JPH0223883A - ヒトβ−ＮＧＦの発現法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ヒトβ−ＮＧＦの発現法に関する。詳しくは遺伝子組換
え技術によりヒトβ−ＮＧＦを発現させる方法に関する
ものである。

（発明が解決しようとする課題） ＮＧＦ（神経成長因子ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａ
ｃｔｏｒ）は交感神経節や知覚神経節等の末梢神経の分
化や成長を促進する作用をもつポリペプチドとして知ら
れているが、近年ＮＧＦが脳内の中枢神経系にも存在し
機能していることが解明されると共に、アルツハイマー
型老人性痴呆症との関連性が注目されている。また、Ｎ
ＧＦはα２βγ２の複合体からなり、これ等サブユニッ
トの中で神経突起を伸長させる活性はβ−ＮＧＦ（以下
便宜上β−ＮＧＦと記す）のみにあって、α−ＮＧＦ及
びγ−ＮＧＦには活性が蝿いことが知られているが、ヒ
）　ＮＧＦの生理作用に関する研究は報告されておらず
、ＮＧＦとアルツハイマー型老人性痴呆症との関係も今
後の研究の進展に委ねられている。

ヒトβ−ＮＧＦの構造については、１９８３年に遺伝子
配列が決定され、マウスβ−ＮＧＦと極めて高い相同性
を有することが報告されているが［ＮＡＴＵＲＥ、Ｖｏ
ｌ　。

３０３．３０　ＪＵＮＥ、８２１〜８２５（１９８３）
コ、これを遺伝子組換え技術により発現させること、特
に酵母を宿主として分泌させることについては全く報告
されていない。

く課題を解決するための手段） 本発明者等は上記の事情に鑑み、ＮＧＦの今後の研究の
進展と応用に寄与するため、とくにヒトβ−ＮＧＦを遺
伝子組換え技術により有利に取得することを目的として
鋭意検討した結果、酵母のαフェロモン（性フエロモン
）遺伝子のリーダー配列を含み、その直後に合成ヒトβ
−ＮＧＦ遺伝子を組み込んだプラスミドを使用し、これ
により杉質転換した酵母がヒトβ−ＮＧＦの分泌能を有
することを確認し本発明を達成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるサツカロマイセス　セレビシェ（Ｓ
ａｃｃｌ＋ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
のαフェロモン遺伝子ＭＦα１のリーダー配列の直後に
合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を含有するプラスミドは、例
えば以下に述べる方法により構築される。

［プラスミドの構築］ （＋）プラスミドｐＲＥ１０７８（７，５ｋｂ）の作！
！（第１図参照） 特開昭６３−１３３９８７号公報及びＭｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、７．３１
８５〜３１９３（１９８７）に記載されている方法で作
製した、サツカロマイセス　セレビシェのαフェロモン
遺伝子門Ｆαｌのプロモーター配列、リーダー（分泌シ
グナル）配列、ターミネータ−配列並びにＴＲＰＩ、２
μｍ及びｐＢＲ３２２のｏｒｉとアンピシリン耐性遺伝
子（Ａｐｒ）を有し、かつリーダー配列とターミネータ
−配列との間にヒトβ−エントルフィン遺伝子が挿入さ
れている公知のプラスミドｐＲＥ＋０５９を使用し、そ
のプロモーター配列をホスフォグリセレートキナーゼ（
ＰＧＫ）のプロモーター配列で置換したプラスミドｐＲ
Ｅ１０７８を作製する。

即ち、ＰＧＫのプロモーター配列とターミネータ−配列
を含む公知のプラスミドｐＭＡ９１［Ｇｅｎｅ、２ｉｉ
、　１〜＋４（１９８３）コを８ｇ１ＩＩで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩで平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩで
切断してＰＧＫのプロモーター配列を含む１．５　ｋｂ
のＥｃｏＲＩ　−（Ｂｇｌ　Ｕ　）断片（１）を単離す
る。

一方、前記のｐＲＥ１０５９をＨｉｎｆｌで切断し、末
端を充填した後、５ａｌｌで切断してＭＦａｌの５゛非
翻訳領域とリーダー配列を含む３３７　ｂｐの断片（■
）を単離する。また、ｐＲＥ１０５９のヒトβ−エンド
ルフィン遺伝子を含むＳａｌ　Ｉ　−ＡａｔＩＩ断片（
ＩＩＩ）と、ＴＲＰＩ、２μｍ及びｐＢＲ３２２のｏｒ
ｉ並びにＡ　ＩＴ　ｒ領域を含むＥｃｏＲ１−ＡａｔＩ
Ｉ断片（ＩＶ）とを夫々の制限酵素で切断して得る。

上記で得られる（１）〜（ＩＶ）を同時に結合すること
によりρＲＥ＋０７８（７，５ｋｂ）を作製する。

（２）プラスミドｐｓｓＥ２（７，５ｋｂ）の作製（第
２図参照）ｐＲＥ＋０７８中のＭＦａｌのリーダー配列
の８６番目のグルタミン酸コドンＧＡＧを部位特異的変
異導入（ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）によりＴＣＴに変え、ここにＢｇｌＩＩ切断部
位が導入されたプラスミドｐｓｓＥ２（７，５ｋｂ）を
作製する。

即ち、ｐＲＥ＋０７８をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切
断して、ＰＧＫのプロモーター配列とＭＦａｌのリーダ
ー配列とを含むＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍ１ｎ　Ｉ断片（１
，６ｋｂ）を採取し、これを既知のファージベクター旧
３ｍｐ１８（東洋紡績社カタログ旧頁記載）にクローン
し、−水銀のファージＤＮＡと変異用ＤＮＡ（５’ＡＧ
ＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＴＡＴＣ３’　）
をアニールさせた後、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のキラ）　（
ＲＰＮ、２３２２）を用いハンドブック（Ｏｆ　ｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏ−ｔｉｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　５ｙｓｔｅｓ＋）
記載の方法に従って処理してＢｇＩ１１切断部位が導入
されたＤＮＡを得る。このように処理して得られた８８
１■切断部位が導入されたＥｃｏＲＩ　−Ｒａｍ）Ｉ　
Ｉ断片を、ｐＲＥ＋０７８のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ
断片（５，７ｋｂ）と結合してｐｓｓＥ２（７，５ｋｂ
）を作製する。

（３）プラスミドｐＳＳＥ９（７，７ｋｂ）の作ｔｇ＜
第２図参＠）上記で得られたｐＳＳＥ２をＢｇＩＩＩ及
びＢａｗｌ　Ｉで切断し、この切断部位に下記塩基配列
からなる合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を結合することによ
り、ｐＲＥ１０７８中のＭＦａｌのリーダー配列の８６
番目から９０番目のコドンとリンカ−配列に由来する７
アミノ酸残基に相当するコドン及びβ−エンドルフィン
遺伝子の代りに、合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子が挿入され
たＰＳＳＥ９（７，７ｋｂ）を作製する。

なお、下記塩基配列の合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子は、前
記ＮＡＴＵＲＥ、Ｖｏ１．３０３，３０　ＪＵＮＥ、８
２１〜８２５（１９８３）に記載されているヒトβ−Ｎ
ＧＦ遺伝子配列のアミノ酸配列は変えずに、酵母で強く
発現している蛋白質の遺伝子でよく使われているコドン
に変えるため、ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子配列中の８５個の
塩基を変えて合成したものである。

［合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子の塩基配列］ＧＡ　ＴＣＴ
　ＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡ　ＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧ
ＡＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＴＣＴ　ＧＴＣＴＧＴ　ＧＡ
ＣＴＣＴ　ＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＧ　ＧＴＴ　ＧＧＴ
　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣＧＡ
ＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴＣＡＴ
Ｇ　ＧＴＴ　ＴＴＧＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＡＣＡ
ＴＴ　ＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＴＴ　ＴＴＣＡＡＧ　ＣＡ
Ａ　ＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧ
Ｔ　ＡＧＡＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＣＣＡ　ＧＴＴ　Ｇ
ＡＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＡＧＡＧＧＴ　ＡＴＣＣ
ＡＴ　ＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧ　ＡＡＣＴＣＴ　ＴＡ
ＣＴＧＴ　ＡＣＣＡＣＴ　ＡＣＣＣＡＣＡＣＴ　ＴＴＣ
ＧＴＣＡＡＧ　ＧＣＴＴＴＧ八ＣＴ　ＡへＧ　ＧＡＣＧ
ＧＴ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣＣＴＧＧΔＧΔ　
ＴＴＣＡＴＣＡＧＡ　ＡＴＴ　　ＧＡＣＡＣＣＧＣＴ　
　ＴＧＴ　　ＧＴＣＴＧＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　　ＴＣＴ
　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ
ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＴＡ八へＡＴ　Ｃ 」Ｌ記の方法により作ル１したプラスミドｐＳＳＥ９で
サツカロマイセス　セレビシェを通常の方法により形７
１転換した形質転換株はヒトβ−ＮＧＦの分液、能を有
し、後記実施例に示すように、形質転換株の培養ｉα上
清からヒトβ−ＮＧＦが取得される。モして１）−）れ
たしトβ−ＮＧＦは、例えばクローン化されたラット副
７７１ｆ質掲色細胞株由来のｒ’ｃＩ２細胞の神経突起
を伸長する作用を有することがｔＪ！察された。

（発明の効果） 本発明によれば、活性ヒトβ−ＮＧＦを発ＩＪＩさせる
ことができるので、今後のＮＧＦ研究の進展と応用（こ
寄りするところが大きい。

（実施例） 以下本発明を実施例について更に＝Ｙ細に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施例に限定
されるものではないゆ なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のｉ〜■の方法によった・Ｉ［制限酵素によ
るＤＮＡの切断と回収コ制限酵素による切断用緩衝液は
、下記３種類を用い（１）〜（３）の使い分けは、Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ（
＋９８１Ｘｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
ｅｗ　Ｖｏｒｋ）に従った。また切断条件は２単位／μ
、ｇ　ＤＮＡの制限酵素を用い３７℃または６５℃で３
０分間処理する。

次いてＴＥ緩衝液（１０ｍ閂のトリス塩酸（ｐＨ８，０
）及びｌ　ｍＭのＥＤＴＡからなる）で飽和したフェノ
ールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き、２倍
容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置した後
、遠心分離してＤＮＡを回収する。

（１）低塩濃度緩衝液 ｌＯ溜−のトリス塩酸（ｐＨ７，４）、１０　ｎ＋Ｍの
硫酸マグネシウム及び１　ｍＭのジチオスレイトールか
らなる。

（２）中塊濃度緩衝液 ５０＋ＩＩＭのＮａＣｌ、　＋Ｏｎ＋Ｍのトリス塩酸（
ｐＨ７，４）、ｌ０ｍＭの硫酸マグネシウム及び１　ｍ
Ｍのジチオスレイトールからなる。

（３）高塩１度緩衝液 １００　ｍＭのＮａＣｌ、５０　ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ７，４）及び１０　ｍＭの硫酸マグネシウムからなる
。

■［大Ｉｌｉ菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮ
Ａの調製コ（１）ミニ調製法（ｌｎｉ　ｐｒｅｐ法）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

ｌ　、１５１３〜＋５２３（１９７９）］大腸菌を宿主
とし、０．５　ｍｌのＬ−ブコス（１０ｇのペプトン、
５呂のイースト・エキス、１ｇのグルコース、５ｇのＮ
ａＣｌ／　ｌからなる　ｐＨ７，２）を用いて一夜間培
養し、遠心分離して集菌した菌体を１００μ＋のｍ　液
Ａ（５０ｍＭのグルコース、ｌｏｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　、
Ａ、２５　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチ
ーム２ｍ８／１からなる）に懸濁し室温で３０分間放置
する。

次いて氷水中で２００μｍのｉＪ液Ｂ［１＄の５Ｏ５（
）’デシル５ＲＨナトリウム）を含む０．２　ＮのＮａ
ＯＨ］を加えて振盪し同時にＤ　Ｎ　Ａの変性を行う。

１５０７１１の３Ｍ酢酸ソーダ溶液を加え水冷後、遠心
分離し、上清に冷エタノールを加え、−２０℃に冷却し
て遠心分離し沈澱を集める。

沈澱を溶液Ｃ（５０ｍＭのトリス塩酸及び０．１Ｍの酢
酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エタ
ノールを加え、沈澱するＤＮＡを洗浄し減圧上乾燥し一
２０℃で保存する。

（２）大量調製法 ２００１のし一ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬
剤を含む）に大腸菌ＨＢＩＯＩを植菌し、−夜間培養シ
テ集菌後、＋５　ｍ１ｃ７）ＳＴＥＳｅｔ衝液［ＴＥＳ
緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）、ｌ　ｍ
ＭのＥＤＴＡ及び５０　ｍＭのＮａＣｌからなる）に２
５％のサッカロースを添加したもの］に懸濁し、ＥＤＴ
Ａ、リゾチーム及びリボヌクレアーゼＡ（シグマ社！り
を夫々３０　ｍＭ、６００μ８／ｍ１及び５０μ８／１
加え、更に氷水中でプロナーゼＥを５００μｇ／ｍｌ添
加する。次いでＳＤＳを１％となるように加え３７℃で
振盪し、氷水中に戻しＮａＣｌを終濃度ＩＭとなるよう
に添加した後、遠心分離し上溝に２倍容の冷エタノール
を加え一２０℃に保持し遠心分離してＤＮＡを沈澱とし
て回収し減圧上乾燥し一２０℃で保存する。

ｍ［Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる連結］連結する２個の
ＤＮＡ断片は、１Ｍｇ／１０μＩになるように連結用緩
衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐ）Ｉ　７．５）、６．
６　ｍＭの塩化マグネシウム、１０　ｍＭのジチオスレ
イトールからなる］に溶解し６５℃で１０分間処理した
後、４℃で６６μ門のＡＴＰ（アデノシントリフオスフ
ェート）を加え、更にＴ４リガーゼを粘着末端の場合は
０．１単位／μｇ　ＤＮＡ、また平滑末端の場合は１単
位／μｇ　ＤＮＡになるように加えて４℃で１８時間反
応させた後、６５℃で１０分間処理する。

■［大腸菌の形質転換（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ（＋９８１）（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｖｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）］５
１のし一ブロスに大腸菌を植菌し、−夜間培養する。こ
の０．２１を２０１のし一ブロスに植え３７℃でクレッ
トユニットが６０に達するまで振盪培養する。菌体を集
め水冷した５０−Ｍの塩化カルシウムと１０僧門のトリ
ス塩酸（ｐＨ８，０）とからなる緩衝液１０　ｍｌに懸
濁し３０分間水冷する。遠心分離した菌体を１１の塩化
カルシウム溶液に懸濁し、その０．１１を１０μｍのＤ
ＮＡ溶液と混合し０℃で３０分間、４２℃で２分間イン
キュベートした後、１．５　ｍｌのＬ−ブロスを加え３
７℃で３０分間培養し、この０．１　ｍｌを寒天培地に
植える。

■［粘着末端の充填］ １ＭｇのＤＮＡを３０μｍの５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ
７，２）、ｌＯＩＩＩＭの硫酸マグネシウム、０．１　
ｍＭのジチオスレイトール、５０μｓ／ｍｌの牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）及び０．２　ｍＭのｄＮＴＰに溶か
し、１．２５単位のｋｌｅｎｏ−断片（大腸菌のＤＮＡ
ポリメラーゼＩをトリプシンで処理して得られる大きな
断片）を加え室温で３０分間反応させる。次いで１μｍ
の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を加えて反応・
を停止させ、フェノール及びエーテルで逐次抽出しフェ
ノールを除去し、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収す
る。

実施例１ （１）プラスミドｐＲＥＩ０７８（７，５ｋｂ）の作１
１１（第１図）ＰＧにのプロモーター配列とターミネー
タ−配列を含むプラスミドｐＭＡ９１をＢｇｌＩＩで切
断し、ＤＮＡポリメラーゼ■で平滑末端とした後、Ｅｃ
ｏＲＩで切断してＰＧＫのプロモーター配列を含む１．
５　ｋｂのＥｃｏＲｌ−（ＢｇｌＩＩ）断片（１）を単
離した。

一方、ｐＲＥ＋０５９をＨｉｎｆｌで切断し、末端を充
填した後、５ａｌｌで切断してＭＦα１の５′非翻訳領
域とノーダー配列を含む３３７　ｂｐの断片（ｎ）を単
離した。

また、ｐＲＥ１０５９のβ−エンドルフィン遺伝子を含
むＳａｌ　Ｉ　−Ａａｔ■断片（ｍ）と、ＴＲＰＩ、２
μｍ及びｐＢＲ３２２のｏｒｉ、Ａｐｒを含むＥｃｏＲ
Ｉ　−ＡａｔＩＩ断片（ｒＶ）とを、夫々の制限酵素で
切断した後、アガロースゲル電気泳動により分離し、目
的のバンドを溶出することにより得た。上記で得た（１
）〜（ＩＶ）の断片を同時にＴ４　ＤＮＡリガーゼで結
合してｐＲＥ１０７８（７，５ｋｂ）を作製した。

り２）プラスミドｐｓｓＥ２（７，５ｋｂ）の作！！（
第２図）ｐＲＥ１０７８をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
切断し、Ｐ（Ｊのプロモーター配列とＭＦα１のリーダ
ー配列を含むＥｃ。

Ｒ１−ＢａｍＨＩ断片（１，６ｋｂ）を採取し、これを
ファージベクター旧３ｗｐ１８にクローンし一本鎖のフ
ァージＤＮＡと変異用ＤＮＡ（５’ＡＧＣＴＴＣＡＧＣ
ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＴＡＴＣ３’　）をアニールさせ
た後、Ａｍｅｒｓｈａ−社のキラ）　（ＲＰＮ、２３２
２）を用いハンドブック（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ−ｔ
ｉｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ）記載の方法に従って
処理してＢｇｌ■切断部位が導入されたＤＮＡを得た。

得られたＢｇＩｎ切断部位が導入されたＥｃｏＲＩ　−
Ｒａｍ）Ｉ　Ｉ断片を、ｐＲＥ＋０７８のＥｃｏＲ１−
Ｂａｗｌ　Ｉ断片（５，７ｋｂ）と結合してｐＳＳＥ２
（７，５ｋｂ）を作製した。

（３）プラスミドｐＳＳＥ９（７，７ｋｂ）の作！１１
（第２図）上記で得たｐＳＳＥ２をＢｇｌＩＩ及びＲａ
ｍ）Ｉ　Ｉで切断し・この切断部位に前記塩基配列の合
成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を結合して、ｐＲＥ＋０７８中
のβ−エンドルフィン遺伝子の代りに、βＮＧＦ遺伝子
が挿入されたｐＳＳＥ９（７，７ｋｂ）を作製した。

（４）　［ｐＳＳＥ９によるサツカロマイセス　セレビ
シェ２０Ｂ−１２株の形質転換］ サツカロマイセス　セレビシェ２０Ｂ−１２株をＹＰＤ
培地（１％酵母エキス、２％バクトペブトン及び２％グ
ルコースからなる）で−夜間培養した培養液０．５１を
２０−１のＹＰＯ培地に植え、３０℃でクレットユニッ
ト６０まで振盪培養した。この１０　ｍｌを遠心分離し
、菌体を１０■１のＴＥ１１衝液で洗浄後１１のＴＥ緩
衝液に懸濁した。この０．５１に０．５１の０．２ｉ酢
酸リチウム、１０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）及
びｌＩＩＩＭのＥＤＴＡを加え、３０℃で１時間保持し
た後、氷水中で冷却した。

得られた菌体懸濁液１００μｍに、上記（３）で得たｐ
ｓｓＥ９の溶液ｌＯμｍを加え、０℃で３０分間保持し
た後、集菌し水０．５１で洗浄後０．３１の水に懸濁し
、プレート１枚に０．！１植えた。

（５）ヒトβ−ＮＧＦの分泌量と活性の測定上記（４）
で得た形質転換菌体をＹＣＤ培地（１％酵母エキス、２
％カザミノ酸及び２％グルコースからなる）で３０℃で
２日間培養し、培養液を遠心分離し、得られた上清をホ
ローファイバー（アミコン社旧Ｐ１０−２０）で１０〜
６０倍量に濃縮して、ヒトβ−ＮＧＦの同定と活性の測
定に供した。

［ヒトβ−ＮＧＦの分泌量］ 上記の濃縮液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた後、抗ＮＧＦ抗体を用いたウェスタンブロッテ
ィング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により測
定した結果、β−ＮＧＦの分泌量は約１０μｇ／ｌであ
った。

［ヒトβ−ＮＧＦの活性］ ／ＰＣ１２ｍ胞（１９７５年、ＧｒｅｅｎｅとＴｉ５ｃ
ｈｌｅｒによりり５、占−ン化されたラット副腎髄質褐
色細胞腫［Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　ｔｈ
ｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　
　５ｃｉｅｎｃｅｓ＋ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｊ
７，２４２４〜２４２８（１９７６）コ由来のＰＣｌ３
の細胞神経突起伸長反応の有無を調べた。

次の処方により分化誘導培地をｖ４ｉｔ、た、即ち、Ｄ
ＭＥ培地（Ｇｉｂｃｏ社１１）とＦ１２培地（Ｇｉｂｃ
ｏ社製）の１０００１用試薬を１：ｌの割合で混合し、
これにヘベス（）Ｉｅｐｅｓ）７．１５　ｇ、亜セレン
酸ナトリウム１０．３６μｇ、重炭酸ナトリウム３．７
ｇ、ペニシリンＧ　１０万単位及び硫酸ストレプトマイ
シン２００Ｉ１ｇを加え、水で合計２０００　ｗ＋Ｉと
する。以下これをＯＦ培地という。

準胎児牛血清及び熱非働化馬血清を、夫々５％濃度とな
るようにＯＦ培地に添加し、この培地を用いてＰＣ１２
℃ｍ胞を２Ｘ　１０４　ｃｅｌｌ／＋ｇｌになるように
希釈し、これを予めコラーゲンでコートした２４穴のウ
ェルに入れる。このウェルに、ヒトβ−ＮＧＦを含む前
記の濃縮上清を加え、５％ＣＯ２を含むインキュヘタ−
中で３〜５日間培養して顕微鏡で観察したところ、明ら
かな神経突起の伸長が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々プラスミドｐＲＥ１０７８及出
願人　工業技術院長　飯　塚　幸 茅 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）サッカロマイセスセレビシエのαフエロモン遺伝
   子ＭＦα１のリーダー配列の直後に、下記の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で示される合成ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を含有するプラス
   ミドでサッカロマイセスセレビシエを形質転換し、得ら
   れた形質転換株を培養してヒトβ−ＮＧＦを分泌させる
   ことを特徴とするヒトβ−ＮＧＦの発現法。