequeña (63 aminoácidos, aproximadamente 7.000
kd PM), de la arqueobacteria hipertermófila Sulfolobus
solfataricus. La proteína es rica en lisina y tiene una alta
estabilidad térmica, ácida y química. Se une al ADN de una forma
independiente de secuencia y cuando se une, aumenta la T_{M} del
ADN en hasta 40ºC en algunas condiciones (McAfee et al.,
Biochemistry 34: 10063-10077, 1995). Se cree
típicamente que Sso7d y sus homólogos están implicados en el
empaquetamiento de ADN genómico y la estabilización de ADN genómico
a temperaturas elevadas. La secuencia proteica se expone en la SEC
ID Nº: 2.
Existen varias proteínas tipo Sso7d conocidas
(también denominadas proteínas Sso7) incluyendo, pero sin
limitación, Sac7a, Sac7b, Sac7d y Sac7e, de la arqueobacteria
hipertermófila S. acidocaldarius; y Ssh7a y Ssh7b,
Sulfolobus shibatae. Estas proteínas tienen una identidad
con Sso7d que varían del 78% al 98%. Otros dominios de Sso7 para su
uso en la invención también pueden identificarse como se expone a
continuación.
Las posiciones de restos superficiales de una
proteína Sso7 se determinan con respecto a la secuencia de Sso7d
expuesta en la SEC ID Nº: 2. Los restos superficiales son los restos
que están expuestos en la superficie de la proteína que
interacciona con las bases de doble hélice de ADN. Estos restos se
han identificado por medio de estudios estructurales de Sso7d
(véase, por ejemplo Gao et al., Nature Struct. Biol.
5: 782-786, 1998). Los aminoácidos superficiales de
superficie Trp24, Val26, Met29, Ser31, Arg43 y Ala45 de la SEC ID
Nº: 2 son restos superficiales que típicamente se sustituyen en las
polimerasas de fusión de la invención. Debería entenderse que
dichas designaciones de posición no indican el número de aminoácidos
en la molécula reivindicada por sí mismas pero indican donde en la
molécula reivindicada aparece el resto cuando la secuencia de la
molécula reivindicada está alineada máximamente con la SEC ID Nº 2.
El alineamiento puede realizarse de forma manual o usando un
algoritmo de comparación de secuencias descrito a continuación. Por
ejemplo, la proteína Sso7 sustituida en el extremo
N-terminal de la secuencia polimerasa de fusión
expuesta en la SEC ID Nº: 4 tiene una glicina sustituida para un
resto triptófano de origen natural. Esta sustitución aparece en el
resto aminoacídico 29 de la SEC ID Nº: 4. Sin embargo, con respecto
a la SEC ID Nº: 2, la sustitución es en la posición Trp24.
Basándose en alineamientos como se describe, los restos siguientes
están típicamente presentes en posiciones superficiales en
proteínas de Sso7 de tipo silvestre: 24-Trp;
26-Val; 29-Met;
31-Ser; 43-Arg; y
45-Ala.
Un ejemplo de un alineamiento de una proteína
Sso7, Sac7e, con la SEC ID Nº: 2 y la identificación de las
posiciones de restos superficiales se muestra en la Figura 2. El
alineamiento se obtuvo usando el programa BLAST del NCBI con los
parámetros por defecto (véase, por ejemplo, Altschul et al.,
Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Sac7e tiene
una identidad del 78% con la SEC ID Nº: 2. En la Figura 2 la
metionina de inicio de Sso7d (véase, la SEC ID Nº: 2) en la
posición 1 no se muestra. Por lo tanto, aunque el resto Ala es el
primer resto de la secuencia Sso7d mostrada en la Figura 2, se
corresponde con la posición 2 de la SEC ID Nº: 2. Como se ha
indicado anteriormente, los restos superficiales de Sso7d son el Trp
en posición 24, la Val en posición 26, la Met en posición 29, la
Ser en posición 31, la Arg en posición 43 y la Ala en posición 45.
Los restos superficiales correspondientes de Sac7e son el Trp en
posición 24 cuando se determina con respecto a la SEC ID Nº: 2
(resto número 23 de la secuencia de Sac7e); la Val en posición 26
(resto número 25 de la secuencia de Sac 7e); la Met en posición 29
(resto número 28 de la secuencia de Sac7e); la Ser en posición 31
(resto número 30 en la secuencia de Sac7e); la Arg en posición 43
(resto número 41 de la secuencia de Sac7e); y la Ala en posición 45
(resto número 43 de la secuencia de Sac7e).
Como las cadenas laterales de estos restos
interaccionan directamente con las bases en la hendidura secundaria,
modificaciones de estos restos con restos distintos de los
aminoácidos de tipo silvestre pueden usarse para modificar la
fuerza de la interacción con ADN sin destruir la estructura del
dominio Sso7, reduciendo la termoestabilidad o reduciendo
enormemente de otro modo la capacidad de los dominios para funcionar
en la presente invención. Además, un subconjunto de los restos
superficiales Trp24, Val26, Met29, y Ala45 interaccionan con una
posición en la que la hélice de ADN está enroscada. Por lo tanto,
puede usarse la mutación en una de estas posiciones para disminuir
la afinidad de dominios Sso7 por ADN que contiene un emparejamiento
erróneo próximo a la posición enroscada.
Un resto superficial puede sustituirse con una
diversidad de restos aminoacídicos. Típicamente el resto sustituido
es uno que no aparece en cualquier otra proteína Sso7 de origen
natural en esa posición. Con frecuencia, el resto sustituido ocupa
menos volumen que el resto aminoacídico en la secuencia nativa. Por
ejemplo, la cadena lateral del triptófano ocupa el mayor volumen de
los aminoácidos de origen natural. Por lo tanto el triptófano puede
sustituirse con aminoácidos menos voluminosos, en particular restos
tales como alanina, glicina o valina que ocupan menos espacio.
Además un resto que introduce un cambio estructural principal en el
polipéptido, por ejemplo, prolina o que tiene la capacidad de
introducir dicho cambio, por ejemplo, cisteína se evita típicamente
como sustitución de resto superficial.
La carga y la hidrofobicidad también pueden
considerarse cuando se sustituyen aminoácidos. La superficie de
Sso7d es altamente básica, conteniendo 2 argininas y 14 lisinas. Por
ejemplo puede ser deseable seleccionar un resto aminoacídico que
tenga una carga positiva neutra o débil. No se espera que la
modificación de cualquiera de los aminoácidos superficiales a Glu o
Asp, que son fuertemente ácidos produzca una proteína funcional.
Por lo tanto, los restos superficiales se
sustituyen típicamente con Ala, Gly, His, Iso, Leu, Met, Phe, Ser,
Thr, Tyr, Asn, Gln, Cys o Val. Además, el aminoácido seleccionado a
insertar en un polipéptido de fusión de la invención para sustituir
el resto superficial deseado es frecuentemente uno que no se
encuentra en esa posición de resto superficial en un polipéptido
Sso7 de origen natural.
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Otros dominios de unión a ADN Sso7 adecuados
para su uso en la invención pueden identificarse basándose en su
homología de secuencia con Sso7d. Típicamente, los dominios que
tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente
el 60%, opcionalmente una identidad de secuencia de aminoácidos de
aproximadamente el 70%, 75, 80, 85, 90 o 95-98% con
una proteína de unión a ácido nucleico bicatenario inespecífica de
secuencia conocida sobre una ventana de comparación de
aproximadamente 30 aminoácidos, opcionalmente aproximadamente
50-70 aminoácidos o la longitud de la proteína
completa pueden usarse en la invención. La secuencia puede
compararse y alinearse para una correspondencia máxima sobre una
ventana de comparación o una región designada según se mide usando
uno de los algoritmos de comparación de secuencia siguientes o
mediante alineamiento manual e inspección visual. Para los fines de
esta patente, el porcentaje de identidad de aminoácidos se determina
mediante los parámetros por defecto de BLAST.
Para comparación de secuencia, típicamente una
secuencia actúa como secuencia de referencia con las que se
comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de
comparación de secuencia, se introducen secuencias ensayo y de
referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de
subsecuencia si es necesario y se designan los parámetros de
programa de algoritmo de secuencias. Pueden usarse los parámetros de
programa por defecto o pueden designarse parámetros alternativos.
El algoritmo de comparación de secuencia calcula después los
porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo
respecto a la secuencia de referencia basándose en los parámetros de
programa.
La ventana de comparación incluye referencia a
un segmento de una cualquiera de las varias posiciones contiguas
seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, habitualmente de
aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente
aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia
puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número
de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se
alineen de forma óptima. Se conocen bien en la técnica métodos de
alineamientos de secuencias para su comparación. Pueden realizarse
alineamientos de secuencias óptimos para su comparación, por
ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de
alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:
443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Person y
Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante
aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics,
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante
alineamiento manual e inspección visual (véase por ejemplo, Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995
suplemento)).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para
determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud
de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen
en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:
3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol.
Biol. 215: 403-4.10 (1990), respectivamente. El
programa informático para realizar análisis de BLAST está
disponible para el público por medio del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de
alta puntuación (HSP) por identificación de palabras cortas de
longitud W en la secuencia de consulta, que coincidan con o
satisfagan alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se
alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de
base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra
vecina (Altschul et al., anteriormente). Estas coincidencias
de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar
búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Las
coincidencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo
largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación
de alineamiento acumulativo. Se calculan puntuaciones acumulativas
usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M
(puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes;
siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos
emparejados erróneamente; siempre < 0). Para secuencias de
aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la
puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de
palabra en cada dirección se interrumpen cuando: la puntuación de
alineamiento acumulativa disminuye por debajo de la cantidad X de
su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa se hace cero o
menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos
de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier
secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la
sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para
secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por defecto una
longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N =
4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de
aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una
longitud de palabra de 3 y una esperanza (E) de 10 y la matriz de
puntuado BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10,
M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:
5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma
menor (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad
por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o
aminoácidos sucedería por casualidad. Por ejemplo, un ácido
nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la
probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido
nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a
aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente
0,01 y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.
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También pueden identificarse proteínas de unión
a ADN Sso7 para su uso en la invención mediante reactividad cruzada
usando anticuerpos, preferentemente anticuerpos policlonales, que se
unen a dominios de unión a Sso7 conocidos. Se generan anticuerpos
policlonales usando métodos bien conocidos por los expertos en la
materia (véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in
Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual
(1988)). Las proteínas que son proteínas de unión que
inmunológicamente presentan reactividad cruzada pueden detectarse
después mediante una diversidad de métodos de ensayo. Para la
descripción de diversos formatos y condiciones que pueden usarse
véase, por ejemplo, Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell
Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993), Coligan, anteriormente y
Harlow y Lane, anteriormente.
Los formatos de inmunoensayo útiles incluyen
ensayos en los que una proteína de muestra se inmoviliza en un
soporte sólido. Por ejemplo, una proteína de unión con reactividad
cruzada puede identificarse usando un análisis de
inmunotransferencia tal como una transferencia de western. La
técnica de transferencia de western comprende generalmente separar
proteínas de muestra por electroforesis en gel basándose en su peso
molecular, transferir las proteínas separadas o un soporte sólido
adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, filtro de nylon o
un filtro de nylon derivatizado), e incubar la muestra con los
anticuerpos que se unen al domino de unión a ácido nucleico
bicatenario inespecífico de secuencia. Los anticuerpos se unen
específicamente a polipéptidos con reactividad cruzada en el
soporte sólido. Los anticuerpos pueden marcarse directamente o como
alternativa pueden detectarse posteriormente usando anticuerpos
marcados (por ejemplo, anticuerpos de oveja
anti-ratón marcados) que se unen específicamente a
los anticuerpos anti-dominio unión. Otros ensayos de
inmunotransferencia, tales como análisis de bibliotecas de
proteínas recombinantes también son útiles para identificar
proteínas adecuadas para su uso en la invención.
Usando esta metodología en condiciones de
inmunoensayo designadas, pueden identificarse proteínas con
reactividad cruzada inmunológica que unen a un anticuerpo
particular al menos dos veces el fondo o más, típicamente más de 10
veces en el fondo y no unen sustancialmente en una cantidad
significativa con otras proteínas presentes en la muestra.
Los inmunoensayos en el formato de unión
competitiva también pueden usarse para determinaciones de la
reactividad cruzada. Por ejemplo, se generan antisueros
policlonales con domino Sso7 conocido, por ejemplo Sso7d. El
antígeno diana puede inmovilizarse después en un soporte sólido.
Pueden añadirse antígenos no diana que tienen una reactividad
cruzada secundaria (si existen) al ensayo para mejorar la
selectividad de los sueros. La capacidad de las proteínas añadidas
para competir por la unión de los antisueros con la proteína
inmovilizada se compara con la capacidad de la proteína Sso7 para
competir consigo misma. El porcentaje de reactividad cruzada para
las proteínas anteriores se calcula usando cálculos convencionales.
Los antisueros con una reactividad cruzada inferior al 10% con la
proteína añadida se seleccionan y se combinan. También pueden
retirarse anticuerpos con reactividad cruzada con antígenos no
diana de los antisueros combinados por inmunoabsorción con los
antígenos no diana. También pueden generarse anticuerpos que se
unen específicamente con dominios de unión a ácido nucleico
particulares de la invención usando esta metodología.
Los antisueros inmunoabsorbidos y combinados se
usan después en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha
descrito anteriormente para comparar una segunda proteína, que se
cree que quizás es un alelo, variante polimórfica o un homólogo del
domino de unión de Sso7 conocido, por ejemplo un homólogo de otra
especie, a la proteína inmunógena. Para realizar esta comparación,
las dos proteínas se ensayan con cada una a un intervalo de
concentraciones amplio y se determina la cantidad de cada proteína
necesaria para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la
proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína
necesaria para inhibir el 50% de la unión es inferior a diez veces
la cantidad de la proteína de dominio de unión a ácido nucleico que
es necesaria para inhibir el 50% de unión, entonces la segunda
proteína se dice que se une específicamente a los anticuerpos
policlonales generados contra el inmunógeno Sso7d.
La actividad de los dominios de unión a ácido
nucleico bicatenario inespecíficos de secuencia puede evaluarse
usando una diversidad de ensayos como se describe, por ejemplo en el
documento W00192501. En la presente invención, el domino Sso7 se
sustituye en al menos un resto superficial. Los dominios Sso7
sustituidos, cuando se unen a una polimerasa, presenta una
capacidad de procesamiento modificada y/o un aumento de la
especificidad de unión a cebador/molde. Una polimerasa conjugada
con Sso7 de la invención puede identificarse usando ensayos bien
conocidos en la técnica que se describen adicionalmente en este
documento.
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El dominio de unión a ADN Sso7 y el domino
polimerasa, por ejemplo Sso7d y Taq polimerasa, de las proteínas
conjugadas de la invención pueden unirse por métodos bien conocidos
por los expertos en la materia. Estos métodos incluyen medios tanto
químicos como recombinantes.
Se describen medios químicos de unión de la
proteína Sso7 a la polimerasa, por ejemplo en Bioconjugate
Techniques, Hermanson, Ed., Academic Press (1996). Éstos incluyen,
por ejemplo, derivatización con el fin de unir las dos proteínas
entre sí, directamente o por medio de un compuesto de enlace, por
métodos que son bien conocidos en la técnica de la química de
proteínas. Por ejemplo, en una realización de conjugación química,
los medios de unión del domino catalítico y el domino de unión de
ácido nucleico comprende un reactivo de acoplamiento
heterobifuncional que en última instancia contribuye a la formación
de un enlace disulfuro intermolecular entre los dos restos. Otros
tipos de reactivos de acoplamiento que son útiles en esta capacidad
para la presente invención se describen, por ejemplo, en la Patente
de Estados Unidos 4.545.985. Como alternativa, un enlace disulfuro
intermolecular puede formarse convenientemente entre cisteínas en
cada resto, que aparecen de forma natural o se insertan por
modificación con ingeniería genética. El medio de unión de restos
también puede usar enlaces tioéter entre reactivos reticulantes
heterobifuncionales o reticulantes escindibles de bajo pH
específicos o enlazadores escindibles por proteasas específicas u
otros enlaces químicos escindibles o no escindibles.
Los medios de unión de los dominios Sso7 y
polimerasa de la proteína conjugada también pueden comprender un
enlace peptidilo formado entre restos que se sintetizan por separado
por química de síntesis peptídica convencional o medios
recombinantes. La propia proteína conjugada también puede producirse
usando métodos químicos para sintetizar una secuencia de
aminoácidos en su totalidad o en parte. Por ejemplo, pueden
sintetizarse péptidos mediante técnicas de fase sólida tales como,
por ejemplo, el método de síntesis en fase sólida de Merrifield en
el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de
aminoácidos en crecimiento (véase, Merrifield (1963) J. Am. Chem.
Soc, 85: 2149-2146). El equipamiento para síntesis
automática está disponible en el mercado de proveedores tales como
PE Corp. (Foster City, CA), y puede hacerse funcionar generalmente
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos
sintetizados pueden escindirse después de la resina y purificarse,
por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento
preparativa (véase Creighton, Proteins Structures and Molecular
Principles, 50-60 (1983)). La composición de los
polipéptidos sintéticos o de los subfragmentos del polipéptido
puede confirmarse por análisis de aminoácidos o secuenciación (por
ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton,
Proteins, Structures and Molecular Principles, páginas
34-49(1983)).
Además, pueden introducirse aminoácidos no
clásicos o análogos de aminoácidos químicos como sustitución o
adición a la secuencia. Los aminoácido no clásicos incluyen, pero
sin limitación los D-isómeros de los aminoácidos
comunes, ácido \alpha-amino isobutírico, ácido
4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino
butírico, \gamma-Abu,
\varepsilon-Ahx, ácido 6-amino
hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido
3-amino propiónico, ornitina, norleucina,
norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico,
t-butilglicina, t-butilalanina,
fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina,
fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tales como
\beta-metil aminoácidos,
C\alpha-metil aminoácidos,
N\alpha-metil aminoácidos y análogos de
aminoácidos en general. Además, el aminoácido pueden ser D
(dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio).
En otra realización, los dominios de Sso7 y
polimerasa se unen por un grupo de enlace. El grupo de enlace puede
ser un agente reticulante químico incluyendo, por ejemplo
succinimidilo-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC). El grupo de enlace también puede ser una secuencia o
secuencias de aminoácidos adicionales incluyendo, por ejemplo, una
polialanina, poliglicina o de forma similar, un grupo enlace.
En una realización específica, las secuencias
codificantes de cada polipéptido en la proteína de fusión se unen
directamente a su extremo terminal amino o carboxi por medio de un
enlace peptídico en cualquier orden. Como alternativa, puede
emplearse una secuencia de enlace aminoacídica para separar el
primer y el segundo componentes polipeptídicos por una distancia
suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus
estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia enlazadora de
aminoácidos se incorpora en la proteína de fusión usando técnicas
convencionales bien conocidas en la técnica. Pueden seleccionarse
secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas basándose en los
siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación
extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura
secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el
primer y segundo polipéptidos; y (3) la ausencia de restos
hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos
funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazadoras peptídicas
típicas contienen restos Gly, Ser, Val y Thr. Otros aminoácidos
neutros cercanos tales como Ala pueden usarse también en la
secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que pueden
emplearse de forma útil como enlazadores se incluyen los descritos
en Maratea et al. (1985) Gene 40: 39-46;
Murphy et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
8258-8262; Patentes de Estados Unidos Nº 4.935.233 y
4.751.180. La secuencia enlazadora puede ser generalmente de 1 a
aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo de 3, 4, 6
ó 10 aminoácidos de longitud, pero pueden ser de 100 ó 200
aminoácidos de longitud. Pueden no ser necesarias secuencias
enlazadoras cuando el primero y segundo polipéptidos tienen regiones
de aminoácidos N terminales no esenciales que pueden usarse para
separar los dominios funcionales y evitar la interferencia
estérica.
Otros enlazadores químicos incluyen enlazadores
carbohidrato, enlazadores lipídicos, enlazadores de ácidos grasos,
enlazadores poliéter, por ejemplo PEG etc. Por ejemplo están
disponibles enlazadores poli(etilenglicol) de Shearwater
Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos enlazadores tienen
opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfidrilo o enlaces
heterobifuncionales.
Otros métodos de unión de los dominios Sso7 y
polimerasa incluyen unión iónica por expresión de colas negativas y
positivas y unión indirecta por medio de anticuerpos e interacciones
biotina-estreptavidina. (Véase, por ejemplo
Bioconjugate Techniques, anteriormente). Los dominios también
pueden unirse entre sí por medio de una secuencia de interacción
intermedia. Por ejemplo, una secuencia de interacción con Sso7d, es
decir, una secuencia que se une a Sso7d, puede unirse a una
polimerasa. La proteína de fusión resultante puede después
permitirse que se asocie no covalentemente con la Sso7d para generar
un conjugado de Sso7d-polimerasa.
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En una realización típica, se produce una
proteína Sso7-polimerasa conjugada de la invención
por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la
proteína, siendo dicha técnica una práctica convencional en la
técnica. Dicho producto de fusión puede generarse por ligación de
las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican las
secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en
la técnica, en la fase codificante apropiada y expresión del
producto por métodos conocidos en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican los dominios
a incorporar en las proteínas de fusión de la invención pueden
obtenerse usando técnicas de rutina en el campo de la genética
recombinante. Los textos básicos que describen los métodos
generales de uso en esta invención incluyen Sambrook y Russell,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª edición 2001); Kriegler,
Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.,
1994-1999).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
los polipéptidos de Sso7 y polimerasa pueden obtenerse usando
cualquiera de una variedad de métodos. En algunas realizaciones, las
secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se
clonan a partir de bibliotecas de ADNc y ADN genómico por
hibridación con sondas, o se aíslan usando técnicas de
amplificación con cebadores oligonucleotídicos. Más comúnmente, se
usan técnicas de amplificación para amplificar y aislar las
secuencias Sso7 y polimerasa usando un molde de ADN o ARN (véase,
por ejemplo, Dieffenfach y Dveksler, PCR Primers: A Laboratory
Manual (1995)). Como alternativa, pueden producirse
oligonucleótidos solapantes sintéticamente y unirse para producir
uno o más dominios. También pueden aislarse ácidos nucleicos que
codifican dominios de unión a ácido nucleico bicatenario o
catalíticos a partir de bibliotecas de expresión usando anticuerpos
como sondas.
En un ejemplo de obtención de un ácido nucleico
que codifica un domino Sso7 o polimerasa usando PCR, la secuencia o
subsecuencia de ácido nucleico se amplifica por PCR usando un
cebador sentido que contiene un sitio de restricción o un cebador
antisentido que contiene otro sitio de restricción. Esto producirá
un ácido nucleico que codifica la secuencia o subsecuencia de
dominio deseado y que tiene sitios de restricción terminales.
Después este ácido nucleico puede ligarse fácilmente en un vector
que contiene un ácido nucleico que codifica el segundo dominio y
que tiene los sitios de restricción correspondientes apropiados. Los
dominios pueden unirse directamente o pueden separarse por un
enlazador u otra secuencia proteica. Pueden determinarse cebadores
de PCR adecuados por un experto en la materia usando la información
de secuencia proporcionada en GenBank u otras fuentes. También
pueden añadirse sitios de restricción apropiados al ácido nucleico
que codifica la proteína o subsecuencia proteica por mutagénesis
dirigida. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia de
nucleótidos codificante de dominio se escinde con la endonucleasa
de restricción apropiada y después se liga en un vector apropiado
para su amplificación y/o expresión de acuerdo con métodos
convencionales.
Se encuentran ejemplos de técnicas suficientes
para dirigir a expertos en la materia a través de los métodos de
amplificación in vitro en Berger, Sambrook y Ausubel, así
como en Mullis et al., (1987) Patente de Estados Unidos Nº
4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis
et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990)
(Innis); Aznheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN
36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:
81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35:
1826; Landegren et al., (1988) Science 241:
1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:
291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y
Barringer et al. (1990) Gene 89: 117.
Otras propiedades físicas de un polipéptido
expresado a partir de un ácido nucleico particular pueden compararse
con propiedades de un polipéptido Sso7 o polimerasa para
proporcionar otro método de identificación de ácidos nucleicos
adecuados.
Un experto también reconocerá que pueden
realizarse adicionalmente modificaciones en los dominios Sso7 y
polimerasa sin disminuir su actividad biológica. Pueden realizarse
algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión o
incorporación de un dominio en una proteína de fusión. Dichas
modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia e
incluyen por ejemplo, la adición de codones en cualquier extremo
terminal del polinucleótido que codifique el dominio de unión para
proporcionar, por ejemplo una metionina añadida al extremo amino
terminal para proporcionar un sitio de inicio o aminoácidos
adicionales (por ejemplo, poli His) colocados en cualquier extremo
terminal para generar sitios de restricción localizados
convenientemente o codones de terminación o secuencias de
purificación.
Uno o más de los dominios también puede
modificarse para facilitar el enlace de los dos dominios para
obtener los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de
fusión de la invención. Por lo tanto, los dominios Sso7 y
polimerasa que están modificados por dichos métodos también son
parte de la invención. Por ejemplo, puede colocarse un codón para
un resto cisteína en cualquier extremo de un dominio de modo que el
dominio pueda unirse, por ejemplo, mediante un enlace sulfuro. La
modificación puede realizarse usando métodos recombinantes o
químicos (véase, por ejemplo, Pierce Chemical Co. catalog, Rockford
IL).
Los dominios Sso7 y polimerasa de la proteína de
fusión recombinante se unen con frecuencia por dominios enlazadores,
habitualmente secuencias polipeptídicas incluyendo Gly, Ser, Ala y
Val, tales como las descritas anteriormente. En algunas
realizaciones, se incorporan restos de prolina en el enlazador para
evitar la formación de elementos estructurales secundarios
significativos por el enlazador.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos
recombinantes que codifican las proteínas de la invención se
modifican para proporcionar codones preferidos que aumenten la
traducción del ácido nucleico en un organismo seleccionado (por
ejemplo codones preferidos de levadura se sustituyen en un ácido
nucleico codificante para su expresión en levadura).
\vskip1.000000\baselineskip
Existen muchos sistemas de expresión para
producir polipéptidos de fusión que son bien conocidos por los
expertos en la materia. (Véase, por ejemplo, Gene Expression
Systems, Femandex y Hoeffler, Eds. Academic Press, 1999; Sambrook y
Russell, anteriormente; y Ausubel et al, anteriormente.).
Típicamente, el polinucleótido que codifica el polipéptido de
fusión se coloca bajo el control de un promotor que es funcional en
la célula hospedadora deseada. Están disponibles una diversidad
extremadamente amplia de promotores y pueden usarse en los vectores
de expresión de la invención, dependiendo de la aplicación
particular. Comúnmente, el promotor seleccionado depende de la
célula en la que vaya ser activo el promotor. Otras secuencias de
control de la expresión tales como sitios de unión a ribosoma,
sitios de terminación de la transcripción y similares también se
incluyen opcionalmente. Las construcciones que incluyen uno o más de
estas secuencias de control se denominan "casetes de
expresión". Por consiguiente, los ácidos nucleicos
que codifican los polipéptidos unidos se incorporan para alto nivel de expresión en una célula hospedadora deseada.
que codifican los polipéptidos unidos se incorporan para alto nivel de expresión en una célula hospedadora deseada.
Las secuencias de control de la expresión que
son adecuadas para su uso en una célula hospedadora particular se
obtienen con frecuencia por clonación de un gen que se expresa en
esa célula. Las secuencias de control procariotas usadas comúnmente
que se definen en este documento que incluyen promotores para el
inicio de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto
con secuencias de sitio de unión a ribosomas, incluyen promotores
usados comúnmente tales como los sistemas promotores de
betalactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (lac) (Change
et al., Nature (1977) 198:1056), el sistema promotor del
triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res.
(1980) 8: 4057), el promotor tac (DeBoer, et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80: 21-25); y el
promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión de ribosomas
de gen N (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). El
sistema de promotor particular no es crítico para la invención,
puede usarse cualquier promotor disponible que funcione en
procariotas. Los vectores de expresión bacterianas convencionales
incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, por
ejemplo, pBLUESCRIPT^{TM}, pSKF, pET23D, vectores derivados de
fago \lambda y sistemas de expresión de fusión tales como GST y
LacZ. También pueden añadirse marcadores epitópicos a proteínas
recombinantes para proporcionar métodos de aislamiento
convenientes, por ejemplo, c-myc, marcador HA,
marcador 6-His (SEC ID Nº: 17), proteína de unión a
maltosa, marcador VSV-G, marcador
anti-DYKDDDDK (SEC ID Nº: 18) o cualquier marcador
de este tipo, conociéndose un gran número de los mismos por los
expertos en la materia.
Para la expresión de polipéptidos de fusión en
células procariotas distintas de E. coli, es necesario un
promotor que funcione en la especie procariota particular. Dichos
promotores pueden obtenerse a partir genes que se han clonado de la
especie o pueden usarse promotores heterólogos. Por ejemplo, el
promotor trp-lac híbrido funciona en
Bacillus además de en E. coli. Estos y otros
promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica y
se describen, por ejemplo en Sambrook et al. y Ausubel et
al. Están disponibles sistemas de expresión bacteriano para la
expresión de las proteínas de la invención por ejemplo en E.
coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al.,
Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al.,
Nature 302: 543-545 (1983). Están disponibles en el
mercado kits para dichos sistemas de expresión.
Se conocen bien en la técnica sistemas de
expresión eucariota para células de mamífero, levadura y células de
insecto y también están disponibles en el mercado. En levaduras, los
vectores incluyen plásmidos de integración en levadura (por
ejemplo, Ylp5) y plásmidos de Replicación en Levadura (los plásmidos
de la serie YRp) y pGPD-2. Los vectores de
expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se
usan típicamente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo,
vectores de SV40, vectores de papiloma virus y vectores derivados
de virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas
ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+,
pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro
vector que permite la expresión de proteínas en la dirección del
promotor de CMV, promotor temprano de SV40, promotor tardío de SV40,
promotor metalotioneina, promotor de virus de tumor mamario murino,
promotor de virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina u
otros promotores que se muestren eficaces para su expresión en
células eucariota.
Pueden usarse promotores regulados o
constitutivos en la presente invención. Los promotores regulados
pueden ser ventajosos porque las células hospedadoras pueden crecer
a altas densidades antes de que se induzcan la expresión de los
polipéptidos de fusión. El alto nivel de expresión de proteínas
heterólogas ralentiza el crecimiento celular en algunas
situaciones. Un promotor inducible es un promotor que dirige la
expresión de un gen cuando el nivel de expresión es alterable por
factores ambientales o de desarrollo tales como, por ejemplo
temperatura, pH, condiciones anaeróbicas o aerobias, luz, factores
de transcripción y químicos.
Para E. coli y otras células hospedadoras
bacterianas, los expertos en la materia conocen promotores
inducibles. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor lac, el
promotor P_{L} de bacteriófago lamba, el promotor
trp-lac híbrido (Amann et al. (1983)
Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA 80: 21), y el promotor T7 de bacteriófago (Studier et
al. (1986) J. Mol. Bio.; Tabor et al. (1985) Proc. Nat'l.
Acad Sci. USA 82: 1074-8). Estos promotores y su
uso se analizan en Sambrook et al., anteriormente.
También son bien conocidos por los expertos en
la materia promotores inducibles de otros microorganismos. Estos
incluyen, por ejemplo, el promotor de metalotioneina, promotor del
choque térmico así como muchos otros.
Puede usarse acoplamiento traduccional para
potenciar la expresión. La estrategia usa una fase de lectura
abierta cadena arriba corta derivada de un gen altamente expresado
nativo para el sistema de traducción, que se coloca cadena abajo
del promotor y un sitio de unión a ribosoma seguido después de unos
pocos codones aminoacídicos por un codón de terminación. Justo
antes del codón de terminación hay un segundo sitio de unión a
ribosomas y después del codón de terminación hay un codón de inicio
para el inicio de la traducción. El sistema disuelve la estructura
secundaria en el ARN, permitiendo el inicio eficaz de la traducción.
Véase Squires, et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:
16297-16302.
La construcción de construcciones
polinucleotídicas generalmente requiere el uso de vectores capaces
de replicarse en bacterias. Dichos vectores se usan comúnmente en
la técnica. Están disponibles en el mercado una plétora de kits
para la purificación de plásmidos a partir de bacterias (por
ejemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, de Pharmacia Biotech; StrataCleanJ,
de Stratagene; y QIAex-press Expression System,
Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados pueden manipularse
después para producir otros plásmidos y usarse para transformar
células.
Los polipéptidos de fusión pueden expresarse
intracelularmente o pueden secretarse a partir de la célula. La
expresión intracelular da como resultado con frecuencia altos
rendimientos. Si es necesario, la cantidad de polipéptido de fusión
activo soluble puede aumentarse realizando procedimientos de
replegamiento (véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
anteriormente.; Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800;
Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151). Pueden
expresarse polipéptidos de fusión de la invención en una variedad de
células hospedadoras, incluyendo E. coli, otros hospedadores
bacterianos, levadura y diversas células eucariotas superiores
tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares
de mieloma. Las células hospedadoras pueden ser células de
mamífero, células de insectos o microorganismos tales como por
ejemplo células de levadura, células bacterianas o células
fúngicas.
Una vez expresados, los polipéptidos de fusión
recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos
convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato
amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna,
electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes,
Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982),
Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein
Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren
composiciones sustancialmente puras de una homogeneidad de al menos
aproximadamente el 90 al 95% y se prefiere más una homogeneidad del
98 al 99% o más. Una vez purificados, parcialmente o hasta la
homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse después
(por ejemplo, como inmunógenos para producción de anticuerpo).
Para facilitar la purificación de los
polipéptidos de fusión de la invención, los ácidos nucleicos que
codifican los polipéptidos de fusión también pueden incluir una
secuencia codificante para un epítopo o "marcador" para el que
esté disponible un reactivo de unión por afinidad. Los ejemplos de
epítopos adecuados incluyen los genes indicadores myc y
V-5; los vectores de expresión útiles para la
producción recombinante de polipéptidos de fusión que tienen estos
epítopos está disponible en el mercado (por ejemplo, los vectores
pcADN3.1/Myc-His y pcADN3:1/V5-His
de Invitrogen (Carlsbad CA) son adecuados para la expresión en
células de mamífero). Los expertos en la materia conocen vectores
de expresión adicionales adecuados para unir un marcador a las
proteínas de fusión de la invención y sistemas de detección
correspondientes y varios están disponibles en el mercado (por
ejemplo, FLAG'' (Kodak, Rochester NY). Otro ejemplo de un marcador
adecuado es una secuencia de polihistidina, que es capaz de unirse
a ligandos de afinidad con quelatos metálicos. Típicamente, se usan
seis histidinas adyacentes, aunque se puede usar más o menos que
seis. Los ligandos de afinidad con quelatos metálicos adecuados,
que pueden servir como resto de unión para el marcador de
polihistidinas incluyen ácido nitrilo-triacético
(NTA) (Hochuli, E. (1990). "Purification of recombinant proteins
with metal chelating adsorbents" En Genetic Engineering:
Principles and Methods, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY;
disponible en el mercado en Qiagen (Santa Clarita, CA)).
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Las secuencias de Sso7 de la invención contienen
sustituciones en restos superficiales. Un experto reconocerá que
existen muchas formas de generar estas alteraciones o variantes de
una secuencia de ácido nucleico dada. Dichos métodos bien conocidos
incluyen mutagénesis dirigida, amplificación por PCR usando
oligonucleótidos degenerados, síntesis química de un
oligonucleótido deseado (por ejemplo, junto con ligación y/o
clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas
bien conocidas. Véase, Giliman y Smith, Gene 8:
81-97 (1979), Roberts, et al., Nature 328:
731-734 (1987) y Sambrook, Innis, y Ausubel (todos
anteriormente).
En un ejemplo de generación de una secuencia
Sso7 de la invención, se usa mutagénesis dirigida para sustituir
con un resto aminoacídico el resto superficial. La secuencia de
ácido nucleico se sustituye por síntesis de un cebador
oligonucleotídico que contenga la mutación. El cebador hibrida con
un ácido nucleico de Sso7, por ejemplo SEC ID Nº: 1, y se amplifica
una nueva secuencia. El producto de amplificación con la mutación
puede ligarse después en un vector de expresión.
Más comúnmente, se alteran secuencias
polipeptídicas como anteriormente, es decir, por cambio de la
secuencia de ácido nucleico correspondiente y expresión del
polipéptido. Sin embargo, también pueden generarse secuencias
polipeptídicas sintéticamente usando sintetizadores peptídicos
disponibles en el mercado para producir un polipéptido deseado
(véase, Merrifield, y Stewart y Young, anteriormente).
Finalmente, las secuencias Sso7 sustituidas se
evalúan usando técnicas tales como las descritas a continuación
para identificar las polimerasas de fusión que presentan una
especificidad de reconocimiento de cebador/molde aumentada y/o una
capacidad de procesamiento que esté aumentada respecto a una
polimerasa no modificada. Típicamente la capacidad de procesamiento
de una proteína de fusión sustituida es inferior a la de una
polimerasa de fusión Sso7 de tipo silvestre.
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Las polimerasas de fusión de la invención
presentan una actividad modulada que incluye tanto una capacidad de
procesamiento aumentada respecto a una polimerasa no modificada como
una especificidad de unión a cebador/molde mejorada. Las actividades
pueden medirse usando procedimientos que son convencionales en la
técnica.
Una polimerasa de fusión de la invención
presenta con frecuencia un aumento en la especificidad de
cebador/molde en comparación con una polimerasa de fusión que
comprende una secuencia de Sso7 de tipo silvestre, por ejemplo SEC
ID Nº: 2. La especificidad cebador/molde es la capacidad de una
enzima para discriminar entre dúplex de cebador/molde emparejados y
dúplex de cebador/molde emparejados erróneamente. La especificidad
puede determinarse, por ejemplo, por comparación del rendimiento
relativo de dos reacciones, empleando uno un cebador emparejado y
empleando el otro un cebador emparejado erróneamente. Una enzima con
una discriminación aumentada tendrá un mayor rendimiento relativo
con el cebador emparejado que con el cebador emparejado
erróneamente, es decir, la proporción del rendimiento en la
reacción usando el cebador emparejado frente a la reacción usando el
cebador emparejado erróneamente es de aproximadamente 1 o superior.
Esta proporción puede compararse después con el rendimiento
obtenido en un conjunto de reacciones en paralelo que emplea una
polimerasa de fusión que comprende el dominio Sso7 de tipo
silvestre. Una proteína de fusión de la invención presenta
típicamente un aumento de al menos 2 veces, con frecuencia 3 veces
o superior en la proporción respecto a una polimerasa de fusión de
tipo silvestre.
La especificidad también puede medirse, por
ejemplo, en una PCR a tiempo real, en la que la diferencia en los
valores Ct (ciclo umbral) (\DeltaC_{t}) entre el cebador/molde
completamente complementarios y cebador/molde emparejados
erróneamente puede usarse para medir la especificidad de unión de
cebador/molde de diferentes enzimas. El valor Ct representa el
número de ciclos necesarios para generar una cantidad detectable de
ADN (una cantidad "detectable" de ADN es típicamente 2X,
habitualmente 5X, 10X, 100X o más por encima del fondo). Una
polimerasa con una especificidad aumentada puede ser capaz de
producir una cantidad detectable de ADN en un número de ciclos más
pequeño aproximándose más a la eficacia de amplificación teórica
máxima de la PCR. Por consiguiente, un valor Ct inferior refleja
una mayor eficacia de amplificación para la enzima.
La capacidad de procesamiento de la polimerasa
puede medirse mediante una diversidad de métodos conocidos por los
expertos en la materia. La capacidad de procesamiento de polimerasa
se define generalmente como el número de nucleótidos incorporados
durante un solo acontecimiento de unión de una enzima modificadora a
un molde cebado. Por ejemplo, un cebador marcado con FAM 5' hibrida
con ADN ssM13mp18 circular o linealizado para formar un molde
cebado. En la medición de la capacidad de procesamiento, el molde
cebado habitualmente está presente en un exceso molar significativo
respecto a la polimerasa de modo que se minimiza la probabilidad de
que cualquier molde cebado se extienda más de una vez por la
polimerasa. El molde cebado por lo tanto se mezcla con la
polimerasa a una proporción tal como de aproximadamente 4000:1 (ADN
cebado: ADN polimerasa) en presencia de un tampón y de dNTP. Se
añade MgCl_{2} para iniciar la síntesis de ADN. Las muestras se
inactivan a diversos tiempos después del inicio y se analizan en un
gen de secuenciación. A una concentración de polimerasa en la que
la longitud media de producto no cambia con el tiempo o la
concentración de polimerasa, la longitud corresponde con la
capacidad de procesamiento de la enzima. La capacidad de
procesamiento de una proteína de la invención, es decir, una
polimerasa de fusión sustituida que contiene un dominio de unión de
ácido nucleico Sso7 sustituido fusionado con el dominio catalítico
de una polimerasa, se compara después con la capacidad de
procesamiento de la enzima sin el dominio de unión (una polimerasa
no modificada) y la capacidad de procesamiento de una polimerasa de
fusión que comprende una secuencia Sso7 de tipo silvestre. La
polimerasa de fusión sustituida de la invención presenta una
capacidad de procesamiento aumentada respecto a la polimerasa no
modificada y típicamente, una capacidad de procesamiento disminuida
respecto a la polimerasa de fusión de Sso7 de tipo silvestre.
También puede demostrarse una eficacia aumentada
por medición de la capacidad aumentada de una enzima para producir
producto. Dicho análisis mide la estabilidad de dúplex de ácido
nucleico bicatenario indirectamente por determinación de la
cantidad de producto obtenido en una reacción. Por ejemplo, puede
usarse un ensayo de PCR para medir la cantidad de producto de PCR
obtenido con un cebador corto, por ejemplo, de 12 nucleótidos de
longitud, hibridado a una temperatura elevada, por ejemplo 50ºC. En
este análisis, se muestra una eficacia aumentada por la capacidad
de una polimerasa para producir más producto en una reacción de PCR
usando el cebador de 12 nucleótidos hibridado a 50ºC cuando se une
a una secuencia Sso7d sustituida en comparación con una polimerasa
no modificada.
Puede usarse PCR larga como otra forma de
demostrar la eficacia aumentada. Por ejemplo una enzima con eficacia
aumentada permite típicamente la amplificación de un amplicón largo
(> 5 kb) en un tiempo de extensión más corto en comparación con
una enzima con una eficacia relativamente inferior.
También pueden usarse ensayos tales como
sensibilidad a sales para demostrar una mejora en la eficacia de
una enzima con capacidad de procesamiento modificadora de ácido
nucleico de la invención. Una polimerasa, cuando se fusiona a una
secuencia de Sso7 de la invención presenta una tolerancia aumentada
a altas concentraciones de sal, es decir, una enzima con capacidad
de procesamiento, con una capacidad de procesamiento aumentada
puede producir más producto en concentraciones salinas superiores.
Por ejemplo, puede realizarse un análisis de PCR para determinar la
cantidad de producto obtenido en una reacción usando una Taq
polimerasa de fusión con Sso7 sustituida en comparación con una Taq
polimerasa no modificada en condiciones de reacción con alto
contenido en sal, por ejemplo 80 mM.
Otros métodos de evaluación de la eficacia
aumentada de las polimerasas mejoradas de la invención puede
determinarse por los expertos en la materia usando ensayos
convencionales de la actividad enzimática de una enzima de
modificación dada.
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Se usó PCR secuencial para introducir las
mutaciones puntuales en el codón que codifica W24 en el
Sso7d-\DeltaTaq de tipo silvestre expuesto en la
SEC ID Nº 2. En la primera vuelta de PCR, se usó el par de cebadores
M13R (5'GCGGA
TAACAATTTCACACAGG 3', SEC ID Nº 19) y W24T (5'ATCTCCAAGATCAAGAAAGTAGNGCGTGTGGG
CAAGATG 3'; SEC ID Nº 20), y el par de cebadores W24AEVG-B (5'CTACTTTCTTGATCTTGGAGAT 3'; SEC ID Nº 21) y 1008R (5'-GAGGGCTTTATAAG GCTCG 3'; SEC ID Nº 22) se usaron para amplificar las regiones correspondientes a partir de pYW1 (véase, publicación PCT WO 01/92501). Los productos de la primera PCR se purificaron y se combinaron entre sí con cebadores M13R y 1008R en una segunda ronda de PCR para producir un fragmento de 400 pb. Este fragmento se digirió con enzimas de restricción EcoRI y BstXI y se insertó en el sitio correspondiente de pYW1. El cebador W24-T contiene un nucleótido degenerado en la posición 23 del extremo 5' de modo que el oligonucleótido final será una población mixta que contiene 25% de cada uno G, T, A y C en esta posición. Como resultado, el codón GNG codifica uno de los cuatro aminoácidos siguientes, Gly (GGG) (SEC ID Nº 3, en negrita y subrayado); Val (GTG) (SEC ID Nº 5, en negrita y subrayado); Glu (GAG) (SEC ID Nº 7, en negrita y subrayado); o Ala (GCG) en la proteína de fusión mutante.
TAACAATTTCACACAGG 3', SEC ID Nº 19) y W24T (5'ATCTCCAAGATCAAGAAAGTAGNGCGTGTGGG
CAAGATG 3'; SEC ID Nº 20), y el par de cebadores W24AEVG-B (5'CTACTTTCTTGATCTTGGAGAT 3'; SEC ID Nº 21) y 1008R (5'-GAGGGCTTTATAAG GCTCG 3'; SEC ID Nº 22) se usaron para amplificar las regiones correspondientes a partir de pYW1 (véase, publicación PCT WO 01/92501). Los productos de la primera PCR se purificaron y se combinaron entre sí con cebadores M13R y 1008R en una segunda ronda de PCR para producir un fragmento de 400 pb. Este fragmento se digirió con enzimas de restricción EcoRI y BstXI y se insertó en el sitio correspondiente de pYW1. El cebador W24-T contiene un nucleótido degenerado en la posición 23 del extremo 5' de modo que el oligonucleótido final será una población mixta que contiene 25% de cada uno G, T, A y C en esta posición. Como resultado, el codón GNG codifica uno de los cuatro aminoácidos siguientes, Gly (GGG) (SEC ID Nº 3, en negrita y subrayado); Val (GTG) (SEC ID Nº 5, en negrita y subrayado); Glu (GAG) (SEC ID Nº 7, en negrita y subrayado); o Ala (GCG) en la proteína de fusión mutante.
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Basándose en estudios estructurales (Gao et
al., Nature Struct. Biol. 5:782-786, 1998), el
resto W24 en Sso7d de tipo silvestre está implicado en el anclaje de
una base en su posición no apilada. Este ejemplo muestra que la
mutación en esta posición da como resultado un aumento en la
especificidad de unión cebador molde de la proteína de fusión.
\newpage
Se usaron dos parejas de cebadores para evaluar
la capacidad de una enzima de PCR para discriminar cebadores
emparejados y cebadores emparejados erróneamente. El cebador
emparejado 57F (5' TCCGTTCTTCTTCGTCA
TAACT 3'; SEC ID Nº 23), es totalmente complementario al ADN de lambda. El cebador emparejado erróneamente 57F5/6 (5' TCCGCCCTTCTTCGTCATAACT 3'; SEC ID Nº 24), contiene dos bases (posición 5 y 6 del extremo 5') que no son complementarias al molde de ADN lambda. El mismo cebador inverso emparejado, 732R (5' CCT
GACTGTTCGATATATTCACTC 3'; SEC ID Nº 25), se usa con 57F o 57F5/6 para producir un amplicón de 675 pb. El programa de ciclado usado era: 94ºC-1 min, 20x (94ºC-10 s, 50-74ºC-30 s, 72ºC-1 min), 72ºC-10 minutos. El rendimiento final de los productos de PCR se cuantificó usando una dilución PicoGreen en un tampón TE (1:200 PicoGreen: TE) y un lector de placas fluorescentes. Para cada enzima, se realizaron dos amplificaciones de PCR, una usando los cebadores 57F y 732R, y la otra usando los cebadores 57F5/6 y 732R.
TAACT 3'; SEC ID Nº 23), es totalmente complementario al ADN de lambda. El cebador emparejado erróneamente 57F5/6 (5' TCCGCCCTTCTTCGTCATAACT 3'; SEC ID Nº 24), contiene dos bases (posición 5 y 6 del extremo 5') que no son complementarias al molde de ADN lambda. El mismo cebador inverso emparejado, 732R (5' CCT
GACTGTTCGATATATTCACTC 3'; SEC ID Nº 25), se usa con 57F o 57F5/6 para producir un amplicón de 675 pb. El programa de ciclado usado era: 94ºC-1 min, 20x (94ºC-10 s, 50-74ºC-30 s, 72ºC-1 min), 72ºC-10 minutos. El rendimiento final de los productos de PCR se cuantificó usando una dilución PicoGreen en un tampón TE (1:200 PicoGreen: TE) y un lector de placas fluorescentes. Para cada enzima, se realizaron dos amplificaciones de PCR, una usando los cebadores 57F y 732R, y la otra usando los cebadores 57F5/6 y 732R.
La capacidad de una enzima para discriminar
cebadores emparejados y emparejados erróneamente se determinó por
comparación del rendimiento relativo de las dos reacciones. La
enzima más discriminativa debería tener un rendimiento relativo
superior con el cebador emparejado que con el cebador emparejado
erróneamente. La Tabla 1 muestra los resultados analizados a
temperatura de hibridación de 64ºC. La proteína de fusión de tipo
silvestre era la menos discriminativa de cebadores emparejados y
emparejados erróneamente. Las tres proteínas mutantes mostraban una
mejora de 2,5-14 veces sobre la proteína de fusión
de tipo silvestre.
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Como la interacción de unión entre Sso7d y ADNbc
es importante para la potenciación de la capacidad de procesamiento
de la proteína de fusión, las mutaciones introducidas pueden
suprimir la potenciación. El ensayo de capacidad de procesamiento
(véase, Publicación PICT WO 01/92501) se usó para medir la capacidad
de procesamiento de proteínas de fusión que contienen mutaciones en
el resto W24 de Sso7d y los resultados se resumen en la Tabla 2.
Dos de las tres proteínas mutantes, W24G y W24V, mantenían todavía
una capacidad de procesamiento dos veces superior que la proteína
no modificada, \DeltaTaq. La proteína mutante que contenía el
cambio W24E presenta la misma capacidad de procesamiento que la
proteína no modificada. Estos resultados sugieren que diferentes
mutaciones en esta posición podrían tener efecto diferencial sobre
la capacidad de procesamiento de la proteína de fusión.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon las proteínas mutantes con la
proteína de tipo silvestre en aplicaciones por PCR. Se usaron dos
criterios en la comparación, uno era el valor de ciclo umbral (Ct)
en aplicaciones de qPCR que refleja la eficacia de la enzima en los
ciclos tempranos de amplificación y el otro era el rendimiento final
del producto de PCR que refleja la eficacia de la enzima en los
ciclos tardíos de amplificación. Se usaron reacciones de qPCR
basadas en SYBR green para amplificar dos amplicones de
beta-actina, BA481 y BA203, a partir de ADN genómico
humano. Las reacciones contenían una concentración final de
MgCl_{2} 2 mM y SYBR Green I 1 x. Se usó un gradiente de
hibridación de 55,8ºC a 72,1ºC. Los valores de Ct se resumen en la
Tabla 3. Se obtuvieron valores Ct muy similares (diferencia < 1
ciclo) para la proteína de fusión de tipo silvestre y la proteína de
fusión Sso7d (G), sugiriendo que no existen diferencias
significativas en la eficacia entre las dos enzimas en los ciclos
tempranos.
Los productos PCR finales se analizaron en un
gel de agarosa al 1% para evaluar los rendimientos relativos. Como
se muestra en la Figura 1, los rendimientos finales de los
amplicones tanto BA481 como BA203 eran significativamente superiores
cuando se usó la proteína mutante,
Sso(G)-\DeltaTaq, que cuando se usó la
proteína de fusión de tipo silvestre, que concuerda con que la
proteína mutante sea más eficaz en los ciclos tardíos de
amplificación.
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SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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SEC ID Nº 3 Secuencia de ADN que codifica
Sso7d(G)-\DeltaTaq
\newpage
SEC ID Nº 4 Secuencia de aminoácidos de la
proteína de fusión Ss07d(G)-\DeltaTaq
El resto en negrita subrayado indica la
sustitución de aminoácido con respecto a
Ss07d-\DeltaTaq de tipo silvestre.
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\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 5 Secuencia de ADN que codifica
Sso7d(V)-\DeltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 6 Secuencia de aminoácidos de proteína
de fusión Sso7d(V)-\DeltaTaq
El resto en negrita subrayado indica la
sustitución de aminoácido con respecto
Ss07d-\DeltaTaq de tipo silvestre.
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\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 7 Secuencia de ADN que codifica
Sso7d(E)-\DeltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 8 Secuencia de aminoácidos de proteína
de fusión Sso7d(E)-\DeltaTaq
El resto en negrita subrayado indica la
sustitución de aminoácido con respecto a
Ss07d-\DeltaTaq de tipo silvestre.
<110> Wang, Yan
\hskip1cmMJ Bioworks, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas conjugadas de la
Sso7-polimerasa mejorada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020130-001200PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> WO no asignada todavía
\vskip0.400000\baselineskip
<141> No asignada todavía
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Estados unidos 10/280, 139
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-10-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Ver. 2.1 de PatentIn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus solfataricus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sso7d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PFT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus solfataricus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína Sso7d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
polimerasa de fusión sustituida de
Sso7d(G)-deltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína de polimerasa de fusión sustituida
Sso7d(G)-deltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
polimerasa de fusión sustituida
Sso7d(V)-deltaTaq
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína de polimerasa de fusión sustituida
Sso7d(V)-deltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
polimerasas de fusión sustituida
Sso7d(E)-deltaTaq
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína de polimerasa de fusión sustituida
Sso7d(E)-deltaTaq
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus solfataricus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sso7d con metionina de comienzo no
mostrada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus acidocaldarius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína Sac7e de tipo Sso7d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
péptido consenso de alineamiento Sso7d y Sac7e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
<212 < PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
péptido consenso de alineamiento Sso7d y Sac7e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
péptido consenso de alineamiento Sso7d y Sac7e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
péptido consenso de alineamiento Sso7d y Sac7e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de Secuencia Artificial:
cebador de amplificación directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaacagtaa agttcaagta caaagg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador de amplificación inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaacatttg tagtagttct tttggagcg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
marcador de epítopo de 6-His
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
marcador de epítopo de anti-DYKDDDDK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador M13R de primera ronda de amplificación por PCR
secuencial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggataaca atttcacaca gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador W24T de primera ronda de amplificación por PCR
secuencial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = g, a, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctccaaga tcaagaaagt agngcgtgtg ggcaagatg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador W24AEVG-B de primera ronda de amplificación
por PCR secuencial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctactttctt gatcttggag at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador 1008R de primera ronda de amplificación por PCR
secuencial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggcttta taaggctcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador 57F coincidente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgttcttc ttcgtcataa ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador 57F5/6 no coincidente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgcccttc ttcgtcataa ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador inverso 732R coincidente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgactgtt cgatatattc actc
\hfill24
Claims (14)
1. Una proteína conjugada de
Sso7-polimerasa que comprende un dominio Sso7 que
tiene una identidad de al menos el 60% con la SEC ID Nº 2 unido a un
dominio polimerasa;
en la que un aminoácido en una posición del
dominio Sso7 que es una posición de resto superficial según se
determina con respecto a la SEC ID Nº 2 se sustituye con un resto
aminoacídico diferente, en el que los restos superficiales son
restos expuestos en la superficie del dominio Sso7 que interacciona
con el ADN;
en el que la sustitución del resto superficial
da como resultado una capacidad de procesamiento que es inferior a
la capacidad de procesamiento de una fusión de
Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la
capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está
fusionado a un dominio Sso7.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 1, en la que el
resto superficial en posición Trp24, Val26, Met29, Ser31, Arg43 o
Ala45 del dominio Sso7 se sustituye.
3. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 2, en la que el
resto superficial en la posición Trp24, Val26 o Met29 del dominio
Sso7 se sustituye.
4. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la
que la sustitución del resto superficial aumenta la especificidad de
unión de cebador/molde de polimerasa en comparación con una proteína
de fusión de Sso7-polimerasa que comprende la SEC ID
Nº 2.
5. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 comprende la
SEC ID Nº 2 en la que un aminoácido en una posición que es una
posición de resto superficial se sustituye por un aminoácido
diferente.
6. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 2, en la que el
resto superficial en posición Trp24 se sustituye por cualquier
aminoácido distinto de Asp, Glu, Arg, Lys y Pro.
7. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 6, en la que la
sustitución de resto aminoacídico se selecciona de glicina, valina y
alanina.
8. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en la que el dominio polimerasa tiene
una actividad polimerasa térmicamente estable.
9. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 8, en la que el
dominio polimerasa es un dominio polimerasa de la familia A o
miembro de la familia B de polimerasa.
10. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 9, en la que el
dominio polimerasa de la familia A comprende un dominio \DeltaTaq
polimerasa.
11. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de la reivindicación 9, en la que el
miembro de la familia B de polimerasa comprende un dominio
polimerasa de Pyrococcus.
12. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 tiene una
identidad de al menos el 75% con la SEC ID Nº 2.
13. La proteína conjugada de
Sso7-polimerasa de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 tiene una
identidad de al menos el 90% con la SEC ID Nº 2.
14. Un método de realización de una reacción de
polimerasa en un ácido nucleico diana presente en una solución,
comprendiendo el método:
- (a)
- poner en contacto el ácido nucleico diana con una proteína conjugada de Sso7-polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; en el que la solución es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico y el dominio polimerasa extienda un cebador que hibrida con la secuencia del ácido nucleico diana; y
- (b)
- incubar la solución en condiciones en las que se extiende el cebador por la polimerasa.
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