JPH02150285A - バシルス・コアグランスのアミラーゼ遺伝子に基づくバシルス発現ベクター - Google Patents

バシルス・コアグランスのアミラーゼ遺伝子に基づくバシルス発現ベクター

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JPH02150285A
JPH02150285A JP1185858A JP18585889A JPH02150285A JP H02150285 A JPH02150285 A JP H02150285A JP 1185858 A JP1185858 A JP 1185858A JP 18585889 A JP18585889 A JP 18585889A JP H02150285 A JPH02150285 A JP H02150285A
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アラン・スロマ
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Cathy F Rudolph
キャシー・フェイ・ルドルフ
Jr Gerald A Rufo
ジェラルド・エイ・ルフォ・ジュニアー
Janice Pero
ジャニス・ペロ
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    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、所望の異種ポリペプチドを生産するだめの遺
伝子工学の利用に関する。（こ〜で使用した用語「ポリ
ペプチド」は蛋白質およびペプチドを含む任意の有用な
アミノ酸鎖を意味し、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕ
ｓ）　Ｊはポリペプチドを生産させようとする宿主細胞
では本来生産されないポリペプチドを意味する。） （従来技術） バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は遺伝子工学によって
作製されたベクター上にコードされた異種ポリペプチド
を生産するための宿主として用いられてきた。ダラム陽
性のバ之立ス細胞を宿主として用いると１．ｔＪｌｉｉ
Ｌ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）のようなダラム陰性微生物内での
異種遺伝子の発現に付随して起こるいくつかの問題；例
えば、エンドトキシンの生産に関する問題；を回避する
ことができる。
色々なりローン化した調節エレメントを用いて異種蛋白
質を生産しうるバシルス発現システムは数多く報告され
ている。
ハープイー（ｔｌａｒｄｙ）ら、　〔ネイチャー　（Ｎ
ａ　ｔｕｒｅ）、罎じ工４８１　（１９８１）および欧
州特許出願第８２３０２１５７．１号明細書）は、Ｂ型
肝炎ウィルスのコア抗原および口蹄疫ウィルスの主要抗
原をコードするＤＮＡ配列杏プラスミドｐＢＤ９１のエ
リスロマイシン耐性遺伝子のプロモーターを用いて、ゲ
展仁失−人・旦り。
入（Ｂａｃｉｌｌｕ１１ル旦旦牡内で発現させた。
ウィリアムズ（Ｗｉ　ｌｌｉａｍｓ）ら〔ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、」：１９９（１９８１）　）は、マウスのジし
ドロ葉酸レダクターゼ遺伝子をファージ５ＰＯ２プロモ
ーターを含むベクターｐＰ１６０Ｂを用いて去ンエ少ノ
ヨ・スーｆ上史入内で発現させた。
ルンペン（Ｒｕｐｐｅｎ）ら（”バシルス　モレキュラ
ジェネティクス　アンド　バイオテクノロジアプリケー
ションズ（［１ａｃｉｌｌｕｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧ
ｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　”エイ・ティー・ガー
レソン（Ａ、Ｔ、Ｇａｒｒｅｓｏｎ）およびジェイ・エ
イ・ポンチ（Ｊ　、　Ａ　、　ｌ１ｏｃｈ）Ｕａ、４２
３−４３２頁、アカデミ・ンク　ブレス（八ｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８６）は、バシルス・スブチ
［入内でヒトの成長ホルモン組換え体を生産するために
ハイブリッド５ｐａｃ　　１プロモーター、合成したり
ポゾーム結合部位、および人埒回のｈ伊遺伝子ターミネ
ータ−を用いることに゛ついて報告している。
（発明の構成） 本発明は、−べ＞ｎｙス−・入ブ４３込（Ｂ、ｓ、、ｕ
ｂｔｉｌｌｓ）のようなダラム陽性細閑内で異種のポリ
ペプチドを生産させるための改良発現システムを堤供す
る。
本発明は我々が発見し単離したヱ達２ノとス−・ツ１久
１グ入（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｕｌａｎｓ）の新規
のアミラーゼをコードする遺伝子を用いることからなり
、この新規遺伝子は著るしく高いレヘルで発現する。
本発明によれば、所望の異種ポリペプチドをコードする
ＤＮＡはバシルス−・１ヱ久ｉス入のアミラーゼ調節領
域の支配下にあるようにベクター内に配置されており、
ポリペプチドの高レベル発現を可能にする。〔バシルス
・旦−η久う７　人はアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡｓｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃ
ｋｖ　ｉ　ｌ　ｌｅ）、マリ−ランド、寄託番号２３４
９８より調達しうる。〕ム上・ユヱｊ立ｌスの新規アミ
ラーゼ遺伝子は、プラスミドベクター上に挿入して！±
＞ｔＶＸ・−各１〕ヒし入内に伝搬された場合にバシル
ス・３７’±ｉ２内で著るしく高レベルで発現すること
に加えて、バシルス・ニー７＆カフ２のアミラーゼ遺伝
子はシグナルペプチドをコードする配列もが欠失してい
るという点でエキスポーティド（ｅｘｐｏｒｔｅｄ）ア
ミラーゼをコードする遺伝子；例えば、バ之及−人早ル
穎孔木火え人情Ｊｊ０ユｉ−ハ、（鼾醇、ｔ＜　ｙ　）
ｐ・五ｊ±ユ入（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
＞のアミラーゼ遺伝子；の中では特異である。また、こ
の新規アミラーゼ遺伝子はコルネリス（Ｃｏｒｎｅｌｉ
ｓ）らによってモレキユラー・アンド・ジェネラル・ジ
エネティクス（１’ｌｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｅｓ
）、ｌｉ、−５０７（１９８２）に記載されているアミ
ラーゼ遺伝子とも異なる。コルネリスらによって開示さ
れているアミラーゼはバ之及ス・ユ立ノ１！Ｌｔ入起源
のアミラーゼと同一ではないとしてもよく似ているよう
に思われ、事実、著者らはこの株はバ±ｙ入　ユが王主
火ま久かもしれないと述べている。　）＜−７）Ｌ、’
）、　・’：Ｊ７９’ｆｐＺ久（し、姐ｐ士狙註のアミ
ラーゼ遺伝子をコードする配列りにはシグナルペプチド
が欠落しているにもか＼わらず結果的に多量のアミラー
ゼが細胞外に見い出されるのは、多分多量の蛋白質が生
産されることおよびこの蛋白質が細胞から遊離されるこ
とによることを我々は発見した。さらに我々は、異種遺
伝子がバシル入・ユヱ久ｙ７久調節領域の転写調節およ
び翻訳調節下にあるように遺伝子工学によって配置した
場合でさえも、大量に発現することを見い出した。
バシルス・２Ｌ尻入遺伝子の調節領域に加えて、本発明
のベクターにはアミラーゼ構造遺伝子の全部または一部
；好適にはアミラーゼの少なくとも最初（アミノ末端か
ら）の２個ないし３０個のアミノ酸をコードする部分構
造遺伝子；が含まれると好都合である。また、ベクター
には調節領域下流でかつその読み枠と一部するように異
［ＤＮＡを挿入するためのサイトも含まれていることが
望ましく、そうすることによってＤＮＡは／＜’／）Ｉ
／入・、７−ヱ久立又久プロモーターの転写調節下に置
かれる。このサイトはアミラーゼ構造遺伝子の３′末端
内または３′末端、翻訳終止コドンのすぐ上流に位置す
ることが最も望ましく、そうすることで発現によって融
合蛋白質（所望の異種ポリペプチドに融合したバクカブ
−・−４−η久プｌスのアミラーゼの全部または一部）
が仕度され、その内で部分的または完全なアミラーゼ蛋
白質はプロテア・−ゼによる消化に対して異種ポリペプ
チドを安定化するための防御担体として働く。このよう
な安定化はペプチドおよび低分子ポリペプチドならびに
真核生物の蛋白質にとって特に重要であり、さもなくば
、これらのほとんどは宿主細胞のプロテアーゼによって
消化されてしまう。
他の好適な実施態様においては、シグナルペプチドをコ
ードする配列が異種遺伝子の上流でかつアミラーゼ調節
領域または部分構造遺伝子の下流に挿入され；上記シグ
ナルペプチドをコードする配列がグラム陽性（好適には
バジル入）の宿主細胞内で機能し、その結果異種遺伝子
の生産物の分泌を可能にしうる。好適にはう／グナルペ
ブチドをコードする配列はバ乞火ス一種、最も好適には
、例えばスロマら（米国特許出願第９２１，３４３号明
細書、出願人に譲渡され、ここに参照として合体させる
）によって開示されたバλ土入・久ヱー九悲スのズブチ
リシン遺伝子のようなバシルスのプロテアーゼ遺伝子、
スロマら　（米国特許第４，６３３．２８０号明細書）
によって開示されたバ之火久・立に立入（８，７のベニ
ジリナーゼ遺伝子、チャング（Ｃｈａｎｇ）ら（米国特
許第４，７１１，８４４号明細書）Ｑこよって開示され
たバ之五入・見ケ−＝も少ｊ入のペニシリナーゼ遺伝子
、ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ）ら（米国特許第４，６９０，
８９８号および第４．６６３．２９４号明細書）によっ
て開示されたバシルス−・２７’チＵのα−アミラーゼ
遺伝子、またはステフェンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）ら（
米国特許出願第８４５，８６４号明細書、出願人に譲渡
され、こ＼に参照として合体させる）によって開示され
た籐ニー乞入・亙立三１ソｖ５入のα−アミラーゼ遺伝
子から誘導される。
他の好適な実施態様において、宿主細胞はグラム陽性の
細胞、好適にはバシル久・入ｊ土ユλ工しｔ成員」１０
一種、またはそのかわりとしてユ之土入・■立正Ｊワ目
λ（Ｂ、　１几蝕ｄ違Ｙ鼾紅、バ之ルス・ア≧ロ１クエ
フ　シエンス（ｊ３１Ｑ■お壮へＪ刺獲夏１μ」鼾ジｙ
、　ｌメニシー〕に入　・　、Ｉｆ−リー主→トニジ二
（Ｂ、Ｊ！！λ１）す１ｙｙ」（し、　　バー孔入り、
卯且銭ハ郵１−、ハシルス・２３ｙ１）弘乙乞ス（Ｌ↓
１回、■土９−ｕｕ、ハゴθシ入・ｊ）ρ元方バし在Ｂ
、ｍｅ　ａｔｅｒｉｕｄ、バシルス・丈上及Ｘ　　（Ｂ
、ｃｅｒｅｕｓ）、バ区火入・±Ｌ土−（Ｂ）ａｔｔｐ
）　、あるいはバシルス・ヱクーＬ友歩り」−欠入（Ｂ
、ａｃｉｄ匹１−坦り１鮭のいずれか１種からのバク火
入の細胞である。
本発明に従って発現され・うる異種のＤＮＡの例として
は、任意の所望のポリペプチド、例えばホルモン、ワク
チン、抗ウィルス性蛋白質、抗腫瘍蛋白質、抗体または
血餅形成蛋白質のような医療上有用な蛋白質、ならびに
酵素または農薬のような農業上および工業上有用な蛋白
質が含まれる０本発明に従って発現されうる所望の真核
生物の蛋白質の一例として心房性ナトリウム利尿因子が
挙げらる。この因子は文献には色々な名前で、一連の長
さのアミノ酸鎖をもつものとして報告されており、これ
らはバルク（Ｐａｌｌｕｋ）ら、ライフ・サイエンス（
Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）、　３６．１４１５（１９
８５）に記載されている０本明細書では、上記文献の第
１図の名称を用いて、心房性ナトリウム利尿因子前駆体
分子ならびにその分子の３つの低分子量生物活性フラグ
メント、アトリオベプチン（Ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎ）
　Ｉ、アトリオベプチン■およびアトリオベブチン■（
ＡＰＩＩＩ）と呼ぶ、これらのペプチドは高血圧症の調
節ならびに血清中のナトリウムおよびカリウムのレベル
の調節のためにヒｔ・の患者に投与されうる。
本発明の他の特徴および利点は以下に記載する好適な実
施態様および特許請求の範囲から明らかになるであろう
。
さ久久二圓構１ 本発明の２つのヘクター、ｐＣＲ４８および９Ｍ５３３
０゜を第３図および第４図に示す、これらベクターの構
築における第１段階は以下のようにして、バ之ｔｖ盈・
２１ｊΣし乙λのアミラーゼ遺伝子をＤＮＡライブラリ
ーから単離することである。
染色体ＤＮＡをバシルス　ニジ１３６久！−人＾ＴＣＣ
寄託番号２３４９８株から単離し、Ｓａｕ　３＾で部分
消化し、さらに０．８χアガロース　ゲルで電気泳動を
行ない大きさによって分画した。３〜６ｋｂの範囲の大
きさのＩ）ＮＡをゲルから電気溶出した。このＤＮＡを
染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡの比率２：１でＢｄ　　
Ｉで切断した１１ＢＤ２１４　（グリクザン（Ｇｒｙｅ
ｚａｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　２０．４５９（１
９８２）　）に結合させた。次いで結合したＤＮＡを受
容能をもつ細胞であるバシルス・□入にＥ乱ノ、　ＢＤ
３９３　（グリクザンら、上記）に形質転換して、その
結果７２００↑＋Ｉｐ’　Ｃｍ”のコロニー（“Ｔａｐ
”″はトリメトプリム耐性であり、”Ｃｍ””はクロラ
ムフェニコール耐性である）を得た。　３３５０Ｔ鍋ｐ
ｌ　Ｃ，ｌからの３個のコロニーはデンプン−アズール
指示薬を含んだ平板培地上に塗布するとハローを形成し
た。３個のこれらのコロニーから得たプラスミドＤＮＡ
はすべて他のアミラーゼ（−）のバシルス　４五１鵞ヒ
Ｊノ５株をＡｎｙ＋に形質転換することができ、このこ
とはアミラーゼ遺伝子がこれらのプラスミド上にクロー
ン化されていることを示している。コロニーのうちの１
個は大きなコロニーを形成し、挿入サイズおよそ３．８
　ｋｂのプラスミド（ｐＮＨ２３７）を含んでいた。
プラスミドｐＮＨ２３７をプロテアーゼ（−）、胞子形
成（−）のバシルス　ｘ−ｙ±ニスの宿主ＧＰ２０５（
、ＩＬ　Δ、　！ｕ！ＬΔ、　肚虹ＯＡ　）と命名され
た株内に形質転換した。　ｐＮＨ２３７をもつＧＰ２０
５の培養は、−晩、クロラムフェニコール（５μｓ／ｄ
）含有のＬＢ培地で増殖させ、上澄液画分のサンプルを
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけコマシー
フ゛リリアント　フ゛ル−（Ｃｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１
ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）で染色することによって分析
した。比較を目的として、クローン化されたバシルス　
ユ欠二水土ｌ久のアミラーゼ遺伝子を含むＧＰ２０５の
培養液から得られた上澄液体のサンプルも同一のゲルに
流し、た。（この遺伝子、およびそのシグナルペプチド
をコードする配列の分泌ベクター内での利用はステフェ
ンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ　）ら、ｔｌ、ｓ、ｓ、ｊｌ、
第８４５，８６４号に記載されており、この特許は出願
人に譲渡され、こ−に参照として合体せる。） バシルス　−１１３（九χ）、のアミラーゼ遺伝子を（
ｐＮＨ２３７上に）含む細胞は分子量およそ５９，００
０の蛋白質を大量に合成することが分かった。ポリアク
リルアミドゲルの蛋白質のバンドをデンシトメーターに
よる定量で比較したところ、ｐＮｌ１２３７をもつ細胞
は、同一ベクター上にバシルス・ユ欠三本ｔｖ５人のア
ミラーゼ遺伝子を含む細胞より５〜１０倍多くアミラー
ゼ蛋白質を生産することがわかった。さらに、バシルス
・ユヱ久立ヱ入ｐＮＨ２３７のクローンは同一ベクター
上に乗せられたバシルス１０　　エ　　シエンスより明
らかに多量のアミラーゼ蛋白質の生産を導くことがデー
タによって示された。
以下に記載の方法に従って、ｐＮ８２３７−ヒのアミラ
ーゼ遺伝子の位置を決定し、そのヌクレオチド配列を決
め、さらにそれに関係する調節配列を同定した。
遺伝子をコードする領域がｐＮＨ２３７に挿入した３、
８ｋｂのどこに位置するかを決定するために、このＤＮ
への制限地図を作製した（第５図）。２つのＥｃｏ　Ｒ
Ｖフラグメントのうちの１つまたは両方のいずれかを欠
落させたプラスミドを構築することによって、１．２５
ｋｂのＥｃｏ　Ｒνフラグメントの存在がアミラーゼ活
性に必要であり、１．ＯｋｂのＥｃｏ　Ｒνフラグメン
トは活性に影響を与えることなく除去されうると断定さ
れ；それ故、アミラーゼの発現に必要な情報は１．２５
ｋｂの中央のＥｅｏ　ＲＶフラグメントの内部に位置す
るはずである。
より精密な遺伝子地図を作製するために、プラスミドＤ
ＮＡを用いて、インビトロ−０Ｊ−リ」ＬＯ−〇転写／
翻訳システムでアミラーゼを合成させた。プラスミドＤ
ＮＡは色々な制限酵素で切断して遺伝子内に位置する制
限サイトを決定した（遺伝子内に位置するサイトで切断
すると生産物の合成が破壊される）。未切断のＤＮＡ、
および挿入フラグメントの中を切断されなかったＤＮＡ
（Ｅｃｏ　Ｒ１による切断）は分子置駒５９，０００の
蛋白質を生産した。ハ但■。
ＥｃｏＲＶまたは５ａｉｌのいずれかでＤＮＡを制限す
ると、５９ｋｄの蛋白質が合成されなくなり、このこと
はこれらの酵素がコード配列の中を切断することを示し
ている。これに対して、Ｂ４＋ｍ旧で切断しても蛋白質
の合成は影響されなかった。このことから遺伝子は拘υ
旧サイトと挿入フラグメントの末端との間の挿入フラグ
メントのおよそ２．１ｋｂの部分に位置する（第５図）
、この２．　ｌｋｂのに虹Ｒ１−ハＬ旧フラグメントを
ｐＮ）１２３７から取り出し、Ｅｃｏ　ＲＩ姐建Ｈｒで
消化したｐＢｓ８１／６内にクローン化した。　（ｐＢ
ｓ８１／６は標準的なバシルスのクローニングベクター
であるｐＢＤ６４　（グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）ら
、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナルアカデミ
イー・オブ・サイエンス（ＰＮＡＳ）　、互、１４２８
（１９７８）　）のＰｖｕ　Ｕサイトを合成リンカ−で
ＨｉｎｄＩＩＩサイトに変えることによってρＢ０６４
から誘導した多コピープラスミドである。）得られたプ
ラスミドは９Ｍ３２８１と命名した。
バシルス　コアグーンスのアミー−ゼ　　　の況よ■ ｐＭｓ２８１のシ１旧サイトとＥｃｏＲＩサイトとの間
の２．１ｋｂのＤＮＡはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジ
デオキシ法によって配列を完全に決定した。アミラーゼ
遺伝子の完全なヌクレオチド配列を第６図に示す。
バシルス　ユヱ久ｉＺ入のアミラーゼ遺伝子はバジルス
　スーアロールモフ　ルスのα−アミラーゼ遺伝子（５
８χ）およびバシルス　−史チ正ジ粗匹」−久のそれ（
６２χ）とかなりの相同性を示した。相同領域はバシル
ス　−Ｌｌ」三歩」仁えメ、遺伝子のシグナルペプチド
をコードする配列のあと直ちに始まり、これはバシルス
　１７−７”７Ｘのアミラーゼ遺伝子をコードする領域
の５′末端に一致する（第７図）。バシルス　ユヱ久立
ｌ入遺伝子は５′末端からバシルス　丈欠三生ｔｖＢ入
のアミラーゼとの相同領域までの間にオーブンリーディ
ングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｓ＋
ｅ）を有せず、また誘導された蛋白質のＮ−末端アミノ
酸配列は之久±土ニブ天上の典型的配列とは相似せず、
このことは、バシルス　ユヱ久ｉノスのアミラーゼが型
通りのシグナルペプチド配列を伴なっていないことを示
している。
精製したバ之土ス　且ヱ久立ｌ入のアミラーゼのアミノ
酸配列を決定し、この配列がＤＮＡ配列から予想される
配列と一致することを見いだしたが、但しロイシン残基
（ＴＴＧでコードされる）と予想される位置にはＮ−末
端メチオニン残基（ｔ１準的にはＡＴＧでコードされる
）が存在した。このことはＴＴＧはグラム陽性微生物で
は時折Ｎ−末端のメチオニンをコードすることが知られ
ているという事実によって説明される。
ＲＮＡポリメラーゼおよびリボゾームの結合部位に似た
配列はＴＴＧ開始コドンの上流の適切な位置に見い出さ
れた。−７０の位置にある配列ＴＴＧＡＡＡはシグマ”
　−１７ＮＡポリメラーゼによって認識されるバシルス
　２７’±１囚のプロモーターの標準的な一３５領域（
ＴＴＧＡＣ＾）とよく似ており、さらに配列ＴＡＴＡＣ
Ｔ　（−４７の位置はバシルス　久ヱ九史ムのシグマ４
３プロモーターの標準的な一１０領域（ＴＡＴＡＡτ）
とよく偵でいる。　ＴＴＧ開始コドンの前にはバシルス
のりボゾーム部合部位として機能しうる配列ＧＡＡＧＧ
ＧＧ　（−１５の位Ｗ）が存在する。
社企丘久久二優１策 二１１類の方法を用いて融合ベクターを構築した。
第一の方法は、ＡＰＩｆｌをコードする遺伝子を挿入す
るために、バシルス　’：Ｊ７”’−ｙＸのアミラーゼ
遺伝子の全長コピーと共にフレーム内に匡ＩＩＩサイト
を誘導するためにバシルス　ユヱｌ立ｌ入のアミラーゼ
遺伝子の３′末端のオリゴヌクレオチド誘導変異を誘発
させることからなる。第二の方法は、バシルス　−１１
フーΣ７７ヨのアミラーゼ遺伝子の調節領域が異種ポリ
ペプチドの発現を導く能力を証明するために、その調！
ｆｆ領域へ異種遺伝子を融合させることからなる。前者
の方法により得られたプラスミドはＰＣＲ４８（第３図
）であり、後者からのプラスミドはｐＭｓ３３０である
。
瘍唄し 第３図は、ＡＰＩＩＩをコー１゛するＤＮＡ＠バ乞烈バ
ク−久立／入の゛アミラーゼ遺伝子の３′末端付近に挿
入したベクター、ｐＣＲ４８の概略図であり、そうする
ことによって、アミラーゼ−ＡＰＩＩＩ融合蛋白質はバ
之上入　コアグ汐−スのアミラーゼプロモーターおよび
リポゾーム結合配列の転写および翻訳洲節下で発現する
。　ｐＣＲ４８は以下の方法に従って構築した。
オリゴヌクレオチド誘導変異誘発法 （ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
　ａｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて、Ｂａｓ＋旧号イ
トをｐＭｓ２８１内のアミラーゼ遺伝子の３′末端に挿
入した。アミラーゼ終止コドンのどちらか片側のオリゴ
ヌクレオチド配列に相補的であり且つＢａｇ旧認識サイ
トをコードする６個の塩基をさらに含む４１塩基からな
るオリゴマーがアミラーゼ遺伝子の最終コドンと終止コ
ドンとの間に導入された。オリゴマーのヌクレオチド配
列を次に示す： ５’　ＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣ
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＣ３’オリゴマ
ーを挿入した結果、Ｂａａ旧サイす内にコードされる２
個の該当アミノ酸（グリシンおよびセリン）がアミラー
ゼポリペプチドのＣ末端に追加された。　ｆｌｉ１旧サ
イトを挿入するための方法を次に示す。
プラスミドｐＭ３２８１　（全アミラーゼ遺伝子を含む
）のサンプルは、抑ａ　Ｉおよびｉｃｏ　Ｒ１で消化（
こうするとアミラーゼ遺伝子の３″末端を含むＤＮＡ’
ｔＪ域が欠落する）、または１ｌｉｎｄｌｌｌおよび１
■で消化（カナマイシン耐性遺伝子が不活性化される）
した、サンプルを混合し、プラスミドを変性させ、−本
１ｉＤＮＡを合成オリゴマー存在下で再びアニル化させ
た。相補鎖プラスミドを制限酵素で消化することによっ
て作製された一本鎖領域の鋳型とアニールさせたオリゴ
ヌクレチオド；それを、ギャップを埋めるために４種類
の全デオキシヌクレオチド存在下ＤＮＡポリメラーゼで
処理することによってプラスミド内に結合させた。変異
を誘発させたＤＮＡを用いて、プロトプラストにした／
＜　＞　７Ｌ／ス　入ｊ土ユムを形質転換し、形質転換
体はクロラムフェニコール耐性およびアミラーゼ合成能
によって選択した。得られたプラスミドはアミラーゼ遺
伝子の末端に存在する新規Ｂａ−旧サイトについてスク
リーニングした。蛋白質のカルボキシ末端にグリシンお
よびセリン残基が追加されてもアミラーゼ活性への影響
は認められなかった。このプラスミドのうちの１つ、ｐ
ＣＲ４６を遺伝子融合物の構築のために用いた。　　（
ｐＣＲ４６はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）寄託番号６７７３６号で寄託さ
れ、本出願人に譲渡された。〕 ＡＰＩＩＩをコードする遺伝子〔ステフェンス（Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓ）ら、上記を参照されたい〕は、以下の方法
に従って、バシルス　ユ’ＬＬｉＺ入のアミラーゼ遺伝
子とフレームが合うように新規作製したｈ見」■サイト
に挿入した。プラスミドｐＭｓ２８０から単離したＤＮ
Ａのシ佳■−肛皿■フラグメントは、び−之土入　−史
カニ＝キノヒえ２．のアミラーゼ遺伝子の３′末端から
誘導されたＤＮＡ断片の上流に位置するＡＰＩＩＩ　コ
ード領域を含むが、このフラグメントをバシルス　ユヱ
久立ｌ久のアミラーゼ遺伝子を含むｐｃｉｌ　４６から
のＢａｇ旧フラグメントと結合させた。
ハＬ旧、Ｉｎおよび■皿■による切断は、ム土人　２１
ノーし乙五のアミラーゼとＡＰＩＩＩの融合物を単コピ
ー含み、Ｂａｇ旧〜Ｈｉｎｄｌｌｌ末端をもつフラグメ
ントを遊離させた０次いでこのフラグメントをＢａａ　
Ｈ１／肛ｎｄｌｌｌ消化のｐＢｓ　８１／６　（上記文
献に記載）と結合させ、バシルス　入ヱ乏１囚内に形質
転換した。得られたプラスミドをｐｃＲ４８と命名した
。
ｐｃｉｌ　４８を含むバシルス　スブｌ」」ＩＰ　２０
５細胞を液体培地中で増殖させ、アミラーゼまたはアミ
ラーゼ−ＡＰＩＩＩ融合蛋白質の存在について、細胞お
よび使用した液体培地中の含量を別々に分析した。細胞
内または細胞外蛋白質はＳＯ３−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を用いて大きさによって分離し、コマジ−ブ
リリアントブルー染料で染色することによって、または
アミラーゼに特異的な抗体を用いたウェスタン（Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ）プロット分析によって目に見えるようにした
。多量のアミラーゼ−ＡＰＩｌ［融合蛋白質がこれら細
胞内に生産され、かつそのうちのかなりの部分（最大で
５０χ）が培養液中に遊離していた。この蛋白質の生産
レベルは一イベ２反入　悲欠士寸−必え入のアミラーゼ
遺伝子とＡＰＩＩＩ遺伝子との融合物のそれより５〜１
０倍高い このように、ｐＣＲ４８上に存在するバシル入　コヱ久
プｌ入のアミラーゼ調節領域は高いレベルの融合蛋白質
の発現を導く能力をもち、これらのうちの所望部分は遊
離され、且つ□人！」Ｌ４Ｊしツ１−クー久！入（Ｓｔ
ａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）ＶＢプロテ
アーゼ〔マイ（Ｍａｉ）ら、欧州特許第０２０７０４４
号明細書〕のような適切な蛋白質分解試薬で切断するこ
とによって精製した融合蛋白質から単離しうる。
上記のように、商業上有用な他の異種ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡもまた、該当する異種ポリペプチドを高
いレベルで生産させるために、バ之±ス　−１１３（ｉ
ンノ、のアミラーゼ遺伝子のカルボキシ末端内に挿入ま
たは融合しうる。ワクチン成分として用いるために異種
ペプチドを含む融合蛋白質を生産する場合には、融合蛋
白質それ自身がワクチンとして有用であるかも知れない
ので、融合蛋白質のアミラーゼキャリ′７一部分から離
して異種ペプチドを精製する必要がない場合もある。
已ト討り 第４図に、バシルス　ユヱ久立ｌスのアミラーゼ遺伝子
およびその調節エレメントをバシルス、！Ｌｌ＝ｔルミ
スのアミラーゼ遺伝子の上流でかつこの遺伝子と同一の
転写読み枠内に挿入したベクターであるｌ）ＭＳ　３３
０を示す、このようにコードされたハイブリッド蛋白質
はバシルス　ユヱｌ立ｌ入のアミラーゼ調節エレメント
の転写・翻訳調節下にある。このベクターは次のように
して構築した。
プラスミドＰＭＳ２８３　（バシルス　−ツヱグ泣ノス
のアミラーゼ遺伝子を含む）をＢａｇ旧およびＥｃｏ　
ＲＶで切断し、バシルス　−ジｊ−グ」Ｌと２．のアミ
ラーゼ遺伝子の調節領域および５′末端を含む６５０ｂ
ｐのフラグメントをｐＵｃ１８のＢａｇ−旧サイトとＬ
ＬｎｘＩＩサイトとの間にクローン化してｐＡｓ４０を
形成した。
ｐＡｓ４０をＮａｒ　Ｉで切断し、４種類の全デオキシ
ヌクレオチド存在下ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）フラグメントで処理してプラントエンドに
し、さらにハｔｌリンカ−（ｄ（ｐ’ＧＣ丁ＧＣ＾ＧＣ
）　）に結合させた。次いでＢａｇ旧およびＰｓｔ　Ｉ
で切断した後、バシルス　旦１ｊ繻り上人のアミラーゼ
コード領域の調節エレメントおよびおよそ３０のコドン
を含む４６０ｂｐのＢａｇ旧−ＰｓＬＩ　フラグメント
をＢａｇ−旧およびＰｓｔ　Ｉで消化したｐＲｓ９２／
１３内にクローン化した。（ｐＢｓ９２／１３はバシル
ス　ユ立三Ｊソ肚辷入のアミラーゼ遺伝子のコード領域
をもつが、プロモーターおよびシグナルペプチドをコー
ドする配列は欠落している。）この結果、プロモーター
欠損かつシグナル欠損のバシルス　−男カニ二ホ」ム亙
ノ、ノアミラーゼ遺伝子の上流にバシルス　ユヱ久立ｌ
久のアミラーゼ調節領域を配置した９Ｍ５３３０が得ら
れた。
バシルス　入ブ±ニスＧＰ２０５細胞内に形質転換した
後、９Ｍ５３３０をもつ細胞によって生産された融合蛋
白質を分析した。生産された融合蛋白質の大部分は細胞
と結合した状態のま〜であった。細胞に結合した状態の
蛋白質は慣用法に従って抽出し、ゲル染色およびウェス
タン　ブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ）によって分析した。バジル入ユヱグ立Ｚムのアミ
ラーゼとバシルス　丈欠三主ｔｖ３久のアミラーゼとの
融合蛋白質の生産レベルは野生型のバシルス　旦１イ（
れ上人のアミラーゼより少なかったが、バシルス　丈欠
三木灰まスのアミラーゼ遺伝子のみで見られるアミラー
ゼ生産のレベルよりはかなり多かった。このことから、
ハシルス　ユヱｊ立ｌス遺伝子の調節エレメントおよび
プロモーター−近位末端は異種遺伝子の高レベル発現の
誘導に有用であることが確認された。
°、ベ　　−の 本発明の発現ベクターは有効なシグナルペプチドをコー
ドする配列の追加によって分泌ベクターに転化しうる。
このことは、バシルス　且ヱＬｉ７７、のアミラーゼ遺
伝子内に有効なシグナルベブチドをコードする配列を導
入することによって、またはそれ自身がシグナルをコー
ドするＤＮＡをもつ異種遺伝子を用いることによって、
達成される。
有効なシグナルペプチドをコードする配列はｔ＜’ｙｔ
ｖｘ　　：ｘ７ｆ−ｙｘのアミラーゼ遺伝子またはその
フラグメントのすぐ下流にシグナルをコードすルＤＮＡ
の合成コピーまたはクローン化コピーのいずれかを挿入
することによって導入される。シグナルペプチドをコー
ドする配列としては、例えば、バ之火ス　、入１−ｈ髪
ノ、のズブチリシン遺伝子より誘導したシグナルペプチ
ドをコードする配列等が好適であるが、バシルス　入し
チーＩＬ内での蛋白質分泌を誘導する能力をもつシグナ
ルペプチドをコードする配列であればどのようなもので
も良い。
異種遺伝子はシグナルペプチドをコードする配列に直接
連結させることもあり、またバシルス　ユｌヱニΣχノ
、のアミラーゼ配列とは別の蛋白質をコードするＤＮＡ
を含む翻訳融合物を介してシグナルをコードするＤＮＡ
に連結させることもある。これらの方法の両方に適切な
構築物の１つは、バ之及２Ｌ久７’±ユ久のズブチリシ
ンのシグナルペプチドをコードする配列をバシルス　−
’：Ｊ７３（ｉンノ、のアミラーゼ遺伝子の調節エレメ
ントおよびアミン末端蛋白質をコードするフラグメント
のすぐ下流に挿入したものを含むであろう、バシルス　
ユ欠三木ｔｖ２人のアミラーゼ遺伝子はズブチリシンの
シグナルをコードする配列の下流に挿入することもでき
たし、その変法として、そうした後にパンー土ス　■立
ｉ目ワヒ鉦入のアミラーゼとＡＰＩＩＩの翻訳融合物を
挿入することもできた。
寄−」Ｅ ｐＣＲｄ６は、ブダペスト条約の条件に基づいて、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）　（ロックビル（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　ｌ　ｌｅ）
、マリ−ランド〕　（受入番号６７７３６）に寄託した
１本願の論受入である出願人、バイオテクニカ・インタ
−ナシ３ナル社（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、　）は、特許が発行され
た後その存続期間が終了する迄に寄託微生物が死滅した
場合には、その寄託物を新たなものに交換しなければな
らない義務、およびそのような特許の発行を＾ＴＣＣに
通知する義務があることを承認しており、また特許発行
時点から、寄託口から少なくとも３０年間、または寄託
物の最後の要求あるいは特許権の存続期間経過後から少
なくとも５年間のいずれか長い方の期間中、本寄託物は
一般に入手可能になル、ソノ時期迄、３７ＣＦＲの第１
．１４条及び３５ＬＩＳＣの第１１２条の条件の下に、
本寄託物は特許庁長官のみが入手でき、そして入手に関
する全ての制限は特許発行時に解除されるであろう。
血坐尖隻眉槙 他の実施態様は特許請求の範囲に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図はバシルス・ユヱ久立ｌ入（Ｌ匹■…並１のアミ
ラーゼ遺伝子の５′末端のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列である。 第２図は、バシルス・−１１３（ｉｚ〕、のアミラーゼ
遺伝子をその下流に位置するＢａ−旧サイトと共に含む
中間ベクターを構築するための工程図であるー 第３図はバシルス・ユヱ久立ｌ久のアミラーゼ遺伝子の
配列およびＡＰＩＩＩ遺伝子を含むベクターｐＣＲ４８
を構築するための工程図である。 第４図はバシルス・−２１３（九２）、のアミラーゼ調
節領域およびバシルス・±欠玉爽ルえ入　４Ｂ。 ＋ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ−のアミラーゼ遺伝子を含
むベクターｐＭ５３３０を構築するための概略図である
。 第５図はバシルス・久ｊ±１久　■組吐■且Ｕのベクタ
ー内におけるアミラーゼ遺伝子を含むバ之火入・ユヱＬ
ｌｌ久の［ｌＮＡ配列の部分制限地図である。 第６図へ、ＢおよびＣはバシルス・−１１３（ｉ！〕、
のアミラーゼ遺伝子の全ヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す一連の配列図である。 第７図はバシルス・ユ立三」Ωｙ３人およびバ之／ｌｚ
７．−ユヱｌｉｚ入のアミラーゼ遺伝子のアミノ酸配列
の比較を示す配列図である。 （外４名） 肴費 Ｃ（３ＣＡＡＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡ１３　ＣＣＧ　　Ｇ
Ｇｅ　　６口１１９Ｑ ＧＧＡ　　ＴＴＴ　　ＡＡＡ ＋　　　　　　　　　　　　　　　参　　　　　　　　
　　　　　　　会ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　＾
＾Ａ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＣＴＴ
　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＣＧＣＧ
＾＾＾ＣＧ　＾＾＾４）４１）　　　　　　　　　　　
　　　　　　畳　　　　　　　　　　　　　　　　４Ｉ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　畳　　　　　
　　　　　　　　　　　畳ＧＴτ　ＴＴＣＴＴＧ　　Ｇ
ＡＡ　　ＣＧＧ　　ＡＡＴ　　ＣＡＴ　　ＡＣＡ　　Ａ
ＴＣＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＧＡＡ
　　ＴＧＧ　　＾＾Ｔ　＾ＣＧ　　ＣＣ＾　ＧＣ＾　Ｇ
＾ＣＭｅｔ　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｈｉｓ　
　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　？′Ｉｅｔ　Ｇｉｎ　　Ｐｈｅ
　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ　　＾ｓｎ　　Ｔｈｒ
　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　＾ｓｐω０ＯｕｋｌＮ ＦＩＧ、２ ↓ 正乃如１１＼コ氾ｔｚ尚セ、金ブウユミｌ“を含を形賢
虹嬬８本の１７リーニンデ↓ ペー Ｕ工 ２、： ■ Ｕ〉 １ヨ Ｕす Ｅ−ＩＱ。 に− ０べ ｅ ０シ ＜Ｈ ｊ苗 Ｕり に３ ヨ３ ？ＩＩ＋ Ｕ＞ ０Ｑ＋ ＜　１ ＬＩぺ ０　い ■ ヨ３ トｌ む二 ｔ５ベ トｚ ０　へ べ１ ０ぺ １−４ψ 睦　１左 ｂａａ　　　　　　　ＣＪＯ。 討　　ご芝 ｈ＞　　　＜飄 妊　科　目　瑚　Ｉ ジ　踵　麺　Ｅ　　５ 目　ヨ　Ｈｉ　目 滅　し　Ｈａ　１　妊 Ｈ証　口　３　騎　目 ８　　仁　　￥　　８　２　　と ト　　　　　の　　　　　く　　　　　べ　　　　　Ｃ
（０発 ０発 ０発 ヴンス キャシー・フエイ・ル ドルフ ジエラルド・エイ・ル フオψジュニア− ジャニス　ベロ レインジ・ロード　１５０ アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２０７２．スト−
トン。 サンデイ・リッジ・ロード　３８ アメリカ合衆国マサチューセッツ州０１８０３．バーリ
ントン、バロン・パーク・レーン　６　アパートメント
　３０アメリ力合衆国マサチューセッツ州０２１７３．
レキシントン、ソロモン・ピアース・ロード　２０手 続 補 正 Ｎ（方力 １、事件の表示 平成１年特許願第１８５８５８号 ２、発明の名称 バシルス―コアグランスのアミラーゼ遺伝子に基づくバ
シルス発現ベクター ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　バイオテクニカ・インターナショナル・インコ
ーホレーテッド ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 電話２７０−６６４１〜６６４６ ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 弔成 １年１０月３１日 （発送日） タイプ印書により浄書した明細書

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、￥バシルス￥・￥コアグランス￥（￥Ｂａｃｉｌｌ
    ｕｓ　ｃｏａｇｕ￥ｌａｎｓ）のアミラーゼ遺伝子と天
    然において機能的に結合しており、かつ該アミラーゼ遺
    伝子の上流に位置する調節ＤＮＡを含むベクター。 ２、前記調節ＤＮＡの下流でかつその読み枠の中に、前
    記￥バシルス￥・￥コアグランス￥の遺伝子または少な
    くとも２個のアミノ酸の長さからなる前記￥バシルス￥
    ・￥コアグランス￥のアミラーゼフラグメントをコード
    する領域をさらに含む、請求項１記載のベクター。 ３、前記フラグメントの長さが少なくとも３０個のアミ
    ノ酸からなる、請求項２記載のベクター。 ４、前記調節領域の下流でかつその読み枠の中に、異種
    のＤＮＡ配列を挿入するためのサイトをさらに含む、請
    求項１または２記載のベクター。 ５、前記異種ＤＮＡ配列が前記サイトに挿入され、該異
    種ＤＮＡ配列の発現が前記調節領域の支配下にある、請
    求項４記載のベクター。 ６、前記サイトが￥バシルス￥・￥コアグランス￥のア
    ミラーゼ遺伝子内に位置し、故に前記ベクターは￥バシ
    ルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼフラグメントと
    前記異種ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド
    との融合物からなる融合ポリペプチドをコードする、請
    求項５記載のベクター。 ７、前記サイトが￥バシルス￥・￥コアグランス￥のア
    ミラーゼ遺伝子の３′末端に位置し、故に前記ベクター
    は￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼ遺伝子
    と前記異種ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチ
    ドとの融合物からなる融合ポリペプチドをコードする、
    請求項５記載のベクター。 ８、前記異種ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプ
    チドを前記ベクターで形質転換した宿主の￥バシルス￥
    の細胞から分泌させるために、グラム陽性細胞内で機能
    可能であり且つ該異種ＤＮＡの上流で且つその読み枠内
    に位置するシグナルペプチドをコードする配列をさらに
    含む、請求項５記載のベクター。 ９、前記シグナルペプチドをコードする配列が￥バシル
    ス￥属から誘導される、請求項８記載のベクター。 １０、前記シグナルペプチドをコードする配列が￥バシ
    ルス￥・￥スブチリス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥　￥ｓ
    ｕｂｔｉｌｉｓ￥）から誘導される、請求項９記載のベ
    クター。 １１、前記シグナルペプチドをコードする配列が￥バシ
    ルス￥のズブチリシン遺伝子に本来結合した配列である
    、請求項８記載のベクター。 １２、前記￥バシルス￥のズブチリシン遺伝子が￥バシ
    ルス￥・￥スブチリス￥より誘導される、請求項１１記
    載のベクター。 １３、前記シグナルペプチドをコードする配列が、本来
    以下の￥バシルス￥種： （ａ）￥バシルス￥・￥セレウス￥（￥Ｂ．ｃｅｒｅｕ
    ｓ￥）、または （ｂ）￥バシルス￥・￥リケニホルミス￥（￥Ｂ．ｌｉ
    ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥） のうちの１つの種からのペニシリナーゼ遺伝子に本来結
    合している配列である、請求項９記載のベクター。 １４、前記シグナルペプチドをコードする配列が、以下
    の￥バシルス￥種： （ａ）￥バシルス￥・￥スブチリス￥、または （ｂ）￥バシルス￥・￥リケミホルミス￥ のうちの１つの種からのα−アミラーゼ遺伝子に本来結
    合している配列である、請求項９記載のベクター。 １５、前記異種ＤＮＡが医療上有用な蛋白質をコードし
    ている、請求項５記載のベクター。 １６、前記異種ＤＮＡがホルモン、ワクチン、抗腫瘍蛋
    白質、抗ウィルス性蛋白質、抗体または凝血性蛋白質を
    コードする、請求項１５記載のベクター。 １７、前記異種ＤＮＡ配列が成長因子をコードする、請
    求項１５記載のベクター。 １８、前記異種ＤＮＡ配列が心房性ナトリウム利尿因子
    またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする
    、請求項１５記載のベクター。 １９、前記異種ＤＮＡが農業上有用な蛋白質をコードす
    る、請求項５記載のベクター。 ２０、前記異種ＤＮＡが工業上有用な蛋白質をコードす
    る、請求項５記載のベクター。 ２１、￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼ遺
    伝子と天然においては機能的に結合しており、かつ該ア
    ミラーゼ遺伝子の上流に位置する調節ＤＮＡからなる精
    製されたＤＮＡ配列であって、￥バシルス￥・￥コアグ
    ランス￥染色体全体より小さい、前記精製ＤＮＡ。 ２２、￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼを
    コードする精製されたＤＮＡ配列。 ２３、￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼを
    コードするＤＮＡ配列からなるベクター。 ２４、請求項１または５記載のベクターで形質転換した
    グラム陽性細胞。 ２５、前記細胞が￥バシルス￥の細胞である、請求項２
    ４記載の細胞。 ２６、前記細胞が￥バシルス￥・￥スブチリス￥の細胞
    である、請求項２５記載の細胞。 ２７、前記細胞が以下の￥バシルス￥種： （ａ）￥バシルス￥・￥リケニホルミス￥（￥Ｂ．ｌｉ
    ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥）、 （ｂ）￥バシルス￥・￥アミロリクエファシエンス￥（
    ￥Ｂ．Ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ￥）、 （ｃ）￥バシルス￥・￥ポリミキサ￥（￥Ｂ．ｐｏｌｙ
    ｍｙｘａ￥）、 （ｄ）￥バシルス￥・￥ステアロテルモフィルス￥（￥
    Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ￥）、 （ｅ）￥バシルス￥・￥テルモプロテオリチクス￥（￥
    Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ￥）、 （ｆ）￥バシルス￥・￥コアグランス￥（￥Ｂ．ｃｏａ
    ｇｕｌａｎｓ￥）、 （ｇ）￥バシルス￥・￥ツリンギエンシス￥（￥Ｂ．ｔ
    ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥）、 （ｈ）￥バシルス￥・￥メガテリウム￥（￥Ｂ．ｍｅｇ
    ａｔｅｒｉｕｍ￥）、 （ｉ）￥バシルス￥・￥セレウス￥（￥Ｂ．ｃｅｒｅｕ
    ｓ￥）、 （ｊ）￥バシルス￥・￥ナット￥（￥Ｂ．ｎａｔｔｏ￥
    ）、または （ｋ）￥バシルス￥・￥アシドカルダリウス￥（￥Ｂ．
    ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ￥）、 のうちの１つの種である、請求項２５記載の細胞。 ２８、￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼを
    グラム陽性細胞で生産させるための方法であって； ￥バシルス￥・￥コアグランス￥のアミラーゼをコード
    するＤＮＡ配列を含むベクターを作製すること、該細胞
    を該ベクターで形質転換すること、 該形質転換細胞を培地中で培養してアミラーゼを生産さ
    せること、および 該アミラーゼを該培養細胞または該培地から単離するこ
    と、 からなる上記の方法。 ２９、異種ポリペプチドをグラム陽性細胞内で生産させ
    るための方法であって； 請求項５記載のベクターを作製すること、 該細胞を該ベクターで形質転換すること、 該形質転換細胞を培地中で培養して該異種ポリペプチド
    を生産させること、および 該蛋白質を該培養細胞または該培地より単離すること、 からなる上記の方法。 ３０、前記異種ポリペプチドをコードするＤＮＡがグラ
    ム陽性細胞で機能する能力をもち且つ該異種ポリペプチ
    ドを該細胞から分泌させうるシグナルペプチドをコード
    する配列を含む、請求項２９記載の方法。 ３１、前記シグナルペプチドをコードする配列が￥バシ
    ルス￥より誘導される、請求項３０記載の方法。 ３２、前記シグナルペプチドをコードする配列が￥バシ
    ルス￥・￥スブチリス￥より誘導される、請求項３１記
    載の方法。 ３３、前記￥バシルス￥のシグナルペプチドをコードす
    る配列がズブチリシン遺伝子のシグナルペプチドをコー
    ドする、請求項３１記載の方法。 ３４、前記ズブチリシン遺伝子が￥バシルス￥・￥スブ
    チリス￥より誘導される、請求項３３記載の方法。 ３５、前記シグナルペプチドをコードする配列が、以下
    の￥バシルス￥種 （ａ）￥バシルス￥・￥セレウス￥、または （ｂ）￥バシルス￥・￥リケニホルミス￥、 のうちの１つの種からのペニシリナーゼ遺伝子に本来結
    合している配列である、請求項３０記載の方法。 ３６、前記シグナルペプチドをコードする配列が以下の
    ￥バシルス￥種 （ａ）￥バシルス￥・￥スブチリス￥、または （ｂ）￥バシルス￥・￥リケニホルミス￥、 のうちの１つの種からのα−アミラーゼ遺伝子と本来結
    合している配列である、請求項３０記載の方法。 ３７、前記異種ＤＮＡが医療上有用な蛋白質をコードす
    る、請求項２９記載の方法。 ３８、前記異種ＤＮＡがホルモン、ワクチン、抗腫瘍蛋
    白質、抗ウィルス性蛋白質、抗体または凝血性蛋白質を
    コードする、請求項３７記載の方法。 ３９、前記異種ＤＮＡが成長因子をコードする、請求項
    ３７記載の方法。 ４０、前記異種ＤＮＡが心房性ナトリウム利尿因子また
    は、その生物学的に活性なフラグメントをコードする、
    請求項３７記載の方法。 ４１、前記異種ＤＮＡが農業上有用な蛋白質をコードす
    る、請求項２９記載の方法。 ４２、前記異種ＤＮＡが工業上有用な蛋白質をコードす
    る、請求項２９記載の方法。
JP1185858A 1988-07-18 1989-07-18 バシルス・コアグランスのアミラーゼ遺伝子に基づくバシルス発現ベクター Pending JPH02150285A (ja)

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