CN104195161B - 基于可控型dna聚合酶和外切酶活性的dna重组酶的制备方法及其应用 - Google Patents

基于可控型dna聚合酶和外切酶活性的dna重组酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程和基因克隆技术领域，具体为一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用。具体步骤如下：(1)构建DNA重组酶的表达载体；(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性；(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA时生成的5’单链突出端长度，(4)验证制备的DNA重组酶生成5’单链DNA突出端的长度和基因克隆效率。本发明的有益效果在于：其制备的5’单链突出端的长度可控，维持在15‑25个核苷酸范围内，使得克隆效率和准确率达到最高，利用中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。

Description

基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法 及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶制备方法，其可以用于构建重组DNA载体，属于蛋白质工程和基因克隆技术领域。
背景技术
基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因DNA片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。限制性核酸内切酶消化和DNA连接效果较难控制，常常造成目标基因克隆失败。同时由于限制性核酸内切酶识别位点的多样性，不同目标基因采用的限制性核酸内切酶不同，使得常规基因克隆的操作通量有限，不能进行高通量基因克隆。
为了克服常规基因克隆方法的缺陷，目前已开发了不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的克隆技术。这些克隆技术的共同点是：通过酶学或化学手段,使目标基因和线性载体DNA产生长度不低于12个核苷酸的单链突出端，且目标基因与线性载体的单链突出端互补配对，重组质粒转入大肠杆菌后，大肠杆菌负责修复目标基因与线性载体间的缺口，形成含有目标基因的完好重组载体。目前不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的克隆方法也存在明显缺点：产生单链突出端的酶学反应处于非可控状态，要么反应过度，要么反应不充分，结果单链突出端生成效率极低，不高于千分之一，需要转化效率极高的感受态细胞(高于108)才能取得较满意的克隆效率。而制备高于108的感受态细胞就是一项困难繁琐的技术。因此制备酶学反应可控的高效稳定的DNA重组酶，用于基因克隆将大大促进不依赖于限制性内切酶和连接酶的克隆技术与基因工程技术的发展。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶学反应可控的新型DNA重组酶的制备方法及其应用，其制备的DNA重组酶可用于基因克隆和点突变，尤其适用于高通量基因克隆。
本发明提供一种新型DNA重组酶制备方法，该新型DNA重组酶同时具有DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，而且这两种活性经过改造后可以在生成5’单链DNA突出端的过程中达到一种平衡状态：当5’单链DNA突出端长度短于15个核苷酸时，重组酶表现为3’外切酶，继续水解3’核苷酸，从而延长5’单链DNA突出端；当5’单链DNA突出端长度长于25个核苷酸时，重组酶表现为DNA聚合酶，在3’端添加核苷酸，使5’单链DNA突出端回退到15-25个核苷酸。这种新型DNA重组酶，可以高效的使5’单链DNA突出端长度维持在15-25个核苷酸左右，从而大大提高5’单链DNA突出端生成效率；使得利用中等效率的感受态细胞(104-105)即可轻松的完成基因克隆。
本发明提供一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法，具体步骤如下：
第一步，构建DNA重组酶的表达载体。
选取同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利用常规基因克隆技术将原型重组酶基因克隆到原核表达载体pET28a，在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达原型重组酶。镍柱亲和纯化DNA重组酶，测定其DNA聚合酶和3’外切酶活性，计算3’外切酶活性/DNA聚合酶活性的比值(E/P值)。
第二步，改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性
在原型DNA重组酶基础上，利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶和3’外切酶活性的关键氨基酸残基，制备一系列原型DNA重组酶突变体，调整其E/P值。利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达原型DNA重组酶突变体。镍柱亲和纯化原型DNA重组酶突变体，测定计算各突变体E/P值；以原型DNA重组酶E/P值作为参照，筛选E/P值增高的DNA重组酶突变体。
第三步，测定DNA重组酶突变体水解双链DNA生成的5’单链突出端长度
由于改变了DNA重组酶突变体的E/P值，使得其具有如下特性：在低浓度dNTP(20-50μM)存在下能够高效水解双链DNA，但当5’单链DNA长度超过25个核苷酸时，DNA聚合酶活性被有效启动，使得5’单链DNA长度缩短；当5’单链DNA长度短于15个核苷酸时，DNA聚合酶活性被关闭，3’外切酶活性被有效启动，使得5’单链DNA长度延长。基于DNA重组酶突变体的这一特性，人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定步骤二中获得的DNA重组酶突变体水解双链DNA的实际效果，筛选生成的5’单链突出端长度在15-25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变体，用于基因克隆。
本发明中还进一步提供利用DNA重组酶进行不依赖于限制性核酸内切酶和连接酶的基因克隆的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)制备的单链突出端的长度可控，维持在15-25个核苷酸范围内，使得克隆效率和准确率达到最高，中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。
(2)制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。
附图说明
图1为本发明基于可控型聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶的工作原理图。
图2为火球菌DNA重组酶的克隆效率图示。
图3为大肠杆菌DNA重组酶的克隆效率图示。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。图1为本发明基于可控型聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶的工作原理图。
实施例1 耐热型DNA重组酶的制备
首先构建火球菌P.furiosus的耐热型DNA聚合酶的重组表达载体，由于其同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性，可作为耐热型重组酶原型。在火球菌原型DNA重组酶的基础上，通过改造其DNA聚合酶和3’外切酶活性，使其DNA聚合酶和3’外切酶活性达到一种平衡状态，从而使最终的火球菌DNA重组酶能够将双链DNA末端加工成长度为15-25个核苷酸的5’单链突出端。具体实施步骤如下：
第一步，制备火球菌原型DNA重组酶
利用原核表达系统表达纯化火球菌重组DNA聚合酶，作为耐热型DNA重组酶原型。利用原核表达质粒pET28a，在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达火球菌原型DNA重组酶。纯化原型DNA重组酶后，测定其DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，活性测定反应体系为：20mMTris-HCl(pH8.8),10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,0.1mg/mL BSA,0.1％(v/v)Triton X-100,2mMMgSO4，根据DNA聚合酶和3’外切酶活性的测定值，计算其E/P值为2.3。
第二步，制备火球菌DNA重组酶突变体
在火球菌原型DNA重组酶基础上，基因定点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶活性的精氨酸和赖氨酸等关键氨基酸残基、负责3’外切酶活性的天冬氨酸和谷氨酸等残基，调整其E/P值，共制备了12个DNA重组酶突变体：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12。利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达DNA重组酶突变体M1-M12，镍柱亲和纯化DNA重组酶突变体，测定计算各突变体的E/P值；以火球菌原型DNA重组酶为参考标准，筛选到E/P值增大的突变体：M2、M3、M5、M8、M11。
第三步，测定火球菌DNA重组酶突变体水解双链DNA生成5’单链DNA突出端的长度
人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定步骤二筛选到的DNA重组酶突变体M2、M3、M5、M8、M11水解双链DNA生成的5’单链突出端长度。测定反应条件如下：50μMdNTP，0.1μM双链DNA，20ng DNA重组酶，60℃反应5-10分钟。根据测定结果筛选到了DNA重组酶M5、M11具有如下特性：能够水解平末端双链DNA，但当5’单链DNA长度超过25个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被有效启动，使得5’单链DNA长度缩短；当5’单链DNA长度短于15个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被关闭，而重组酶的3’外切酶活性被有效启动，使得5’单链DNA延长。其中DNA重组酶M5和M11生成的5’单链DNA长度分别为：18和22个核苷酸。因此DNA重组酶M5、M11可以用于基因克隆。
第四步，火球菌DNA重组酶基因克隆效率测定。利用火球菌DNA重组酶M5进行不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆，反应条件为60℃反应0-30分钟。其中，火球菌DNA重组酶M5的克隆效率见图2。感受态细胞的转化效率为2.3×105。纵坐标表示克隆数，克隆数越多代表克隆效率越高。横坐标为反应时间，在0-5分钟内克隆效率与反应时间基本成正比例；克隆效率在5分钟后达到最高值，而且随反应时间的延长，克隆效率并未降低，在30分钟内都很稳定，这是本DNA重组酶的主要优点。
实施例2 常温型DNA重组酶的制备
大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段同时具有DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，又是常温型蛋白，因此可以作为常温型DNA重组酶原型。基于常温型DNA重组酶原型的大肠杆菌DNA重组酶的制备步骤如下：
第一步，制备大肠杆菌原型DNA重组酶
利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达大肠杆菌重组DNA聚合酶I的Klenow大片段，作为常温型DNA重组酶原型。镍柱亲和纯化常温型大肠杆菌原型DNA重组酶，测定其DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，计算大肠杆菌原型DNA重组酶的E/P值＝1.3。活性测定体系为：50mM Tris-HCl(pH8.0),5mM MgCl2,1mM DTT。
第二步，制备大肠杆菌DNA重组酶突变体
在步骤一原型DNA重组酶基础上，改变大肠杆菌原型DNA重组酶负责DNA聚合酶活性的精氨酸和赖氨酸等关键氨基酸残基，以及负责3’外切酶活性的天冬氨酸和谷氨酸等残基，制备一系列DNA重组酶突变体：M1-M15。利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达这些DNA重组酶突变体。镍柱亲和纯化大肠杆菌DNA重组酶突变体，测定M1-M15各个突变体的DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，并计算各突变体的E/P值。以大肠杆菌原型DNA重组酶的E/P值为参照，筛选到E/P值增高的突变体M3、M6、M7、M10、M12、M13。
第三步，测定大肠杆菌DNA重组酶突变体水解双链DNA生成5’单链DNA突出端的长度
人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定步骤二筛选到的DNA重组酶突变体M3、M6、M7、M10、M12、M13水解双链DNA生成的5’单链突出端长度。测定反应条件如下：50μM dNTP，0.1μM双链DNA，20ng DNA重组酶，60℃反应5-10分钟。根据测定结果筛选到了DNA重组酶M3、M10具有如下特性：能够水解平末端双链DNA，且当5’单链DNA长度超过25个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被有效启动，使得5’单链DNA长度缩短；当5’单链DNA长度短于15个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被关闭，而DNA重组酶的3’外切酶活性被有效启动，又使得5’单链DNA长度延长。大肠杆菌原型DNA重组酶突变体M3和M10水解双链DNA生成的5’单链DNA长度分别为16和21个核苷酸，可以满足不依赖于DNA连接酶和限制性核酸内切酶的基因克隆的要求。
第四步，大肠杆菌DNA重组酶基因克隆效率测定
利用大肠杆菌DNA重组酶M10进行基因克隆，反应条件为37度反应0-30分钟。大肠杆菌DNA重组酶的克隆效率见图3。感受态细胞的转化效率为1.4×105。纵坐标表示克隆数，克隆数越多代表克隆效率越高。横坐标为反应时间，在0-5分钟内克隆效率与反应时间基本成正比例；克隆效率在5分钟后达到最高值，而且随反应时间的延长，克隆效率在30分钟内都很稳定，并未降低，这是本专利技术制备的DNA重组酶的主要优点。

Claims (2)

1.一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建DNA重组酶的表达载体
选取同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达原型重组酶，镍柱亲和纯化得到DNA重组酶，测定其DNA聚合酶和3’外切酶活性，计算原型DNA重组酶的3’外切酶活性和DNA聚合酶活性的比值，即E/P值，作为改善型DNA重组酶的筛选参数；
(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性
在原型DNA重组酶基础上，利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶和3’外切酶活性的氨基酸残基，调整DNA重组酶的E/P值，设计制备一系列DNA重组酶突变体；利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS重组表达、镍柱亲和纯化得到一系列DNA重组酶突变体，测定突变体的DNA聚合酶和3’外切酶活性、计算各突变体的E/P值，以原型DNA重组酶为参照物，筛选E/P值增高的一系列DNA重组酶突变体；
(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA产生的5’单链DNA长度
人工合成长度为80个碱基对的双链DNA，以其作为底物，测定DNA重组酶突变体水解双链DNA的效果，筛选生成的5’单链突出端长度在15-25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变体为用于不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆的DNA重组酶。
2.根据权利要求1所述制备方法得到的DNA重组酶于不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆技术中的应用。
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