CN117964697A - 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤化合物，所述抗肿瘤化合物为N端连接保护基团、C端连接具有细胞毒活性的分子片断的多肽，所述多肽的氨基酸序列为RGDAAN或RGDKTAN。该抗肿瘤化合物将多肽与具有细胞毒性的分子成功实现了偶联，不仅能够实现肿瘤靶向，并且在进入细胞后，仅在具有豆荚蛋白的肿瘤环境下才能释放药物，具有良好的选择性，并具有良好的抗肿瘤活性。

Description

一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种多肽与小分子药物共价结合的抗肿瘤偶联化合物，及其制备方法和在制备肿瘤治疗药物中的应用。

背景技术

目前癌症是全世界范围内影响人类健康的最大疾病之一，严重威胁着人类的生活及健康。黑色素瘤是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤。临床上常规化疗仍然是治疗癌症的主要方法。高剂量的细胞毒性药物通常是杀死肿瘤细胞必需的条件，但传统的化疗药物难以区分癌细胞和正常细胞，从而加重诸如心脏、毛囊、皮肤、骨髓、消化道和生殖系统等的全身毒性。因此，改善药物肿瘤输送的靶向性是提高细胞毒性药物治疗效果，降低化学药物治疗毒性的重要因素之一。

近年来，多肽-药物偶联物(Peptide-Drug Conjugate，PDC)作为靶向抗肿瘤药物受到广泛的关注。与正常细胞相比，肿瘤细胞通常高表达某种受体，PDC研发策略在于设计一种能与受体特异性结合的短肽，并将短肽与毒性载荷结合，提高药物肿瘤输送的靶向性。这些短靶向肽通常由数十种氨基酸组成，且能够化学合成，生产便捷。

PDC由多肽通过连接子与药物特异性结合，多肽作为肿瘤靶向载体具有许多优势。多肽基团优先靶向肿瘤细胞，并通过在肿瘤部位或肿瘤内而不是在健康组织中释放细胞毒性载荷来限制脱靶细胞毒性。

目前有多种PDC药物获得FDA批准上市，最早获批的PDC药物是¹¹¹In-DTPA-Octreotide一种通过静脉注射定位癌性肿瘤的诊断药物，于1994年在美国上市。奥曲肽(Octreotide)被用作靶向生长抑素受体(somastotatin receptor,SSTR)的肿瘤靶向肽，¹¹¹In作为有效载荷与DTPA(Diethylene triamino pentaacetic acid)螯合。尽管在转移性神经内分泌肿瘤患者中使用高剂量/>可以缓解症状，但肿瘤大小的消退并不令人满意，因此仅被批准用于SSTR阳性肿瘤的诊断成像。迄今为止最成功的放射性PDC治疗药物是诺华子公司Advanced Accelerator Applications S.A的¹⁷⁷Lu-DOTATATE这是第一款多肽受体放射性核素治疗(Peptide Receptor RadionuclideTherapy,PRRT)药物，由生长抑素作为归巢肽，经肌注用于治疗SST受体阳性胃肠胰神经内分泌肿瘤，2018年1月26日获得FDA批准。Melflufen/>是Oncopeptides公司PDC平台的先导药物，这是一种靶向氨肽酶(aminopeptidase)的PDC，能迅速将烷化剂Melphalan作为有效载荷传递到肿瘤细胞中，用于治疗多发性骨髓瘤，2021年2月27日获得FDA批准。

RGD序列是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的短肽序列，可以与细胞表面的整合素受体细胞外结构域发生特异性结合。这些受体在人体各种组织特异性表达以及其表达谱与各种病理生理条件关联紧密，使这些受体成为多种疾病诊断和治疗的合适靶向候选药物。基于RGD的整合素配体已在生物医学研究中广泛应用。由于一些特定整合素受体如αvβ3受体在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞上过表达，现有技术利用RGD序列将治疗剂或诊断剂特异性递送至癌细胞中。然而，RGD结合的整合素受体同样在正常组织、血液和其他体液中存在并发挥生理作用，因此基于RGD靶向递送的药物安全性显著影响了相关抗肿瘤产品的开发。第一个整合素靶向药物是阿昔单抗，但该药可能通过促血栓机制诱导直接毒性作用，未能达到研究终点。2003年，依法珠单抗获批，但由于进行性多灶性脑白质病的不良反应，于2009年撤回。2013年，西仑吉肽在胶质母细胞瘤治疗临床试验中失败。迄今为止，尚无获批的靶向αv-整合素的药物。

PDC提供了小分子靶向递送至病变组织，以提高局部药物浓度，并减轻非病变组织中全身暴露和蓄积引起的毒性作用。但组成偶联物的药物和多肽需要通过不同的途径协同获得理想疗效。多肽的组织特异性递送作用受多种因素影响。细胞外多肽受体必须以配体依赖性方式内化足够的药物小分子，并进一步从PDC上释放，以使药物产生药理作用。同时需要考虑PDC在正常组织的毒性引起药物不良反应问题。因此设计考虑功效和选择性相匹配的结构至关重要。(moleclues,2019,24:1855)

发明内容

针对上述现有技术的问题，本发明提供一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用，该抗肿瘤化合物将多肽与具有细胞毒性的分子成功实现了偶联，不仅能够实现肿瘤靶向，并且在进入细胞后，仅在具有豆荚蛋白的肿瘤环境下才能释放药物，具有良好的选择性，并具有良好的抗肿瘤活性。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种抗肿瘤化合物，所述抗肿瘤化合物为N端连接保护基团、C端连接具有细胞毒活性的分子片断的多肽，所述多肽的氨基酸序列为RGDAAN或RGDKTAN。

优选的，所述保护基团为乙酰基(Ac)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)。

优选的，所述具有细胞毒活性的分子片断来自于柔红霉素或阿霉素。

优选的，所述抗肿瘤化合物为Ac-RGDKTAN-柔红霉素或其药物上可接受的盐，或者Fmoc-RGDAAN-阿霉素或其药物上可接受的盐。

所述Ac-RGDKTAN-柔红霉素的结构式为：

所述Fmoc-RGDAAN-阿霉素的结构式为：

本发明还提供上述抗肿瘤化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用固相合成法制备N端连接保护基团的所述多肽；

(2)将步骤(1)制得的N端连接保护基团的所述多肽与具有细胞毒活性的分子加入到溶剂中，加入苯并三唑四甲基四氟硼酸(TBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)反应，即得。

优选的，所述N端连接保护基团的所述多肽与所述具有细胞毒活性的分子的摩尔比为1:1。

优选的，步骤(2)中所述反应的时间为2h。

本发明还提供一种含有上述抗肿瘤化合物的药物组合物。

本发明还提供上述抗肿瘤化合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

所述肿瘤是结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、黑色素癌、骨肉瘤或血液瘤。

本发明的有益效果在于：

本发明制备的抗肿瘤化合物将多肽与具有细胞毒性的分子成功实现了偶联，不仅能够实现肿瘤靶向，并且在进入细胞后，仅在具有豆荚蛋白的肿瘤环境下才能释放游离药物，具有优良的肿瘤细胞选择性。

本发明制备的抗肿瘤化合物在抗肿瘤治疗中具有显著的治疗效果。

本发明制备的抗肿瘤化合物由于仅在肿瘤环境下释放游离药物，对组织的毒性显著降低。

附图说明

图1是实施例2制得的Fmoc-RGDAAN-阿霉素分别在214nm和480nm的高效液相色谱分析图谱。

图2是实施例4中不同浓度的Fmoc-RGDAAN-阿霉素在293T细胞和B16-F10细胞的流式分析图。

图3是实施例5中动物在实验期间的体重变化图。

图4是实施例5中动物11天时的肿瘤体积图。

图5是实施例5中动物11天时的肿瘤重量图。

图6是实施例5中动物11天时的肿瘤形态。

图7是实施例5中获得的肿瘤、肝脏、心脏组织切片图(比例尺为50mm)。

具体实施方式

实施例1

制备Ac-RGDKTAN-柔红霉素：

(1)将Wang树脂用DCM溶液进行浸泡溶胀，DMF溶液对树脂进行冲洗。称量相当于6倍树脂担载量的Fmoc-Asn(Trt)-OH、以及适量DIEA和DCM溶液加入反应管中，再加入DMF溶液(使DCM：DMF＝1:1)反应2h。洗涤树脂、脱除Fmoc基团并用茚三酮检测。称量3倍树脂担载量的相应Fmoc保护氨基酸、以及适量HOBt、TBTU及DIEA加入反应管中，加入DMF溶液反应。重复洗涤、脱除Fmoc基团及检测的操作。

按照多肽序列RGDKTAN重复以上步骤，完成肽链偶联。最后用醋酸酐进行N端保护，得到Ac-RGDKTAN-Wang树脂，洗涤后真空干燥树脂。

将树脂加入切割液三氟乙酸TFA:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(v/v/v)反应，最终得到的白色絮状固体即为多肽Ac-RGDKTAN-OH，-20℃保存，高效液相色谱进行纯化，质谱对其进行表征。

(2)将合成的多肽与柔红霉素盐酸盐以摩尔比1:1的投料比加入到DMF中，加入TBTU和DIEA，反应2h，得到的Ac-RGDKTAN-柔红霉素粗品通过高效液相色谱纯化，冻干得到Ac-RGDKTAN-柔红霉素，-20℃保存，并使用高效液相色谱和质谱对其进行表征。使用ESI-MS进行结构表征。

ESI-MS实验条件如下：Endplate offset为-500V，毛细管电压为4000V，雾化器压力为1.5bar，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为180℃，一级扫描质量范围m/z 400-2000，得到[M+2H]²⁺为656.92，[M+H]⁺为1311.57。

实施例2

制备Fmoc-RGDAAN-阿霉素：

(1)使用2-Cl树脂作为制备固相载体、Fmoc-氨基酸为原料、DIC/4-二甲氨基吡啶以及HOBt/DIC为缩合剂、20％哌啶为脱Fmoc试剂、茚三酮为反应指示剂、混合溶液三氟乙酸TFA:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(v/v/v)为切割剂，制得粗肽Fmoc-RGDAAN-OH。所制备粗肽样品采用RP-HPLC进行纯化和纯度分析，使用ESI-MS进行结构表征。

RP-HPLC的实验条件如下：Phenomenex PEPTIDE(C18，250mm×4.6mm，5mm)色谱柱，柱温25℃，检测波长214nm，流动相A为含1‰三氟乙酸的水，流动相B为含1‰三氟乙酸的乙腈，流速1ml/min，梯度洗脱为B：20％-70％(0-20min)，进样量20mL。

ESI-MS实验条件如下：Endplate offset为-500V，毛细管电压为4000V，雾化器压力为1.5bar，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为180℃，一级扫描范围m/z 400-2000，得到[M+H]为826.09。

(2)将合成的多肽Fmoc-RGDAAN-OH与阿霉素盐酸盐以摩尔比1:1的投料比加入到DMF中，加入TBTU和DIEA，反应2h，得到的Fmoc-RGDAAN-阿霉素粗品通过高效液相色谱纯化，冻干得到Fmoc-RGDAAN-阿霉素，-20℃保存，并使用高效液相色谱和质谱对其进行表征。

RP-HPLC的实验条件同上，检测波长214nm和480nm。谱图如图1所示。

ESI-MS实验条件如下：Endplate offset为-500V，毛细管电压为4000V，雾化器压力为1.5bar，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为180℃，一级扫描和自动二级全扫描质量扫描范围m/z 400-2000，得到[M+2H]²⁺为675.27，[M+H]⁺为1349.53。

ESI-MS/MS实验条件如下：喷雾电压(+)为1500.00V，毛细管温度为320.00℃，最大喷雾电流为50.00V，RF水平为40.00，离子源为NSI，扫描范围为m/z 300-1800，得到Fmoc-RGDAAN-阿霉素的碎片质量数551.2249，622.2617，693.2983，807.3405。

对比实施例2

制备Boc-RGDPTN-表阿霉素：

(1)采用实施例1步骤(1)的方法制备、切割纯化得到多肽Boc-RGDPTN-OH。

(2)将合成的多肽与表阿霉素以摩尔比1:1的投料比加入到DMF中，加入TBTU和DIEA，反应2h，得到Boc-RGDPTN-表阿霉素。质谱结果为[M+2H]²⁺642.81，[M+H]⁺1284.52。

实施例3

(1)Fmoc-RGDAAN-阿霉素的体外抗肿瘤活性：

采用MTT法测细胞毒性。将胰酶消化后的293T和B16-F10细胞以每孔200mL，共4×10³个细胞加到96孔板中培养。细胞贴壁后去除培养基，加入用新鲜培养基稀释的不同浓度的药物。阴性对照组加入无菌水，实验组为不同浓度的实施例2制得的Fmoc-RGDAAN-阿霉素，浓度分别为33nM，100nM，333nM，1000nM，3333nM和10000nM，阳性对照组加入阿霉素，浓度参照实验组，在孵育72h后将所有组吸走100mL，加入10mL浓度为5mg/ml MTT溶液放入培养箱培养4h，取出每孔加入100mL甲臜溶解液继续培养4h，直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜全部溶解后取出，通过多功能酶标仪检测96孔板在570nm处的OD值，每组重复三次。Fmoc-RGDAAN-阿霉素在72h对B16-F10细胞的IC₅₀为3650nM，阳性对照组的IC₅₀为69.92nM。阿霉素组和Fmoc-RGDAAN-阿霉素组在48h的293T细胞存活率分别为48％和101％。

(2)Boc-RGDPTN-表阿霉素的体外抗肿瘤活性：

MTT法测细胞毒性。将胰酶消化后的B16-F10细胞以每孔200mL，共4×10³个细胞加到96孔板中培养。细胞贴壁后去除培养基，加入用新鲜培养基稀释的不同浓度的药物。阴性对照组加入无菌水，实验组为不同浓度的对比实施例1制得的Boc-RGDPTN-表阿霉素，浓度分别为33nM，100nM，333nM，1000nM，3333nM和10000nM，阳性对照组加入表阿霉素，浓度参照实验组，在孵育72h后将所有组吸走100mL，加入10mL浓度为5mg/ml MTT溶液放入培养箱培养4h，取出每孔加入100mL甲臜溶解液继续培养4h，直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜全部溶解后取出，通过多功能酶标仪检测96孔板在570nm处的OD值，每组重复三次。在测试浓度范围内，未获得Boc-RGDPTN-表阿霉素在72h对B16-F10细胞的IC₅₀，阳性对照组的IC₅₀为90.67nM。

通过对比可见，豆荚蛋白对于Fmoc-RGDAAN-阿霉素和Boc-RGDPTN-表阿霉素的酶解效率存在差异。Fmoc-RGDAAN-阿霉素对于B16-F10细胞的细胞毒性更优。

实施例4

Fmoc-RGDAAN-阿霉素的体外细胞摄取作用：

通过流式细胞仪对细胞中阿霉素荧光进行定量分析，考察细胞对Fmoc-RGDAAN-阿霉素的摄取能力。

293T细胞和B16-F10细胞在24h对不同浓度的Fmoc-RGDAAN-阿霉素摄取能力如图2所示。对于B16-F10细胞而言，随着Fmoc-RGDAAN-阿霉素中阿霉素浓度的升高，相对荧光强度也随之增强，说明两种细胞以浓度依赖性方式增加对Fmoc-RGDAAN-阿霉素的摄取。高浓度时，B16-F10细胞对Fmoc-RGDAAN-阿霉素摄取能力是293T细胞的8.5倍。

实施例5

Fmoc-RGDAAN-阿霉素的体内抗肿瘤活性：

选取肿瘤大小在80-120mm³，形态均一良好的小鼠，随机分为五组：阴性对照组，阳性对照组(阿霉素5mg/kg)，Fmoc-RGDAAN-阿霉素高剂量(相当于阿霉素：8mg/kg)、中剂量(相当于阿霉素：5mg/kg)、低剂量(相当于阿霉素：2.5mg/kg)组，每组4只小鼠。将第一次进行尾静脉注射那天作为药效试验的第0天，在第2，4，6，8天再次给药。接下来每隔一天用游标卡尺来测量瘤子的长径(L)和短径(H)，并通过V＝L×H²/2公式计算肿瘤的体积，同时监测并且记录小鼠每天的体重情况，并且在最后一天取出肿瘤组织并进行肿瘤重量称重。图3、4为小鼠肿瘤给药时间曲线变化图。分别取心、肝和肿瘤，4％多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋切片和HE染色，观察组织病理学改变。

数据用单因素方差分析(one wayANOVA)进行组间比较，****表示p<0.0001有统计学意义。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤化合物，其特征在于，所述抗肿瘤化合物为N端连接保护基团、C端连接具有细胞毒活性的分子片断的多肽，所述多肽的氨基酸序列为RGDAAN或RGDKTAN。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤化合物，其特征在于，所述保护基团为乙酰基或9-芴甲氧羰基。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤化合物，其特征在于，所述具有细胞毒活性的分子片断来自于柔红霉素或阿霉素。

4.根据权利要求1-3任一所述的抗肿瘤化合物，其特征在于，所述抗肿瘤化合物为Ac-RGDKTAN-柔红霉素或其药物上可接受的盐，或者Fmoc-RGDAAN-阿霉素或其药物上可接受的盐。

5.权利要求1-4任一所述抗肿瘤化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采用固相合成法制备N端连接保护基团的所述多肽；

（2）将步骤（1）制得的N端连接保护基团的所述多肽与具有细胞毒活性的分子加入到溶剂中，加入苯并三唑四甲基四氟硼酸和N,N-二异丙基乙胺反应，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述N端连接保护基团的所述多肽与所述具有细胞毒活性的分子的摩尔比为1:1。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述反应的时间为2h。

8.一种含有权利要求1-4任一所述的抗肿瘤化合物的药物组合物。

9.权利要求1-4任一所述的抗肿瘤化合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、黑色素癌、骨肉瘤或血液瘤。