WO2023080578A1 - 상처 치료 및 항염증 활성을 가지는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

상처 치료 및 항염증 활성을 가지는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023080578A1
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wound healing
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peptide
inflammatory
dualpep
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박찬호
조성민
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a peptide exhibiting wound healing and anti-inflammatory activity and a pharmaceutical composition containing the peptide, which exhibits very excellent efficacy in treating, preventing or improving a disease or condition requiring inflammation inhibition and cell proliferation, and is used as a medicine, It can be applied to quasi-drugs, medical devices, functional foods and cosmetics.
  • Infection by external infectious agents such as bacteria, fungi, viruses, and various types of allergens, frostbite, burns, wounds, surgery, mechanical stimulation, electrical stimulation, or a disease in the human body caused by chemicals is called "inflammation”.
  • Inflammatory response is a non-specific immune response that causes symptoms such as fever, swelling, and pain when a pathogen invades due to damage to the skin or mucous membrane.
  • the inflammatory response is a non-specific phenomenon and is an immediate defense against the invasion of pathogens, and serves to prevent the spread of infection and remove damaged cells.
  • T lymphocytes When macrophages in damaged tissues secrete cytokines, T lymphocytes are activated, and when mast cells, a type of white blood cell, secrete histamine, they initiate internal defenses and induce inflammation in infected tissues. Therefore, when the skin is damaged, the blood vessels dilate, the skin surface becomes red, fever appears, and the permeability of the blood vessel wall increases. As a result, leukocytes and macrophages that perform phagocytosis easily move to the wound site and remove pathogens. Along with this, swelling, pain, and fever appear. The heat formed by the inflammatory reaction promotes the regeneration process and inhibits the proliferation of pathogens.
  • cytokine cytokine
  • chemokine chemokine
  • interleukine interleukine
  • interferon a mediator that increases permeability due to vasodilation.
  • Antibodies, plasma, and phagocytic cells are concentrated in the inflammatory region.
  • anti-inflammatory drugs of steroid and non-steroidal systems are widely used for purposes such as relieving inflammation, soothing skin, and alleviating atopy.
  • use of conventional anti-inflammatory agents is limited due to human safety and side effects, and the effect is insignificant, so that the anti-inflammatory effect cannot be substantially expected.
  • Wound healing occurs as a result of the interaction of various immunological and biological systems, and in general, the four stages of hemostasis, inflammation, proliferation, and remodeling occur sequentially and sequentially.
  • an object of the present invention is to provide a novel wound healing and anti-inflammatory peptide that is safe, stable, and applicable to cosmetics and pharmaceuticals.
  • Another object of the present invention is to provide cosmetics, pharmaceuticals, medical devices, foods, etc. containing wound healing and anti-inflammatory components.
  • a peptide consisting of 17 amino acids of KKPERRPRGRRRGRKCG (SEQ ID NO: 10) derived from human MRPL15 protein (hereinafter referred to as "Dualpep R1-9") or terminal deletion peptides and mutant peptides in which some amino acids were deleted, substituted or added showed low cytotoxicity and significantly reduced the cellular inflammatory response induced by polysaccharides, as well as , it was found that the wound healing effect was also shown.
  • the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention exhibited low cytotoxicity and significantly reduced the cellular inflammatory response induced by polysaccharide, and also exhibited wound healing efficacy.
  • the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention exhibited a whitening effect and a whitening synergistic effect.
  • Figure 1a is the result of measuring IL-6, an inflammatory response substance, by treating immune cells RAW264.7 with the peptide of the present invention at each concentration.
  • Figure 1b is a result of confirming whether cell death is induced by concentration using HaCaT skin cells.
  • Figure 2 shows the results of confirming the anti-inflammatory efficacy of the peptides of the present invention.
  • Figure 3a is a result of confirming the wound healing efficacy using skin cells, and is an image of the wound healing effect over time through the wound efficacy test of the peptide of the present invention.
  • Figure 3b is a graph of the degree of closure of the wound in Figure 3a.
  • Figure 4a Figure 4b is Dualpep R1 variant SEQ No. It is a graph showing the regeneration efficiency of 1-16.
  • amino acid and amino acid residue refer to natural amino acids, non-natural amino acids or modified amino acids. Unless otherwise stated, all references to amino acids, either generically or specifically by designation, include reference to both the D and L stereoisomers (where the structure permits such stereoisomeric forms).
  • Natural amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) and Valine (Val) is included.
  • Non-natural amino acids include modified amino acid residues that have been chemically modified on the N-terminal amino group or side chain group, or reversibly or irreversibly chemically blocked, such as N-methylated D and L amino acids or side chain functionalities that have been chemically modified with another functional group. residues are included.
  • “conservative substitution” refers to a modification of a cargo molecule transport domain that includes substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not cause loss of biological or biochemical functions of the cargo molecule transport domain. it means.
  • a “conservative amino acid substitution” herein is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and are well known. These classes include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g. glycine).
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acids with beta-branched side chains e.g threonine, valine, isoleucine
  • amino acids with aromatic side chains e.g tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • inflammation is caused by infection by external infectious agents such as bacteria, fungi, viruses, various types of allergens, frostbite, burns, wounds, surgery, mechanical stimulation, electrical stimulation, or chemicals.
  • external infectious agents such as bacteria, fungi, viruses, various types of allergens, frostbite, burns, wounds, surgery, mechanical stimulation, electrical stimulation, or chemicals.
  • diseases in the human body without limitation, acute and/or chronic inflammatory diseases and diseases accompanying inflammation, such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, colitis, cystitis, rhinitis, tonsillitis, dermatitis, inflammatory bowel disease, gastric ulcer or asthma, etc.
  • anti-inflammatory means preventing, treating or improving inflammation.
  • One aspect of the present invention is
  • Dualpep R1-9 peptide consisting of SEQ ID NO: 10 derived from human MRPL15;
  • Dualpep R1-9 consisting of 5 or more amino acids in which 1 to 11 consecutive amino acids from the N-terminus are deleted and/or 1 to 10 consecutive amino acids from the C-terminus are deleted among the Dualpep R1-9 peptides. terminal deletion peptide;
  • Dualpep R1-9 terminal addition peptide in which 1 to 2 amino acids are added to the N-terminus and/or C-terminus of the Dualpep R1-9 peptide;
  • Dualpep R1-9 peptide of 1) above, or the Dualpep R1-9 terminal deletion peptide of 2) above, or the Dualpep R1-9 terminal addition peptide of 3) above is substituted with a conservative amino acid, and/or , Dualpep R1-9 variant peptide consisting of at least 5 amino acids, in which at least 1 to 5 amino acids in the middle of the non-terminal sequence are deleted, preferably at least 1 to 2 amino acids in the middle of the sequence are deleted; and
  • a Dualpep R1-9 sequence homologous peptide consisting of at least 5 amino acids and exhibiting at least 80% sequence homology with the selected peptides of 1), 2), 3) and 4) above; It provides a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of one selected from among.
  • one aspect of the present invention provides a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, wherein the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity is a peptide consisting of 5 to 17 amino acids.
  • one aspect of the present invention provides a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, wherein the conservative amino acid substitution is that an arginine residue is substituted with a lysine residue and the lysine residue is substituted with arginine.
  • one aspect of the present invention provides a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, wherein the peptide exhibits wound healing efficacy in addition to anti-inflammatory function.
  • one aspect of the present invention is that the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity exhibits a whitening effect, and when added to a conventional whitening functional ingredient, a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, exhibiting a whitening synergistic effect provides
  • one aspect of the present invention provides a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, wherein the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity is any one of the peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16. It is apparent to those skilled in the art that the peptides exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention are not limited to the peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16.
  • one aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding a peptide exhibiting any one of the above wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • the polynucleotide encoding the peptide exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity is any one polynucleotide of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 32, a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity Provides a polynucleotide encoding a. It is apparent to those skilled in the art that the polynucleotide encoding the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention is not limited to the peptides of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 32 .
  • one aspect of the present invention provides a vector for expressing a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity, including the polynucleotide.
  • one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the inflammation is not particularly limited, but preferably, the inflammation is characterized by dermatitis including atopic dermatitis.
  • 3) provides a wound healing and inflammation-improving functional food composition
  • a vector for expressing the peptide exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity comprising a vector for expressing the peptide exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • a vector for expressing the peptides exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity to provide a medical device selected from a functional wound dressing, filler, or complex filler, including wound healing and inflammation improvement.
  • one aspect of the present invention is characterized in that two or more, preferably 2 to 10 peptides exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity are linked in succession with the same sequence or different sequences, wound healing activity and peptides exhibiting anti-inflammatory activity.
  • one aspect of the present invention includes a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity in which a functional molecule is bound to at least one of the N-terminus and C-terminus of the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity
  • a fusion compound is provided.
  • the functional molecule is a therapeutic peptide, including hormones, growth factors, neurotransmitters, and ion channel ligands, or various enzymes, including superoxide dismutase, albumin, and therapeutic proteins such as antibodies. Characterized in that, it provides a fusion compound comprising a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • one aspect of the present invention is characterized in that the functional molecule is a molecule that exhibits antioxidant function, such as peroxyredoxin, anti-inflammatory function, such as interleukin, or wound healing function, wound healing activity And it provides a fusion compound comprising a peptide exhibiting anti-inflammatory activity.
  • antioxidant function such as peroxyredoxin
  • anti-inflammatory function such as interleukin
  • wound healing function such as wound healing activity
  • fusion compound comprising a peptide exhibiting anti-inflammatory activity.
  • one aspect of the present invention is a fusion in which a functional molecule is bound to one or more of the N-terminus and C-terminus of the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity or the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating disease comprising the compound.
  • the disease may include, for example, dermatitis such as atopy, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, colitis, cystitis, rhinitis, tonsillitis, inflammatory bowel disease, gastric ulcer or asthma, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the prevention and treatment of wounds and inflammation caused by trauma such as dermatitis, particularly atopic dermatitis, skin cuts, wounds, and abrasions.
  • one aspect of the present invention is a peptide exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity or a functional molecule bound to any one or more of the N-terminus and C-terminus of the peptide exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • a cosmetic composition comprising the fusion compound is provided.
  • the cosmetic composition can relieve inflammation and treat wounds when the skin is wounded.
  • Cosmetics of the present invention may include color cosmetics such as foundation, lipstick, and eye shadow in addition to basic cosmetics such as lotion, cream, essence, water-in-water or water-in-oil emulsion, and ointment.
  • one aspect of the present invention is a peptide exhibiting at least one wound healing activity and anti-inflammatory activity, or a functional molecule at any one or more of the N-terminus and C-terminus of the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity.
  • a food composition exhibiting anti-inflammatory function and/or wound healing function comprising the fused fusion compound is provided.
  • one aspect of the present invention is a peptide exhibiting one or more wound healing activity and anti-inflammatory activity, or the N-terminus and C-terminus of the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity. It includes a fusion compound in which molecules are bonded, and provides a medical device selected from among wound dressings, fillers, and complex fillers.
  • Peptides exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity include Dualpep R1-9 peptide; and a Dualpep R1-9 terminal deletion peptide in which some consecutive amino acids are deleted from at least one of both ends as described above; and Dualpep R1-9 terminal addition peptide to which amino acids are added at at least one of both ends as described above; Dualpep R1-9 variants in which one or more amino acids are mutated due to substitution, deletion and/or addition; And homologous peptides exhibiting 80% or more homology with them and exhibiting anti-inflammatory activity; is interpreted as meaning including.
  • the Dualpep R1-9 terminal deletion peptide according to the present invention Dualpep R1-9 terminal addition peptide; Dualpep R1-9 variant peptides in which one or more amino acids are mutated due to substitution, deletion and/or addition; and a homologous peptide exhibiting 80% or more homology thereto and exhibiting anti-inflammatory activity; has substantially the same function and/or effect as the anti-inflammatory peptide Dualpep R1-9 according to the present invention, and has 80% or 85% or more; Preferably, it is interpreted as meaning including variants having 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence homology.
  • the peptides exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention may still have anti-inflammatory activity even if they have conservative amino acid substitutions, terminal or intermediate amino acid deletions, or terminal or intermediate amino acid additions as described above. do.
  • the present invention is characterized in that the functional molecule is selected from nucleic acids such as proteins, peptides, oligonucleotides, and polynucleotides, carbohydrates, lipids, and mixtures of one or more of them.
  • the present invention is characterized in that the chemical bond between the functional molecule and the peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity is a covalent bond or a non-covalent bond, preferably a covalent bond.
  • the chemical bond may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • Non-covalent bonds may include ionic bonds, bonds by electrostatic attraction, or bonds by hydrophobic interactions.
  • the substance capable of binding to the anti-inflammatory peptide through ionic bonding or electrostatic attraction may be a charged substance such as DNA or RNA.
  • Peptides exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention are not limited to SEQ ID NOs: 1 to 16, but it is clear that representative peptides are shown in Table 1 for convenience of experiments.
  • a polynucleotide encoding a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention a fusion compound of a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity and a functional molecule, or a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity
  • a pharmaceutical composition containing a vector containing a polynucleotide encoding a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity as an active ingredient is formulated with a carrier commonly accepted in the pharmaceutical field and applied to the skin by a conventional method. It can be formulated in various forms such as external use, oral, spray, patch, or injection.
  • oral compositions include tablets and gelatin capsules, which, in addition to the active ingredient, may contain diluents (e.g. lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (e.g. silica, talc). , stearic acid and its magnesium or calcium salts and/or polyethylene glycol), and the tablets may also contain a binder (eg magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone).
  • diluents e.g. lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine
  • lubricants e.g. silica, talc
  • the tablets may also contain a binder (eg magnesium
  • compositions are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and/or contain adjuvants (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure). In addition, they may contain other therapeutically useful substances.
  • disintegrants eg starch, agar, alginic acid or its sodium salt
  • Injectable compositions are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and/or contain adjuvants (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure). In addition, they may contain other therapeutically useful substances.
  • the pharmaceutical preparation prepared in this way may be administered orally or parenterally, that is, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topically applied, as desired.
  • the dose may be administered by dividing the daily dose of 0.0001 to 100 mg/kg into 1 to several times.
  • the dosage level for a specific patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, administration time, administration method, excretion rate, severity of disease, and the like.
  • the term "food” used in the present invention means a natural product or processed product containing one or more nutrients, and preferably means a product that can be eaten directly through a certain degree of processing process. As a meaning, it may include all foods, food additives, functional foods, health functional foods, health supplement foods, and beverages.
  • the food composition of the present invention may be prepared in the form of various beverages, chewing gum, tea, sweets, vitamin complexes, health supplements, and the like, without limitation.
  • the preferred intake amount of the food composition of the present invention varies depending on the condition, body weight, severity of symptoms, food type, and intake period of the person who consumes it, and may be appropriately selected. In the food composition of the present invention, it is preferable for optimal effect that the active ingredient be ingested at 0.2 mg/kg to 200 mg/kg per day.
  • a fusion compound in which a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity or a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity is combined with a functional molecule, or a polynucleotide encoding a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease containing a vector containing a polynucleotide encoding a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity as an active ingredient is characterized in that it is an external preparation for treating skin inflammation.
  • a coating agent containing, as an active ingredient, the fusion compound to which a peptide or functional molecule exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention is added can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method.
  • the composition exhibiting the wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention is contained in a general oil-in-water (O/W) or water-in-oil (W/O) cream base, and a fragrance or chelate is added thereto.
  • Agents, pigments, antioxidants, and preservatives are used as needed, while synthetic or natural materials such as proteins, minerals, and vitamins can be used in combination for the purpose of improving physical properties.
  • HaCaT and RAW264.7 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and an antibiotic solution (100 units/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin). 37 °C, 95% humidity, 5% CO 2 It was cultured under conditions maintained, and when the cells were 70-80% adhered to the culture dish, they were treated with trypsin-EDTA and subcultured.
  • HaCaT cells were distributed and cultured from the laboratory of Professor Tae-Yoon Kim, College of Medicine, Democratic University of Korea, and RAW264.7 cells were distributed and cultured from the laboratory of Professor Sang-Beom Kim, College of Pharmacy, Sahmyook University.
  • DualPep R1 was synthesized using a standard Fmoc-SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis) protocol using 2-chloro trityl chloride resin and amino acids. The DualPep R1 was then cleaved from the resin and side chain protecting groups were removed from the amino acids using trifluoroacetic acid (TFA), water and triisopropylsilane. DualPep R1 was purified using reverse phase HPLC using a C18 column and adding ether for precipitation. Elution was performed with a water-acetonitrile linear gradient (0-75% (v/v) of acetonitrile) containing 0.1% (v/v) TFA.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptide was dissolved in water and 100 mM HCl was added to prepare 8 mM HCl. The solution was incubated at room temperature for 5 minutes, frozen in liquid nitrogen, lyophilized overnight to remove all liquid, the lyophilized powder redissolved in HCL solution, frozen again and then lyophilized overnight. Lyophilization was repeated for redissolution three times. After the final lyophilization step, the peptide was re-dissolved in water and the molecular weight of the purified peptide was confirmed using LC/MS.
  • FIG. 1 The cytotoxicity evaluation results are shown in FIG. 1 .
  • Figure 1a is the result of measuring IL-6, an inflammatory response substance, by treating immune cells RAW264.7 with peptides at different concentrations
  • Figure 1b is the result of confirming whether cell death is induced by concentration using HaCaT skin cells.
  • RAW264.7 macrophages 5 x 10 4 RAW264.7 cells were attached to a 24-well plate 12 hours before. Then, the cells were cultured in serum-free medium for 1 hour and then treated with 10 uM peptide for 2 hours. Then, each well was treated with 100 ng/ml of LPS (lipopolysaccharide), and after 4 hours, the medium was recovered, centrifuged at 1,000 g for 10 minutes, and TNF- ⁇ was detected.
  • LPS lipopolysaccharide
  • HaCaT cells were attached to each well by 2 ⁇ 10 5 using a 24-well plate, and wounds were induced using a 200 ul pipette tip. After inducing the wound, the cells were washed twice using a serum-free medium, and then treated with peptides in serum-free medium at different concentrations. Cell images were acquired using a microscope after 18 and 24 hours, respectively, and analysis was performed by measuring the width of the wound using the imagej program.
  • FIG. 3 The results of confirming the wound healing efficacy using skin cells are shown in FIG. 3 .
  • Figure 3a is an image showing the wound healing efficacy of Dualpep R1 over time.
  • Figure 3b is a result of graphing the degree of wound closure.
  • Dualpep R1 The cell regeneration efficacy of Dualpep R1 was confirmed in HaCaT skin cells. After attaching 1 x 10 4 HaCaT cells to each well in a 96-well plate, cell regeneration efficacy was evaluated by treating DualPep R1 and variants. After 24 hours of peptide treatment, the cell activity of each well was measured using a CCK8 cell activity assay reagent.
  • doxorubicin Doxo or Dox
  • IGF insulin-like growth factor
  • FIG. 4 The results of confirming the cell regeneration efficacy in skin cells are shown in FIG. 4 .
  • Figure 4a is Dualpep R1 variant SEQ No. It is a graph showing the regeneration efficiency of 1-9.
  • Figure 4b is a mutant SEQ No. It is a graph showing the regeneration efficiency of 10-16.
  • DualPep R1 In order to evaluate the whitening efficacy of DualPep R1 using B16F10 cells, they were attached to a 24-well plate to fill up to about 90%. Thereafter, after washing with serum-free DMEM medium, 2% FBS DMEM medium was prepared and 50 nM of melanocyte promoting hormone ( ⁇ -MSH) was added thereto. Thereafter, arbutin or ascorbic acid and DualPep R1 were diluted to an appropriate concentration with the culture medium, and then the diluted culture medium was treated with the B16F10 cells and further cultured for 3 days.
  • ⁇ -MSH melanocyte promoting hormone
  • the culture medium was removed, the B16F10 cells were washed once with a phosphate-buffered saline (PBS) solution, and then a solution containing 10% DMSO in 1N NaOH was added and reacted at 60° C. for 1 hour to dissolve the cells. Thereafter, a portion of the cell lysate was transferred to a 96-well plate, and absorbance at a wavelength of 490 nm was measured using a micro-plate reader (SpectraMax ABS Plus).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention a polynucleotide encoding a peptide exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity of the present invention, a vector containing the polynucleotide of the present invention, and a functional molecule and a peptide of the present invention
  • a fusion compound in which peptides exhibiting wound healing activity and anti-inflammatory activity are fused can be used as a medicine applied to inflammation including skin inflammation, cosmetics, food compositions for preventing or alleviating inflammation, wound healing agents, fillers, complex fillers, and the like.

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Abstract

본 발명은 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드와 이를 포함하는 융합 화합물 및 이를 포함하는 약제, 화장료, 식품, 의료기기 등에 관한 것이다. 본 발명자들은 서열번호 10의 Dualpep R1-9 펩타이드 및 이의 변이체가 낮은 세포 독성을 나타내고, 지다당에 의해 유도되는 세포 염증반응을 현저히 감소시켰으며, 이뿐만 아니라, 상처 치료 효능도 나타냄을 밝혀내었다.

Description

상처 치료 및 항염증 활성을 가지는 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 상처 치료 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드와 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 염증억제 및 세포 증식이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 의약, 의약외품, 의료기기, 기능성 식품 및 화장품 등에 적용될 수 있다.
박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질 등과 같은 외부 감염원에 의한 감염, 동상, 화상, 상처, 수술, 기계적 자극, 전기자극 또는 화학물질 등에 의하여 유발되는 인체내 질환을 "염증"이라고 한다.
사람의 피부는 물리적인 1차 방어벽을 형성하므로 세균이나 바이러스 같은 병원체가 피부를 직접 뚫고 들어올 수 없다. 그러나 피부에 상처가 생기면 병원체가 침입하게 된다. 이때 우리 몸에는 즉각적인 작용이 일어나는데 그 대표적인 반응이 염증이다. 피부나 점막의 손상으로 병원체가 침입했을 때, 열, 부어오름, 통증 등의 증상이 나타나는 비특이적 면역 작용을 염증 반응이라 한다. 염증 반응은 비특이적 현상으로서 병원체의 침입에 대한 즉각적인 방어 작용이며, 감염이 확대되는 것을 방지하고 손상된 세포를 제거하는 역할을 한다.
손상된 조직의 대식 세포가 사이토카인을 분비하면 T 림프구가 활성화되며, 백혈구의 일종인 비만세포가 히스타민을 분비하면 내부 방어 작용을 시작하도록 하여 감염된 조직에서 염증이 유도된다. 따라서 피부가 손상되면 혈관이 확장되어 피부 표면이 붉어지고 발열이 나타나며, 혈관벽의 투과성이 증가한다. 이로 인해 식균 작용을 하는 백혈구와 대식 세포가 상처 부위로 쉽게 이동하여 병원체를 제거한다. 이와 함께 부종과 통증이 생기며, 발열이 나타난다. 염증 반응으로 형성된 열은 재생 과정을 촉진시키고, 병원체의 증식을 억제하는 기능이 있다.
외부 자극에 의하여 손상을 입은 세포들은 친염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine), 케모카인 (chemokine), 인터루킨 (interleukine), 인터페론 (interferon) 등의 다양한 매개 물질을 분비하고, 혈관 확장으로 인하여 투과성이 증가하며, 항체, 혈장, 식균 세포 등이 염증부위로 집중된다.
스테로이드 및 비스테로이드 계통의 다양한 항염증 약물이 염증 완화, 피부 진정, 아토피 완화 등의 목적으로 널리 사용된다. 그러나, 종래의 항염제들은 인체 안전성 및 부작용으로 인해 사용이 제한되고 있으며, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제가 있다.
피부 상처는 외상, 타박상, 찢김 등으로 인하여 유발되며 상처 치유는 손상 입은 조직을 복구하여 피부가 온전해지는 과정이다. 상처 치유는 다양한 면역학 및 생물학적 시스템의 상호작용으로 일어나며, 일반적으로 지혈, 염증, 증식, 재형성의 네 단계가 순차적이고 연속으로 일어난다.
최근 상처 치유에는 성장인자 등을 포함하는 다양한 약학 조성물이 개발되고 있다. 그러나, 좀 더 효과적이며, 개체 내에서 안정적이고 안전한 상처 치유 조성물이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체에 안전하고, 안정적이며, 화장료, 의약품 등으로 적용 가능한 새로운 상처 치료 및 항염증의 이중 효능을 가진 펩타이드를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상처 치료 및 항염증 성분을 포함하는 화장료, 의약품, 의료기기, 식품 등을 제공하려는 것이다.
위와 같은 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 수많은 인간 유래 후보 펩타이드를 선정하여 시험한 결과, 본 발명자들은 인간 MRPL15 단백질 유래 KKPERRPRGRRRGRKCG (서열번호 10)의 17개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (이하, 본 발명에서 "Dualpep R1-9"로 칭함) 또는 이 중 일부 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 말단 결실 펩타이드 및 변이체 펩타이드가 낮은 세포 독성을 나타내고, 지다당에 의해 유도되는 세포 염증반응을 현저히 감소시켰으며, 이뿐만 아니라, 상처 치료 효능도 나타냄을 밝혀내었다.
본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 낮은 세포 독성을 나타내고, 지다당에 의해 유도되는 세포 염증반응을 현저히 감소시켰으며, 이뿐만 아니라, 상처 치료 효능도 나타냈다. 이뿐만 아니라, 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 미백 효과 및 미백 시너지 효과를 나타내었다.
도 1a는 면역세포 RAW264.7에 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리하여 염증 반응 물질인 IL-6를 측정한 결과이다.
도 1b는 HaCaT 피부 세포를 이용하여 농도별 세포 사멸을 유도하는지 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명 펩타이드의 항염 효능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 피부세포를 이용한 상처 치유 효능을 확인한 결과로서, 본 발명 펩타이드의 상처 효능 실험을 통해 시간별 상처 치료 효과를 촬영한 이미지이다.
도 3b는 도 3a에서 상처가 닫힌 정도를 그래프화한 것이다.
도 4a, 도 4b는 Dualpep R1 변이체 SEQ No. 1-16의 재생 효능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 MSH로 유도된 세포에 아스코르브산 또는 알부틴과 DualPep R1 및 그 변이체를 처리하였을때 미백 효능이 증대되는 것을 확인한 결과이다.
본 발명의 설명 및 청구범위 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로 D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예컨대 N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 화물분자 수송 도메인의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 화물분자 수송 도메인의 변형을 의미한다.
본 명세서에서 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
본 명세서에서, "염증"이라 함은 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질 등과 같은 외부 감염원에 의한 감염, 동상, 화상, 상처, 수술, 기계적 자극, 전기자극 또는 화학물질 등에 의하여 유발되는 인체내 질환을 제한 없이 포함하며, 급성 및/또는 만성 염증 질환 및 염증을 수반하는 질환, 예컨대, 류마티스 관절염, 골관절염, 대장염, 방광염, 비염, 편도염, 피부염, 염증성 장질환, 위궤양 또는 천식 등을 모두 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어 “항염증”은 염증을 예방, 치료 또는 개선하는 것을 의미한다.
기타 본 명세서, 청구범위 및 도면에 기재된 용어는 특별히 명시되지 않은 경우 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 양태는
1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 10으로 이루어진 Dualpep R1-9 펩타이드;
2) 상기 Dualpep R1-9 펩타이드 중 N 말단으로부터 연속하는 1개 내지 11개의 아미노산이 결실되고/되거나 C 말단으로부터 연속하는 1개 내지 10개의 아미노산이 결실된, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드;
3) 상기 Dualpep R1-9 펩타이드 중 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 내지 2개의 아미노산이 부가된 Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드;
4) 상기 1)의 Dualpep R1-9 펩타이드, 또는 상기 2)의 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드, 또는 상기 3)의 Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드 중 하나 이상의 아미노산이 보존적 아미노산으로 치환되고/되거나, 말단이 아닌 서열 중간의 1개 이상 5개 이하, 바람직하게는 서열 중간의 1개 이상 2개 이하의 아미노산이 결실된, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 변이체 펩타이드; 및
5) 상기 1), 2), 3) 및 4) 중 선택된 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 서열 상동성 펩타이드; 중 선택된 1종의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 아미노산 5개 내지 17개로 이루어진 펩타이드인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 보존적 아미노산 치환이 아르기닌 잔기가 라이신 잔기로, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환되는 것인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 펩타이드가 항염증 기능 외에 상처 치료 효능도 나타내는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 미백 효과를 나타내며, 종래의 미백 기능성 성분에 부가한 경우 미백 시너지 효과를 나타내는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 펩타이드인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 16의 펩타이드로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 어느 하나의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 17 내지 서열번호 32 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 17 내지 서열번호 32의 펩타이드로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는
1) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 약학 조성물을 제공한다. 상기 염증에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 바람직하게는 상기 염증은 아토피 피부염을 비롯한 피부염증임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 양태는
1) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 치유 기능 및 염증 개선 이중 기능성 화장료를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는
1) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상치 치유 및 염증 개선 기능성 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는
1) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 치료 및 염증 개선 기능성 창상피복재, 필러 또는 복합 필러 중 선택된 의료기기를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 동일한 서열 또는 서로 다른 서열로 두 개 이상, 바람직하게는 2 ~ 10개 연속하여 결합된 것을 특징으로 하는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 기능성 분자가 결합된 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 포함하는 융합 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 기능성 분자가 호르몬, 성장 인자, 신경 전달 물질, 이온 채널 리간드를 비롯한 치료용 펩타이드이거나 또는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈를 비롯한 다양한 효소, 알부민, 항체 등의 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 포함하는 융합 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 기능성 분자가 예컨대 퍼옥시레독신과 같이 항산화 기능을 나타내거나, 인터류킨 등과 같이 항염증 기능을 나타내거나 또는 상처 치유 기능을 나타내는 분자인 것을 특징으로 하는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 포함하는 융합 화합물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 기능성 분자가 결합된 융합 화합물을 포함하는 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 예컨대, 아토피염과 같은 피부염증을 비롯하여 류마티스 관절염, 골관절염, 대장염, 방광염, 비염, 편도염, 염증성 장질환, 위궤양 또는 천식 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 본 발명의 약학 조성물은 피부염, 특히 아토피 피부염, 피부의 자상, 창상, 찰과상 등의 외상으로 인한 상처와 염증의 예방 및 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 기능성 분자가 결합된 융합 화합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 피부에 상처가 생긴 경우 염증을 완화하고 상처를 치료할 수 있다. 본 발명의 화장료는 화장수, 크림, 에센스, 수중유형 또는 유중수형 에멀젼, 연고 등의 기초 화장료 외에도 파운데이션, 립스틱, 아이섀도우 등의 색조 화장료도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기 하나 이상의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 기능성 분자가 결합된 융합 화합물을 포함하는 항염증 기능 및/또는 상처 치유 기능을 나타내는 식품 조성물을 제공한다.
이뿐만 아니라, 본 발명의 일 양태는 상기 하나 이상의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 기능성 분자가 결합된 융합 화합물을 포함하며, 창상피복재, 필러 또는 복합 필러 중 선택된 의료기기를 제공한다.
본 발명에 따른 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 Dualpep R1-9 펩타이드; 및 위에서 기재한 바와 같이 양측 말단 중 일측 이상에서 일부의 연속하는 아미노산들이 결실된 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드; 및 위에서 기재한 바와 같이 양측 말단 중 일측 이상에서 아미노산이 부가된 Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드; 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가로 인하여 변이된 Dualpep R1-9 변이체; 및 이들과 80% 이상의 상동성을 나타내며 항염증 활성을 나타내는 상동성 펩타이드;를 포함하는 의미로 해석된다.
또한, 본 발명에 따른 상기 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드; Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드; 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가로 인하여 변이된 Dualpep R1-9 변이체 펩타이드; 및 이들과 80% 이상의 상동성을 나타내며 항염증 활성을 나타내는 상동성 펩타이드;는 본 발명에 따른 항염증 펩타이드 Dualpep R1-9과 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 가지며, 80% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 변이체들도 포함하는 의미로 해석된다.
또한, 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 위와 같은 보존적 아미노산 치환, 말단 또는 중간의 아미노산 결실, 말단 또는 중간의 아미노산 부가를 갖더라도 여전히 항염증 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
또한, 본 발명은 상기 기능성 분자가 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등의 핵산, 탄수화물, 지질 및 이들 중 1종 이상의 혼합물 중 선택된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 기능성 분자와 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드의 화학결합이 공유결합 또는 비공유결합이며, 바람직하게는 공유결합임을 특징으로 한다. 상기 화학결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 비공유결합으로는 이온결합 또는 정전기적 인력에 의한 결합 또는 소수성 상호작용에 의한 결합 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 이온결합 또는 정전기적 인력으로 항염증 펩타이드와 결합할 수 있는 물질은 DNA 또는 RNA와 같이 전하를 띠는 물질일 수 있다.
본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 서열번호 1 내지 16에 한정되는 것이 아니나, 실험의 편의를 위하여 대표적인 펩타이드들을 표 1에 예시한 것임을 분명히 밝힌다.
또한, 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드, 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드와 기능성 분자의 융합 화합물, 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 피부 외용제, 경구, 스프레이, 패치 또는 주사 등 다양한 형태로 제형화할 수 있다. 예를 들면 경구용 조성물로는 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품, 건강기능식품, 건강보조식품 및 음료 등을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은, 비제한적으로 각종 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체, 건강 보조식품 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 바람직한 섭취량은 섭취하는 사람의 상태, 체중, 증상의 정도, 식품 형태, 섭취 기간에 따라 다르며, 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 유효 성분이 1일 0.2㎎/㎏ 내지 200㎎/㎏으로 섭취되도록 하는 것이 최적의 효과를 위해 바람직하다.
또한, 상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드와 기능성 분자가 결합된 융합 화합물, 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 또는 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 질병 예방 또는 치료용 약제 조성물은 피부 염증 치료용 피부외용제임을 특징으로 한다. 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 또는 기능성 분자가 부가된 융합 화합물을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 조성물을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.
기타 본 명세서, 청구범위 및 도면에 기재된 용어는 특별히 명시되지 않은 경우 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 사용하는 의미로 사용되었음을 밝힌다.
peptide name amino acid sequence Characteristics SEQ
No.
Dualpep R1 ERRPRGRRRGRKC SEQ No.10의 4~16 아미노산 1
Dualpep R1-1 ERRPRGRRRGRK SEQ No.10의 4~15 아미노산 2
Dualpep R1-2 RRPRGRRRGRKC SEQ No.10의 5~16 아미노산 3
Dualpep R1-3 PRGRRRGRKC SEQ No.10의 7~16 아미노산 4
Dualpep R1-4 ERRPRGRRRG SEQ No.10의 4~13 아미노산 5
Dualpep R1-5 EKKPRGKKKGRKC SEQ No.10의 4~16 아미노산에서 R5K,R6K,R10K,R11K,R12K 치환 6
Dualpep R1-6 RRPRRRRGRKC SEQ No.10의 5~16 아미노산에서G9 결실 7
Dualpep R1-7 ERRPRGRGR SEQ No.10의 4~14 아미노산에서
R10,R11 결실		 8
Dualpep R1-8 RPRGRGRKC SEQ No.10의 6~16 아미노산에서
R10,R12 결실		 9
Dualpep R1-9 KKPERRPRGRRRGRKCG SEQ No.10의 1~17 아미노산 10
Dualpep R1-10 SKKPERRPRGRRRGRKC SEQ No.10의 1~16 아미노산, N말단에 S 부가 11
Dualpep R1-11 ERRPR SEQ No.10의 4~8 아미노산 12
Dualpep R1-12 RPRGR SEQ No.10의 6~10 아미노산 13
Dualpep R1-13 PRGRR SEQ No.10의 7~11 아미노산 14
Dualpep R1-14 RGRRR SEQ No.10의 8~12 아미노산 15
Dualpep R1-15 PGRKC SEQ No.10의 12~16 아미노산 16
Name polynucleotide sequence SEQ No.
Dualpep R1 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 17
Dualpep R1-1 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa 18
Dualpep R1-2 aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 19
Dualpep R1-3 cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 20
Dualpep R1-4 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt 21
Dualpep R1-5 gag aaa aaa cca aga ggt aaa aaa aaa ggt aga aaa tgt 22
Dualpep
R1-6		 aga aga cca aga cgg aga aga ggt aga aaa tgt 23
Dualpep R1-7 gag aga aga cca aga ggt cgg ggt aga 24
Dualpep R1-8 aga cca aga ggt cgg ggt aga aaa tgt 25
Dualpep R1-9 aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt
ggc		 26
Dualpep
R1-10		 tcc aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa
tgt		 27
Dualpep R1-11 gag aga aga cca aga 28
Dualpep R1-12 aga cca aga ggt cgg 29
Dualpep R1-13 cca aga ggt cgg aga 30
Dualpep R1-14 aga ggt cgg aga aga 31
Dualpep R1-15 aga ggt aga aaa tgt 32
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
1. 세포 배양
HaCaT 그리고 RAW264.7 세포는 DMEM 배지에 10% 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS)과 항생물질용액 (100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신)이 첨가된 세포 배양액을 통해 배양되었다. 37 ℃, 95% 습도, 5% CO2가 유지되는 조건에서 배양하였고, 세포가 배양접시에 70-80% 유착되었을 때 트립신-EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. HaCaT 세포는 카톨릭대학교 의과대학 김태윤 교수 실험실로부터 분양받아 배양하였으며, RAW264.7 세포는 삼육대학교 약학대학 김상범 교수 실험실로부터 분양받아 배양하였다.
2. Dualpep R1 합성
DualPep R1은 2-클로로 트리틸 클로라이드 수지와 아미노산을 사용하여 표준 Fmoc-SPPS(고상 펩티드 합성) 프로토콜을 이용해 합성하였다. 그 다음, DualPep R1을 수지로부터 절단하고 TFA (Trifluoroacetic acid), 물 및 트리이소프로필실란을 사용하여 아미노산으로부터 측쇄 보호기를 제거하였다. 침전을 위해 에테르를 첨가하고 C18 컬럼을 사용하는 역상 HPLC를 이용해 DualPep R1을 정제하였다. 용출은 0.1 %(v/v) TFA를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 (아세토니트릴의 0~75 %(v/v))로 수행하였다. TFA를 제거하기 위해 펩타이드를 물에 녹이고 100 mM HCl을 첨가하여 농도 8 mM의 HCl을 제조하였다. 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 액체 질소에서 동결하고, 밤새 동결 건조하여 모든 액체를 제거하고, 동결 건조된 분말을 HCL 용액에 재용해하고, 다시 동결한 다음 밤새 동결 건조하였다. 3회 재용해하기 위해 동결건조를 반복하였다. 최종 동결건조 단계 후, 펩타이드를 물에 재용해하고 LC/MS를 이용하여 정제된 펩타이드의 분자량을 확인하였다.
3. 염증 유도 평가
RAW264.7 대식세포에서 Dualpep R1의 염증 유도를 평가하기 위해 12 시간 전 24웰 플레이트에 5 x 104 양의 세포를 부착시켰다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 내에 농도별로 Dualpep R1 펩타이드를 처리하였다. 6시간 이후 배지를 회수하여 1,000 g에서 10분간 원심분리한 후 mouse IL-6 ELISA set (BD Biosciences, 미국)를 이용하여 제조자의 설명에 따라 분비된 IL-6를 검출하였다.
4. 세포 독성 평가
HaCaT 피부세포에서 Dualpep R1의 독성을 평가하기 위해 12 시간 전 96웰 플레이트에 3 x 104 양의 HaCaT 세포를 부착시켰다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 내에 농도별로 Dualpep R1 펩타이드를 처리하였다. 24 시간 이후, 무혈청 배지로 총 세 번 세척해주었고 이후 CCK8 assay를 이용하여 세포 활성을 측정하였다.
세포 독성 평가 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1a는 면역세포 RAW264.7에 펩타이드를 농도별로 처리하여 염증 반응 물질인 IL-6를 측정한 결과이고, 도 1b는 HaCaT 피부 세포를 이용하여 농도별 세포 사멸을 유도하는지 확인한 결과이다.
5. 염증 유도 평가
RAW264.7 대식세포에서 Dualpep R1의 항염증 효능을 평가하기 위해 12 시간 전 24웰 플레이트에 5 x 104 양의 RAW264.7 세포를 부착시켰다. 그 후, 세포를 무혈청 배지에서 1 시간 배양한 후 10 uM의 펩타이드를 2시간 처리하였다. 그 다음, 각 웰에 LPS (lipopolysaccharide)를 100 ng/ml씩 처리하고 4 시간 후에 배지를 회수하여 1,000 g에서 10분간 원심 분리한 후 TNF-α를 검출하였다.
Dualpep R1의 항염증 효능을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
6. 세포 상처 치료 실험
HaCaT 피부세포에서 Dualpep R1의 상처치료 효능을 확인하기 위해서 스크래치 분석법을 진행하였다. 24웰 플레이트를 이용하여 HaCaT 세포 2 x 105 씩 각 웰에 부착시킨 후에 200 ul 파이펫 팁을 이용하여 상처를 유도하였다. 상처를 유도한 후 무혈청 배지를 이용하여 세포를 두 번씩 세척한 후 무혈청 배지 내에 농도별로 펩타이드를 처리하였다. 각각 18, 24 시간 후 현미경을 이용하여 세포 이미지를 획득하였으며 imagej 프로그램을 이용하여 상처의 넓이를 측정하여 분석을 진행하였다.
피부세포를 이용한 상처 치유 효능을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3a는 Dualpep R1의 시간별 상처 치료 효능을 나타내는 이미지이다. 도 3b는 상처가 닫힌 정도를 그래프화한 결과이다.
7. 세포 재생 실험
HaCaT 피부세포에서 Dualpep R1의 세포 재생 효능을 확인하였다. 96웰 플레이트에 1 x 104 HaCaT 세포를 각 웰에 부착시킨 후 DualPep R1 및 변이체들을 처리하여 세포 재생 효능을 평가하였다. 펩타이드 처리 24 시간 후 CCK8 세포 활성 분석 시약을 이용하여 각 웰의 세포 활성도를 측정하였다.
효능을 비교하기 위하여 독소루비신 (Doxorubicin; Doxo 또는 Dox) 10 uM 그리고 인슐린 유사 성장인자 (Insulin-like growth factor; IGF) 100 ng/ml 처리한 비교군도 포함하였다.
피부세포에서 세포 재생 효능을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4a는 Dualpep R1 변이체 SEQ No. 1-9의 재생 효능을 나타내는 그래프이다. 도 4b는 변이체 SEQ No. 10-16의 재생 효능을 나타내는 그래프이다.
8. 미백 효능 평가
B16F10 세포를 이용하여 DualPep R1의 미백 효능을 평가하기 위하여 24웰 플레이트에 90% 정도로 채우도록 부착시켰다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지로 세척한 후 2% FBS DMEM 배지를 만들어 멜라노사이트 촉진 호르몬 (α-MSH) 50 nM을 넣었다. 그 후 알부틴 또는 아스코르브산과 DualPep R1을 상기 배양액으로 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 배양액을 상기 B16F10 세포에 처리하고 3일간 추가 배양하였다.
이후 배양액을 제거하고, PBS (phosphate-buffered saline) 용액으로 상기 B16F10 세포를 1회 세척한 다음, 1N NaOH 에 10% DMSO 가 들어간 용액을 넣고 60℃에서 1시간 동안 반응시켜 세포를 용해시켰다. 그 후 상기 세포 용해물 일부를 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 마이크로-플레이트 판독기(SpectraMax ABS Plus)를 이용하여 490 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
도 5는 MSH로 유도된 세포에 아스코르브산 또는 알부틴과 DualPep R1을 처리 하였을때 미백 효능을 증가시키는 것을 확인한 결과이다.
본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드, 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 기능성 분자와 본 발명의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드가 융합된 융합 화합물은 피부 염증을 비롯한 염증에 적용하는 약제, 화장료, 염증 예방 또는 완화용 식품 조성물 및 창상 치유제, 필러, 복합필러 등으로 이용할 수 있다.
전자파일로 첨부하였음.

Claims (15)

1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 10으로 이루어진 Dualpep R1-9 펩타이드;
2) 상기 Dualpep R1-9 펩타이드 중 N 말단으로부터 연속하는 1개 내지 11개의 아미노산이 결실되고/되거나 C 말단으로부터 연속하는 1개 내지 10개의 아미노산이 결실된, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드;
3) 상기 Dualpep R1-9 펩타이드 중 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 내지 2개의 아미노산이 부가된 Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드;
4) 상기 1)의 Dualpep R1-9 펩타이드, 또는 상기 2)의 Dualpep R1-9 말단 결실 펩타이드, 또는 상기 3)의 Dualpep R1-9 말단 부가 펩타이드 중 하나 이상의 아미노산이 보존적 아미노산으로 치환되고/되거나, 말단이 아닌 서열 중간의 1개 이상 5개 이하, 바람직하게는 서열 중간의 1개 이상 2개 이하의 아미노산이 결실된, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 변이체 펩타이드; 및
5) 상기 1), 2), 3) 및 4) 중 선택된 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는, 아미노산 5개 이상으로 이루어진 Dualpep R1-9 서열 상동성 펩타이드; 중 선택된 1종의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 4)의 서열 중간의 아미노산 결실은 1~2개의 아미노산 결실인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 아미노산 5개 내지 17개로 이루어진 펩타이드인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 보존적 아미노산 치환은 아르기닌 잔기가 라이신 잔기로, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환되는 것인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 미백 효과를 나타내는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 펩타이드인, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드.
청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 하나의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
청구항 7의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터.
1) 청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 한 항의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 청구항 7의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 청구항 8의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 항염증 약학 조성물.
청구항 9에 있어서,
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상처 치료용 및/또는 항염증 약학 조성물.
청구항 9의 염증은 피부염증인, 항염증 약학 조성물.
청구항 9의 염증은 아토피염인, 항염증 약학 조성물.
1) 청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 한 항의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 청구항 7의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 청구항 8의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 개선 기능과 염증 개선 기능을 갖는 기능성 화장료.
1) 청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 한 항의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 청구항 7의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 청구항 8의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 치료 및/또는 염증 개선 기능성 식품 조성물.
1) 청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 한 항의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드;
2) 청구항 7의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
3) 청구항 8의 상처 치료 활성 및 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 발현용 벡터;를 포함하는 상처 치료 및/또는 염증 개선 기능성 창상피복재, 필러 또는 복합 필러 중 선택된 의료기기.
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Title
YASHIRO RYU, MUROTA YUKIKO, NISHIDA KAZUMICHI M., YAMASHIRO HARUNA, FUJII KAEDE, OGAI ASUKA, YAMANAKA SOICHIRO, NEGISHI LUMI, SIOM: "Piwi Nuclear Localization and Its Regulatory Mechanism in Drosophila Ovarian Somatic Cells", CELL REPORTS, ELSEVIER INC, US, vol. 23, no. 12, 1 June 2018 (2018-06-01), US , pages 3647 - 3657, XP093063732, ISSN: 2211-1247, DOI: 10.1016/j.celrep.2018.05.051 *
ZHANG YUHAN, LIU WEIWEI, LI RONGHONG, GU JIAQI, WU PING, PENG CHAO, MA JINBIAO, WU LIGANG, YU YANG, HUANG YING: "Structural insights into the sequence-specific recognition of Piwi by Drosophila Papi", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 115, no. 13, 27 March 2018 (2018-03-27), pages 3374 - 3379, XP093063731, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1717116115 *

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