JPH0394695A - Ｈｌａ ｄｐ抗原に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＨＬＡクラス■抗原に属するＤＰ抗原に対す
るモノクローナル抗体に関する．〔従来の技術〕 ＨＬＡ抗原はヒトの臓器移植の際、移植片の定着の可否
を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たして
いる． ＨＬＡ抗原は移植免疫において拒絶現象に深く関連する
ことから主要＆ｌｌｗ８適合抗原とも呼ばれ、それをコ
ードする遺伝子群は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨ
Ｃ）と呼ばれる． ＨＬＡはヒトのＭＨＣであり、ＨＬＡクラスＩ抗原は細
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、Ａ．ＢＣの３
つの遺伝子座に支配されている．クラスＩ抗原は分子量
４４ｋｄの糖タンパク（αｇ）が分子量１２ｋｄのタン
パク質（β２−ミクログロプリン）と非共有結合によっ
て会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置するＮ末端
側に、αｌ　α２　α３の３個のドメインがあり、次い
で細胞内に埋め込まれた領域（　ｔｒａｎｓｓｅｍｂｒ
ａｎｅＲｅｇｉｏｎ　）　、細胞内に位置する領域（ｃ
ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍｅｉｎ　）が並んでいる．
β２−ミクログロフ゜リンはｌつのドメインからなり、
α鎖に結合している． ＨＬＡクラス■抗原は、膜貫通性の糖タンノくクである
分子量３５ｋｄのα鎖と分子量２７ｋｄのβ鎖が非共有
結合したヘテロダイマーである。クラス■抗原としてＤ
Ｐ抗原，　ＤＱ抗原およびＯＲ抗原があるがこれらの構
ｔ２鎖の分子サイズにわずかな違いが認められる。

｝ＩＬ＾遺伝子領域はヒト第６染色体短腕上に２．５セ
ンチモルガン（ｃＭ）の距離に亘って存在し、セントロ
メアーの側からクラスＩＩ　ｊＩ域（１．ＯｃＭ），ク
ラス■領域（ＤＲ−Ｂ間＝　０．７ｃＭ）　，　　クラ
ス■領域（０．８ｃＭ）の順に並んでいる． （Ｊｏｒｄａｎ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ　　ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
１．Ｒｅｖ．＋８４＋７３＋１９８５） ＨＬＡ−ＤＰ抗原を検査する方法として感作リンパ球試
験（ｐｒｉｍｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｔｙｐｉｎ
ｇ；ＰＬＴ）がある．これは、ＤＰ抗原が一次ＭＬＣ活
性（Ｄ抗原活性）はないが、以前に抗原を感作されたＴ
ｉｌｌ胞に対しては増殖を誘導しうるという性質を利用
した方法である。

しかし、この方法は、感作リンパ球の調製や、刺激細胞
のマイトマイシンＣ処理、細胞の培養等繁雑な処理が必
要なこと、測定に時間がかかることから血清学的分析で
ＤＰ抗原の検査を行なえるようにモノクローナル抗体の
開発が望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記事情に鑑み為されたもので、新規なモノク
ローナル抗体を提供することを目的とする． 〔課題を解決するための手段および作用〕上記課題を解
決するために、本発明ではＨＬＡＤＰヶ．鎖およびＤＰ
β１鎖を含むＤＰ抗原遺伝子をマウスの真核細胞に導入
して得られた、Ｉ｛ＬＡ−ＤＰ抗原を発現した形質転換
細胞を免疫原として用いることとした．この形質転換細
胞でマウスを免疫し、免疫後のマウスから脾細胞を取り
出してミエローマ細胞と融合して本発明のモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを作製した．本発明の
モノクローナル抗体は少なくともＨＬＡ−ＤＰｗＣＰ６
３アロ抗原特異性を有するから、ＨＬＡ−ＤＰ抗原のタ
イピングに有用である。

〔実施例〕

実施例に基づいて本発明を説明する。

この実施例においては、ＨＬＡ遺伝子クローンを得るた
めに、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉ
ｒｕｓ）で形質転換したＢリンパ球系細胞ＡＫＩＢＡ（
ＨＬＡ−Ａ２４，　Ｂｗ５２，　Ｃｗ−，　ＤＲ２，　
Ｄｗｌ２，　ＤＱｗｌ，　ＤＰｗＣｐ６３　）を用いた
．このＡＫＩＢＡ細胞は、九州大学生体防御医学研究所
遺伝学部門の笹月健彦氏によって作製されたもので、イ
ギリスのＩｍｐｅｒｉａｌ　Ｃａｎ　−ｃｅｒ　Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄのーａｌｔｅｒ　Ｂｏｄｗ＋ｅｒ
氏によって分与された． このＡＫＩＢＡ細胞からＨＬＡ　［ｌＰ抗原のα．　Ｉ
ｌとβ１鎖に対応する遺伝子クローン９ＡＰ１３９を取
出し、この遺伝子をマウスの繊維芽細胞１，　ｔｍ−　
に導入した．この［，　ｔｋ−細胞は、Ｅａｒｌｅ　Ｗ
．Ｒ．氏等によってＣ３Ｈ／ｌｉｅマウス皮下脂肪繊維
から分離されたもので（Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ
ｓｔ．＋　４．１６５．１９４３）．ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐ．Ｏ．
の旧ｃｈａｌＷｌｇｌｅｒ氏によって分与された． これによりＨＬＡ−ＤＰ抗原が発現された細胞ＬＡＰ４
ｌ０８を免疫原に用い、それ以外はモノクローナル抗体
作製の常法により、ＨＬＡ−ＤＰ抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を作製した．以下、順を追って詳細に説明す
る。

ＨＬＡ−ＤＰ　　　　クローンの ＾ＫＩＢＡ細胞ＩＸＩＯ＠個をＰＢＳ　（リン酸緩衝液
）２ｄに浮遊させ、エツペンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ社製）に入れたものを液体窒素中で凛らせ、ＦＲＥ
ＥＺＥＲ／ＭＩＬＬ　（ＳＰＥＸ社製）を用い、１２ｄ
　ｌｙｓｉｓＩｌ衝液（ｐＨ８．０）中で細胞を破壊し
たｅ　　ｌｙｓｉｓｌｌ衝液は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ｐＨ８．ｏ．２０ｍＭ　ＥＤＴＡ．０．ＩＭ　ＮａＣＩ
，１％　ＳＯＳとなるように蒸溜水に溶解したものを使
用した． これに、タンパク分解酵素であるプロネースＫ（メルク
社製）６■／ｄの濃度の水溶液３００μｌを加え、５０
℃で１２時間静置して核膜を破壊した．次いでｌ４−ト
リス飽和フェノールを加え、２Ｓ　ｒｐ一で１時間回転
して混和し、更に３０Ｗｌ用の肉厚コーレックス（Ｃｏ
ｌｅｘ社製）に移し、２，５００ｒｐ−で１０分間遠心
することによりフェノール層に抽出させ、タンパク質を
除去した．水層にＲＮＡ分解酵素であるＲＩＢＯＮＵＣ
ＬＢＡＳＢ＾（ＳＩＧＭＡ社製）及びＲＩＢＯＮＵＣＬ
ＥＡＳＥ　Ｔｌ　（ＳＩＧＭＡ社製）を最終濃度が夫々
８０μｇ／ｄ，３０μｇ／ｄになるように加え、３７℃
で２時間静置した後にフェノールを加えて反応を停止さ
せた．続いて、１時間回転して混和した後、２．５００
ｒｐ■でｌＯ分間遠心することによりフェノール層に抽
出させ、ＲＩＢＯＮＵＣＬＥＡＳＥ＾及びＲＩＢＯＮＵ
ＣＬｆ！ＡＳＥＴｔを除去した．水層に３Ｍ酢酸カリウ
ム及び２倍量のエタノールを加え、激しく攪拌してＤＮ
Ａを沈澱させた．沈澱したＤＮＡをエタノールで洗浄し
、エッペンチェーブに移して真空ポンプで乾燥した． 第１図は、上記で得られたＡＫＩＢＡ細胞のＤＮＡにお
けるＨＬＡ−ＤＰｔｌ域の遺伝子地図を示している．次
に、上記で得た３００μｇ　ＤＮＡにｌｍの↑Ｅ緩衝液
を加え、４℃で放置してＤＮＡを溶解した．ＴＢＩｌ衝
液は、１ｍＭ−Ｔｒｌｓｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８．０．　１
ｍＭ−１！ＤＴＡｐＨ８．０になるように蒸溜水に溶か
したものを使用した． 続いて、これに制限酵素Ｓａｕ３＾１　（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、３７℃で１時間静置した後、フェノール
を加え、１５．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心することに
よって酵素を除いた．この処理によりＤＮＡはＳａｕ３
Ａ１部位で切断され、第１図に示した断片ｐＡＰ１３９
を含む多数のＤＮＡ断片が得られる．こうして得られた
ＤＮＡ断片の中から、１０〜４０％シｇ糖密度勾配によ
り３０〜４０ｋｂの分画を得た．この分画は、第１図に
示したｐＡＰ１３９に対応する．コスミドＯＮ＾（Ｃｏ
ｓｍｉｄ　ｐＪＢ８　ａｒｍｓ，ＡＭＥＲＳＨＭ社製）
に制限酵素（ＢａｍＨＩ）を加え、３７℃で３時間静置
することによりコスミドを開環した．これにアルカリホ
スファターゼを加え、３７℃で３０分間静置して脱リン
化を行なった．こうして得られた開環コスミド０．３μ
ｇ　ＤＮＡに、上記で得た３μｇのＤＮＡ断片を１７５
ｕｎｉｔｓのＴ４ＤＮ＾　リガーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製
）を用いて結合させた．この組替えコスξドＤＮＡをλ
ファージのパフケージングエキストラクト（ＤＮＡ　Ｐ
ａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔベーリンガー社製）１体分に
加えて混和し、室温で１時間静置することによりファー
ジ粒子に組込んだ．これを大腸菌に加え、３７℃で２０
分間静置することにより感染させた． 上記のようにして組替えコスξドＤＮＡを導入した大腸
菌をｐＨ７．５のＮＺＹＣＭ培地中で増殖させた後、ｆ
ｌＬＡ−ＤＰのαｌ鎖およびβｌ鎖に関するｃＤＮＡを
プローブに用いたコロニーハイブリッド法によりクロー
ニングを行なった，　　ＮＺＹＣＭ培地は、１０　ｇ　
ＮＺ　Ａ＋＊ｉｎｅ　Ｔｙｐｅ　Ａ　（和光純薬製）．
　　５　ｇＮａｃ１，５　ｇＹＥＡＳＴ　ＩＩＸＴＲＡ
ＣＴ（ＤＩＦＣＯ社製）．　１　ｇ　ＶＩＴＡＭＩＮ−
ＰＲＥＥ　ＣＡＳ＾旧Ｎｏ＾ＣＩＩＩＳ　（ＤＩＦＣＯ
社製）．．２ｇ硫酸マグネシウム７水和物をｌｊ！の蒸
溜水に溶解したものである．このクローンニングにより
、ＨＬＡ−ＤＰ抗原のα１１ＮＫとβＩＩＮ遺伝子クロ
ーンを有する大腸菌のシングルコロニーを得た． こうして得た大腸菌のクローン株をＮＺＹＣＭ培地で増
殖させ、次のようにしてｐＡＰ１３９を含むＤＮＡ断片
を回収した． まず、遠心（　８　，　０００ｒｐｍ　Ｘ　２０分、４
゜Ｃ）により大腸菌を集め、’ｌ　ｍｌの５■／ｄリゾ
チーム（ＳＩＧＭＡ社製）で溶菌した後、フェノール処
理してエタノール中で沈澱させた．得られた粗ＤＮＡを
塩化セシウム密度勾配遠心（４０ｋｒｐｍ　Ｘ　４０時
間、２０゜Ｃ）にかけることによりＤＮＡのバンドに分
け、バンドを回収した。その際、ＤＮＡに２００　ｄの
５■／戚エチジウムブロマイド（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
を結合させることにより、紫外線３６０ｎ＋ｗでＤＮＡ
のバンドを検出した．次いで、セシウム飽和イソプロバ
ノール（ベーリンガーマンハイム社製）を同量加え、混
和することによりエチジウムブロマイドを除去した． 次に、上記で得たプラスミドＤＮＡ断片を、以下に述べ
る改良リン酸カルシウム法（Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎＣｅｌｌ　ｂｙ　Ｐ１ａｓｎ＋ｉｄ　ＤＮ
Ａ　；　ＣＬＡｔｌＤＩＡ　ＣＨＥＮ　ａｎｄＨＩＲＯ
ＴＯ　ＯＫＡＹＡＭＡ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ
　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｌｏｌｏｇ７．　１９８？．　ｐ
２７４５．　Ｖｏｌ．７）によりマウスの繊維芽細胞Ｌ
　ｔｍ−に導入した。

まず、１０％ＦＣＳ　（Ｆａｔａｌ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒ
ｕｍ）を含むダルベッコの修正イーグル培地　（ＤＭＥ
ｒｌ地ｉ５．９５７５ｇ　／　１．　Ｈｅｐｅｓ，　　
２．０ｇ　／　ＩＮａＨＣＯ３．　１００，０００ｕｎ
ｉｔｓ／　ｌペニシリンＧカリウム，０．１ｇ／ｌ硫酸
ストレプトマイシンを含む）を１０ｍ用い、直径１００
■のディッシュに５Ｘ１０’個の１，Ｌｋ−細胞を均一
にまき、５％ＣＯｚ．３７℃の条件下に１２時間培養し
た．培養後、培地を半量交換して３〜４時間してから、
ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱をｌｔｌｌ（ｌｄ）づつ
、ディッシュに均一にまいた．なお、ＤＮＡ−リン酸カ
ルシウム沈澱は、０．５ｄの０．２５Ｍ塩化カルシウム
及び０．５ｄの２倍ＩＢＥＳ−緩衝生理食塩液（５０＋
＋Ｍ　ＢＥＳ　ｐｌ’ｌ６．９５，２８０ｓ＋Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，１．５ｍＭ　Ｎａ＊ＨＰＯ水溶液）を２０ｕｇの
ｐＡＰ１３９遺伝子と０．５μｇのＰＳＶ２ｎｅｏ遺伝
子に加えることにより得られる．続いて、３％ｃｏ．，
　３５゜Ｃで２４時間培養した後、１０％ＦＣＳ−Ｄ？
ｌＥ？Ｉ培地にて洗浄した．更に、５％Ｃｏｗ，　３７
℃の条件で培養した。１０−のＥＤＴＡ　ｉ容液　（　
　８．０ｇ　　／　　ｊ！　　　ＮａＣ１．　　０．４
ｇ　　／　　１２　　　ＭＣＩ．１．０ｇ／４１！グル
コース．　０．３５ｇ　／　ｊ！　　ＮａＨＣＯｓ．０
．２　ｇ　／　１　（０．５４ｍＭ）　ＥＤＴＡを蒸溜
水に溶したもの）および１０ｄ　　０．０４％トリプシ
ンーＥＤＴＡ溶液（１：２５０　（ＧＩＦＣＯ社））に
より細胞を剥離し、１０倍に稀釈して再度ディッシュに
撒いた．翌日、培地の半量を４００μｇ　／　ｔａｉｌ
ネオマイシン含有１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ（ｐｓ−）　
　（ペニシリンＧカリウムと硫酸ストレプトマイシンを
除いたもの）と交換し、その後は３日ごとに培地を４０
０μｇ／ｄネオマイシン含有１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ（
ｐｓ−）　　と交換してネオマイシン耐性株を選び出し
た．このネオマイシン耐性株におけるＨＬＡ−ＤＰ抗原
の発現について、抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体７
Ｂ／２１　（ベクトンデッキンソン社製）を用いた免疫
蛍光抗体法をフローサイトメトリーＦＡＣＳｔｅｒ　（
ベクトンデツキンソン社）で解析し確認した。

上記の免疫蛍光抗体法によりＨＬＡ−ＤＰ抗原の強い発
現がＴｓ１認された細胞ＬＡＰ４１０８を増殖させ、こ
れをモノクローナル抗体作或のための免疫原とした． まず、上記で得られたＬＡＰ４１０Ｂ細胞によりマウス
を免疫した。ＩＸＩＯ’個（７）　ＬＡＰ４１０８ｔａ
胞を、（０．４　ｄのＲＰＭＩ（ｐｓ−）　　（１０．
４　ｇ　／　ＱのＲＰＭ１１６４０ＧＩＢＣＯ社製）．
　２．０　ｇ　／　ｊ！　ＮａＨＣＯ３＋　５．９５７
５　ｇ　／　１のＨｅｐｓｓ　（ＳＩＧＭＡ社製）から
なる）に浮遊させた細胞懸濁液を１週間毎に４回、Ｃ３
Ｈ／Ｈｅマウス（雌．７−８週齢（チャールスリバー社
製））の腹腔内に注射した． 最終免疫操作の３日後に、免疫したマウスの牌臓を取出
し、これをＲＰＭＩ　１６４０　（ペニシリンＧカリウ
ム，硫酸ストレプトマイシン含有）で洗い、更に新しい
ＲＰ旧１６４０中においてピンセットでほぐしてリンパ
球を取出した。こうして得られた肺臓由来Ｂリンパ球を
含むＲＰＭＩ　１６４０を１５ｍの試験管に移し、遠心
（　１　．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間．４゜Ｃ）を行な
った．集めた細胞に８ＩＩ１のトリス塩化アンモニウム
液を加えて赤血球を溶血させ、ＲＰＭＩ　１６４０で洗
浄した後、１０ｄのＲＰＭＩ１６４０に浮遊させた。

上記で得たＢリンバ球細胞と短ローマ細胞とを融合させ
ることにより、ハイブリドーマを得た．ミエローマ細胞
としては、Ｐ３−ＮＳＩ／１−＾ｇ４−１（ＭＳ−１）
を用いた。細胞融合に用いるポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）　ｉ液としては、予め次のようにして調製した
ものを使用した．即ち、Ｉｇの分子ｉｔ　ｔ．ｏｏｏの
ＰＥＧをガラス試験管にとり、オートクレープで滅菌溶
解（　２　ａｔｍ．ｌ２１　”Ｃ　．　１０分間）した
．これに０．３５ｄ　ＤＭＳＯ及びＩＩＩ１のＲＰＭ１
　１６４０（ｐｓ−）を加えて攪拌し、３７゜Ｃに保温
した．細胞融合に当っては、ＩＸＩＯ’個のミエローマ
細胞ＭＳ−１を３０−のＲＰＭＩ　１６４０に浮遊させ
、これに前記１０Ｍ１のリンパ球浮遊液を混合した．ミ
エローマ細胞の量は、リンパ球の１／１０とした．混合
液を１　．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心した後、上清
をよく取除き、遠心管を回転させながら上記の０．５ｄ
　ＰＥＧ溶液を１分間かけて滴下した．次いで、１　ｄ
ＲＰＭＩ　１６４０（ｐｓ−）を１分間で加え、更に９
−のＲＰＭ１　１６４０（ｐｓ−）を３０秒に１−づつ
加えて希釈することによりＰＥＧを希釈した．こうして
融合を終了した細胞浮遊液は．　１　．　２００ｒｐｍ
でｌＯ分間室温での遠心を行なった後、５０ＩＩｉのｌ
５％ＦＣＳ−ＲＰ旧１６４０中にリンパ球がＩＸＩＯ”
個となるように調整した． ス　翼一ニング　びクローニング 上記で得られたハイブリッド細胞から、目的とするＨＬ
Ａクラス■抗体の産生能を育するものを選び出した． ９６ウエルのマイクロプレートを用い、個々のウエルに
上記で得られた細胞浮遊液を１００μｉづつ分注した．
５％Ｃ０８、３７℃の条件で１晩培養し、翌日■＾Ｔ培
地を１００＃ｊ！づつ加えて５０％ＨＡＴ培地とした．
以後、３日ごとにＨＡ↑培地で培地交換を行なった． 次に、下記のＥＬＩＳＡ法および細胞障害試験により、
各ウエル内のハイブリドーマについて抗体産生能の確認
を行なった． ＜ＥＬＩＳＡ法〉 ９６ウエルのプレートに１００μｇ／ａｔのポリ−　Ｌ
　−　ＵジンーＰＢＳ溶液を５０ｐｌづつ各ウエルにま
き、１時間放置することによってコートした．ＰＢＳ溶
液は、１０　ｇ　　ＮａＣｌ，　５．５　ｇのＮａｔＨ
ＰＯ４＋　１．５ｇのＫＨ！ＰＯ４を蒸留水１ｌに溶か
したものを使用した． ＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、２Ｘ１０”個／ＩＩＮに
調製した細胞浮遊ＲＰＭＩ　　１６４０を５０ｐｌづつ
各ウエルにまき、１５００ｒｐｍで１０分間遠心したの
ち１０分間静置し、３００μｌの０．０２５％グルタル
アルデヒドーＰＢＳ溶液を加え、２０分間静置すること
によって細胞を固定化した．　　ＰＢＳ溶液で２回洗浄
後、３００μｌの０．１％フェニルヒドラジン−ＰＢＳ
溶液をウエルに加え、１時間静置することによって細胞
の内因性ベルオキシダーゼを押える．次に、ＰＢＳ溶液
で２回洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−Ｐ
ＢＳｉ液をウエルにいっぱい加え、４゜Ｃで１８時間放
置することによって抗体の非特異吸着を防ぎ、ＰＢＳＩ
液で２回洗浄後、サンプルとなる細胞培養液を５０μｌ
づつ加え、４゜Ｃで１８時間放置した．次に、ＰＢＳ溶
液で４回洗浄後、二次抗体となるベルオキシダーゼで標
識した抗マウスイムノグロプリン抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅＣｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｆ（ａｂ’）ｚ　　Ｆｒ
ａ２ａｅｎｔｓ　ｏｆ　ＡｆｆｉｎｉｔｙＰｕｒｉｆｉ
ｅｄ　　Ａｎｔｌｂｏｄｌｅｓ　　ｔｏ　　Ａｎｔｉ−
Ｍｏｕｓｅ　　Ｉｓｍｕｎｏｇ−１ｏｂｕｌｉｎｓ（Ｉ
ｇＡ．　　　ＩｇＧ　　　ａｎｄ　　　　ＩｇＭ）　　
　（Ｈｅａｖｙ　　ａｎｄＬｉｇｈｔＣｈａｉｎｓ　Ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ　；　Ｃａｐｐｅ１社）をＰＢＳ溶液で
４００倍に希釈したものを１００μｌづつウエルに加え
、室温で２時間放置後、ＰＢＳ溶液で３回洗浄した．そ
の後、１００，ｕｎ！の基質溶液（０−フェニレンジア
ξン２０■．クエン酸　Ｈ，０１．０６　ｇ　／２００
ｍ　，　　リン酸（ＮａＨＰＯｎ　・１２　Ｈ　ｚ）　
３．　５ｇ／２００ｄ濃度のクエン酸リン酸溶液５０ｊ
ｄ．　ｐｉ５．０，　Ｈｏｏｔ　１０μｌ）を分注し、
室温で暗所に３０分間静置し、２０Ｍ１の２Ｎ−｝１！
Ｓｏ．を添加し反応を停止させ、各ウエルの吸光度（波
長４９０ｎ■）を測定した． 〈細胞障害試験〉 １０ｕｌｌ／ウエルの流動バラフィンを入れたテラサキ
プレート（　ＮＵＮＣ社）に、サンプルとなる１μｌの
細胞培養液と、パネル細胞として種々のｌμｌの３Ｘ１
０’個／ｄ　　ＥＢウイルス形質転換Ｂリンパ芽球細胞
を入れ３７゜Ｃで１時間静置した．次いで、補体源とし
て５μｌのウサギ血清（Ｂｒｏｗｎ　Ｄｅｅｒ社）加え
た． 室温で２時間静置した後、エオシン染色にて細胞の生死
を判定した．エオシン染色は室温下に５分間行ない、判
定に際してはホルマリン固定を行なった．また、判定に
は倒立顕微鏡を用い、次の基準により行なった． 評　価　　死細胞（％） １　　　０〜１０ ２　　　１１〜２０ ４　　　　２１〜４０ ６　　　４１〜８０ ８　　　８１〜１００ 上記ＥＬＩＳＡ法および細胞障害性試験で高い測定値を
示したウエルを選択し、当該ハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングした．このスクリーニング及びク
ローニングにより、特異性のあるモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマ株として、ＡＬ／ＤＰ２３４．
２．２細胞株とＡＬ／ＤＰ　１４３．４．４細胞株が得
られた。

ロー　ル　　の 上記でクローニングしたハイブリドーマ株を１０％ＦＣ
Ｓ−ＲＰＭＩ培地においてＩＸＩＯ’個／ｄの状態から
３日間培養することによって単クローン抗体の含まれる
培養上清を得た． 且立藍豆 こうして得られたモノクローナル抗体について、以下の
特性試験を行なった． 〈細胞障害試験〉 特異性を明らかにするために、ＥＢウイルス形質転換Ｂ
リンパ芽球細胞に対し、細胞障害試験を行なった，　Ｅ
Ｂ−ウイルス形質転換Ｂリンパ芽球細胞についての結果
を第１表に示した。

モノクローナル抗体ＡＬ／ＤＰＩ４３．４．４及びＡＬ
／ＤＰ２３４．２．２の細胞障害試験結果ＣＥＬＬ　　
ＨＬＡ−ＤＰ　　ＡＬ／ＤＰｌ４３．４．４　　ＡＬ／
ＤＰ２３４．２．２ン（Ｆｌａｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｆ（ａｂ’）ｚ　Ｆｒａｇｌ′ｌＩ
ｅｎｔｓｏｆ　　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　Ｐｕｒｉｆｉｅ
ｄ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｇｏａｔ　　Ａｎ　　ｔ
ｉ−Ｍｏｕｓｅ　　Ｉｍｓ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｔｎｓ
　　（ＩｇＡ＋　　ＩｇＧ　　ａｎｄ　　　ＩｇＭ）（
Ｈｅｓｖｙ　ａｎｄ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎｓ　Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ；Ｃａｐｐｅ１社）の１５倍希釈液を加え
、暗所において室温で１５分間静置した．洗浄後、フロ
ーサイトメトリーにより解析した．その結果を第２図に
示す。

＜ＥＬＩＳＡ法〉 特異性を明らかにするため、各細胞に対してＥＬＩＳＡ
を行った．その結果を第２表に示す．〈蛍光抗体法〉 ハブロタイプの異なる細胞５Ｘ１０’個に５０μｉのハ
イブリドーマの培養上清を加え、４゜Ｃで３０分間静置
した．０．ｌ％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後、２０μｌ
の蛍光標識ヤギ抗マウスイムノグロプリ第２表 くイムノグロブリンクラス〉 オクタロニー法により、上記で得られた精製モノクロー
ナル抗体のイムノグロブリンクラスを決定したところ、
ＡＬ／ＤＰ　２３４．２．２はＩｇＧ１＾Ｌ／ＤＰ　Ｉ
４３．４．４　はＩｇＧｘｍであった．以上、上述した
実施例で得られたハイブリドーマ＾Ｌ／ＤＰ２３４．２
．２が産生ずるモノクローナル抗体＾Ｌ／ＤＰ２３４．
２．２はＤＰ抗原の中でＤＰｗＣｐ６３　アロ抗原に単
一特異性を有するから、ＨＬＡタイピング用として最適
なモノクローナル抗体であると言える．ハイブリドーマ
ＡＬ／ＤＰＩ４３．４．４が産生ずるモノクローナル抗
体ＡＬ／ＤＰ１４３．４．４はＤＰｗＣｐ６３．０ＰＭ
Ｉ　＊　ＤＰｗ３　＊　ＤＰｗ５のアロ抗原に反応性を
有し、ＤＰＨ２　．　ＤＰｗ４のアロ抗原に反応性を有
しないから、モノクローナル抗体ＡＬ／ＤＰ１４３．４
．４単独の使用だけではＨＬＡアロ抗原の正確な同定は
できないが、他のアロ抗原特異性を有するモノクローナ
ル抗体による検査結果と組み合わせることによりＦＩＬ
Ａタイピングに使用することができる．〔発明の効果〕 本発明のモノクローナル抗体はＩＩＬＡタイピングまた
はＨＬＡ抗原の生化学的解析や機能的解析に有用である
．

【図面の簡単な説明】

第１　図！；ｔＨＬＡ　ＤＰｆ＋ｆｆ　域及ヒｐＡＰ１
３９（７）位置を示す遺伝子地図、 第２図（１）は、異なるアロ抗原を発現している各種細
胞へのモノクローナル抗体ＡＬ／ＤＰ２３４．２．２の
反応性を示すフローサイトメトリー、第２図（ＩＩ）は
異なるアロ抗原を発現している各種細胞へのモノクロー
ナル抗体ＡＬ／ＤＰ１４３．４．４の反応性を示すフロ
ーサイトメトリーである、図中横軸は蛍光強度を表し、
縦軸は細胞数を表わす．

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＥＢウィルス形質転換Ｂリンパ芽球細胞から取出
   したＨＬＡ−ＤＰｗＣＰ６３アロ抗原特異性を有するＤ
   Ｐ＿α＿１鎖およびＤＰ＿β＿１鎖を含む遺伝子クロー
   ンをマウス細胞株に導入することによりＨＬＡ−ＤＰ抗
   原が発現した形質転換細胞を免疫原とし、該形質転換細
   胞で免疫したマウスから得られた脾細胞と、マウスミエ
   ローマ細胞とを融合することにより形成された抗体産生
   ハイブリドーマ細胞より得られるＨＬＡＤＰ抗原に対す
   るモノクローナル抗体。
2. （２）ＨＬＡ−ＤＰｗＣＰ６３抗原に反応する請求項１
   記載のＨＬＡ−ＤＰ抗原に対するモノクローナル抗体。
3. （３）ＨＬＡ−ＤＰｗＣＰ６３、ＤＰｗ１、ＤＰｗ３お
   よびＤＰｗ５に交差反応する請求項１記載のＨＬＡＤＰ
   抗原に対するモノクローナル抗体。
4. （４）ハイブリドーマ細胞ＡＬ／ＤＰ２３４．２．２に
   よって産生され、免疫グロブリンクラスがＩｇＧ＿１で
   あることを特徴とする請求項２記載のＨＬＡＤＰ抗原に
   対するモノクローナル抗体。
5. （５）ハイブリドーマ細胞ＡＬ／ＤＰ１４３．４．４に
   よって産生され、免疫グロブリンクラスがＩｇＧ＿２＿
   ａであることを特徴とする請求項３記載のＨＬＡＤＰ抗
   原に対するモノクローナル抗体。
6. （６）ＨＬＡ−ＤＰ抗原α鎖およびβ鎖を含む遺伝子を
   マウス細胞株に導入して得られ、ＨＬＡＤＰ抗原を発現
   した形質転換細胞をマウスに投与して免疫し、該免疫後
   のマウスから得た脾細胞と、ミエローマ細胞を融合して
   得られた抗体産生ハイブリドーマ細胞により産生される
   ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であって、ＨＬＡ−
   ＤＰｗＣＰ６３抗原に反応し、ＨＬＡ−ＤＰｗＤＰｗ１
   、ＤＰｗ２、ＤＰｗ３、ＤＰｗ４およびＤＰｗ５に反応
   しないことを特徴とするＨＬＡＤＰ抗原に対するモノク
   ローナル抗体。