HU197351B - Process for preparing polypeptide from genetically codeable aminoacids - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás genetikailag kódolható aminosavakból álló polipeptidek előállításának megkönnyítésére egy olyan szignálpeptid segítségével, amely egy propeptid alkotórésze. A propeptidet szignálpeptidázt tartalmazó Streptomyces-sejtben szignálpeptidre és polipeptidre bontjuk, a polipeptidet a sejtből eltávolítjuk és tenyészközegben kiválasztjuk.

A találmány tárgyai továbbá a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciák, ezen DNS-szekvenciákat tartalmazó génszerkezetek (amelyek ezt a DNS-szekvenciát a szerkezeti génnel leolvasó keretben tartalmazzák), az ilyen génszerkezeteket tartalmazó plazmidok, valamint az ilyen plazmidokat tartalmazó gazdaszervezetek.

A P 3 331 860.3 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésben már leírtak egy eljárást a Streptomyces tendae fermentációjával történő tendamistat-elöállítására. Az eljárásban szubletális adag Acriflavinnal kezelt, tendamistatot termelő S. tendae törzseket alkalmaznak. Az igy kapott törzsekből izolálnak egy, a tendamistat génjét tartalmazó DNS-fragmenset, mégpedig egy 2,3 kb-Pst I-fragmenset. Ezen fragmens Pst I-vel hasított pBR 322-be történő beépítésével tudják ezt a DNS-t E. coli-ban szaporítani és ismét izolálni.

Felismertük, hogy ebben a 2,3 kb-fragmensben közvetlenül a tendamistat szerkezeti génje előtt az (I) általános képletű

Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala (I) szignálpeptid (prepeptid) kódja van, az (I) általános képletben pedig X 17-20 aminosavat magában foglaló hidrofób egységet jelent.

Felismertük továbbá, hogy ez a szignálpeptid alkalmas arra, hogy más peptideket a megfelelő szignálpeptidázt tartalmazó gazdasejtekből .kizsilipeljen'. A találmány ennek következtében a (II) általános képletű propeptidetre is vonatkozik.

Sig-R (II) a képletben Sig az (I) általános képletben jellemzett aminosav sorrendet jelenti,

R jelentése egy aminoterminálisan csatolt, genetikusán kódolható peptid maradéka, amelyben az amino-végen egy savanyú aminosav, előnyösen aszparginsav van.

A találmány tárgya tehát egy olyan (II) általános képletű peptid, amelyben

R jelentése hidrogénatom, vagy egy peptidmaradék, például tendamistat-maradék.

A találmány tárgya a megfelelő DNS-szekvencia is, amelyet szubletális adag Acriflavinnal kezelt tendamistatot termelő

Streptomyces tendae törzsekből nyerünk a kővetkező előállítási lépésekkel: a teljes DNS izolálása, Pst I-el történő emésztetése, az

5’-(³²P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3’ (A) képletű DNS-szekvenciával történő Southern-hidridizáció, a 2,3 kb-Pst I-fragraens izolálása, Bam ΗΙ-vel történő hasítás, az (A) képletű DNS-szekvenciával történő Southern-hibridizáció, a 0,94 kb-Pst Ι-Bam Hl-subfragmens izolálása, Sau 3a-val történő hasítás, az (A) képletű DNS-szekvenciával történő Southern-hidridizáció, a 0,525 kb-Bam HI-SAU 3a-subfragmens izolálása és a DNS-szekvencía megállapítása

A találmány tárgyát képező DNS-szekvencia jellemzői:

a) közvetlenül a tendamistat szerkezeti génje előtt helyezkedik el,

b) az amino-végen a Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg sorrendet kódolja,

c) a karboxi-végen a,z Ala-Ser-Ala sorrendet kódolja, és

d) középen a 17-20 aminosavat tartalmazó hidrofób egységet kódolja.

Ezt a DNS-szekvenciát a következőkben (B)-szekvenciának, illetve szignálpeptidnek fogjuk nevezni. A standard jelzőkkel történő összehasonlítással meghatározott kb-számérték pontossága a szokásos.

A Southern-hidridizációhoz az (A) szekvencia helyett tetszőleges, a tendamistat-génnel vagy az ellenszállal komplementer szekvenciát választhatunk.

A (B) jelű DNS-szekvencia jellemzésének különböző lépéseihez a DNS-t a gyakorlatban mindig egy alkalmas vektorba ültetjük, amelyet egy gazdasejtbe traszformálunk, ott szaporítjuk, az (A) szekvenciával történő kolónia-hibridizációval a transzformánsokat meghatározzuk, és a DNS-t újra izoláljuk. Ezek a lépések ismertek.

A (C) jelű DNS-szekvencia, amelynek kódoló szálját a függelékben tüntetjük fel, a

S. tendae tendamistat szerkezeti génjének nukleotid-sorrendjét mutatja. Az említett génszerkezetek tehát a (B) jelű DNS-szekvenciát leolvasókeretben tartalmazzák egy szerkezeti génnel, amely például a tendamistatot kódolja és ez előnyösen a (C) jelű DNS-szekvencia.

A találmány tárgyai továbbá olyan plazmidok, amelyeket a (B) jelű DNS-szekvencia jellemez, leolvasókeretben egy szerkezeti génnel, amely például a tendamistatot, előnyösen a (C) jelű DNS-szekvenciát kódolja. Ezek a plazmaidok tartalmazhatnak E. coli-ban hatásos replikont és igy képesek a DNS-t E. coli-ban szaporítani és adott esetben kifejezni is.

Előnyösek azok a plazmaidok, amelyek egy, a Streptomycesekben hatásos replikont is tartalmaznak. Ha egy ilyen plazmiddal Streptomyces-t transzformálunk, akkor a plazmid képes lesz arra, hogy a szerkezeti génnel meghatározott peptidet a (II) általános képletű propeptid formájában kifejezze, amelyet aztán a folyamat során a szignálpeptidáz hasit, és a kívánt peptid a tenyészközegbe kiválasztódik.

Előnyösek az úgynevezett .Shuttle (ingázó) plazmidok is, amelyek úgy E. coli-ban, mint a Streptomycesekben hatásos replikont tartalmaznak. Ezek a .Shuttle* plazmidok E. coli-ban szaporíthatok és reizoláció után Streptomycesekbe transzformálhatok, ahol a kívánt polipeptid termelése megtörténik.

A találmány tárgyához tartoznak azok a gazdaszervezetek is, amelyeket a megemlített plazmidokkal transzformáltunk, különösen a Streptomyces nemhez tartozó gazdaszervezetek, mindenek előtt az S. tendae vagy különösen a S. lividans.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy (III) általános képletű polipeptid előállítására,

HzN-R’ (III) a (III) általános képletben R’ jelentése a (II) általános képletben R jelentésénél megadott peptid maradéka. Az eljárásban a fent nevezett, transzformált gazdaszervezeteket alkalmazzuk, amelyek olyan szignálpeptidázt tartalmaznak', amely a (II) általános képletű propeptidet bontja és a kívánt polipeptidet kiválasztja.

Mig a Gram-n^gativ baktériumokhoz nagy számban ismertek vektorok, addig a Gram-pozitiv baktériumokhoz csak kevés vektort Írtak eddig le. A S. tendae baktérium fajhoz eddig nem voltak ismert vektorok.

Találmányunk lehetővé teszi a S. tendae gazdaszervezetként történő használatát. ₍

A találmány rendkívüli előnye, hogy a transzformált Streptomyces törzsek, különösen a S. lividans törzsek optimálisan spórázódnak, azaz a rekombináns plazmid-tartalom nem befolyásolja ezen törzsek generatív fázisát. A transzformált szervezetek igy további törzs javításra is alkalmasak, például metabolikus mutánsok előállítására és szelekciójára, amelyek előállításánál spórákkal dolgozunk. A S. tendae ismert törzseivel ellentétben a transzformált törzsek, különösen a S. lividans, nem termelnek melanint. igy ennek elválasztása elmarad, ezzel a kívánt peptid, például a tendamistat izolálása lényegesen könnyebbé válik és a kitermelési veszteség is csökken.

A találmány további előnye, hogy az idegen gént is S. lividans-ban exprimaljuk és a megfelelő polipeptidet kiválasztjuk, ez szintén a törzsjavitás és az igy előállított polipeptid módosítása sokoldalú lehetőségét szolgáltatja.

A találmány szerinti eljárással más Streptomyces fajok is transzformálhatok, például a S. ghanaensis vagy a S. aureofaciens. Ha plazmidmentes törzseket, amelyek képesek specifikus szignálpeptidázt szintetizálni, a találmány szerinti hidrid plazmidokkal transzformálunk, akkor stabil transzformált szervezeteket kapunk, amelyek a kódolt peptidet kifejezik és kiválasztják.

A találmányt a következő példákkal világítjuk meg. A hibrid plazmidokat ábrázoló rajzokon a hasítási helyeket méretarányosan tüntettük fel.

A példákban a kővetkező, irodalomból ismert vektorokat alkalmazzuk:

M 13 mp 8 és M 13 mp 9 jelű egyszálas fágok a Messing és munkatársai: Gene 19 (1982) 269. oldal irodalmi közlemény alapján: p UC a Vieira és munkatársai: Gene 19 (1982) 259. oldal irodalmi közlemény alapján: P AC 177 és 184 a Chang és munaktársai: Bacteriology 134 (1978) 1141. oldal irodalmi közlemény alapján; pIJ 102 és 350 a Kieser és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 185 (1982) 223. oldal irodalmi közlemény alapján.

A S. tendae törzs eltartásét a 4 226 764 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. A tendamistat gén izolálása alapvetően minden tendamistatot termelő törzsből megtörténhet. Ennek ellenére különösen előnyös a P 3 331 860.3 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentés szerint eljárni, amelynek 3. példájában leírták a DNS izolálását (lásd függelékben). Ez az izolált teljes DNS a következő 1. példa kiindulási anyaga.

A példákban ismertetett eljárásokban az enzimeket a gyártó cégek által javasolt módon alkalmazzuk, illetve a Maniatis et al., Mölecular Cloning, 1982 helyen ismertetett módon járunk el, hacsak másképpen nem jelezzük.

1. példa pg DNS-t a Pst I restrikciós enzimmel teljesen megemésztettünk, és 0,8%-os agaróz gélben történő szétválasztás után nitrocellulóz szűrőre visszük fel (Southern átvitel). A szűrőt a megkötött, denaturált DNS-sel 6 órán keresztül előbibridizáljuk 5 ml elóhibridizáló közegben (0,6 mól NaCl, 0,06 mól Na-EDTA, 0,1% nátrium-dodecilszulfát oldat, 100 pg/ml ultrahanggal kezelt borjú csecsemórairigy-DNS és 4-szeresen koncentrált Denhardt-oldat). Ezt követően ismét 5 ml előhibridizáló közeggel kezeljük, amelyhez 500 000 cpm/ml radioaktív izotóppal jelzett DNS-t adunk. Ezt a radioaktív izotóppal jelzett mintát a következők szerint állítjuk eló:

Az (A) jelű DNS-szekvéneiét foszfit-eljárással szintetizáljuk. Ez 20 nukleotidot tartalmaz (a molekulatömege kb. 13 000). komplementerje a tendamistat feltételezett DNS-szekvenciájának és az E. coli által kedvelt triplett használatával a tendamistat 37-dik aminosavjétól kezdődő tendamistat-aminosav-szekvenciából származtatjuk. Ezt az (A) jelű DNS-szekvenciát az 5’ végen ϊ-^ΏΡ-ΑΤΡ és nukleotid-kinéz segítségével radioaktivan megjelöljük.

Ennek a radioaktív mintának a teljes DNS-ben lévő komplementer DNS-szekvenciához történő hibridizálása érdekében a keveréket 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a meg nem kötődött radioaktív DNS-t eltávolítjuk, és a szűrőt 37 °C hőmérsékleten ötször 30 percenként 200-200 ml hibridizáló közeggel mossuk és ezt követően autoradioagrafáljuk. 24 órás expozíció után a hibridizációs jelek azt mutatják, hogy a gén egy 2,3 kb Pst I-fragmensen helyezkedik el. Ezt a fragmenset egy preparatív agaróz-gélből származó, ennek a fr'agmensnagyságnak megfelelő kivágás elektroelúciójával nyerjük, amely agaróz-gélre a teljes, Pst I-vel emésztett DNS-t felvittük. Az eluált DNS-t a pUC 8 plazmid Pst I hasítási helyébe klónozzuk (50 pl reakciótérfogat, 0,5 pg DNS, Maniatis, id. h. 289. oldal). Ezeket a hibrid plazmidokat JM 103 jelű E. coli-ba transzformáljuk (Maniatis et al., id. h. 250. oldal) és szaporítjuk. Azokat a kiónokat, amelyek a keresett tendamistat-gén részletet hordozzák. (A) jelű radioaktív DNS mint a felhasználásával telep-hibridizációval mutatjuk ki. Az igy kapott pKA I la, illetve lb hibridplazmidokat az 1. a és 1. b ábra mutatja. A gén helyzetét az izolált 2,3 kg Pst I-fragmenssel és ennek szubfragmenseivel végzett további Southern-hibridizációkkal pontosan meghatározhatjuk (2. a, 2. b, 2. c ábrák).

2. példa

A pIJ 102 plazmid szinguláris Pst I hasítási helyére [Kieser et al., Molecular General Genetics 185, 223-238 (1982)] klónozzuk a S. tendae-ből származó 2,3 kb Pst I-fragmenseL Az így kapott pAX la és lb hibridplazmidok, amelyek a lényeges részlet orientációjában különböznek, S. lividans törzsekbe történő transzformáció után alkalmassá teszik ezen törzseket tendamistat termelésre.

A 3. ábra mutatja a pAX la plazmidot.

3. példa

A TK 24 jelű, kereskedelemben (John Innes Institute, Norwich, Anglia) kapható S. lividans törzset ismert módon protoplaszttá alakítjuk [Chater, K. F. etal., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 69-95 (1982)], és 1 pg pAX la jelű hibridplazmidot adunk 10® protoplaszthoz, 20% poli-(etilén-glikol) 6000 adagolása mellett. A transzformáit protoplasztot R2YE regenerációs közegen [Thompson és társai: Natúré 286 (1980) 525. oldal] 30 °C hőmérsékleten 5 napig tenyésztjük. A sejten kívüli amiláz inaktivátor, azaz a tendamistat képződésének kimutatását lemezes vizsgálattal végezhetjük: A regenerált telepekre 5 ml 0,4-1,0 mg/ml pankreatint tartalmazó vizes oldatot öntünk és 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. Az oldatot ezután leöntjük és 5 ml 2%-os keményítő agárral helyettesítjük. A lemezekre 2 órás 37 °C hőmérsékleten történő inkubáció után 5 ml kálium-jodidos jödoldatot öntünk a szinelóhivás céljából. Ha a telepeknek kék udvara képződik, akkor az azt mutatja, hogy a kiónok tendamistatot szintetizálnak és választanak ki. Ellenőrzésként a tendamistatot termelő, jól spórázódó törzsekből a plazmid-DNS-t izolálhatjuk és feltérképezhetjük. Minden tendamistatot termelő tőrzsben előfordul a beültetett plazmid-DNS.

4. példa

A 2. példában leírtak szerint járunk el, de pIJ 350 jelű plazmidot alkalmazunk, amely tiosztrepton-rezisztencia gént hordoz és ez a Streptomycesekben szelekciójelzőként működik. Ezzel az eljárással a pAX 350 a és b jelű hibridplazmidokat kapjuk, amelyek a beiktatott részlet orientációjában különböznek.

A 4. ábra mutatja a pAX 350 a jelű plazmidot.

A 3. példa szerinti transzformáció után minimál-közegre [Hopwood: Bacteriological Reviews 31 (1967) 373-403. oldal) szelektáljuk a rezisztens kiónokat 50 pg/ml tiosztrepton jelenlétében, és vagy közvetlenül a minimál-közegen, vagy nem szelektív R2YE-agarra történő átvitel után vizsgáljuk a tendamistát-ternielést.

5. példa

A 2,3 kb Pst I-fragmenset tartalmazó hibrid plazmidok, amelyek a Streptomyces-replikonon kívül E. coli-replikont is tartalmaznak, mint „Shuttle'-vektorok egy sor előnnyel rendelkeznek. Ezek a hibrid plazmidok az E. coli-replikon és az E. coli-ban hatásos rezisztencia jelzők alapján ezekben a szervezetekben jól szaporíthatok. Izolálás és Streptomycesekbe - különösen S. lividans-ba - történő transzformáció után nagy a stabilitásuk. A Streptomycesekben hatásos szelekció jelzőik és a Streptomyces-replikon következtében ezekben a szervezetekben is jól szaporíthatok és exprimálhatók és tendamistatot választanak ki. A pAC 184 jelű plazmidot a Sál I restrikciós enzimmel teljesen megemésztetjük és az enzimet fenol-kloroformos extrakcióval eltávolítjuk. A kiálló 5’ végeket ATP, CTP, GTP és TTP jelenlétében DNS-polimeráz enzim (Klenow-fragmens) segítségével feltöltjük. A tompa végekre (blunt ends) 16 °C hőmérsékleten történő ligáz-reakcióval (Maniatis et al., id.h. 243-244) az

5’ TCG AGC TGC AGC TCG A 3’

3’ AGC TCG ACG TCG AGC T 5’ szerkezetű Pst I-linkert (0,4 pg DNS-hez 2 pg linker, pl. a 932/85 az. magyar szabadalmi bejelentésben ismertetett módon előállítva, ligálunk. A DNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a kicsapódás után kapcsolható Pst I-végek kialakítása érdekében Pst I enzimmel emésztetjük. Ezután a DNS-t defoszforiláljuk, ismét fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a részlegesen Pst I enzimmel emésztett (Maniatis et al., id.h. 282. oldal) pAX la plazmiddal kapcsoljuk. A kapcsolt keveréket HB 101 (ATCC 33 694) illetve MC 1061 jelű (F. Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, New York 1986, 1. 4. 9.) E. coli-ba transzformáljuk. A kloramfenikollal szemben rezisztens kiónokat a lemezről leöblítjük és a DNS-t izoláljuk (Maniatis et al., id.h. 444. oldal szerinti módon). A TK 24 jelű S. lividans törzset 1-2 pg DNS-sel transzformáljuk és megvizsgáljuk, hogy tendamistatot termelnek-e (3. példa szerinti módon). A tendamistat vizsgálatban pozitívan reagáló kiónokat izoláljuk, a plazmid-DNS-t lúgos lizissel izoláljuk [Bimbóim, H.C. and Doly, J., Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)] és a HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli-ba visszatranszformáljuk. A szaporítás után újra izolált plaznAdok nem különböznek a S. lividans törzsekből izolált plazmidoktól. A tendamistat gént hordozó beiktatott részlet iroentációja szerint a rekombináns plazmidokat pSA 2a-val vagy pSA 2b szimbólummal jelöljük (5a és b ábra).

6, példa

Az 5. példában leírtak szerint járunk el, de pAX 350 plazmidból indulunk ki, E. coli-ban a klóramfenikol-rezisztencia, S. lividans-ban a tiosztrepton-rezisztencia és végül a tendamistat termelés szerint szelektáljuk, igy a pSA 351a és b jelű plazmidokat kapjuk (6a és b ábra).

7. példa

Az 5. példában leírtak szerint járunk el, de a pAC 184 jelű plazmid helyett pAC 177 jelű plazmidból indulunk ki, az így kapott pSA 3a illetve b plazmidokat a 7a és b ábra mutatja.

Ennél az eljárásnál a pAXl a jelű plazmidot Pst I-el részlegesen hasítjuk, és az enzimet 15 percen keresztül 68 °C hőmérsékleten végzett melegítéssel inaktiváljuk. A DNS-t a pAC 177 jelű, Pst I-el hasított, defoszforilált és deproteinált plazmidhoz ligái— juk. A HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli transzformációja után a kanamicinnel szemben rezisztens kiónokat a lemezről leöblítjük, a plazmid-DNS-t izoláljuk és 1-2 pg ilyen

DNS-el a TK 24 jelű S. lividans-t transzformáljuk. A tendamistatot termelő kiónokat szelektáljuk és a plazmidot jellemezzük.

8. példa

A 7. példában leírtak szerint járunk el, de a pAX la jelű plazmid helyett a pAX 350a jelű plazmidot alkalmazzuk és a S. lividansban a tiosztrepton-rezisztencia szerint szelektálunk, így a pSA 352a illetve b jelű plazmidokat kapjuk (8a és b ábra).

9. példa

Mint azt a 2. ábra mutatja, a tendamistatot és a szignál-szekvenciát kódoló gén mintegy 0,3 kb nagyságú. Az előző példákban alkalmazott 2,3 kb-fragmens tehát rövidített alakban olyan hibridplazmidok készítéséhez alkalmazható, amelyek a tendamistat termelését biztosítják.

A pKA I la jelű plazmidot Sál I-el emésztetjük és újra ligáljuk. igy kapjuk a pKA I 2 jelű, kb. 750 bázis-párral lerövidített plazmidot. Ezt klónozzuk, izoláljuk és Pst I-el hasítjuk. A DNS-t borjúbélből származó lúgos foszfatázzal defoszforiláljuk és fenolos kloroformmal proteinmentesítjűk. A pIJ 102 jelű plazmidot Pst I-el teljesen hasítjuk, és a fragmenseket az enzim hő-inaktiválása után a pKA I 2 Pst I hasítási helyeire ligáljuk. A Íigációs keveréket H 101 vagy MC 1061 jelű E. coli-ba transzformáljuk. A plazmid-DNS-t az ampicillinnel szemben rezisztens kiónokból lúgos gyors lizis-eljárással izoláljuk, és a TK 24 jelű S. lividans-t 1-2 pg ilyen DNS-el transzformáljuk. A tendamistat-termelés szerint szelektálunk és a megfelelő kiónok plazmid-DNS-ét lúgos gyors lizissel izoláljuk. A HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli-ba történő visszatranszformálás és a plazmid-DNS-nek a transzformált E. coli törzsekből történő izolálása után restrikciós analízissel jellemezzük a pSA 1 jelű plazmidot (9. ábra).

A plazmid nem különbözik a S. lividans törzsekből izolált plazmidtól, de az E. coliból történő DNS-feldolgozás termelékenyebb és rövidebb idő alatt lehetséges.

10. példa

A 9. példában leírtak szerint járunk el, de a pIJ 102 jelű plazmid helyett a pIJ 350 jelű plazmidot alkalmazzuk és a S. lividans-ban kiegészítőleg a tiosztrepton-rezisztencia szerint is szelektálunk, igy kapjuk a pSA 350a, illetve b plazmidot. A 10. ábra mutatja a pSA 350a jelű plazmidot. Ez a plazmid a rázatott tenyészetekben nagyobb tendamietat kitermeléshez vezet, mint a pAS 350b jelű

-510 plazmid, amely a tendamistat-gént hordozó részletet fordított orientációval tartalmazza. Ezzel szemben a beiktatott részlet lecsökkentése 1,5 kb nagyságra semmilyen szignifikáns hatással nincs a termék-képződésre.

11. példa

A tendamistat gén szerkezetének és nukleotid-szekvenciájának meghatározására a 0,94 kb Pst I-Bam HI-szubfragmenst (2a és b ábra) valamint a 295 bp Sau 3a-Bam HI-ezubframgenst (2c ábra) az M 13 mp 8 és az M 13 mp 9 jelű egyszálas fágokkal klónozzuk. A di-dezoxi-szekventáló reakcióhoz primerként a 20 nukleotidot magában foglaló (A) jelű DNS-szekvenciát, valamint egy kereskedelemben (Bethesda Research Laboratories GmbH, Neu-Isenburg) kapható 15 bp prímért használunk. Eredményként a (C) jelű DNS-szekvenciát kapjuk.

12. példa

A tendamistat szerkezeti génje előtt a DNS-en egy nyitott leolvasó keret található, amely az ATG (Met) kezdő kódig terjed, és amely egy, a tendamistat aminoterminális végéhez közvetlenül csatlakozó proteint kódol. Ennek a szignálpeptidnek a (B) jelű DNS-szekvencia felel meg.

13, példa

Interleukin-2 termelése 15

A 9. példa szerinti pKAI 2 plazmidot Xmain-nial és Pstl-gyel hasítjuk, és a kis fragmenst eltávolítjuk. A XmalII vágóhely a tendamisztat-szignálszekvenciában helyezke20 dik el, éspedig a C-termilás vég közelében (a 24-26. aminosavak területén). A nagy fragmenst egy olyan szintetikus génnel ligáljuk, amely a maradék szignálszekvenciát, aszparagint (amely a tendamisztat első aminosava) és az ahhoz csatlakozó interleukin-2-t kódolja. Ezt a szintetikus gént a 163 249 sz. európai szabadalmi bejelentésben ismertetett módon állítjuk elő, a leírt gént azonban a kővetkezőképpen módosítjuk:

	2ö Alá	Gly	Pro	Alá	Ser	30 Alá	Asp
G	GCC	GGG	CCG	GCC	TCC	GCC	GAC
		CCC	GGC	CGG	AGG	CGG	CTG

(XmalII) Szignálpeptid

1	133
Alá	Thr
GCG ...	ACC TGA TAG CTG
CGC	TGG ACT ATC G
Interleukin-2	(Pstl)

Az így kapott plazmidot Pstl-gyel linearizál- 14. példa juk, és a szintén Pstl-gyel felnyitott pIJ 350 40 expressziós plazmidba ligáljuk a 9. példa szerinti módon. A szelektálást a triosztrepton-rezisztencia alapján végezzük (v.ö. 10. példa).

A kiválasztott interleukin-2-t az említett 45 európai bejelentésben ismertetett teszttel vizsgáljuk.

Hirudin termelése

A 13. példa szerinti módon járunk el, szintetikus génként azonban a 2980/85 sz. magyar szabadalmi bejelentés szerinti módon előállított gént használjuk, melynek szekvenciája a következő:

25 Alá	Gly	Pro	Alá	Ser	30 Alá	Asp	1 Thr	64 Gin
G GCC	GGG	CCG	GCC	TCC	GCC	GAC	ACG ...	CAG	TGA	TAG	CTG
	CCC	GGC	CGG	AGG	CGG	CTG	TGC	GTC	ACT	ATC	G
(XmalII)		Szignálpeptid			Hirudin				(Pstl)

A kiválasztott hirudint véralvadási teszttel (trombingátlás) vizsgáljuk.

CA

-61973Ε1

Függelék
	(C) jelű DNS-szekvencia (kódoló szál)
5’	-GAC	ACG	ACC	GTC	TCC
NH2	-Asp	Thr	Thr	Val	Ser
ACG	CTC	TAC	CAG	AGC	TGG
Thr	Leu	Tyr	Gin	Ser	Trp
AAC	GGC	TGT	GCC	GAG	ACG
Asn	Gly	Cys	Alá	Glu	Thr
TAC	GAG	GAC	GAC	ACC	GAA
Tyr	Glu	Asp	Asp	Thr	Glu
GCA	CCG	GGC	CAG	ATC	ACC
Alá	Pro	Gly	Gin	Ile	Thr
ATC	GGC	TCG	CAC	GGC	CAC
Ile	Gly	Ser	His	Gly	His
TGC	CTT	TAG-3’
Cys	Leu	Stp

GAG	CCC	GCA	CCC	TCC	TGC
Glu	Pro	Alá	Pro	Ser	Cys
CGG	TAC	TCA	CAG	GCC	GAC
Arg	Tyr	Ser	Gin	Alá	Asp
GTG	ACC	GTG	AAG	GTC	GTC
Val	Thr	Val	Lys	Val	Val
GGC	CTG	TGC	TAC	GCC	GTC
Gly	Leu	Cys	Tyr	Alá	Val
ACC	GTC	GGC	GAC	GGC	TAC
Thr	Val	Gly	Asp	Gly	Tyr
GCG	CGC	TAC	CTG	GCT	CGC
Alá	Arg	Tyr	Leu	Alá	Arg

A Ρ 3 331 860.3 számú NSZK szabadalmi bejelentés 1. és 3. példája:

1. példa

Mutációs eljárás

Az A 49 847 számú európai szabadalmi iratban leírt, zabpehely-agaron tenyésztett DSM 2727 jelű törzs kb. 0,25 cm^nyi spórázódott micéliumát átoltjuk egy 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, amelybe a következő tenyészközegből 25 ml-t töltünk:

szójaliszt	2%
glükóz	3%
kukoricakeményitő	0.2%
karbamid	0.1%
ammónium-citrát	0.1%
maláta extrák tűm	0.5%
KH2PO4	0.2%
A közeget 30 percig 121 °C	hőmérsékle-

ten és 1 bar nyomáson autoklávban kezeljük, a pH-értéke 7,0. Az oltó lombikot 2 napig 30 °C hőmérsékleten, rázógépben inkubáljuk. Az A 49 847 számú európai szabadalmi irat szerint ezután 2 ml-nyi kifejlett előtenyészetet átoltunk egy 20 ml fótenyészkőzeggel töltött 100 ml-es Erlenmeyer lombikba. A főtenyészkőzeg összetétele:

oldható keményítő	2-4%
szójaliszt	0.4%
folyékony kukoricalekvár	0.4%
sovány tejpor	0.7%
glükóz	1.0%
(NH<)2HPO4	1.2%
A közeg pH-értéke az autoklávban tőr-

ténő kezelés után 7,6. Ehhez a közeghez 10-25 ug/ml koncentrációban Acriflavint adunk mutagén ágensként. A tenyészetet 5 napig 28 °C hőmérsékleten 220 min'¹ frekvenciával rázatjuk. Ezután a tenyészoldatot centrifugáljuk (1300 g, 5 perc) és a sejttómeget a fő tenyészközeggel mossuk.

A mosott sejteket üveghomogenizátorral fragmentáljuk és az alábbi összetételű agarlemezekre szélesztjük:

	Nádcukor	0.30%
25	Dextrin	1.50%
	NaCl	0.05%
	K2HPO4	0.05%
	FeSO4x7H2O	0.001%
	Triptone Sója Broth	0.05%
30	(Oxid cég gyártmánya)
	Hús extraktum (Difco cég gyártmánya)	0.10%
	Élesztő extraktum (Difco cég gyártmánya)	0.20%
35	Agar (Merck cég gyártmánya)	1.50%
	Az oldat pH-értéke 7,1	(az autoklávos

kezelés megegyezik a fentiekben leírttal).

A lemezeket 5 napig 28 °C-on tenyészt40 Jük, és az egyes telepeket ferde zabpehely-agarral oltjuk át. Ezeket az előbbiek szerint tovább tenyésztjük, mig a micéliumok spórázódnak. A spórázódott micéliumot a már leírtak szerint elő- és főtenyészetben szaporít45 juk és az 5 napos főtenyészet szüredékét az A 49 847 számú európai szabadalmi irat szerint tendamistat-tartalomra vizsgáljuk. Ilyen módon az 1-9353, 1-9362, 1-9417 és 1-9418 jelű törzseket szelektáljuk. Ezek a törzsek fejlődési periódusukban, a leirt feltételek mellett kb. 90 000-100 000 NE tendamistatot termelnek 1 liter tenyészoldatra vonatkoztatva, azaz 1,5-1,8 g/1 inaktivátort.

3. példa

A dezoxiribonukleinsav izolációja S. tendae-ból és molekuláris biológiai jellem60 zése.

A sejtek tenyésztése az 1. példában leírtak szerint történik. A fó tenyészközegben való három napos fejlődés után az egyik Er65 lenmeyer lombik sejtjeit 4 °C hőmérsékleten,

-714

3000 g gyorsulással 5 percig centrifugálva összegyűjtjük és kétszer 50-50 ml, 50 mmól-os Trie/HCl pufferból, 100 mmól-os NaCl-ból ée 25 mmól-ós EDTA-ból álló oldattal mossuk. A szilárdra centrifugált sejtekből 3 g-ot -198 °C hőmérsékleten, folyékony nitrogénben, sokkszerűen mélyhűtőnk és ezt kővetően vágókéses homogenizátorban (Warring Commercial Blender), nitrogénben finom porrá homogenizáljuk. Ezt a port 10 ml-nyi, az előbbiekben megnevezett puffer oldattal elegyítjük, jégre helyezve (0 °C-on) feloldjuk és 0,8 ml 30 mg/ml koncentrációjú lizozim-oldat hozzáadása után 20 percig 28 °C hőmérsékleten enyhe rázással inkubáljuk. A szuszpenzióhoz 0,8 ml 15 mg/ml-es proteináz K oldatot és az N-lauroil-szakrozín nátrium sójának 20%-os oldatából 0,8 ml-t adunk hozzá. Óvatos keverés után a keveréket jégre helyezve (0 °C-on) 30 percig és szobahőmérsékleten további 15 percig inkubáljuk. 22 g szilárd cézium-klorid hozzáadása és feloldása után a mér említett puffer oldattal a térfogatot 22 ml-re egészítjük ki és a szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten 12 000 g gyorsulással 25 percig centrifugáljuk. A centrifugált termék tisztájához etidium-bromidot adunk és a törésmutatóját CsCl-al n=l,392O értékre állítjuk be. Preparatív ultracentrifugálás után (120 000 g, 36 óra, 15 °C) a kromoszomális DNS sávját a centrifugacsőből kivesszük és azonos feltételek között újracentrifugáljuk. Az izolált sávot n-butanollal történő kirázással az etínium-bromidtól mentesítjük és a CsCl maradéktalan eltávolítása érdekében dializáljuk. Az igy nyert DNS hasítható, például Pst I, Bam Hl, Sau 3 A, Cla I, Bgl II és Xho I enzimekkel és nem hasítható Eco R I és Hind III endonukleázokkal. Az 1-9353 és 1-9362 mutánsokból nyert DNS-t az ATCC 31 210, illetve a DSM 2727 DNS-ével ellentétben egy erősített genetikus elem jellemzi, amelynek egyes fragmensei az etídium-bromid fluoreszcens színezékkel történő megfestés után a nem szelektíven szaporított fragmensek hátteréből jól láthatóan előtűnnek. Az erősített elem nagyságát, valamint a restrikciós endonukleázokkal történó emésztetés után keletkező egyes jellemző fragmenseket a következő táblázatban adjuk meg:

Fragmens sorszáma	Fragmens nagyság (Kbp)
Pst I	Xho I	Bam H
1.	9.0	13.5	7.2
2.	7.0	11.5	6.1
3.	6.8	9.3	5.3
4.	4.6	2.8	2.9
5.	3.4	0.7	2.6
6.	3.1		2.5
7.	2.3		2.15
8.	1.1		2.1
9.			1.5
10.			1.2

Fragmens Fragmens nagyság (Kbp) sorszáma Pst I Xho I Bam Η I

11. 1.1

12. 1.0

13. 0.8

14. 0.5

15. 0.48

Összesen: 37.3 37.8 37.43

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás genetikailag kódolható aminosavakból álló polipeptidek előállításának megkönnyítésére, azzal jellemezve, hogy egy, a polipeptid szerkezeti génjével azonos leolvasókeretben egy prepeptid (B) DNS-szekvenciáját tartalmazó génszerkezetet, amely szekvencia tendamisztatot termelő, acriflavin szubletális dózisával kezelt Streptomyces tendae törzsből nyerhető, és amely szekvencia

   a) közvetlenül a szerkezeti gén előtt helyezkedik el,

   b) az amino-végen a Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg sorrendet kódolja,

   c) a karboxi-végen az Ala-Ser-Ala sorrendet kódolja, és

   d) középen egy hidrofób tartományt kódol, amely 10-25 arainosavat tartalmaz, egy Streptomyces nembe tartozó gazdasejtbe beviszünk, amely gazdasejt egy, a prepeptidet lehasitani és a kívánt polipeptidet a tenyészkőzegbe kiválasztani képes szignálpeptidazt tartalmaz és az igy kialakított transzformánst megfelelő tápközegen tenyésztve a genetikai információt kifejezzük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prepeptid DNS-e olyan középső hidrofób tartományt kódol, amely 17-20 aminosavat tartalmaz.
3. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy S. tendae-ból izolált prepeptid (B) DNS-szekvenciát használunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a S. tendae vagy a S. lividans fajok sejtjeit alkalmazzuk.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génszerkezetet a gazdasejtbe egy olyan plazmáddal visszük be, amely a Streptomycesekben hatásos replikont tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely a Streptomycesekben hatásos replikonon kívül E. coli-ban hatásos replikont is tartalmaz.

   -816
7. 7. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerkezeti génként a tendamistat szerkezeti génjét használjuk.
8. 8. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tendamistat szerkezeti génként a függelékben feltüntetett (C) jelű DNS-szekvenciával rendelkező gént alkalmazunk.

   8 ábraoldal