FI81113C - Foerfarande foer framstaellning av polypeptider i streptomyceter genom att utnyttja en signalpeptid. - Google Patents

Description

1 81113

Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi streptomykeetoissa signaalipeptidiä hyväksi käyttäen

Keksintö koskee menetelmää geneettisesti koodat-5 tavissa olevista aminohapoista koostuvien polypeptidien valmistamiseksi signaalipeptidiä hyväksi käyttäen. Sig-naalipeptidi on rakenneosana propeptidissä, joka pilkkoutuu streptomykeettasoluissa, jotka sisältävät signaalipep-tidaasia, signaalipeptidiksi ja polypeptidiksi, jolloin 10 jälkimmäinen poistuu solusta ja erittyy viljelyalustaan. Lisäksi kuvataan DNA-jaksoja, jotka koodaavat tätä signaalipeptidiä, geenirakenteita, jotka sisältävät tämän DNA-jakson luentakehyksessä rakennegeenin kanssa, plas-mideja, jotka sisältävät tällaisen geenirakenteen, sekä 15 tällaisia plasmideja sisältäviä isäntäorganismeja.

DE-patenttihakemuksessa P 33 31 860.3 on jo ehdotettu menetelmää tendamistaatin valmistamiseksi fermen-toimalla Streptomyces tendaeta, jolle menetelmälle on tunnusmerkillistä se, että käytetään tendamistaattia tuot-20 tavia S. tendae-kantoja, jotka on käsitelty pienemmillä kuin kuolettavilla annoksilla akriflaviinia. Täten saaduista kannoista eristettiin tendamistaattia koodaavan geenin sisältävä DNA-fragmentti, nimittäin 2,3 kb:n pituinen Pst I -fragmentti. Liittämällä tämä fragmentti Pst 25 I:llä pilkottuun pBR 322:een voitiin lisätä tätä DNA:ta E.

colissa ja eristää se takaisin.

Nyt on havaittu, että tässä 2,3 kb:n fragmentissa on välittömästi ennen tendamistaattirakennegeeniä jakso, joka koodaa signaalipeptidiä (prepeptidiä), jolla on kaava 30 I,

Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala (I) jossa X on hydrofobinen alue, joka käsittää 17-20 amino-35 happoa. Lisäksi on havaittu, että tällä signaalipeptidillä 2 81113 on kyky saada aikaan myös muiden peptidien erittyminen isäntäsoluista, jotka sisältävät vastaavaa signaalipep-tidaasia. Kyseisiä propeptidejä voidaan esittää kaavalla II, 5 Sig-R (II) jossa Sig on kaavan I mukainen aminohappojakso ja R on vety tai aminopäähän liittynyt geneettisesti koodattavissa oleva peptidiryhmä, jonka aminopäässä on edullisesti hapan 10 aminohappo, erityisesti asparagiinihappoa. Peptidiryhmänä voi olla esimerkiksi tendamistaattiryhmä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle polypeptidin valmistamiseksi on tunnusomaista, että suvun Streptomyces isäntäsolussa saatetaan ilmentymään geenirakenne, joka 15 sisältää luentakehyksessä toivottua polypeptidiä koodaavan rakennegeenin kanssa prepeptidin DNA-jakson, joka on saatavissa tendamistaattia tuottavista Streptomyces tendae -kannoista, jotka edullisesti on käsitelty pienemmillä kuin kuolettavilla annoksilla akriflaviinia, eristämällä 20 kokonais-DNA, pilkkomalla Pst I:llä, tekemällä Southern-hybridaatio DNA-jakson A kanssa, 5' -(32P- )CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3’ (A) 25 eristämällä 2,3 kb:n pituinen Pst I -fragmentti, pilkkomalla BamHI:llä, tekemällä Southern-hybridaatio jakson A kanssa, eristämällä 0,94 kb:n Pstl-BamHI -osafragmentti, pilkkomalla Sau 3a:11a, tekemällä Southern-hybridaatio jakson A kanssa, eristämällä 0,525 kb:n BamHI-Sau 3a -osa-30 fragmentti ja sekvensoimalla DNA, ja joka a) sijaitsee välittömästi ennen rakennegeeniä, b) koodaa aminopäässä aminohappoj aksoa Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) koodaa karboksyylipäässä aminohappojaksoa Ala- 35 Ser-Ala ja i 3 81113 d) koodaa keskellä olevaa hydrofobista aluetta, joka käsittää 10-25 aminohappoa.

Vastaavasta DNA-jaksosta käytetään tästedes nimitystä jakso B tai signaalipeptidi.

5 Standardimarkkereihin vertaamalla saatujen kb-ar- vojen tarkkuus on tavanomainen.

Jakson A sijasta voidaan Southern-hybridaatioon valita haluttu tendamistaattigeenille tai vastasäikeelle komplementaarinen jakso.

10 DNA-jakson B karakterisoinnin eri vaiheissa viedään käytännössä kulloinkin DNA soveltuvaan vektoriin, transformoidaan isäntäsolu tällä vektorilla, lisätään sitä siellä, muodostetaan transformantteja tekemällä pesäkehyb-ridisaatio jakson A kanssa ja eristetään DNA uudelleen. 15 Nämä vaiheet ovat sinänsä tunnettuja.

DNA-jaksolla C, jonka koodaava säie esitetään liitteessä, on S. tendaesta saatavan tendamistaattigeenin nukleotidijärjestys.

Mainitut geenirakenteet sisältävät siten DNA-jakson 20 B luentakehyksessä rakennegeenin, joka koodaa esimerkiksi tendamistaattia, nimittäin edullisesti DNA-jakson C kanssa.

Käytetyt plasmidit, käsittävät DNA-jakson B luentakehyksessä rakennegeenin, joka koodaa esimerkiksi ten-25 damistaattia, erityisesti DNA-jakson C kanssa. Nämä plasmidit voivat sisältää E. colissa toimivan replikonin ja niillä on siten kyky lisätä DNA:ta E. colissa ja mahdollisesti myös saada aikaan sen ilmentyminen.

Edulliset plasmidit sisältävät lisäksi streptomy-30 keetoissa toimivan replikonin. Kun tällaisella plasmidilla transformoidaan streptomykeetta, saadaan aikaan rakenne-geenin ilmentyminen sen määräämänä peptidinä, joka on kaavan 11 mukaisen propeptidin muodossa, joka sitten pilkkoutuu signaalipeptidaasin vaikutuksesta, jolloin viljely-35 alustaan erittyy haluttua peptidiä.

4 81113

Edullisia ovat myös niin kutsutut "Shuttle"-plas-midit, jotka sisältävät sekä E. colissa että myös strep-tomykeetoissa toimivan replikonin. Näitä "Shuttle"-plas-mideja voidaan lisätä E. colissa ja niillä voidaan uudel-5 leeneristämisen jälkeen transformoida streptomykeetta, jossa sitten tapahtuu toivotun polypeptidin tuotanto.

Isäntäorganismit, jotka transformoidaan mainituilla plasmideilla ovat Streptomyces-suvun, ennen kaikkea lajin S. tendae tai erityisesti S. lividans isäntäorganismeja.

10 Gram-negatiivisille bakteereille soveltuvia vek toreita on olemassa suuri joukko, kun taas gram-positiivi-sille bakteereille soveltuvia vektoreita on kuvattu vain harvoja. Lajin S. tendae bakteereille sopivia vektoreita ei ole tähän mennessä tunnettu. Keksintö tekee siten mah- 15 dolliseksi S. tendaen käytön isäntäorganismina.

Keksinnön erityisenä etuna on se, että transformoidut Streptomyces-kannat, erityisesti S. lividans -kannat, tuottavat itiöitä parhaalla mahdollisella tavalla, so. sillä, että nämä kannat sisältävät yhdistelmäplasmi- 20 dia, ei ole haittavaikutuksia niiden generatiivisessa vaiheessa. Transformoidut organismit soveltuvat siten myös kantojen edelleen parantamiseen, esimerkiksi metabolisten mutanttien valmistukseen ja valintaan, jossa valmistuksessa käytetään itiöitä.

25 Toisin kuin tunnetut S. tendae -kannat, eivät transformoidut kannat, erityisesti S. lividans, muodosta melaniinia. Tällöin jää pois sen erottaminen, mikä helpottaa oleellisesti halutun peptidin, esimerkiksi tendamis-taatin, eristystä ja estää saantotappioita.

30 Keksinnön lisäetuna on se, että vieraat geenit il mentyvät myös S. lividansissa ja erittyy vastaavia poly-peptidejä, mikä tarjoaa monipuolisia mahdollisuuksia sekä kantojen parantamiseen että täten valmistetun polypeptidin muuntamiseen.

35 Keksinnön mukaisesti voidaan transformoida toki I; 5 81113 muitakin Streptomyces-lajeja, esimerkiksi S. ghanaensis tai aureofaciens. Kun plasmidia sisältämättömät kannat, joilla on kyky syntetisoida spesifistä signaalipeptidaa-sia, transformoidaan kuvatuilla hybridiplasmideilla, saa-5 daan stabiileja transformantteja, joissa tapahtuu koodatun peptidin ilmentyminen ja erittyminen.

Keksinnön erityisen edullisia suoritusmuotoja valaistaan lähemmin seuraavissa esimerkeissä. Prosenttiluvut ovat tässä yhteydessä painoprosentteja, ellei toisin mai-10 nita. Hybridiplasmideja esittävissä kuvissa pilkkoutumis-kohdat esitetään mittakaavan mukaisesti.

Esimerkeissä on käytetty seuraavia kirjallisuudesta tunnettuja vektoreita: Yksisäiefaagit M 13 mp 8 ja M 13 mp 9 [Messing et ai., Gene 19 (1982) 269]; pUC 8 [Vierra et 15 ai., Gene 19 (1982) 259]; pAC 177 ja 184 [Chang et ai., J. Bacteriology 134 (1978) 114]; pIJ 102 ja 350 [Kieser et ai., Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223].

S. tendae -kannan ylläpitoa kuvataan US-patentti-julkaisussa 4 226 764. Tendamistaattigeenin eristäminen 20 voidaan tehdä periaatteessa jokaisesta tendamistaattia tuottavasta kannasta. Erityisen edullinen on kuitenkin DE-patenttihakemuksen P 33 31 860.3, jonka esimerkissä 3 kuvataan DNA:n eristämistä, mukainen menettely. Tämä eristetty kokonais-DNA on lähtöaineena seuraavassa esimerkissä 25 1.

Esimerkki 1 5 pg DNA:ta pilkotaan täydellisesti restriktioent-syymillä Pst I ja 0,8-%:isella agaroosigeelillä tehdyn erotuksen jälkeen siirretään nitroselluloosasuodattimelle 30 (Southern-siirto). Sitoutuneen, denaturoituneen DNA:n si sältävää suodatinta esihybridisoidaan 6 h 5 ml:ssa esihyb-ridisaatioalustaa (0,6 mol/1 NaCl, 0,06 mol/1 Na-EDTA, 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia, 100 pg/ml ultraäänikä-siteltyä vasikan kateenkorva-DNA:ta ja 4-kertaisesti vä-35 kevöityä Denhardt-liuosta). Sen jälkeen käsitellään uudel- 81113 ο leen 5 ml:11a esihybridaatioalustaa, johon on kuitenkin lisätty 500 000 cpm/ml radionuklidileimattua DNA: ta. Tämä radionuklidileimattu koetin valmistetaan seuraavasti.

DNA-jakso A syntetisoidaan kemiallisesti fosfiitti-5 menetelmällä. Se sisältää 20 nukleotidia (molekyylipaino noin 13 000) ja on komplementaarinen oletetulle tendamis-taattia koodaavalle DNA-jaksolle, joka on johdettu ten-damistaatin aminohappo jaksosta tendamistaatin aminohaposta 37 lähtien käyttämällä E. colin suosimaa triplettiä. Tämän 10 DNA-jakson 5'-pää leimataan radioaktiivisesti ^"-32P-ATP:n ja nukleotidikinaasin avulla.

Tämän radioaktiivisen osoittimen hybridisoimiseksi komplementaariseen, kokonais-DNA:ssa olevaan DNA-jaksoon seoksen annetaan seistä 24 h 37°C:ssa. Sen jälkeen pois-15 tetaan sitoutumaton radioaktiivinen DNA, suodatinta pestään 37eC:ssa viidesti 30 min käyttäen kullakin kerralla 200 ml hybridisaatioalustaa, ja tehdään suodattimena au-toradiografia. 24 h: n säteilytyksen jälkeen osoittavat hybridisaatiosignaalit, että geeni sijaitsee 2,3 kb:n Pst 20 I -fragmentissa. Tämä fragmentti otetaan talteen elektro-eluoimalla tätä fragmenttikokoa vastaava vyöhyke prepara-tiiviselta agaroosigeeliltä, jolla Pstl-pilkottu kokonais-DNA on erotettu. Eluoitu DNA kloonataan plasmidin pUC 8 PstI-pilkkoutumiskohtaan.

25 Tällä hybridiplasmidilla transformoidaan E. coli JM

103, ja plasmidin annetaan lisääntyä. Ne kloonit, jotka sisältävät halutun tendamistaattigeenin sisältämän jakson, osoitetaan pesäkehybridisaatiolla käyttäen radioaktiivista DNA-koetinta A. Siten saadut hybridiplasmidit pKAI 1 a ja 30 Ib esitetään kuvissa 1 a ja 1 b.

Tekemällä edelleen Southern-hybridaatio eristetyn 2,3 kb:n Pst I -fragmentin ja sen osafragmenttien kanssa voidaan geenin sijaintikohta määrittää tarkasti (kuvat 2a-2c).

35 Esimerkki 2

Plasmidin pIJ 102 ainoaan Pst I -pilkkoutumiskoh- 7 81113 taan kloonataan 2,3 kb:n Pst I -fragmentti. Täten saadut hybridiplasmidit pAX 1 a ja 1 b, jotka eroavat toisistaan liitetyn jakson orientoitumisen suhteen, antavat S. livi-dans -kantojen transformoinnin jälkeen näille kyvyn tuot-5 taa tendamistaattia. Kuva 3 esittää plasmidia pAX 1 a.

Esimerkki 3

Kaupallisesti saatava kanta S. lividans TK 24 (John Innes Institute, Norwich, England) muutetaan tunnetulla tavalla protoplastimuotoon, ja 1 pg:aan hybridiplasmidia 10 pAX 1 a lisätään 10® protoplastia lisäten 20 % polyetylee-niglykoli 6000:a. Transformoituja protoplasteja kasvatetaan regenerointialustalla R2YE [Thompson et ai.. Nature 286 (1980) 525] 30°C:ssa 5 vrk.

Se, että on muodostunut solun ulkopuolista amylaa-15 si-inaktivaattoria, voidaan osoittaa maljakokeella:

Regeneroidut pesäkkeet peitetään 5 ml:11a vesi-liuosta, joka sisältää 0,4-1,0 mg/ml pankreatiinia, ja inkuboidaan 1 h 37°C:ssa. Sitten liuos poistetaan ja korvataan 5 ml:11a 2-%:ista tärkkelysagaria. Inkuboidaan 2 h 20 37°C:ssa ja maljat peitetään 5 ml:lla jodi-kaliumjodidi-liuosta, joka toimii kehitteenä. Sinisen kehän ympäröimät pesäkkeet osoittavat, että kloonit syntetisoivat ja erittävät tendamistaattia.

Kontrollia varten voidaan myös eristää tendamis-25 taattia tuottavista, hyvin itiöitä muodostavista kannoista plasmidi-DNA:ta ja tehdä sille kartoitus. Kaikissa tendamistaattia tuottavissa kannoissa esiintyy käytetty plas-midi-DNA.

Esimerkki 4 30 Toimitaan muuten esimerkin 2 mukaisesti, mutta käy tetään plasmidia pIJ 350, joka sisältää tiostreptoniresis-tenssigeenin streptomykeetoissa toimivana valintamarkke-rina. Täten saadaan hybridiplasmidit pAX 350 a ja b (jotka eroavat toisistaan liitetyn jakson orientoitumisen suh-35 teen). Kuva 4 esittää plasmidia pAX 350 a.

8 81113

Esimerkin 3 mukaisen transformoituiin jälkeen valitaan minimialustalla [Hopwood, Bacteriological Reviews 31 (1967) 373-403] tiostreptonin (50 pg/ml) läsnä ollessa resistentit kloonit, ja ne testataan tendamistaattituotan-5 non suhteen joko suoraan minimialustalla tai siirrostet-tuina ei-selektiiviselle R2YE-agarille.

Esimerkki 5

Hybridiplasmideilla, jotka sisältävät 2,3 kb:n Pst I -fragmentin ja streptomykeettareplikonin lisäksi myös E. 10 coli -replikonin, on "Shuttle"-vektoreina joukko etuja: E. coli -replikonin ja E. colissa toimivan resistenssi-markkerin ansiosta niitä on helppo lisätä näissä organismeissa. Niiden stabiilisuus on hyvä eristyksen ja strep-tomykeettojen, erityisesti S. lividansin, transformoinnin 15 jälkeen. Streptomykeetoissa toimivan valintamarkkerina ja streptomykeettareplikoninsa ansiosta on niitä helppo lisätä myös tässä organismissa ja saada aikaan ilmentyminen tendamistaattina ja tämän erittyminen.

Plasmidi pAC 184 pilkotaan täydellisesti restrik-20 tioentsyymillä Sal I, ja entsyymi poistetaan fenoli-kloro-formiuutolla. Yksisäikeiset 5'-päät täytetään ATP:n, CTP:n, GTP:n ja TTP:n läsnä ollessa DNA-polymeraasientsyy-min (Klenow-fragmentin) avulla. Tylppiin päihin (blunt ends) liitetään 16°C:ssa tehtävällä ligaasireaktiolla Pst 25 I -liittäjä, jonka rakenne on 5'TCG AGC TGC AGC TCG A 3' 3'AGC TCG ACG TCG AGC T 5’ (2 pg liittäjää 0,4 pg:aa DNA:ta kohden). DNA uutetaan fenolikloroformiseoksella, ja laskeuttamisen jälkeen pil-30 kotaan entsyymillä Pst I ligaatiokykyisten Pst I -päiden aikaansaamiseksi. Sen jälkeen DNA defosforyloidaan, uutetaan uudelleen fenoli-kloroformiseoksella ja sille tehdään ligaatio osittain Pst I -pilkotun plasmidin pAX 1 a kanssa. Ligaatioseoksella transformoidaan E. coli (HB 101 tai 35 MC 1061). Kloramfenikoliresistentit kloonit huuhdotaan i 9 81113 pois maljoilta ja eristetään DNA. S. lividans TK 24 transformoidaan 1-2 pg:lla DNA:ta ja testataan tendamistaat-tituotannon suhteen.

Tendamistaattitestissä positiiviset kloonit eriste-5 tään, eristetään plasmidi-DNA emäksisellä pikahajoituksel-la ja transformoidaan sillä uudelleen E. coli HB 101 tai MC 1061. Amplifikaation jälkeen uudelleeneristetyt plas-midit eivät eroa S. lividans -kannoista eristetyistä plas-mideista. Tendamistaattigeenin sisältävän liitetyn jakson 10 orientoitumisen mukaan käytetään yhdistelmäplasmideista nimityksiä pSA 2 a tai b (kuvat 5a ja b).

Esimerkki 6

Kun toimitaan muuten esimerkin 5 mukaisesti, mutta lähdetään plasmidista pAX 350, tehdään valinta E. colissa 15 kloramfenikoliresistenssin perusteella ja S. lividansissa tiostreptoniresistenssin ja tendamistaattituotannon perusteella, saadaan plasmidit pSA 351 a ja b (kuvat 6a ja b).

Esimerkki 7

Kun toimitaan muuten esimerkin 5 mukaisesti, mutta 20 lähdetään plasmidin pAC 184 sijasta plasmidista pAC 177, saadaan plasmidit pSA 3 a ja b (kuvat 7a ja b).

Tätä varten pilkotaan plasmidi pAX 1 osittain Pst I:llä ja inaktivoidaan entsyymi pitämällä 15 min 68eC:ssa. DNA:lie tehdään ligaatio Pst I:llä pilkotun, defosforyloi-25 dun ja deproteinoidun plasmidin pAC 177 kanssa. E. coli HB 101:n tai MC 1061:n transformoinnin jälkeen huuhdotaan kanamysiiniresistentit kloonit pois maljoilta, eristetään plasmidi-DNA ja transformoidaan S. lividans TK 24 1-2 pg:lla tätä DNA:ta. Valitaan tendamistaattia tuottavat 30 kloonit ja karakterisoidaan plasmidit.

Esimerkki 8

Kun toimitaan muuten esimerkin 7 mukaisesti, mutta käytetään plasmidin pAX 1 sijasta plasmidia pAX 350 a ja tehdään S. lividansissa tapahtuva valinta tlostreptoni-35 resistenssin perusteella, saadaan plasmidit pSA 352 a ja b (kuvat 8a ja b).

10 81113

Esimerkki 9

Kuten kuvasta 2 ilmenee, on tendamistaattia ja sig-naalijaksoa koodaava geeni noin 0,3 kb:n pituinen. Edellä esitetyissä esimerkeissä käytettyä 2,3 kb:n fragmenttia 5 voidaan käyttää myös lyhennetyssä muodossa rakennettaessa hybridiplasmideja, jotka saavat aikaan tendamistaattituo-tannon:

Plasmidi pKAI 1 pilkotaan Sai I:llä ja tehdään sille uudelleenligaatio. Täten saadaan noin 750 emäsparilla 10 lyhentynyt plasmidi pKAI 2. Tämä kloonataan, eristetään ja pilkotaan Pst I:llä. DNA defosforyloidaan vasikansuolesta saadulla emäksisellä fosfataasilla ja deproteinoidaan fe-nolikloroformiseoksella.

Plasmidi pIJ 102 pilkotaan täydellisesti Pst I:llä 15 ja fragmenteille tehdään entsyymin lämpöinaktivoinnin jälkeen ligaatio pKAI 2:n Pst I -pilkkoutumiskohtiin. Ligaa-tioseoksella transformoidaan E. coli HB 101 tai MC 1061. Ampisilliiniresistenteistä klooneista saatava plasmidi-DNA eristetään emäksinen nopea hajotus -menetelmällä ja S. li-20 vidans TK 24 transformoidaan 1-2 pg:lla tätä DNA:ta. Tehdään valinta tendamistaattituotannon perusteella ja eristetään tämän kloorin plasmidi-DNA emäksisellä nopealla hajotuksella. Transformoidaan uudelleen E. coli 101 tai MC 1061, ja plasmidi-DNA:n transformoiduista E. coli -kan-25 noista eristämisen jälkeen karakterisoidaan plasmidi pSA 1 restriktioanalyysillä (kuva 9). Plasmidi ei millään tavalla eroa S. lividans -kannoista eristetystä plasmidista, talteenotto E. colista on kuitenkin tuottoisampaa ja nopeampaa .

30 Esimerkki 10

Kun toimitaan muuten esimerkin 9 mukaisesti, mutta käytetään plasmidin pIJ 102 sijasta plasmidia pIJ 350, jolloin S. lividansille voidaan tehdä lisäksi valinta tio-streptoniresistenssin perusteella, saadaan plasmidit pSA 35 350 a ja b. Kuva 10 esittää plasmidia pSA 350 a. Tämä i 11 81113 plasmidi johtaa ravistusviljelyssä suurempiin tendamis-taattisaantoihin kuin plasmidi pSA 350 b, jossa tendamis-taattigeenin sisältävä liitetty jakso on päinvastaiseen suuntaan orientoituneena. Sitä vastoin liitetyn jakson 5 lyhentämisellä 1,5 kb:een ei ole merkittävää vaikutusta tuotteenmuodostukseen.

Esimerkki 11

Tendamistaattigeenin rakenteen ja nukleotidi järjestyksen määrittämiseksi kloonattiin 0,94 kb:n Pst I -Bam HI 10 -osafragmentti (kuvat 2a ja b) ja 295 bp:n Sau 3a -Bam HI -osafragmentti (kuva 2c) yksisäiefaageihin M 13 mp 8 ja M 13 mp 9. Esijaksona dideoksisekventointireaktiossa toimi 20 nukleotidiä käsittävä DNA-jakso A sekä kaupallisesti saatava 15 bp:n aloke (Bethesda Research Laboratories 15 GmbH, Neu-Isenburg). Tulokseksi saatiin DNA-jakso C. Esimerkki 12 DNAtssa on ennen tendamistaattirakennegeneiä avoin luentakehys proteiinin, joka edeltää saumattomasti tendamistaatin aminopäätä, aloituskodoniin ATG (Met) asti. 20 Tämä signaalipeptidi vastaa DNA-jaksoa B.

Liite: DNA-jakso C (koodaava säie) 25 30 35 12 81113 5 10 5' -GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG NI^-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro Ser Cys Val 15 20 b ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp 25 30 35

AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC

Asn Gly Cys Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Val Val 10 40 45

TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC

Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Val 50 55 60

GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC

^ Ala Pro Gly Gin lie Thr Thr Val Gly Asp Gly Tyr 65 70

ATC GGC TCG CAC GGC CAC GCG CGC TAC CTG GCT CGC

Tie Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Arg 7Π TGC CTT TAG-3'

Cys Leu Stp DE-patenttihakemuksen P 33 31 860.3 esimerkit 1 ja 3.

25 Esimerkki 1

Mutaatiomenetelmä: noin 0,25 cm2 kannan DSM 2727 itiöitä sisältävää myseeliä, jota kasvatetan kaurahiutale-agarilla (EP-hakemusjulkaisu 49 847), siirrostetaan 100 miina erlenmeyerpulloihin, jotka sisältävät 25 ml seuraa-30 vaa kasvatusalustaa:

Soijajauhoa 2 %

Glukoosia 3 %

Maissitärkkelystä 0,2 %

Ureaa 0,1% 35 Ammoniumsitraattia 0,1 % i 13 81113

Ma11asuutetta 0,5 % ΚΗ2Ρ04 0,2 %

Alustaa pidetään 30 min autoklaavissa 121°C:ssa ja 5 1 barin ylipaineessa, pH arvo on 7,0. Siirrostepulloja inkuboidaan 2 vrk 30°C:ssa ravistimessa. Sitten siirroste-taan 2 ml pestyä esiviljelmää 20 ml:aan pääviljelyalus-taa, joka on 100 ml:n erlenmeyerpulloissa (EP-hakemus-julkaisu 49 847): 10 Liukoista tärkkelystä 2-4 %

Soijajauhoa 0,4 %

Maissiuutetta 0,4 %

Rasvatonta maitojauhetta 0,7 %

Glukoosia 1,0 % 15 (NH4)2HP04 1,2 %

Alustan pH on autoklavioinnin jälkeen 7,6.

Tähän alustaan lisätään 10-25 pg/ml akriflaviinia mutageeniseksi aineeksi. Viljelmää ravistellaan 5 vrk 28°C:ssa kierrosnopeudella 220 rpm. Sen jälkeen viljelmä-20 liuos sentrifugoidaan (1300 g, 5 min) ja solupelletti pestään pääviljelyalustalla. Pestyt solut fragmentoidaan la-sihomogenaattorissa ja siirrostetaan agarmaljoille, joissa on seuraavaa alustaa:

Ruokosokeria 0,3 % 25 Dekstriiniä 1,5 %

NaCl 0,05 % K2HP04 0,05 %

FeS02 x 7 H20 0,001 %

Tryptoni-soijalientä 0,5 % 30 (valm. Oxoid)

Lihauutetta 0,1 % (valm. Difco)

Hiivauutetta 0,2 % (valm. Difco) 35 Agaria (Merck) 1,5 % 14 81113

Liuoksen pH on 7,1 (autoklavointiolosuhteet kuten edellä).

Maljoja inkuboidaan 5 vrk 28°C:ssa ja yksittäispe-säkkeet siirrostetaan vinopintaputkiin, joissa on kaura-5 hiutaleagaria. Näitä inkuboidaan kuvatulla tavalla, kunnes myseelissä on itiöitä. Itiöitä muodostanutta myseeliä lisätään edellä kuvatulla tavalla esi- ja pääviljelmässä, ja viljelmän suodoksesta mitataan 5 vrk:n pääviljelyn jälkeen tendamistaattipitoisuus (vrt. EP-hakemusjulkaisu 49 847). 10 Tällä tavalla voidaan valita kannat 1-9353, 1-9362, 1-9417 ja 1-9418, jotka kasvuaikanaan edellä kuvatuissa olosuhteissa tuottavat noin 90 000-100 000 ky tendamistaattia/1 viljelmäliuosta, mikä vastaa 1,5-1,8 g inaktivaattoria/1.

15 Esimerkki 3

Deoksiribonukleiinihapon eristäminen S. tendaesta ja sen molekyylibiologinen karakterisointi

Solujen kasvatus tapahtuu esimerkin 1 mukaisesti. Kun soluja on kasvatettu 3 vrk pääviljelyalustassa, erote-20 taan yhden erlenmeyerin solut sentrifugoimalla 5 min kiihtyvyydellä 3000 g 4eC:ssa ja pestään kahdesti 50 ml:11a liuosta joka sisältää 50 mmol/1 Tris/HCl-puskuria, 100 mmol/1 NaCl ja 25 mmol/1 EDTAra.

Tyypillisessä preparoinnissa pikapakastetaan 3 g 25 kiinteäksi sentrifugoituja soluja nestetypessä -198eC:ssa ja homogenoidaan sitten leikkaushomogenaattorissa (Warring Commercial Blender) typen alla hienojakoiseksi jauheeksi. Tämä jauhe sekoitetaan 10 ml:aan mainittua puskuria, liuotetaan jäähauteessa ja inkuboidaan 20 min 28°C:ssa 0,8 30 ml:n kanssa lysotsyymiliuosta (30 mg/ml) kevyesti ravistellen. Suspensioon lisätään sitten 0,8 ml proteinaasi K-liuosta (15 mg/ml) ja 0,8 ml 20-%:ista N-lauroyylisar-kosiinin natriumsuolan liuosta. Sekoitetaan varovasti ja seosta inkuboidaan sitten 30 min jäähauteessa ja vielä 15 35 min huoneen lämpötilassa. Seokseen lisätään ja liuotetaan is 81113 22 g kiinteää keesiumkloridia, tilavuus säädetään edellä mainitulla puskurilla 22 ml:ksi ja sentrifugoidaan suspensiota kiihtyvyydellä 12 000 g 4°C:ssa 25 min. Kirkkaaseen sentrifugaattiin lisätään etidiumbromidia ja taitekerroin 5 säädetään CsClrlla refraktometrisesti arvoon n = 1,3920. Preparatiivisen ultrasentrifugoinnin jälkeen (120 000 g, 36 h, 15°C) erotetaan kromosomi-DNA:ta sisältävät vyöhykkeet sentrifugiputkista ja sentrifugoidaan uudelleen samoissa olosuhteissa. Eristetyistä vyöhykkeistä poistetaan 10 etidiumbromidi ravistelemalla n-butanolin kanssa ja CsCl poistetaan täydellisesti dialysoimalla. Siten saatu DNA on pilkottavissa esimerkiksi entsyymeillä Pst I, Bam HI; Sau 3a, Cla I, Bgl II ja XHO I, mutta ei pilkkoudu endonuk-leaaseilla Eco Rl ja Hind III.

15 Esimerkiksi mutanteista 1-9353 ja 1-9362 talteen otettu DNA karakterisoidaan ATCC 31210:n tai DSM 2727:n DNA:ta vastaan amplifioidun geneettisen rakenneosan avulla, jonka yksittäisfragmentit erottuvat selvästi havaittavalla tavalla fluoresenssiväriaineella etidiumbromidilla 20 tehdyn värjäyksen jälkeen ei-selektiivisesti lisätyistä fragmenteista koostuvaa taustaa vasten. Amplifioidun rakenneosan koko sekä restriktioendonukleaasipilkkomisen jälkeen havaitut karakteristiset yksittäisfragmentit annetaan seuraavassa: 25 30 35 ie 81113

Fragmentti Fragmentin pitus (kbp)

n:o__Pst I_Xho I_Bam H I

1 9,0 13,5 7,2 2 7,0 11,5 6,1 5 3 6,8 9,3 5,3 4 4,6 2,8 2,9 5 3,4 0,7 2,6 6 3,1 2,5 7 2,3 2,15 10 8 1,1 2,1 9 1,5 10 1,2 11 1,1 12 1,0 15 13 0,8 14 0,5 15 __0,48 kaikkiaan 37,3 37,8 37,43

Claims (5)

17 81113

1. Menetelmä geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista koostuvien polypeptidien valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että suvun Streptomyces isäntäso-lussa saatetaan ilmentymään geenirakenne, joka sisältää luentakehyksessä toivottua polypeptidiä koodaavan rakenne-geenin kanssa prepeptidin DNA-jakson, joka on saatavissa tendamistaattia tuottavista Streptomyces tendae -kannois-10 ta, jotka edullisesti on käsitelty pienemmillä kuin kuolettavilla annoksilla akriflaviinia, eristämällä kokonais-DNA, pilkkomalla Pst I:llä, tekemällä Southern-hybridaa-tio DNA-jakson A kanssa, 32 15 5'-( P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' (A) eristämällä 2,3 kb:n pituinen Pst I -fragmentti, pilkkomalla BamHI:llä, tekemällä Southern-hybridaatio jakson A kanssa, eristämällä 0,94 kb:n Pstl-BamHI -osafragmentti, 20 pilkkomalla Sau 3a:11a, tekemällä Southern-hybridaatio jakson A kanssa, eristämällä 0,525 kb:n BamHI-Sau 3a -osa-fragmentti ja sekvensoimalla DNA, ja joka a) sijaitsee välittömästi ennen rakennegeeniä, b) koodaa aminopäässä aminohappojaksoa Met-Arg-Val-25 Arg-Ala-Leu-Arg, c) koodaa karboksyylipäässä aminohappojaksoa Ala-Ser-Ala ja d) koodaa keskellä olevaa hydrofobista aluetta, joka käsittää 10-25 aminohappoa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prepeptidin DNA koodaa keskellä olevaa hydrofobista aluetta, joka käsittää 17 - 20 aminohappoa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että prepeptidiä vastaava DNA-jakso eristetään S. tendaesta. 18 81113

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on lajia S. tendae tai S. lividans.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 5 netelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu sisältää signaalipeptidaasia, joka pilkkoo prepeptidin ja vapauttaa halutun polypeptidin kasvualustaan.

6. Yhden tai useamman edellä olevista patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että geenirakenne viedään isäntäsoluun plasmidin mukana, joka sisältää streptomykeetoissa toimivan replikonin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidi sisältää streptomykeetoissa toimivan replikonin lisäksi E. colissa toimivan 15 replikonin.

8. Yhden tai useamman edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rakennegeeni koodaa tendamistaattia.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että rakennegeenissä on DNA-jakso C 5 10 5'-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG (c) NH2-Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Ala Frc Ser Cys Vai 15 2 0

25 ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp 25 30 35 AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC Asn Gly Cys Ala Glu Thr Vai Thr Vai Lys Vai Vai 30 **o »*s TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Vai so 55 eo GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC

35 Ala Pro Gly Gin Ile Tnr Thr Vai Gly Asp Gly Tyr i 19 81113 65 70 ATC GGC TOG CAC GGC CAC GCG CGC TAG CTG GCT CGC lie Gly Ser His Gly His Ala Arc Tyr Leu Ala Arg TGC CTT TAG-3'

5 Cys Leu 3tp 20 81 1 1 3