DK161836B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af interferon-gamma-polypeptid, en dna-sekvens, som koder derfor, plasmid indeholdende dna-sekvensen og en mikroorganisme som indeholder plasmidet - Google Patents

Description

DK 161836 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af interferon-^ [IFN-Y], en DNA-sekvens, som koder for IFN-& og et rekombinant plasmid indeholdende DNA-sekvensen. DNA-sekvénsen koder også 5 for biologisk aktivt IFN-^. Den foreliggende opfindelse angår også en mikroorganisme indeholdende det rekombinante plasmid.

Interferoner (i det følgende benævnt som IFN) er proteiner (hvoraf nogle er på glycosyleret form) med antiviral 10 aktivitet opdaget oprindeligt af Isaacs og Lindenmann i 1957. Det er kendt, at mindst tre typer IFN dannes, nemlig IFN-a, IFN-β og IFN-^. Efterfølgende studier har indikeret antitumor aktivitet for stofferne foruden den antivirale aktivitet, og derfor ventes en bred kli-15 nisk anvendelse af disse stoffer. Det er f.eks. rapporte ret, at IFN kan være effektiv over for forskellige virale lidelser og maligne tumorer.

På grund af dets artsspecificitet kan imidlertid kun IFN af human oprindelse anvendes på mennesker. Anvendelsen 20 af IFN har været helt begrænset på grund af vanskeligheder ved masseproduktion. Først for nylig er rekombinant-DNA-teknologien blevet anvendt til fremstilling af IFN-a og IFN-β ved hjælp af mikroorganismer, såsom Escherichia coli og Saccharomyces cerevisiae. Af samme grunde er 25 der også et behov for udvikling af teknologi til fremstilling af humant IFN-V.

Dertil er en hidtil ukendt DNA og et hidtil ukendt rekombinant plasmid blevet udviklet til fremstilling af humant IFN-Ymed lethed og i store mængder.

30 Det er blevet rapporteret, at IFN-Y kan have kraftigere antitumor aktivitet end andre interferoner [Proc. Natl.

DK 161836 B

2

Acad. Sci., USA, 77, 5928-5932 (1980)]. For nylig er kloning såvel som udtrykkelse af en IFN-OJ cDNA i Esche- j richia coli såvel som nucleotidsekvensen for cDNA'en beskrevet af Gray et al., Nature, 295, 503-508 (1982) 5 og Derynck et al., Nucleic Acids Research, bind. 10, nr. 12 (1982), 3605-3615. Derynck et al. har konstrueret adskillige IFN-}( cDNA kloner og fundet, at kun en klon p69 har. en Gin ved aminosyrestilling nr, 140 (Gray), og de øvrige fem kloner p52, p67, p72, pl2S 8 og pS12-10 10 har en Arg i denne stilling. De konkluderer, at en trans- kriptionsfej1 er sket under in vitro cDNA-syntesen, som gav p69, specielt da Arg i stilling 140 også findes i sekvensen for det kromosomale gen for IFN-& .

Det tekniske problem, der ligger til grund for den fore- 15 liggende opfindelse, er at tilvejebringe en DNA-sekvens, der koder for et hidtil ukendt IFN-^ -polypeptid, som 9 */ er forskelligt fra det kendte Lys -IFN-o -polypep.tid ved en enkelt aminosyre, nemlig Gln^-IFN-^ . Et yderligere teknisk problem er at tilvejebringe en rekom-20 binant DNA, der inkluderer DNA-sekvensen kodende for det hidtil ukendte IFN-Jf -polypeptid, en Escherichia coli mikroorganisme indeholdende denne rekombinante DNA, en fremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte IFN-lT -polypeptid under anvendelse af Escherichia 25 coli mikroorganismen og endelig at tilvejebringe det hidtil ukendte IFN-^ -polypeptid. Løsningen af disse tekniske problemer fremgår af den efterfølgende beskrivelse .

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse frem-30 stilles en DNA, som udviser komplementaritet over for human IFN-KmRNA, under anvendelse af human IFN-}CmRNA som skabelon, og der fremstilles et hidtil ukendt rekom-binant plasmid indeholdende DNA'en. Desuden kan det rekombinante plasmid indsættes i en værtsmikroorganisme.

DK 161836B

3 DNA'en og det rekombinante plasmid kan bl.a. anvendes til forstærkning af det humane IFN-^ gen i bakterier, såsom Escherichia coli. Sådanne bakterier vil være nyttige til fremstillingen af humant IFN-J{ i store mængder 5 med lav omkostning.

DNA'en og det rekombinante plasmid ifølge opfindelsen fremstilles efter følgende almene procedure.

Først ekstraheres cytoplasmisk RNA fra humane mononucleære celler induceret med et T-cellemitogen, såsom phytohæmag-10 glutinin, concanavalin A (Con A) i nærværelse af en phorbolester, såsom 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat, mezerein eller dermed beslægtede forbindelser. Alternativt kan RNA'en isoleres fra humane T-celler eller humane T-cellelinier fra thymus, lymphoblaster og perifere 15 blodceller induceret med andre inducere, såsom Staphylococ- enterotoxin A (SEA) eller B (SEB) eller deacetylthymosin a.

Fra denne RNA isoleres den humane IFN-Ji mRNA med poly A (polyadenylsyre). Der syntetiseres en dobbeltstrenget 20 DNA, f.eks. ved revers transcriptase, med mRNA-præparatet med høj IFN —^ mRNA-aktivitet som skabelon. En rekombinant opnås ved at indsætte den syntetiserede DNA i en vek-tor-DNA, såsom Escherichia coli plasmid-DNA, ved in vitro DNA-rekombinationsteknikken. Rekombinante plasmider 25 med den indsatte DNA, som udviser komplementaritet over for human IFN-$ mRNA, udvælges.

På tegningen viser fig. 1 et restriktionsendonucleasespaltningskort for p!FN-^-G4 cDNA. cDNA af P69 rapporteret af Gray et al.

30 er også vist til sammenligning, j 4

DK 161836 B

fig. 2 viser den fuldstændige nucleotidsekvens af cDNA fra pIFN-lf-G4, og fig. 3 viser konstruktionen af plasmidet pHG)fG4, som anvendes til udtrykkeisen af cDNA i abeceller.

5 Humane mononucleære celler isoleres fra lymphocytrige "blodpladerester" ved centrifugering ved 400 x g i 30 minutter på en Ficol/Hypaque gradient. Cellerne behandles med 5 ng/ml af en phorbolester, såsom 12-0-tetrade-canoylphorbol-13-acetat i 2 timer. Derpå tilsættes et 10 T-cellemitogen, såom PHA (5 ^im/ml) eller Con A eller lignende, og blandingen holdes ved 37 °C i 20-40 timer.

Cellerne opsamles og sprænges, og kernerne fjernes.

Hele cytoplasmiske RNA'er ekstraheres med f.eks. phenol.

Alternativt sprænges cellerne, og både DNA'er og RNA'er 15 ekstraheres med f.eks. phenol. DNA'erne dekomponeres med DNAase og fjernes efter ekstraktionen af RNA'erne.

De således ekstraherede RNA'er opløses i en saltopløsning af NaCl eller KC1 i høj koncentration, såsom 0,5 M, og anbringes på en søjle af oligocellulose (dT) til 20 adsorption af mRNA med poly(A) på søjlen. Eluering sker med vand, en saltopløsning ved lav koncentration, såsom 10 mM Tris-HCl-puffer eller lignende, til isolering af mRNA med poly(A).

Den isolerede mRNA fraktioneres ved saccharosemassefylde-25 gradientcentrifugering. IFN-mRNA aktivitet i hver frak tion kontrolleres ved at bestemme interferonaktivitet (antiviral aktivitet) af det protein, som syntetiseres i oocytter fra afrikansk frø (Xenopus laevis) efter mikroinjicering af en del af mRNA'en i hver fraktion.

30 Bestemmelsen af IFN-aktiviteten udføres efter den metode,

DK 161836 B

5 der er beskrevet i Japan J. Microbiol. ]J3, 449-456, (1974).

Dernæst syntetiseres en DNA, der udviser komplementaritet over for mRNA'en, in vitro ved revers transcrip-5 tase, som opnås fra avian myeloblastosis virus (AMI/), under anvendelse af en mRNA, der har den højeste inter-feron-mRNA-aktivitet, som skabelon.

Syntesen udføres som følger.

En mRNA reagerer ved en passende temperatur (f.eks.

10 41 °C) i et passende tidsrum (f.eks. 90 minutter) med oligo(dT), MgC^ (f.eks. 5 mM), NaCl (f.eks. 30 mM), mercaptoethanol (f.eks. 5 mM) og Tris-HCl-puffer (f.eks. pH 8,0, 40 mM) under anvendelse af en revers transcriptase sammen med deoxyadenosintriphosphat (dATP), deoxy-15 thymidintriphosphat (sTTP), deoxyguanosintriphosphat (dGTP) og deoxycytidintriphosphat (dCTP) (f.eks. 0,5 mM) som substrat.

Det således opnåede reaktionsprodukt underkastes deprote-inisering med f.eks. phenol, og skabelon-RNA'en fjernes 20 ved alkalibehandling eller ribonucleasebehandling.

Dobbeltstrenget cDNA syntetiseres ved revers transcriptase på lignende måde som syntesen af den første streng (dvs. enkeltstrenget cDNA) som beskrevet i det foregående, med den undtagelse, at mRNA og oligo(dT) ikke er til 25 stede. Ued at anvende Escherichia coli DNA polymerase I i stedet for revers transcriptase kan det dobbeltstrengede cDNA også syntetiseres. Den cDNA, som syntetiseres ved den i det foregående beskrevne procedure, behandles med nuclease S^, som kan opnås fra Aspergillus 30 oryzae i nærværelse af ZnC^ (f.eks. 1 mM), natriumacetatpuffer (f.eks. 0,1 M, pH 4,5), NaCl (f.eks. 0,2 M), i

DK 161836 B

etc.

Alternativt kan dobbeltstrenget cDNA syntetiseres som beskrevet af Land et al., [Nucleic Acids Res. 9_, p.

2251-2266 (1981)]. Den enkeltstrengede cDNA behandles 5 med terminal transferase med dCTP som substrat til til- føring af deoxycytidylrester ved 3'-enden af cDNA'en.

Efter deproteinisering inkuberes den forlængede cDNA med oligo(dG)^2 ^8’ revers transcriptase, dATP, dGTP, dCTP og dTTP til syntetisering af den anden streng.

10 Revers transcriptase kan erstattes af DNA-polymerase I i denne reaktion-.

På denne DNA forlænges deoxycytidylrester ved begge 3'ender af den syntetiserede DNA ved inkubering med en terminal transferase oprenset fra kalvethymus i nær-15 værelse af kaliumcacodylatpuffer (f.eks. pH 7,6, 0,14 M), Tris (base) (f.eks. 0,03 M), dithiothreito1 (f.eks.

0,1 mM), CoCl2 (f.eks. 1 mM) og dCTP (f.eks. 1 mM) ved en passende temperatur (f.eks. 37 °C) i et passende tidsrum (f.eks. 20 minutter).

20 På den anden side anvendes en plasmid DNA, som anvendes som en vektor-DNA, f.eks. Escherichia coli plasmid pBR322DNA [Gene vol. 2, p. 95-113 (1977)] eller derivater deraf. Den dobbeltstrengede DNA indsættes på et restriktionssted i plasmidet. F.eks. behandles p321, 25 opnået fra P. Berg, Stanford University, som er et derivat af pBR322 [Okayama & Berg; Molecular and Cellular Biology, bind 2, p. 161-170 (1982)] med Kpnl [Klebsiella pneumoniae, Takara Shuzo Co.) i en egnet opløsning, f.eks, Tris-HCl-puffer (f.eks. pH 7,5, 6 mM), MgCl^ (f.eks.

30 6 mM), NaCl (f.eks. 6 mM), 2-mercaptoethanol (f.eks.

6 mM) og 0,02% bovin serumalbumin til skæring af et KpnI-sted i p321. Derefter forlænges deoxyguanylrester ved begge 3'-ender på samme måde som beskrevet i det

DK 161836 B

7 foregående for syntese af dobbeltstrenget DNA ved anvendelse af dGTP i stedet for dCTP som substrat for den terminale transferase.

Syntetisk dobbeltstrenget DNA og plasmid DNA, som er 5 kæde forlænget ved begge 3'-ender som beskrevet i det foregående, inkuberes ved en passende temperatur i et passende tidsrum med Tris-HC1-puffer (f.eks. pH 7,5, 50 mM), NaCl (f.eks. 0,1 M), EDTA (f.eks. 5 mM) eller lignende til dannelse af hybride plasmider [Taniguchi 10 et al, Nature bind 274, p. 223-228 (1978)]. Derpå transformeres en transformabel Escherichia coli stamme, f.eks. Escherichia coli X1776 (Molecular Cloning of Recombinant DNA, Scott, W. A. & Werner, R., udgivere, Academic Press p. 99-114, 1977) med de hybride plasmider ved fremgangs-15 måden ifølge Enea et al. (J. Mol. Biol., bind 96, p.

495509, 1975) eller lignende.

I det således opnåede hidtil ukendte rekombinante plasmid DNA eksisterer der et vektor-DNA-gen, f.eks. β-lac-tamase (enzym, der nedbryder ampicillin) gen afledt 20 fra Escherichia coli plasmid pBR322. Derfor udviser den transformerede Escherichia coli resistens over for ampicillin. Den følgende teknik anvendes almindeligvis til at opsamle en stamme med en hidtil ukendt rekombinant plasmid-DNA indeholdende et gen, som viser komplemen-25 taritet over for human IFN mRNA blandt disse ampicil- linresistente (ApR) stammer.

32 Først syntetiseres [ P]-mærket DNA med RNA med IFN-mRNA aktivitet som beskrevet i det foregående som skabelon, og DNA'en hybridiseres med mRNA ekstraheret uden 30 indføring af PHA (derfor induceres ikke IFN-mRNA synte se), ud fra humane mononucleære celler ved inkubering ved en høj temperatur (f.eks. 65 °C) i en reaktionsblanding indeholdende f.eks. NaCl (f.eks. 0,5 M). Derpå

DK 161836 B

8 adskilles den hybridiserede DNA (probe A) og den ikke-hybridiserede DNA (probe B) ved hydroxyapatit-søjle-chromatografi. Dernæst hybridiseres filter-fikserede DNA'er fra transformanter separat med probe B eller 5 probe A efter teknikken udviklet af Grunstein-Hogness (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, bind 72, p. 3961-3965, 1975), og stammer med en DNA hybridiserbar med probe A, men ikke eller næsten ikke med probe A skelnes ved autoradiografi.

10 Derefter isoleres plasmid DNA fra hver af de udskilte stammer og hybridiseres med mRNA med IFN-mRNA aktivitet ved inkubering ved en høj temperatur (f.eks. 53 °C) i nærværelse af 80 % (vægt/volumen) formamid, 0,4 M NaCl, etc. Da mRNA'en hybridiseret med cDNA-del af plas-15 mid DNA fra den i det foregående beskrevne stamme kan holdes tilbage på et nitrocellulosefilter, hvorimod uhybridiseret mRNA ikke kan under visse betingelser (dér henvises til eksemplet i det følgende og Nygaard, A. P. & Hall, B. D., Biochem. Biophys. Res. Commun.

20 bind 12, p. 98- 104, 1963), kan denne mRNA udvindes selektivt fra filteret ved høj temperatur (f.eks. 60 °C) i en opløsning såsom 90% (vol./vol.) formamid og derefter indsprøjtes i oocytter fra Xenopus laevis.

Når interferon er syntetiseret i oocytterne, må den 25 til hybridiseringen anvendte DNA indeholde en DNA, som er komplementær til interferon mRNA, og ved denne metode kan en rekombinant plasmid DNA med et gen, der udviser komplementaritet over for den humane IFN-1^ mRNA, isoleres.

Alternativt syntetiseres en del af den kendte DNA-frekvens, 30 som koder for IFN-^, og anvendes som probe ved screenin gen. Probe-DNA'en syntetiseres ved en konventionel tries-termetode [JACS, 97_, 7327 (1975)], og afprøvningen udføres ved in situ hybridisering i alt væsentligt som beskrevet

DK 161836B

9 i det foregående.

Den klonede cDNA kan let udtrykkes i f.eks. dyrkede abeceller, såsom COS-7 celler. [Gulzman, Cell, 23, 175, (1981)].

5 De hidtil ukendte rekombinante plasmider ifølge opfindel sen anvendes til masseproduktion af INF-tf med en mikroorganisme, såsom Escherichia coli, eller eukaryote celler.

En specifik udførelsesform for den foreliggende opfin-10 delse er forklaret nærmere i det efterfølgende repræ sentative eksempel.

EKSEMPEL

(1) Fremstilling af en mRNA fra lymphocytter, fremstilling af DNA-sekvens og plasmid, som udtrykker IFN-X : 15 Humane mononucleære celler isoleres fra lymphocytrige blodpladerester [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. J3. (6), 3469-3472 (1981)] ved Ficoll/Hypaque-massefyldegradient-centrifugering ved 400 x g. 6 x 10^/ml mononucleære celler behandles med 5 ng/ml 12-0-tetradecanoylphorbol-20 13-acetat (TPA) opnået fra Consolidated Midland i RPMI 1640 medium uden serum (produkt fra GIBC0) i 2 timer.

Derpå tilsættes 5^ug/ml renset phytohæmagglutinin (PHA).

Efter 20 - 40 timers forløb ved 37 °C udvindes cellerne med en gummiskraber (policeman) i en fysiologisk salt- 9 25 vandsopløsning pufret med natriumphosphat. Ca. 4 x 10 celler pelleteres under centrifugering ved 800 x g i 5 minutter og resuspenderes i en fysiologisk saltvandsopløsning pufret med natriumphosphat. Derpå dispergeres suspensionen i 80 ml af en blanding af 10 mM iskølet 30 Tris-HCl (pH 7,5) indeholdende 10 mM ribonucleotid/vana-

DK 161836 B

10 dyl-kompleks [S.L. Berger and C. S. Birkenmeier, Biochemistry ]J3, 5143-5149 (1979)], 10 mM NaCl og 1,5 mM MgCl^ , i 150 ml Corexrør. Nonidet P-40 (forhandlet af SIGMA, USA) sættes til en endelig koncentration på 0,3 % (vol/-5 vol), og blandingen centrifugeres i en Sorvall GS rotor ved 300 omdr./min. i 5 minutter til fjernelse af kerner. Den overliggende væske anbringes i et Corexrør indeholdende 4 ml 10 %'s natriumdodecylphosphat, 4 ml 2 M Tris-HCl (pH 9,0) og 2 ml 0,25 M EDTA og underkas-10 tes straks ekstraktion med phenol. Ekstraktionen gen tages 2 gange, og RNA udfældes med ethanol. 250 mg af den således opnåede RNA opløses i 10 ml 1 mM EDTA. Efter inkubering ved 65 °C i 2 minutter sættes 2,5 ml af en saltopløsning ved høj koncentration [0,5 M Tris-15 HC1 (pH 7,5), 1 M NaCl, 50 mM EDTA] til opløsningen. !

Blandingen underkastes oligo-dT-cellulose-søjlechroma-tografi (P-L Biochemicals) . Adsorberede mRNA'er med poly A elueres med en saltopløsning ved lav koncentration [10 mM Tris-HCl, (pH 7,5)] eller med vand til op-20 nåelse af 250^-ug mRNA med poly A.

(2) Fraktionering af mRNA ved saccharosemassefyldegradi-entcentrifugering: mRNA udfældes med ethanol og opløses i 0,5 ml 1 mM EDTA.

Efter opvarmning ved 70 °C i 2 minutter centrifugeres 25 opløsningen ved 26.000 omdr./min. og 4 °C i 19 timer i Hitachi PRS 40 Ti rotoren i 5 - 25%'s saccharosemassefy Idegradient fremstillet i en opløsning af 50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA. Ribosomal RNA centrifugeres med et andet rør til anvendelse af størrelses-30 markør. Det første udvindes i 15 fraktioner, og IFN-)^ mRNA aktivitet måles i en del af fraktionerne. Resultaterne er vist i tabel 1. Den største I FN — mRNA aktivitet findes i fraktion nr. 8.

11

DK 161 836B

TABEL 1

Delvis rensning af humant IFN-'Γ mRNA ved saccharosegra-dientcentri fugering IFN aktivitet fra Xenopus laevis oocytter, hvori ,- ... „ mRNA fra hver fraktion blev

Fraktion nr. ... . , , . , injiceret (enheder/ml) 1 N.D.

2 N.D.

3 N.D.

4 N.D.

3 N.D.

6 <10 7 250 8 1250 9 80 10 < 10 11 < 10 12 < 10 13 N.D.

14 N.D.

15 N.D.

N. D. ikke bestemt 5 (3) Fremstilling af cDNA og dsDNA: I dette trin inkuberes 14,4^ug mRNA i fraktion nr. 8 ved 37 °C 1 time i en reaktionsopløsning indeholdende O, 5 mM af hvert af stofferne dATP, dGTP, dTTP og dCTP, lyug oligo(dT), 8 enheder AMV-transcriptase (produkt 10 fra Bethesda Research Lab.), 5 mM MgC^» 30 mM NaCl,

DK 161836B

12 5 mM mercaptoethanol og 40 mM Tris-HCl (pH &,£}, cDNA-komplementaritet til mRNA dannes i opløsningen. Protein fjernes med phenol, og RNA fjernes ved behandling ved 37 °C i 15 timer med 0,3 N NaOH.

5 Derpå behandles cDNA'en ved 37 °C i Z0 minutter med 2 enheder terminal transferase (produkt fra Bethesda Research Lab.) i 30^ul reaktionsopløsning (2,65^,ug DNA, 0,14 M kaliumcacodylat, 30 mM Tris, 1 mM dCTP, 0,1 mM dithiothreitol, 1 mM CoCl^j pH 7,6) for at addere ca.

10 23 deoxycytidylrester til enden af cDNA'en. 3^ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) tilsættes for at stoppe reaktionen, og protein fjernes med phenol. Vandlag samles og DNA'er udvindes ved tilsætning af ethanol. 2,32^ug af den således udvundne DNA behandles ved 37 °C i 1 time med revers 15 transcriptase-reaktionsopløsningen som nævnt i det fore gående med den undtagelse, at oligo(dT) er erstattet med l^ug oligo(dG)^2 (Collaborative Research Inc.) til opnåelse af 4,24^ug dobbeltstrenget DNA (dsDNA).

Derpå behandles l,78^ug af dsDNA'en ved 37 °C i 20 minut-20 ter med 1 enhed terminal transferase i ZO^ul reakti onsopløsning [l,78^ug dsDNA, 0,14 M kaliumcacodylat (pH 7,6), 0,03 M Tris-HCl, 0,1 mM dithiothreitol, 1 mM CoCl^j 1 mM dCTP] for at addere ca. 31 deoxycytidy1-rester til begge 3'-ender i dsDNA'en.

25 (4) Kloning af dsDNA: I dette trin behandles 15,6^ug plasmid p321 ved 37 °C i 1 time med Kpn (Klebsiella pneumoniae 0K8, produkt fra Takara Shuzo Co.) i 100^-ul reaktionsopløsning [6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 6 mM 2-mer-30 captoethanol, 0,02% bovin serumalbumin] for at skære et Kpn-sted i plasmid p321. Det skårne plasmid p321 behandles ved 37 °C i 20 minutter med 2 enheder terminal

DK 161836 B

13 transferase (produkt fra Bethesda Research Lab.) i 100 jjl reaktionsopløsning [15,6 μ g DNA, 0,14 M kaliurnea-codylat, 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM dOTP, 0,1 mM dithiothreitol, 1 mM CoC^] for at addere ca. 35 deoxy-5 guaniner til begge 3'-ender i p321 DNA.

Derpå inkuberes 80 ng af den således opnåede plasmid-DNA og 30 ng af den i trin (3) opnåede dsDNA ved 65 °C i 2 minutter, ved 46 °C i 120 minutter, ved 37 °C i 60 minutter og ved stuetemperatur i 60 minutter i 10 en opløsning bestående af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl og 1 mM EDTA til hybridisering af begge DNA'er. Escherichia coli X1776 (ATCC 31244) transformeres med den hybride DNA ved metoden af Enea et al. [J. Mol.

Biol., J36, 495-509 (1975)]. Der isoleres ca. 5.500 am-15 picillinresistente stammer (ApR). 3.200 af disse stammer udvælges, og DNA'en for hver stamme fikseres på nitrocellulosefiltre i duplikat. Derpå udvælges 6 stammer, som ved 37 °C hybridiserer stærkt til en probe-oligode-oxynucleotid mærket med ^P0^--, "^P-TGCCAGGACCCATA, 20 [Grundstein-Hogness metode, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 3961 (1975)].

De således opnåede 6 stammer underkastes samme sorteringsmetode som i det foregående ved 44 °C til opnåelse af stærkt hybridiseret plasmid, som kaldes pIFNf-G4.

25 (5) Nucleotidsekvens for plasmidet, pIFNY-G4: cDNA-indsættelsen i plasmidet pIFN -G4 opnået i det foregående nedbrydes af forskellige restriktionsendo-nucleaser, og dets spaltningskort er vist på fig. 1. Restriktionsenzymspaltningskortet for cDNA'en fra plasmid 30 P69 rapporteret af Gray et al. [Nature, 295, 503 (1982)] er også vist på fig. 1 til sammenligning. En bemærkelsesværdig forskel i disse to cDNA kloner er tilstedeværel

DK 161836 B

14 sen af et yderligere Rsa I [produkt fra New England Biolabs. U.S.A.] sted i klonen pIFN V^-g4, som ikke findes i cDNA klonen p69 rapporteret af Gray et al.

Dernæst bestemmes hele nucleotidfrekvensen for DNA’en, 5 som sandsynligvis har nucleotidsekvensdivergens, efter Maxam-Gilbert-metoden (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.

74, 560 - 564 (1977)). Sekvensen fremgår af fig. 2.

Den del af frekvensen, som svarer til den rapporterede N-terminalregion i humant IFN^ (Gray et al., Nature, 10 295, 503 (1982)) er vist i det følgende.

pIFNV'-G4

BstNI Rsal TGC (J^G GAC CCA TAT gJa CAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT Cys Gin Asp Pro Tyr Val Gin Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 15 En cDNA klon for humant IFN-Tf rapporteret i Nature 295, 503 (1982) har følgende nucleotidsekvens, som svarer til den i det foregående anførte sekvens for pIFNjf-G4.

BstNI

—TGC (JAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT— 20 Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 5 10 15 cDNA-frekvensen for plasmidet pIFNtf-G4 afviger således fra den rapporterede IFN-^cDNA ved to nucleotider (vist ved pile i fig. 2) resulterende i en aminosyreudskift-25 ning (Lys Gin) i IFN-Y-polypeptider. Den udskiftede aminosyre er indrammet på fig. 2.

For at vise, at den hidtil ukendte cDNA koder for biologisk aktivt humant IFN -V, blev cDNA1en spaltet med Sau3A (produkt fra Takara Shuzo Co., Ltd.), og den DNA, som 30 omfatter hele kodningsregionen for IFN-YmRNA blev indført i et plasmid pKCR (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad.

DK 161836 B

15

Sci., U.S.A., 78, 1527 (1981) som vist på fig. 3. cDNA kobles i nedstrøms retning fra den tidlige S\/—4□ promotor til konstruktion af plasmid pHG$G4A.

Plasmid-DNA'en, pHG^g4A, blev transficeret over i COS-7 5 celler ved proceduren ifølge McCutchan og Pagano, J.

Natl. Cancer Inst., 41, 351 (1968). 72 Timer efter trans-ficering blev interferon-aktiviteten i dyrkningsmediet bestemt, og resultaterne er fremsat i tabel 2 i det følgende. Som vist i tabel 2 var der i mediet produceret 10 aktivitetsegenskaber for humant IFN-K, hvilket viser, at cDNA'en i det nye rekombinante plasmid, pIFNV-G4, koder for humant IFN-}(.

TABEL 2 IFN-aktivitet

Prøve humant ^(-IFN-antiserum (enheder/ml) 15 nativt humanttf-IFN - 256 » + 4 COS-7 cellekulturvæske efter trans- fektion med pHGtG4 - 32 " + 4 20 Plasmid, pIFNf-G4, blev deponeret i American Type Cultu re Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. under tilgængelighedsnummeret Escherichia coli IG-G4 ATCC 39123.

De efterfølgende eksperimenter viser, at IFN-V ifølge opfindelsen har uventet nyttig virkning i forhold til 25 kendt IFN-tf .

DK 161836B

16 EKSPERIMENT 1

Aktivitet af interferon-^ i serum

Aktiviteter af interferon-X ifølge opfindelsen (i det 9 5 følgende benævnt Gin -IFN-^) og det, der er beskrevet 9 .

i den kendte teknik (i det følgende benævnt Lys -1FN-4 ) i serum blev undersøgt på følgende måde.

10 ul af en opløsning indeholdende 100 ug/ml IFN-^(Gln9!-

* Q

IFN-K eller Lys -IFN-tf) og 490 μΐ humant serum blev 10 blandet, og blandingen blev holdt ved 37 °C i 24 timer.

Blandingen blev fortyndet 50 gange med MEMmedium indeholdende 5 % bovin serumalbumin, og IFN-Jf aktivitet (antiviral aktivitet) blev bestemt ved metoden af Armstrong [Armstrong 0. A., et al.: Appl. Microbiol, 21_, 723-725 15 (1971)]. Som kontrol blev opløsningen indeholdende IFN-X

holdt ved 4 °C i 24 timer og underkastet undersøgelsen. Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel.

Gln9-IFN-X Lys9-IFN-V

Antiviral Aktivitets- Antiviral Aktivitets- aktivitet forhold aktivitet forhold (U/ml) (U/ml) gennemsnit gennemsnit

Kontrol 200,0*1 193,3*1 158.0169.3 1,00 201,8 212,1 1,00 149,9j 241,2j

Test 284,0*1 205, tT

248.3 254,4 1,50 234,0 222,8 1,05 230,9J 228,8j

DK 161836 B

17 EKSPERIMENT 2

Aktivering af IFN-j^ ved behandling med trypsin 45 μ af henholdsvis 50 jjg/ml Gln^-IFN-)^ og 50 jjg/ml 9 i

Lys -IFN-5 blev sat til 3 μ af en trypsinopløsning 5 (produkt fra Worthington) til dannelse af blandinger indeholdende trypsin og IFN —>C i vægtforhold på 1:50, 1:100, 1:200 og 1:400. Blandingen blev inkuberet ved 5 °C i 60 minutter. 20 μ af blandingen blev sat til 980 μ MEM-medium indeholdende trypsininhibitor (produkt 10 fra Sigma) for at standse reaktionen. Antiviral aktivitet af reaktionsblandingen blev bestemt på samme måde som i eksperiment 1. Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel.

DK 161836 B

18 «

Gln9-IFN-]^ Lys9-INF-Y^

Forhold Antiviral Aktivitets- Antiviral Aktivitets- trypsin: aktivitet forhold aktivitet forhold INF-Y (U/ml) (U/ml) gennemsnit gennemsnit - --- - -;-1—'

Kontrol 651,07 747,66 539,13 605,8 1,00 599,04 613,4 1,00 627,10] 493,50 i 1:50 263,37 604,31 318,56 292,8 0,48 528,99 603,4 0,98 296,53 676,89 1 i 1:100 1059,30 633,76 843,73 887,7 1,46 684,30 688,7 1,12 760,2lJ 748,04j 1:200 1404,19] 1271,8 ] 1388,89 1326,0 2,18 1214,5 1240,6 2,02

1184,88j 1235,6 J

1:400 1708,7o] 1004,08] 1448,74 1553,1 2,56 1566,84 1309,2 2,13 1501,81 1356,62 /

Claims (7)

1. Analogi fremgangsmåde til fremstilling af interferon-X-polypeptid med den peptidsekvens, der er vist på fig. 2, kendetegnet ved, at man dyrker en mikroorganisme indeholdende den rekombinante DNA som 5 defineret i krav 3 i et næringsmedium, akkumulerer in terferon-)^ -polypeptid i mediet og udvinder polypeptidet derfra.

2. DNA, som koder for interferon-X -polypeptidet som defineret i krav 1.

3. Rekombinant DNA indeholdende den i krav 2 definerede DNA.

4. Rekombinant DNA ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er plasmid pIFNV'-GA.

5. Mikroorganisme indeholdende den rekombinante DNA 15 som defineret i krav 3.

6. Mikroorganisme indeholdende den rekombinante DNA som defineret i krav 4.

7. Mikroorganisme ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at mikroorganismen er en Escherichia 20 coli.