CN117136066A - Nectin-4靶向肽化合物及其药物偶联物 - Google Patents
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Abstract
提供一类Nectin‑4靶向肽化合物，以及包含所述靶向肽化合物的药物偶联物。具体地，所述靶向肽包括含有非天然氨基酸的线性肽或环肽。所述靶向肽可以改善靶向肽‑药物偶联物的半衰期并提高其稳定性，进一步地还提高了与靶蛋白Nectin‑4的结合亲和力。所述靶向肽‑药物偶联物能够以高亲和力特异性结合靶蛋白Nectin‑4，从而高效杀伤表达Nectin‑4的肿瘤，为肿瘤治疗领域提供了一种新型抗肿瘤靶向药。
Description
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一类针对Nectin-4靶点的多肽化合物及其药物偶联药物的制备方法和用途。
癌症，是威胁人类健康的头号杀手。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)公布的数据显示，2020年全球新诊断癌症1930万例，其中我国新发癌症457万人，位居全球第一。手术虽然可以切除早期的局限性肿瘤，但对于晚期或全身性癌症来说收效甚微；而放疗和化疗会带来脱发、呕吐等副作用。
靶向药是抗肿瘤药市场的“明日之星”。靶向药物的一大特点是针对特定靶点产生作用，每个病人的情况各不相同，可以选用的靶向药物也各有不同，一定程度上实现对肿瘤的个体化治疗。从药品的需求趋势来看，疗效明显、副作用小是未来产品发展的主要需求方向，在这种市场需求驱动下，靶向抗肿瘤药的研发与临床应用将是抗肿瘤药行业未来主要发展方向之一。
Nectin-4(Nectin cell adhesion molecule 4)作为一种I型膜蛋白，它属于Ig超家族蛋白的Nectin家族，是一种I型膜蛋白。Nectin-1、-2、-3、-4是Nectin家族的四个成员，分别由PVRL1、PVRL2、PVRL3和PVRL4基因编码(Rikitake等，2012)。Nectin-4在疱疹和麻疹病毒感染期间作为进入受体发挥着至关重要的作用。前三种Nectin(1、2和3)通常存在于成人组织中，而Nectin-4的表达仅存在于胎盘和胚胎组织中。但已发现Nectin-4的表达在多种不同类型的癌症中更高，如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌等(Challita-Eid等，2016)。多项研究提供的证据表明，Nectin-4与癌症患者疾病严重程度有关。可溶性和膜结合Nectin-4在不同类型的肿瘤中均过表达。它已被确定为癌症最差预后的新型生物标志物，并与肿瘤的增殖、血管生成、转移、复发、DNA修复等密切相关(Nishiwada等，2015；Sethy等，2020)。
抗体药物偶联物(ADC)主要应用于在靶向肿瘤治疗领域。ADC药物是一类由抗体、连接子和细胞毒性药物组成的靶向生物制剂。ADC所使用的抗体与肿瘤细胞表面抗原有极高的亲和力，对含有相同靶点的正常细胞由于抗体半衰期较长(1-3周)，因此其在体内留存的时间内会不断地杀伤正常细胞，极大的增大了药物的毒副作用，另外抗体是个比较笨拙的运输工具、在肿瘤的小胡同穿行比较困难，据估计只有0.1％的药物能到达肿瘤组织，为了保证其它99％的剧毒弹头不要带来系统毒性，连接弹头与抗体的化学链接必须足够稳定。但为了能在细胞内释放弹头又不能太稳定，这显然为药物设计带来麻烦。由于分子量的巨大差异，对于相同摩尔数的有效载荷(payload)，ADC药物所用的质量是有效载荷的300倍左右，因此副作用相对较大。
ADC还易于聚集，ADC聚集会导致修饰从而降低其与抗原的结合能力。蛋白质聚集是ADC开发的主要障碍，聚集可以发生在每个阶段以及运输和长期储存期间。聚集体具有免疫原性。此外，蛋白质聚集会导致产品损失。总体而言，任何化学或物理降解都可能导致ADC的结构改变并导致蛋白质过度聚集。还有各种其他因素会导致聚集，例如频繁的冷冻/解冻、高浓度蛋白和盐浓度、升高的温度或低pH值。此外，大多数有效载荷是疏水的，在蛋白质表面以高DAR结合有效载荷会导致蛋白质过度聚集，从而阻碍ADC的成功开发。
另外抗体偶联药物(ADC)与抗体药物一样也存在免疫原性，其免疫原性风险对病人来说，免疫原性影响了药物的安全性和有效性、甚至会因为ADA和内源蛋白交叉给病人带来致命的新疾病。
PDC(Peptide-Drug Conjugate)即多肽偶联药物，由连接子(linker)、归巢肽(homing peptide)以及具有细胞毒性的有效载荷(payload)构成，归巢肽可以特异性靶向肿瘤细胞表面过表达的蛋白受体从而传递细胞毒素诱导肿瘤细胞凋亡。相比于目前ADC药物，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透性强、免疫原性低、利用固相合成法可大规模合成、生产成本较低、相对较好的药代动力学等特点，成为继小分子靶向药、单克隆抗体、ADC之后的下一代靶向抗肿瘤药。
PDC在临床或临床前研究中用于治疗多种疾病，例如CN108135881B、CN 106466485B中均有揭示相应的多肽药物，但这些只是把化疗药物与天然氨基酸组成的线性多肽连接，或是两个天然氨基酸组成的线性多肽(或配体)简单组合，稳定性差半衰期短。因此，本领域亟待开发一种稳定性提高的特异性靶向PDC。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半衰期改善且稳定性提高的靶向Nectin-4蛋白的靶向肽，以及含有所述靶向肽的药物偶联物。
本发明的第一方面，提供了一种分离的多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽包含修饰或未修饰的非天然氨基酸，并且所述多肽特异性靶向Nectin-4蛋白。
在另一优选例中，所述多肽为线性肽或环肽。
在另一优选例中，所述多肽为环肽，所述环肽具有式A所示结构：
Z0-Y1-Z1 (A)
式中，
Z0或Z1为无，或1、2或3个氨基酸残基；
Y1为具有环结构的靶向Nectin-4蛋白的靶向肽；
所述Y1包含被至少两个不包含半胱氨酸残基的间隔序列J1和J2隔开的至少三个半胱氨酸残基C1、C2和C3，所述半胱氨酸残基共同通过链内连接子(intro-chain
linker)形成环结构；
并且，所述Y1去除形成环结构所对应的半胱氨酸残基后具有如下式(I)所示的基础氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14 (I)
式中，
X1为Pro；
X2为1Nal或2Nal；
X3为D-Asp,D-Arg或D-Glu；
X4为无，或Gly,Met,或Ser；
X5为无，或Gly,D-Asp,或Ser；
X6为Met,Val,Nle,Thr或无；
X7为hArg或Hyp；
X8为Glu,D-Glu,Asp或Gln,优选为Glu；
X9为Trp,5-F-Trp,Phe或1Nal；
X10为Ser或Thr；
X11为Thr或Ser；
X12为Pro；
X13为Hyp或Pro；
X14为Trp、5-F-Trp或Phe；
并且，所述间隔序列J1和J2衍生自式(I)所示氨基酸序列，其长度为3-10个氨基酸残基，且J1+J2的长度≥10个氨基酸残基；
所述半胱氨酸残基C1位于式(I)所示氨基酸序列中X1至X3所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，所述半胱氨酸残基C2位于式(I)所示氨基酸序列中X4至X11所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间，半胱氨酸残基C3位于X12至X14所构成的第三区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第三区段的最后一个氨基酸之后。
在另一优选例中，所述环肽中Y1的氨基酸序列结构如式(Ia)所示：
Cys-X1-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (Ia)
式中的X1至X14如上定义。
在另一优选例中，所述链内连接子(intro-chain linker)为：TATA(1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮),即
在另一优选例中，所述多肽为线性肽，所述线性肽具有式B所示结构：
Z0-Y2-Z1 (B)
式中，
Z0或Z1为无，或1、2或3个氨基酸残基；
Y2为靶向Nectin-4蛋白的线性靶向肽；
所述Y2具有如式II所示的基础氨基酸序列：
X1-X2-X3-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14 (II)
式中，
X1为Pro；
X2为1Nal；
X3为D-Asp或D-Glu；
X6为Met,Val,Nle或无；
X7为hArg；
X8为Glu,D-Glu,Asp或Gln,优选为Glu；
X9为Trp,5-F-Trp,Phe或1Nal；
X10为Ser或Thr；
X11为Thr或Ser；
X12为Pro；
X13为Hyp；
X14为Trp、5-F-Trp或Phe。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个半胱氨酸残基。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中2个半胱氨酸残基，其中，所述半胱氨酸残基分别位于式(II)所示氨基酸序列中X1至X11所构成的区段中任意两个氨基酸之间或位于所述区段的第一个氨基酸之前，以及式(II)所示氨基酸序列中的X14之后。
在另一优选例中，所述线性肽中的Y2具有选自如下式(IIa)至式(IIe)所示的结构：
Cys-X1-X2-X3-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IIa)；
X1-X2-Cys-X3-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IIb)；
X1-X2-X3-X6-Cys-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IIc)；
X1-X2-X3-X6-X7-Cys-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IId)；
X1-X2-X3-X6-X7-X8-X9-Cys-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IIe)。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个半胱氨酸残基，以及包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个丙氨酸残基，所述插入的半胱氨酸残基和丙氨酸残基数总数不超过3个。
在另一优选例中，所述线性肽中的Y2具有如下式(IIf)所示的结构：
Ala-X1-X2-X3-Cys-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys (IIf)。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个或3个Aib残基。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的3个Aib残基W1、W2和W3，所述W1位于式(II)所示氨基酸序列中X1至X3所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，所述W2位于式(II)所示氨基酸序列中X6至X11所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第二区段的第一个氨基酸之前，所述W3位于X12至X14所构成的第三区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第三区段的最后一个氨基酸之后3。
在另一优选例中，所述线性肽中的Y2具有如下式(IIg)所示的结构：
Aib-X1-X2-X3-Aib-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Aib (IIg)。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个或3个乙酰化(Ac)修饰或未修饰的赖氨酸残基。
在另一优选例中，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的3个乙酰化(Ac)修饰或未修饰的赖氨酸残基K1、K2和K3，所述K1位于式(II)所示氨基酸序列中X1至X3所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，所述K2位于式(II)所示氨基酸序列中X6至X11所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第二区段的第一个氨基酸之前，所述K3位于X12至X14所构成的第三区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第三区段的最后一个氨基酸之后3。
在另一优选例中，所述线性肽中的Y2具有下式(IIh)所示的结构：
Lys(Ac)-X1-X2-X3-Lys(Ac)-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Lys(Ac)
(IIh)。
在另一优选例中，所述多肽选自下组：
在另一优选例中，所述多肽包含如式I所示的基础氨基酸序列，其中，在式I中，X8为Glu或D-Glu，优选为Glu。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同源性。
在另一优选例中，所述多肽保留了SEQ ID NO:28的生物活性的至少≥50％，≥60％，≥70％，≥80％，≥90％、≥100％，例如80-500％，较佳地100-400％。
在另一优选例中，所述生物活性指的是Nectin-4蛋白结合活性。
本发明的第二方面，提供了一种药物偶联物，所述药物偶联物具有如下式III所示结构：
(D)n-L-P (III)
其中，D为有效荷载；
L为接头；
P为靶向肽，所述靶向肽为如本发明第一方面所述的多肽；
n为≥1的正整数，较佳地，n＝1至4，最佳地，n＝1或2。
在另一优选例中，所述有效荷载选自抗肿瘤药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。
在另一优选例中，所述有效荷载选自下组：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷，磷酸依托泊苷和替尼泊苷；抗肿瘤抗生素，包括他克莫司、雷帕霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素；免疫抑制剂。
在另一优选例中，所述有效荷载选自下组：甲基澳瑞他汀E(MMAE)、DNA拓扑异构酶I抑制剂(Dxd)、他克莫司、雷帕霉素。
在另一优选例中，所述接头选自下组：-PABC-Cit-Val-戊二酰-β-
Ala-[Sar]m、-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-[Sar]m、-PABC-Cit-Val-己二酰-β-Ala-[Sar]m、-MC-Gly-Gly-Phe-Gly-、或-PABC-Cit-Val-戊二酰-βAla-[Sar]m，或-PABC-Cit-Val-(PEG)p-β-Ala-[Sar]m
其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；
m为≥1的正整数，较佳地，m＝1至10，最佳地，m＝5、8或10；
p为≥1的正整数，较佳地，p＝1至10，最佳地，p＝2或10。
在另一优选例中，所述细胞毒性剂与所述双环肽之间的接头包含一个或多个氨基酸残基。
在另一优选例中，所述氨基酸残基残基选自下组：Ala、Cit、Lys、Trp、Val或其组合。
本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)如本发明第二方面所述的药物偶联物；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中还包含治疗肿瘤的其他药物。
本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多肽，或如本发明第二方面所述的药物偶联物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症高表达Nectin-4蛋白。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症包括但不限于急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、头颈癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明的第五方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采用固相合成方法合成线性多肽；和
(2)可选择的，将步骤(1)所得线性多肽与环化试剂进行环化反应，从而得到环肽。
本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第二方面所述的药物偶联物的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)提供一接头和有效荷载，使所述接头与有效荷载在有机溶剂中反应以获得中间体；
(B)使用活化试剂对中间体进行活化；
(C)将本发明第一方面所述的多肽与步骤(A)的中间体进行活化酯反应，从而获得所述药物偶联物；
(D)对步骤(C)中的药物偶联物进行纯化。
本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的多肽在制备用于检测Nectin-4蛋白的检测试剂或试剂盒中的用途。
本发明的第八方面，提供了一种检测样品中Nectin-4蛋白的方法，所述方法包括步骤：(i)将样品与如本发明第一方面所述的多肽接触；(ii)检测是否形成多肽-Nectin-4蛋白复合物，其中形成复合物就表示样品中存在Nectin-4蛋白。
在另一优选例中，所述的检测为非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述检测用于肿瘤或癌症的诊断或预后。
本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如本发明第一方面所述的多肽。
在另一优选例中，所述试剂盒用于检测样品中的Nectin-4蛋白。
在另一优选例中，所述样品包括血液样本、体液样本或组织样本。
在另一优选例中，所述试剂盒还包含说明书，所述说明书记载所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的Nectin-4蛋白表达。
本发明的第十方面，提供了一种治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第二方面所述药物偶联物或本发明第三方面的药物组合物。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症高表达Nectin-4蛋白。
在另一优选例中，所述肿瘤或癌症包括但不限于急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、头颈癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1为本发明的SMTA33直链肽质谱图
图2为本发明的SMTA33质谱图
本发明人经过广泛而深入的的研究，通过大量的实验筛选，首次意外地研发了一类特异性靶向Nectin-4的靶向肽，所述靶向肽包括含有非天然氨基酸的线性肽或环肽，并利用所述靶向肽制备靶向肽-药物偶联物。本发明制备的靶向肽为含非天然化学修饰的线性肽或环肽(尤其是氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的靶向肽SMTA33，其氨基酸序列相对于现有靶向肽的区别主要在于将第8位的Asp(D)变为Glu(E))，可以改善靶向肽-药物偶联物的半衰期并提高其稳定性，进一步地还提高了与靶蛋白Nectin-4的结合亲和力。本发明提供的靶向肽-药物偶联物能够以高亲和力特异性结合靶蛋白Nectin-4，从而高效杀伤表达Nectin-4的肿瘤，为肿瘤治疗领域提供了一种新型抗肿瘤靶向药。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用，术语“分离的多肽”、“靶向肽”、“肽化合物”可互换使用，均指本发明第一方面的靶向Nectin-4蛋白的合成多肽。
如本文所用，术语“链内连接子(intro-chain linker)”是指在本发明所述环肽中用于环化连接多肽链内半胱氨酸残基的接头，在本发明的优选实施方式中，多肽链内的被两个不包含半胱氨酸残基的间隔序列(长度为至少三个氨基酸残基)分隔开的三个半胱氨酸残基通过链内连接子TATA(1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮)环化连接形成环肽。
如本文所用，术语“药物偶联物”、“靶向肽-药物偶联物”、“缀合化合物”可互换使用，均指本发明第一方面的多肽与一个或多个治疗剂分子(例如MMAE等小分子化合物)通过接头(连接子)缀合形成的偶联物。
本发明的靶向肽
在本发明的一个方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽为靶向Nectin-4的靶向肽。
本发明还包括本发明第一方面所述多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持结合Nectin-4的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个
或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(i ii)本发明第一方面所述多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多6个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明第一方面所述多肽的类似物。这些类似物与本发明第一方面所述多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
一些常用的非天然氨基酸列于下表B。
表B
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
本发明的药物偶联物
在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明第一方面所述的靶向肽的药物偶联物，其具有如下式III所示的结构：
(D)n-L-P (III)
其中，D为有效荷载；
L为接头；
P为本发明第一方面所述的靶向肽；
n为≥1的正整数，较佳地，n＝1至4，最佳地，n＝1或2。
在本发明的一个具体的实施方式中，所述有效荷载选自抗肿瘤药物，例如用于癌症治疗的细胞毒性剂。
在另一优选例中，所述有效荷载选自下组：烷化剂如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱类，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安丫啶、依托泊苷，磷酸依托泊苷和替尼泊苷；抗肿瘤抗生素，包括他克莫司、雷帕霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、博来霉素、刺胞霉素；免疫抑制剂。
在一些实施方式中，所述有效荷载为小分子化合物，包括但不限于甲基澳瑞他汀E(MMAE)、DNA拓扑异构酶I抑制剂(Dxd)、他克莫司、雷帕霉素。
在一些实施方式中，所述接头为-PABC-Cit-Val-戊二酰-β-Ala-[Sar]m、-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-[Sar]m、-PABC-Cit-Val-己二酰-β-Ala-[Sar]m、-MC-Gly-Gly-Phe-Gly-、或-PABC-Cit-Val-戊二酰-βAla-[Sar]m，或-PABC-Cit-Val-(PEG)p-β-Ala-[Sar]m
其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；
m为≥1的正整数，较佳地，m＝1至10，最佳地，m＝5、8或10；
p为≥1的正整数，较佳地，p＝1至10，最佳地，p＝2或10。
本发明的靶向肽制备方法
在本发明的另一方面，提供了本发明第一方面所述的多肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采用固相合成方法合成初始多肽；
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤后，加入适量有机溶剂沉淀后离心，用有机溶剂洗涤沉淀，经干燥后得到粗肽；
(3)可选择的，将步骤(2)所得粗肽与环化试剂进行环化反应，得到环化多肽。
在一些实施方式中，所述步骤(1)中固相合成所采用的树脂载体选自Wang树脂、2-CTC树脂中的一种。
在一些实施方式中，所述步骤(1)包括如下子步骤：
(a)树脂溶胀—投料(首个氨基酸/缩合试剂)—测定树脂取代值—脱除氨基保护基—溶剂洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—溶剂洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—直到最后一个氨基酸脱除氨基保护基并洗涤；
其中，所述的氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。
所述的氨基保护基可选自叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。
所述步骤(a)所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DMF或DCM。
所述步骤(a)脱除氨基保护基的脱除剂选自浓度10-40％的哌啶/DMF(PIP)，优选浓度为20-25％的哌啶/DMF(PIP)；脱除时间可选为20-50min，优选脱除时间为25-35min。
所述步骤(a)中氨基酸缩合的步骤需要加入缩合试剂，所述缩合试剂选自碳二亚胺型试剂、苯并三氮唑鎓盐型试剂或1-羟基苯并三唑(HOBt)中的一种或两种组合。
所述碳二亚胺型试剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)中的一种。
所述苯并三氮唑鎓盐型试剂选自2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)中的一种。
所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。在一些实施方案中，步骤(a)中所述的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
所述步骤(a)中所述的顺序偶联剩余氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
在一些实施方式中，步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂选自茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇或间甲酚中的一种、两种或几种组合。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂选自三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷：水＝95:2.5:2.5(V/V/V)。
在一些实施方式中，步骤(3)中所述的环化反应需加入环化试剂和碳酸氢铵(NH4HCO3)，其中环化试剂选自1，3，5-三丙烯酰基六氢-1，3，5-三嗪。
本发明所提供的多肽制备方法从步骤(2)获得粗品后还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
本发明的靶向肽-药物偶联物制备方法
在另一方面，本发明还提供了用于制备本发明所述的药物偶联物的方法，所述的方法包括：
(A)提供一接头和有效荷载，使所述接头与有效荷载在含有机碱的有机溶剂中反应以获得中间体；
(B)使用活化试剂对中间体进行活化；
(C)将本发明的靶向肽与步骤(A)的中间体进行活化酯反应，从而获得所述靶向肽-药物偶联物；
(D)对步骤(C)中的靶向肽-药物偶联物进行纯化。
在一些实施方式中，所述步骤(A)中使用的接头选自-PABC-Cit-Val-戊二酰-β-Ala-[Sar]m、-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-[Sar]m、-PABC-Cit-Val-己二酰-β-Ala-[Sar]m、-MC-Gly-Gly-Phe-Gly-、或-PABC-Cit-Val-戊二酰-βAla-[Sar]m，或-PABC-Cit-Val-(PEG)p-β-Ala-[Sar]m
其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；
m为≥1的正整数，较佳地，m＝1至10，最佳地，m＝5、8或10；
p为≥1的正整数，较佳地，p＝1至10，最佳地，p＝2或10。
在一些实施方式中，所述步骤(A)中有效荷载为小分子化合物，包括但不限于甲基澳瑞他汀E(MMAE)，DNA拓扑异构酶I抑制剂(Dxd)，他克莫司、雷帕霉素。
在一些实施方式中，步骤(A)中的有机溶剂选自DMSO、DCM、DMF、或THF，优选DMSO。
在一些实施方式中，步骤(A)中的有机碱选自DIEA、TEA、DMAP其中的一种或者组合；优选DMAP/三乙胺。
在一些实施方式中，步骤(B)中的活化试剂选自2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)中的一种。
在一些实施方式中，所述步骤(C)中治疗剂在赖氨酸残基处与靶向肽相连，并且其中靶向肽包含与其连接的1、2、3或者4个治疗剂分子连接其上。
在一些实施方式中，所述步骤(D)中所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明第二方面所述的药物偶联物；以及(b)药学上可接受的载体。本发明药物偶联物在药物组合物中的量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明的药物偶联物。此外，本发明的药物偶联物可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生
对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有冻干粉针剂、注射剂、口服制剂等。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
治疗性应用
本发明还提供了所述多肽和药物偶联物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第二方面所述药物偶联物。
其中，所述肿瘤或癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤，所述肿瘤或癌症高表达Nectin-4蛋白。可使用本发明的药物偶联物进行治疗的肿瘤或癌症包括但不限于急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、头颈癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明提供的药物偶联物中的多肽是含非天然化学修饰的肽或环肽，可以改善半衰期并提高稳定性。
(2)本发明提供的药物偶联物中的多肽与靶蛋白的亲和力远高于现有技术，可以更有效的结合Nectin-4靶蛋白，实现有效内吞，并且在与Nectin-4其它配
体的竞争结合中更占优势。
(3)本发明提供的药物偶联物中的多肽相比现有技术，非天然氨基酸更多或环大小更小，可以改善半衰期提高稳定性或降低生产成本。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：靶向肽SMTA01的制备
靶向肽SMTA01的结构式：
Aib-Pro-1Nal-D-Asp-Aib-Met-HArg-Asp-Trp-Ser-Thr-Pro-Hyp-Trp-Aib
材料及试剂：表1
仪器：表2
1.SMTA01粗肽的制备
称取CTC树脂1.0g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml DCM，浸泡2h；按下表进行投料进行第一个氨基酸的缩合：
表3
用DCM洗涤树脂6次；随后加入20％PIP/DMF溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色；称取三倍量的Fmoc-Trp(Boc)-OH，DIC，HOBT加入10ml DMF溶解，加入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测为蓝紫色则表示缩合反应不完全，无色则为反应完成。按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成，用DCM洗涤树脂6次，真空干燥树脂。
按照1g树脂加入10ml裂解试剂的比例配置裂解试剂，试剂配比为TFA:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(V:V:V)，裂解试剂加入树脂中，室温搅拌反应3小时，抽滤，旋蒸除去部分TFA，向抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，沉淀用冰乙醚反复洗涤4-5次，真空干燥，称重。
2.SMTA01的纯化和分析
用半制备型RP-HPLC，对粗肽进行纯化。
(1)纯化
色谱柱：YMC-pack ODS-A-HG C18制备柱(10mm×250mm,10μm)
流速：5ml/min
检测波长：215nm、280nm
流动相：A相：0.1％HAc/水溶液
B相：0.1％HAc/乙腈
梯度洗脱程序如下表：
表4
(2)分析
用Thermo U3000型HPLC，对收集产物进行分析
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)
流速：1ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.05％TFA/水
B相：0.05％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表:
表5
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证与理论分子量相符。
实施例2：靶向肽SMTA33的制备
靶向肽SMTA33(SEQ ID NO:28)的结构：
1.SMTA33直链肽粗肽的制备
称取CTC树脂1.0g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml DCM，浸泡2h；
按下表进行投料进行第一个氨基酸的缩合：
表6
用DCM洗涤树脂6次；随后加入20％PIP/DMF溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色；称取三倍量的Fmoc-Trp(Boc)-OH，DIC，HOBT加入10ml DMF溶解，加入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测为蓝紫色则表示缩合反应不完全，无色则为反应完成。按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成，用DCM洗涤树脂6次，真空干燥树脂。
按照1g树脂加入10ml裂解试剂的比例配置裂解试剂，试剂配比为TFA:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(V:V:V)，裂解试剂加入树脂中，室温搅拌反应3小时，抽滤，旋蒸除去部分TFA，向抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，沉淀用冰乙醚反复洗涤4-5次，真空干燥，称重。
2.SMTA33直链肽的纯化和分析
(1)纯化
色谱柱：YMC Triart C18-S C18制备柱(10mm×250mm,10μm)
流速：5ml/min
检测波长：215nm、280nm
流动相：A相:50mM PBS,pH8.0；B相:乙腈
梯度洗脱程序如下表：
表7
(2)分析
用Thermo U3000型HPLC，对收集产物进行分析
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)
流速：1ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.05％TFA/水；B相：0.05％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如下表:
表8
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证与理论分子量相符。
3.SMTA33直链肽的环化
称取SMTA33直链肽30mg，加入1ml水溶解，用碳酸氢铵调pH至8.0，称取1.5eq 1，3，5-三丙烯酰基六氢-1，3，5-三嗪溶于乙腈中，将环化试剂的乙腈溶液加入到肽溶液中，室温下反应0.5h～1h，HPLC监控反应进程。
4.SMTA33的纯化和分析
色谱柱：YMC Triart C18-S C18制备柱(10mm×250mm,10μm)
流速：5ml/min
检测波长：215nm、280nm
流动相：A相:50mM PBS,pH8.0；B相:乙腈
梯度洗脱程序如下表：
表9
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1094.44【M+2H】2+，与理论分子量相符。
实施例3：其余系列靶向肽化合物的制备与纯化
按照实施例1或实施例2中所述的方法，制备其余靶向肽化合物，经ESI-MS进行分子量确证。本发明制备的靶向肽如下：
注：NA表示未测定
实施例4：表面等离子共振(SPR)亲和力测定
使用SPR技术研究本发明制备的靶向肽与Nection-4蛋白的亲和力，确定动力学参数Ka(M-1s-1)、Kd(s-1)、KD(M)。
采用Biacore 8K仪器，通过标准的生物素-链霉素偶联方式将生物素化的Nection-4蛋白固定在SA芯片上，偶联水平1200～3000RU水平。采用PBST(0.02％Tween)溶解靶向肽，制成浓度为88nM的母液，用PBST以2倍稀释法制备浓度梯度样品。在25℃下以PBST为运行缓冲液，10mMGly(PH3.0)为再生缓冲液，运行SPR，结合时间为60S，解离时间为60～100S，采用相应的软件对数据进行处理和动力学拟合，靶向肽的动力学数据如下所示：
表10
注：NA表示未测定或未结合
同时测定了现有技术中靶向肽的亲和力：
现有技术中靶向肽(SMTA55)的结构：
(SEQ ID NO:33)
测定方法：采用Biacore 8K仪器，通过标准的生物素-链霉素偶联方式将生物素化的Nection-4蛋白固定在SA芯片上，偶联水平1200～3000RU水平。采用PBST(0.02％Tween)溶解靶向肽，制成浓度为88nM的母液，用PBST以2倍稀释法制备浓度梯度样品。在25℃下以PBST为运行缓冲液，10mMGly(PH3.0)为再生缓冲液，运行SPR，结合时间为60S，解离时间为60～100S，采用相应的软件对数据进行处理和动力学拟合。
结果显示，现有技术中靶向肽的亲和力KD：2.41*10-9M。
实施例5：制备靶向肽-药物偶联物
以SMTA331(SMTA33偶联MMAE)为例，制备靶向肽-药物偶联物。
肽HM-1295C_1按照通用方法合成，在50％乙腈/水(25mL)中的溶液中，加入肽HM-1295C_1(50mg，0.024mmol)并搅拌，随后加入化合物1a(7.72mg，0.031mmol)，并用1M浓度的碳酸氢铵调节pH值至8。2小时后，LC-MS显示反应完全。通过冷冻干燥除去溶剂，得到粗肽HM-1295C_2。通过制备型HPLC(40％
乙腈/水，含0.1％三氟乙酸)纯化粗产物，得到所需产物，为白色固体(30mg，产率:43％)。
DMF溶解的HM-1295B_5(56mg,0.27mmol，CAS:19364-66-0)加入HATU(84mg,0.22mmol)、DIEA(29mg,0.22mmol)。室温搅拌0.5h，然后加入HM-297I_2(100mg,0.09mmol,CAS:644981-35-1)。混合物在室温下搅拌2h。通过制备型HPLC(40％乙腈/水，含0.1％三氟乙酸)纯化粗产物，得到HM-1295B_6，为白色固体(60mg，产率:47％)。
DMF(3mL)溶解的HM-1295B_6(200mg,0.153mmol)加入到HoSu(23mg,0.2mmol)、EDCI(150mg,0.765mmol)中，混合物室温搅拌1h。通过制备型HPLC(40％乙腈/水，含0.1％三氟乙酸)纯化粗产物，得到白色固体(120mg，产率:43％)HM-1295B_3。
将HM-1295C_2(25mg，0.009mmol)和HM-1295B_3(17mg，0.0119mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，然后在反应混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(3.5mg，0.027mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌2小时。LC-MS显示HM-1295B_2完全消耗，并检测到一个具有所需分子量m/z的主峰。通过制备型HPLC(三氟乙酸条件)纯化反应混合物，得到白色固体形式的所需产物HM-1295C_3(10mg，产率:27％)，即靶向肽-药物偶联物SMTA331。
其他靶向肽药物偶联物均采用类似方法制备，在此不再赘述。
靶向肽-药物偶联物SMTA311(SMTA31偶联MMAE)的结构：
靶向肽-药物偶联物SMTA391(SMTA39偶联MMAE)的结构：
靶向肽-药物偶联物SMTA451(SMTA45偶联MMAE)的结构：
现有技术中靶向肽-药物偶联物SMTA551(SMTA55偶联MMAE)的结构：
实施例6：细胞毒性实验
测试样品：SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551
对照样品：MMAE
实验方法：
测试细胞系：非小细胞肺癌细胞NCI-H292，膀胱癌细胞HC1376,乳腺癌细
胞MDA-MB-468。
将肿瘤细胞系在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
1.细胞铺板
(1)用台盼兰进行细胞染色并计数活细胞。
(2)将细胞浓度调整至合适浓度。
(3)在培养板中每孔加入90μL细胞悬液，在空白对照孔中加入不含细胞的培养液。
(4)将培养板在37℃，5％CO2,及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
2.SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551存储板制备
制备SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551存储板：将SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551用DMSO从最高浓度梯度稀释至最低浓度。
3.10X偶联物工作液的配制及PDC处理细胞
(1)10X偶联物工作液的配制：在V形底的96孔板中加入990μL细胞培养液，从1000X SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551存储板中分别吸取10μL SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入10μL相对应的溶剂，用排枪吹打混匀。
(2)加药：取10μL的10X SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551工作加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白对照中加入10μL相对应的溶剂。
(3)将96孔细胞板放回培养箱中培养72小时。
4.CellTiter-Glo发光法细胞活性检测
以下步骤按照Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒的说明书来进行。
(1)将CellTiter-Glo缓冲液融化并放置至室温。
(2)将CellTiter-Glo底物放置至室温。
(3)在一瓶CellTiter-Glo底物中加入CellTiter-Glo缓冲液以溶解底物，从而配制CellTiter-Glo工作液。
(4)缓慢涡旋震荡使充分溶解。
(5)取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温。
(6)在每孔中加入50μL(等于每孔中细胞培养液一半体积)的CellTiter-Glo工作液。用铝箔纸包裹细胞板以避光。剩余CellTiter-Glo工作液分装至50mL离心管中，-20℃避光保存，并在一个月内使用完毕。
(7)将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解。
(8)培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号。
(9)在2104 EnVision读板器上检测发光信号。
细胞毒性实验结果如下：表11
结果与讨论：SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451、SMTA551对NCI-H292，HC1376，MDA-MB-468肿瘤细胞都有杀死肿瘤细胞或抑制生长的作用，并且SMTA311、SMTA331、SMTA391、SMTA451在部分细胞系中IC50值低于SMTA551，具有比SMTA551更好的杀伤肿瘤细胞的效果。
实施例7：靶向肽-药物偶联物动物模型药效研究
1.实验目的:评价受试物在BALB/c nude小鼠MDA-MB-468皮下移植瘤模型中的体内药效。
2.实验设计
表12体内药效实验动物分组及给药方案
注：
a.N:每组小鼠数目
b.给药容积：根据小鼠体重10μl/g。如果体重下降超过15％，给药方案应做出相应调整。
c.如果体重下降超过15％(相比于D0)，暂时停药，待小鼠体重恢复到下降<10％后再继续给药。
3、实验材料
实验动物及饲养环境
3.1.1.实验动物
种属：小鼠
品系：BALB/c nude
周龄：6～8周龄
性别：雌性
体重：18～22克
数量：65只，不包括分组剩余鼠
3.1.2.饲养环境
动物到达后在实验环境饲养7天后方开始实验。动物在SPF级动物房以IVC(独立送风系统)笼具饲养(每笼5只)。每笼动物信息卡注明笼内动物数目，性别，品系，接收日期，给药方案，实验编号，组别以及实验开始日期。所有笼具、垫料及饮水在使用前均灭菌。笼具、饲料及饮水每周更换两次。饲养环境及光照情况如下：
温度：20～26℃
湿度：40～70％
光照周期：12小时光照，12小时无光照(上午8点开灯～下午8点关灯)
笼具：以聚碳酸酯制成，体积300mm x 180mm x 150mm。垫料为玉米芯，每周更换两次。
食物：实验动物在整个实验阶段中可自由进食(照射灭菌，干颗粒状食物)。
饮水：实验动物可自由饮用灭菌水。
笼具标识：每笼动物信息卡应注明笼内动物数目，性别，品系，接收日期，给药方案，实验编号，组别以及实验开始日期。
4、实验方法与步骤
4.1细胞培养
MDA-MB-468细胞体外贴壁培养，培养条件为L-15培养基中加10％胎牛血清和1％PS，37℃，0％CO2培养。一周常规传代2次。当细胞维持在指数增长期时，收取细胞，计数，接种。
4.2肿瘤细胞接种
在每只BALB/c nude小鼠的右侧颈背部接种0.2mL(10×106个+Matrigel)MDA-MB-468细胞。接种同时将实验动物进行耳标号标记，作为后续实验的唯一确认标志。等待肿瘤生长，接种后第27天肿瘤平均体积达到132mm3时开始进行随机分组给药。具体分组后的信息见表12。
4.3实验动物日常观察
本实验方案的拟定及任何修改均通过了南通药明康德新药开发有限公司实验动物管理与使用委员会(IACUC)的评估核准。实验动物的使用及福利遵照国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)的规定执行。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤生长和药物治疗对动物日常行为表现的影响如行为活动，摄食摄水量(仅目测)，体重变化(每周测量两次体重)，外观体征或其它不正常情况。
4.4肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)的计算：T/C％＝某处理组给药结束时平均肿瘤体积/溶剂对照组治疗结束时平均肿瘤体积×100。
4.5统计分析
统计分析基于开始给药后第35天每组肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)。三组或多组间比较用one-way ANOVA。使用GraphPad Prism软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
本发明的靶向肽-药物偶联物在体内能够有效抑制肿瘤生长，抑瘤效果显著优于阳性对照SMTA551，并且毒副作用更低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
- 一种分离的多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽包含修饰或未修饰的非天然氨基酸，并且所述多肽特异性靶向Nectin-4蛋白。
- 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为环肽，所述环肽具有式A所示结构：Z0-Y1-Z1 (A)式中，Z0或Z1为无，或1、2或3个氨基酸残基；Y1为具有环结构的靶向Nectin-4蛋白的靶向肽；所述Y1包含被至少两个不包含半胱氨酸残基的间隔序列J1和J2隔开的至少三个半胱氨酸残基C1、C2和C3，所述半胱氨酸残基共同通过链内连接子(intro-chain linker)形成环结构；并且，所述Y1去除形成环结构所对应的半胱氨酸残基后具有如下式(I)所示的基础氨基酸序列：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14 (I)式中，X1为Pro；X2为1Nal或2Nal；X3为D-Asp,D-Arg或D-Glu；X4为无，或Gly,Met,或Ser；X5为无，或Gly,D-Asp,或Ser；X6为Met,Val,Nle,Thr或无；X7为hArg或Hyp；X8为Glu,D-Glu,Asp或Gln,优选为Glu；X9为Trp,5-F-Trp,Phe或1Nal；X10为Ser或Thr；X11为Thr或Ser；X12为Pro；X13为Hyp或Pro；X14为Trp、5-F-Trp或Phe；并且，所述间隔序列J1和J2衍生自式(I)所示氨基酸序列，其长度为3-10个氨基酸残基，且J1+J2的长度≥10个氨基酸残基；所述半胱氨酸残基C1位于式(I)所示氨基酸序列中X1至X3所构成的第一区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第一区段的第一个氨基酸之前，所述半胱氨酸残基C2位于式(I)所示氨基酸序列中X4至X11所构成的第二区段中任意两个氨基酸之间，半胱氨酸残基C3位于X12至X14所构成的第三区段中任意两个氨基酸之间或位于所述第 三区段的最后一个氨基酸之后。
- 如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述链内连接子(intro-chain linker)为：TATA(1,1’,1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮),即
- 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为线性肽，所述线性肽具有式B所示结构：Z0-Y2-Z1 (B)式中，Z0或Z1为无，或1、2或3个氨基酸残基；Y2为靶向Nectin-4蛋白的线性靶向肽；所述Y2具有如式II所示的基础氨基酸序列：X1-X2-X3-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14 (II)式中，X1为Pro；X2为1Nal；X3为D-Asp或D-Glu；X6为Met,Val,Nle或无；X7为hArg；X8为Glu,D-Glu,Asp或Gln,优选为Glu；X9为Trp,5-F-Trp,Phe或1Nal；X10为Ser或Thr；X11为Thr或Ser；X12为Pro；X13为Hyp；X14为Trp、5-F-Trp或Phe。
- 如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述线性肽的Y2包含插入式(II)所述基础氨基酸序列中的1个或2个半胱氨酸残基。
- 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含如式I所示的基础氨基酸序列，其中，在式I中，X8为Glu或D-Glu，优选为Glu。
- 如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同源性。
- 一种药物偶联物，其特征在于，所述药物偶联物具有如下式III所示结 构：(D)n-L-P (III)其中，D为有效荷载；L为接头；P为靶向肽，所述靶向肽为如权利要求1所述的多肽；n为≥1的正整数，较佳地，n＝1至4，最佳地，n＝1或2。
- 如权利要求8所述的药物偶联物，其特征在于，所述有效荷载选自抗肿瘤药物。
- 如权利要求8所述的药物偶联物，其特征在于，所述接头选自下组：-PABC-Cit-Val-戊二酰-β-Ala-[Sar]m、-PABC-环丁基-Ala-Cit-βAla-[Sar]m、-PABC-Cit-Val-己二酰-β-Ala-[Sar]m、-MC-Gly-Gly-Phe-Gly-、或-PABC-Cit-Val-戊二酰-βAla-[Sar]m，或-PABC-Cit-Val-(PEG)p-β-Ala-[Sar]m其中PABC代表p-氨基苄基氨基甲酸酯；m为≥1的正整数，较佳地，m＝1至10，最佳地，m＝5、8或10；p为≥1的正整数，较佳地，p＝1至10，最佳地，p＝2或10。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)如权利要求8所述的药物偶联物；和(b)药学上可接受的载体。
- 如权利要求1所述的多肽，或如权利要求8所述的药物偶联物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
- 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或癌症高表达Nectin-4蛋白。
- 如权利要求1所述的多肽在制备用于检测Nectin-4蛋白的检测试剂或试剂盒中的用途。
- 一种治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求8所述药物偶联物或如权利要求11所述的药物组合物。
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