HU220355B - Eljárás antitest előállítására - Google Patents
Eljárás antitest előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU220355B HU220355B HU9400110A HU9400110A HU220355B HU 220355 B HU220355 B HU 220355B HU 9400110 A HU9400110 A HU 9400110A HU 9400110 A HU9400110 A HU 9400110A HU 220355 B HU220355 B HU 220355B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- human
- cdna
- cell line
- cells
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 165
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 59
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 3
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 claims 1
- 230000002609 anti-worm Effects 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 claims 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 54
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 241000282708 Aotus <primate> Species 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 5
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- SXTAYKAGBXMACB-DPVSGNNYSA-N L-methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-DPVSGNNYSA-N 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 4
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241000288935 Platyrrhini Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101150010986 J5 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 1
- 102100027544 Blood group Rh(D) polypeptide Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000580024 Homo sapiens Blood group Rh(D) polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 101150006978 J1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000288903 Lemuridae Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000012266 Needlestick injury Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 101100407904 Plasmodium berghei (strain Anka) PB47 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000007720 allelic exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000012410 cDNA cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- -1 ddTTp Chemical compound 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000002309 glutamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002525 phosphocholine group Chemical group OP(=O)(OCC[N+](C)(C)C)O* 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000001850 polyploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012414 sterilization procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány főemlős rekombináns ellenanyagok DNS-technológiával,valamint mikro-RNS-eljárásokkal történő előállításával; nem humánfőemlős rekombináns ellenanyagokkal; az előbbieket tartalmazógyógyászati készítményekkel; valamint ilyen ellenanyagok diagnosztikaicélú felhasználásával foglalkozik. ŕ
Description
A találmány rekombináns főemlős ellenanyagok DNStechnológiával történő előállításával, azok eukarióta sejtvonalakban való expresszálásával, valamint az ellenanyagok humán célú terápiás és profilaktikus felhasználásával foglalkozik.
Az ellenanyagok, más néven immunglobulinok fehérjetermészetű bifúnkcionális molekulák. Egy régió, amely a különböző ellenanyagokat tekintve nagyon változékony, felelős egy antigénhez, például számos a szervezetre nézve fertőző ágenshez való kötődésért, míg egy másik állandó régiójuk felelős sejtek Fc-receptoraihoz való kötődésért, valamint aktiválja a sejtek lízisét eredményező összetett proteinrendszert, a komplement rendszert. Ily módon az ellenanyagok az idegen mikroorganizmusok és vírusok elpusztításával az emlősök immunválaszának életfontosságú alkotórészei.
Az ellenanyagokat állandó régiójuk szerkezete alapján különböző osztályokba soroljuk. Az emberben például öt fő eltérő szerkezetű osztály különíthető el, az immunglobulin-G, azaz IgG, az IgM, az IgA, az IgD, valamint az IgE. Az egyes osztályok fizikai és biológiai sajátságaik alapján különíthetők el, amelyek összefüggnek az immunrendszerben betöltött funkciójukkal. Az IgG-osztály a nehéz lánc aminosav-összetételében és a diszulfidkötésben (lásd az alábbi magyarázatot) kimutatható különbségek alapján, ami eltérő biológiai viselkedésükhöz vezet, további négy alosztályra osztható: IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4.
Az egyes osztályok és alosztályok ismertetése megtalálható: Iván Roitt, „Essential Immunology”, (Blackwell Scientific Publications).
Egy ellenanyag-molekulát két könnyű és két nehéz lánc alkot, melyeket a láncok közti diszulfidhidak kötnek össze. Mindegyik könnyű láncot diszulfidkötés kapcsol egy nehéz lánchoz, és a két nehéz láncot diszulfidkötések kapcsolják egymáshoz. Minden egyes nehéz lánc egyik végén egy variábilis dómén található, amelyet több állandó dómén követ és minden egyes könnyű lánc egyik végén egy variábilis, a másikon egy állandó dómén található. A könnyű lánc variábilis doménja a nehéz lánc variábilis doménjához igazodik. A könnyű lánc állandó doménja a nehéz lánc első állandó doménjához igazodik. A nehéz lánc fennmaradó állandó doménjai egymással rendeződnek sorba. A könnyű és nehéz lánc állandó doménjai nem vesznek részt közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kötődésében.
Egy könnyű és nehéz láncból álló pár variábilis doménjai képezik az antigénkötő helyet. Ezek ugyanazzal az általános szerkezettel rendelkeznek, mindegyik dómén négy régióból álló keretet tartalmaz, melyek szekvenciái viszonylag konzervatívak, és amelyeket három komplementaritást meghatározó szakasz (CDR-ek) köt össze. A négy keretrégió nagy része béta-sík-konformációt vesz fel, a CDR-szakaszok a béta-sík-szerkezetű szakaszokat összekötő, és esetenként annak részét alkotó hurkokat képeznek. A CDR-szakaszokat a keretrégiók szoros közelségben tartják, és a másik dómén CDR-szakaszaival együtt az antigénkötő hely kialakításában vesznek részt. Az ellenanyagláncokat különböző kromoszómákon elhelyezkedő három elkülönült lokuszon található gén kódolja. Egy lokusz kódolja a nehéz lánc izotípusokat, külön lokusz kódolja a kappa- és lambda-könnyűláncokat, a B-limfocitákban azonban ezek közül csak az egyik könnyűlánc-lokusz íródik át. Az ellenanyag variábilis doménokat kódoló gének a Blimfociták ontogenezise során keletkeznek a V, D, valamint J régiók kapcsolódását magában foglaló rekombinációs folyamat révén. Egy adott limfocita csak egy nehéz- és egy könnyűlánc-eredetű, rekombinációval keletkezett variábilis domént használ, biztosítandó, hogy csak egyetlen antigénre legyen fajlagos, így egyetlen Blimfocitában csak egy nehézlánc-allél és egy könnyűlánc-allél expresszálódik. Az előbbi jelenség allélikus kizárásként ismert.
Fertőzés vagy immunizálás révén egy állat találkozása egy antigénnel különböző fajlagossággal és affinitással rendelkező, különböző ellenanyagok termelődését eredményezi, így az immunizált állatból nyert antiszérum heterogén, és számos különböző limfocitaklón által termelt ellenanyagok összességét tartalmazza. Az így kapott ellenanyagokat poliklonális ellenanyagoknak nevezzük, ez a poliklonális jelleg a fő hátránya ezen ellenanyagok terápiás és diagnosztikai vizsgálatokban való alkalmazásának.
A fő előrelépést Köhler és Milstein közleménye jelentette 1975-ben [Natúré, 256, 495-497, (1975)], mely szerint egy antigénnel immunizált egér lépsejtjeit sikeresen fuzionálták egy egér-mielomasejtvonal sejtjeivel. Az így kapott hibridomáknak nevezett hibrid sejtek rendelkeztek a lépsejtek ellenanyag-termelő, és a mielomasejtek folyamatos szaporodási képességével. Mindegyik hibridoma egyetlen ellenanyagot szintetizál és választ ki az eredeti antigén egy meghatározott determinánsa ellen. Annak érdekében, hogy egy tenyészetben minden sejt azonos legyen, azaz egy meghatározott ellenanyag szintéziséhez szükséges genetikai információt tartalmazzák, a sejtfúzióból eredő hibridomákat klónozzák és szubklónozzák. így a klónozott hibridomák abból az eredeti állatfajból származó homogén ellenanyagot termelnek, amelyből a lépsejtek származtak.
A monoklonális ellenanyagok előállításának lehetősége forradalmasította sok betegség diagnózisát, és lehetővé tette számos kórtani elváltozás megelőzését és immunterápiáját. Sajnos vakcinázás vagy terápia céljából embernek ismételten adott idegen ellenanyagokat, nevezetesen nem humán fajból, például egérből vagy patkányból származó ellenanyagokat az egyed immunrendszere felismeri, és az nagy valószínűséggel nem kívánt antiimmunglobulin-választ vált ki. Ez az antiellenanyag-válasz az állandó doménok és a négy keretrégió idegen eredetének köszönhető. Ennek a válasznak a következménye valószínűleg a terápiás ellenanyag neutralizációja és káros anafilaxiás és allergiás reakciók kiváltása. A nem humán eredetű monoklonális ellenanyagok továbbá nem különösen jól kötődnek humán komplementhez, és az ellenanyag állandó régiójának effektor funkciójában kimutatható különbségek tükrében kisebb valószínűséggel váltanak ki nem specifikus sejteltávolító folyamatokat, mint például ellenanyagfüggő sejt közvetítette citotoxicitást (ADCC). A nem humán eredetű
HU 220 355 Β monoklonális ellenanyagok ezért nem olyan hatásosak, mint a humán ellenanyagok a fertőzött vagy beteg sejtek eltávolításában. Egy terápiás célra hatásos ellenanyagnak és antiellenanyag-válasz kiváltása nélkül a keringésben maradó ellenanyagnak tehát el kell kerülnie ezt, hogy a befogadó egyed immunrendszere felismerje.
A probléma egyik megoldása kiméra ellenanyagok előállítása [Morrison és munkatársai, P. N. A. S., 81, 6851-6855, (1984); valamint Neuberger és munkatársai, Natúré, 314, 268-270, (1985)], amelyekben egy idegen faj egy fent ismertetett hibridomából származó variábilis régióját humán ellenanyag állandó régiójába ültetik át. Ebben az esetben azonban a variábilis régió idegen marad a befogadó szervezet számára, így az felismerheti és jelentős immunogenitási problémát jelenthet. Egy ellenanyag Jones és munkatársai [Natúré, 321, 522-525, (1986)], valamint Riechmann és munkatársai [Natúré, 332, 323-327, (1988)] által ismertetett humanizálása, mely szerint egy humán ellenanyag keretrégiójába egy idegen ellenanyag CDR-régióit ültetik, sok fenti nehézség megoldását megkönnyítette. Az ellenanyagok CDR-régióinak átültetése azonban bonyolult folyamat, és a kapott ellenanyag a kötőaffinitás megtartása érdekében esetleg további módosítást igényel. Világos tehát, hogy a humán immunrendszer általi felismerést elkerülendő egy ellenanyag optimális formája egy humán ellenanyag, vagy egy humán ellenanyaggal alapvetően azonos ellenanyag.
Szóbeli közlések szerint laboratóriumi kísérleti állatként szokásosan használt emberszabású majmok (például csimpánzok) és majmok (például cynomolgus, rhesus, aotus) az emberéhez kellően közel álló immunválasszal rendelkeznek ahhoz, hogy fertőzési modellként jól alkalmazhatók legyenek. Feltételezték azt is, hogy ezek ellenanyagai elegendő homológiát mutatnak a humán ellenanyagokkal ahhoz, hogy leküzdjék például a rágcsáló-ellenanyagokkal kapcsolatos nehézségek egy részét. Nincs erre nézve nyomtatásban megjelent bizonyíték és csak néhány nem humán főemlőseredetű sejtvonal áll rendelkezésre a vizsgálatokhoz. Az ilyen ellenanyagok előállítására szolgáló eljárás ezért rendkívül problematikus. Készítettek humán limfocitákból sejtvonalakat, azonban az ilyen sejtvonalak alacsony stabilitással rendelkeznek, nem könnyen képeznek stabilabb hibrideket és in vivő tenyésztve rendszerint kevés ellenanyagot termelnek. Főemlős-eredetű sejtekben előfordulhat fertőző nukleinsav, például vírusból származó nukleinsav is, amely a kezelendő egyén keresztfertőzésének problémáját veti fel. Hosszadalmas tisztítási és/vagy sterilizálási eljárásokat kell alkalmazni, mielőtt az abból előállított ellenanyag embernek való beadás céljára alkalmassá válik.
A 314 161 számú európai szabadalmi leírás humán immunglobulin előállítására szolgáló eljárást ismertet eukarióta gazdasejtben. A gazdasejtet működőképesen összekapcsolt, humán nehéz lánc variábilis, illetve állandó doménjait kódoló első és második génnel transzfektálták. A gazdasejtet működőképesen összekapcsolt, humán könnyű lánc variábilis, illetve állandó doménjait kódoló génekkel is transzfektálták. Ezt a transzfektált sejtet tenyésztették, a sejttenyészetből a kívánt kötő fajlagosságú variábilis régiókkal rendelkező rekombináns humán immunglobulinok nyerhetők. Ez az eljárás azonban számos problémát vet fel: i) az eljárás kivitelezéséhez elegendő mennyiségű genomiális DNS előállításához nagyszámú limfocita szükséges. Az ismertetett eljárás szerint 1-2 xlO8 limfocitát használtak fel, melyből 121 mikrogramm genomiális DNS-t nyertek; ii) a genomiális DNS-ben mind a négy alléi (kettő a nehéz, kettő a könnyű láncnak) jelen van, és a további eljárás céljára a gének funkcionális párosítása (egy a nehéz és egy a könnyű lánchoz) alapos szekvenálást, klónozással történő válogatást, valamint az expresszálási és kötési tulajdonságok vizsgálatát igényli; iii) az említett találmány szerinti eljárással transzfektált sejtek tenyésztésével alacsony szintű ellenanyag-expressziót értek el. A találmány szerinti eljárással 6,7-34,5 mikrogramm/ml, átlagosan 20 mikrogramm/ml DNS-t nyertek, és egy citomegalovírus (CMV) expressziót fokozó konstrukció alkalmazásával csak 1 mikrogramm/ml DNS-t nyertek.
A WO 91/04336 számú közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés szintén egy humán monoklonális ellenanyagok előállítására szolgáló eljárást ismertet genomiális DNS nyerésén keresztül.
Nyilvánvaló, hogy az eljárás ugyanazokkal a hátrányokkal rendelkezik, mint a fent említett 314 161 számú európai szabadalmi leírás szerinti.
A PCR-technika bevezetése lehetővé tette kisszámú sejtből nyert mRNS-ből cDNS-klónok előállítását. Bár a PCR igen hatásos eszköz, az a tény, hogy ismemi kell a célzott cDNS 5’ és 3’ végének szekvenciáját, hátráltatja ennek a technikának az alkalmazását cDNS-klónok előállítására változatos szekvenciákkal rendelkező proteineket, különösen eltérő vezetőszekvenciával rendelkező szekretált termékeket, például humánellenanyagcsaládot kódoló mRNS-ből. Bár sok humán H-lánc-szekvenciát leírtak [Kábát E. A. és munkatársai, Sequences of Proteins of immunological Interest, 4. kiadás, US Dept. of Health and Humán Services, az Amerikai Egyesült Államok kormányának nyomdai szolgálata, 1987], és a PCR-primereket ezek konszenzus szekvenciái alapján tervezik, ezen primerek alkalmazásával nem mindegyik humán V régió amplifikálható, mivel a Taq polimerázzal a 3’ végi bázisokat nem tudjuk meghosszabbítani.
A találmány tárgyát egy új eljárás képezi, amely szokásos rekombináns cDNS-klónozási technika alkalmazásával megkönnyíti teljes humán nehéz, valamint könnyű lánc ellenanyag gének átmentését és expresszióját eukarióta sejtekben nagy hatékonyságú eukarióta expreszsziós vektorok alkalmazásával, ezáltal folyamatosan előállítható működőképes ellenanyagokat nyerve.
Kimutattuk továbbá, hogy egy nem humán főemlős perifériás vérének limfocitáiból klónozott cDNS, valamint az ebből előállított ellenanyaglánc gyakorlatilag elegendő homológiát mutat egy humán ellenanyaglánc szekvenciájával ahhoz, hogy alkalmazható terápiás szer legyen. A találmány kiteljed tehát egy nem humán eredetű nehéz és könnyű lánc ellenanyag gének előállításá3
HU 220 355 Β ra szolgáló eljárásra, valamint a gének expresszálására, amint azt fent ismertettük.
A találmány tárgyát képezi egy rekombináns, főemlős-eredetű ellenanyag előállítása, amelynek során (i) kiválasztunk egy a kívánt ellenanyag expreszszálására képes fóemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;
(ii) a sejtvonalból RNS-t izolálunk, valamint az mRNS-t elválasztjuk az így izolált egyéb RNS-től;
(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk és a cDNS-t inszertáljuk egy klónozási vektorba;
(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;
(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló génekre nézve;
(vi) a géneket kódoló cDNS-t inszertáljuk egy expressziós vektorba;
(vii) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral; és (viii) a transzfektált gazdasejteket tenyésztjük és a kívánság szerinti ellenanyagot izoláljuk.
A „főemlős” elnevezés alatt előmajmokat (például Lemurokat), újvilági majmokat (például aotus), óvilági majmokat (például cynomolgus), emberszabású majmokat (például csimpánzokat) és embert értünk.
Egy fóemlőslimfocita-eredetű sejtvonalon a találmány szerint egyetlen főemlős-limfocitából származó sejtvonalat értünk, amely egyetlen ellenanyagot termel. A sejtvonalnak elegendő stabilitással kell rendelkeznie ahhoz, hogy lehetővé tegye RNS előállítását, és előnyös esetben szokásos vírustranszformációs és/vagy hibridóma technikával stabilizáljuk vagy folyamatos növekedésűvé tesszük [lásd: Methods of Hybridoma Transformation, szerkesztők: Bartal és Hirsaut, Humana Press, Clifton, N. H., (1985)]. Ilyen sejtvonalak beszerezhetők sejtgyűjteményekből, például az American Type Culture Collection gyűjteményéből (Rockville MD, USA).
A sejtvonal előállítható például egy betegségen bizonyítottan átesett vagy annak gyógyulási szakaszában levő egyedből (humán, vagy nem humán főemlős), egy kórokozó organizmussal bizonyítottan fertőzött egyedből, vagy karcinomában vagy autoimmun betegségben szenvedő de a betegség teljes tünetegyüttesét nem mutató egyedből, egy antigénnel vakcinázott vagy beoltott, és arra ellenanyag-termeléssel válaszoló egyedből, vagy a keresett ellenanyagra nézve vizsgált egészséges egyedekből nyert perifériás vérből, nyirokcsomókból vagy lépből eltávolított limfocitákból, nevezetesen limfoblasztoid sejtekből vagy B-limfocitákból. A betegségállapot például lehet egy kórokozó organizmussal (például vírussal vagy baktériummal) való fertőzés, ahol a limfocitákat előnyösen a felépülés után két-három hónapon belül vagy a magas ellenanyagszint ideje alatt távolítjuk el, vagy egy antigénnel, például egy kórokozó organizmussal vakcinázott egyed, ahol a limfocitákat előnyösen az immunizálást követő két vagy három hónapon belül távolítják el. Olyan egyedek, akikben a kórokozó organizmus például vírus kimutatható, akiben azonban nem fejlődik ki egészében a betegség szintén különösen hasznos forrásai az ellenanyag-termelő sejteknek. Nyilvánvaló, hogy főemlősök alkalmazása esetén az organizmus gyengített formája helyett, amely gyakran az emberi vakcinázás céljára alkalmazott forma, lehetséges a kórokozó organizmussal való beoltás. Az erre az organizmusra adott immunválasz sokkal erősebb lehet, így előnyösebb forrásai az ellenanyag-termelő sejteknek, mint a vakcinázott egyed.
Előállíthatunk sejtvonalakat továbbá olyan egyedből nyert limfociták felhasználásával, aki tumor- vagy autoimmun betegségben szenved és kimutatható, hogy tumor- vagy saját antigénekkel szemben ellenanyagválaszt produkál. Nyerhetünk limfocitákat olyan egyedből is, akiről megállapítható tumorjának visszafejlődése (remissziója) vagy akit tumorantigénekkel vakcináztak és ellenanyagválaszt mutatott. Más megközelítés szerint a találmány szerinti hasznos limfociták azonosíthatók olyan csoportok egyedeinek szűrése során, amely egyedek bizonyos környezeti tényezők hatására vagy genetikai hajlam miatt nagyobb valószínűséggel kapnak tumoros betegséget, például a „tumoros családok”, melyekben a populáción belül az átlagosnál nagyobb gyakorisággal fordul elő rákbetegség. Ezek a csoportok különösen olyan egyedek kiválasztása céljából szűrhetők, amelyek tumorantigének ellen ellenanyag termelésre képesek és ezért nem kapnak rákbetegséget. Lehetséges egészséges egyedek szűrése is azon elmélet alapján, hogy tumorsejtek minden egyedben előfordulnak, azonban az immunrendszer általában képes válaszolni, nevezetesen ellenanyagok termelésével és a rákbetegség állapot elérése előtt a mutáns sejteket eltávolítja. Amennyiben ez így van, a találmány szerint hasznosítható limfociták bármely egyedből nyerhetők. Az így azonosított limfociták folyamatos sejtvonallá alakíthatók vírusos transzformáció és/vagy sejtfúzió segítségével az alább leírtak szerint.
Vírusos transzformálás előnyösen Epstein-Barr-vírus (EBV) alkalmazásával lehetséges. A perifériás vér B-limfocitáinak többsége rendelkezik EBV-receptorral és a vírussal történő fertőzés során az EBV-mag-antigén (EBNA) egyidejű expresszálódása mellett transzformálódnak. A sejteknek azonban csak körülbelül mintegy 20%-a válik in vitro folyamatos sejtvonallá, és ezek általában kis, nem aktivált B-sejtek. A plazmasejtekről (aktivált B-sejtekről) hiányzik az EBV-receptor, így a vírusfertőzéssel szembeni rezisztencia az érettség fokával arányosan növekedni látszik, ezzel csökkentve az érett limfociták vírusos transzformálásának hatásfokát.
Az EBV-t alkalmazó vírusos transzformáció céljára ezért célszerű nem plazmasejt perifériásvér-limfocitákat használni. Egy sejtvonal előállításához egy a vírust termelő sejtvonal például a B95.1 (Miller és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 383-387, 1972) felülúszója általában tartalmaz elegendő fertőző részecskét. A gyakorlat szerint akár 107 sejtet tartalmazó üledéket szuszpendálunk a vírustenyészet felülúszójának 1 mililiterében és 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. Ez lehetővé teszi a vírusrészecskék kapcsolódását a B-sejtek fajlagos receptorához és a sejtbe jutásukat. Célszerű a kémcső óvatos rázogatása, ezzel gátolva a sejtek leülepedését. Az így fertőzött sejtek ezután tenyészthetők és a kívánt ellenanyag génjei klónozhatok.
HU 220 355 Β
Egy más megoldás szerint, vagy a vírusos transzformációt követő további lépésként mielómasejtekkel való fúzióval állítunk elő stabil (folyamatos) sejtvonalakat (Crawford, D. H., Humán Hybridomas and Monoclonal Antibodies, 1985 szerk.: E. G. Engelman, S. K. H. Foung, J. Larrick és A. Raubitschek, 37-50. oldal, vagy Roder, J. C. és munkatársai, The Epstein-Barr virushybridoma technique, ugyanott, 55-67. oldal). A mielóma lehet heterohibridóma, előnyösen egér/humán eredetű. Előállíthatunk a célnak megfelelő heterohibridómát például egy olyan ellenanyag-termelő sejtvonalból, mint a HT01. Megfelelő sejteket hipoxantin-, aminopterin- és timidinérzékenység alapján 8-azoguanintartalmú tápfolyadékban történő sorozatos passzálással válogathatjuk, mivel azok aminopterinéizékenyek.
Hogy egy ilyen heterohibridóma használható legyen, az endogén humán nehéz és könnyű láncokat kódoló géneket deletálni kell, különben a végső sejtvonal több mint egy ellenanyag termelésére lesz képes, és nem kizárólag a kívánt ellenanyag könnyű és nehéz láncát tartalmazza. Ez megoldható a sejtek 90%-os letalitású ultraibolya-besugárzásával, majd megfelelő kolóniák kiválasztásával antihumán IgG citoplazmafestéssel, valamint a kromoszómakészlet vizsgálata alapján, amely poliploid és 60-140 egérkromoszómát tartalmaz.
Előnyös továbbá erőteljesen szaporodó sejteket választani. Ez elérhető 2,6,10,14-tetrametil-pentadekánnal (azaz pristane-nal) kezelt egér hasüregében történő passzálással. A végső kiválasztás a szaporodási hajlam, kariotipus és fúzióra való hajlam alapján történik, melyek közül a kariotipus a legfontosabb. A találmány szerinti előnyös heterohibridóma főleg egérkromoszómákat tartalmaz.
Egy kívánt limfocita-sejtvonal kiválasztása lehetséges a kívánt antigénnel affinitást mutató ellenanyag termelésére, valamint ellenanyag-funkcióra történő vizsgálatával.
Az affinitásvizsgálatokat végezhetjük immunvizsgáló eljárásokkal például radioimmun próbával (RIA) vagy enzimes immunszorbens próbával (ELISA). Az ilyen immunvizsgáló eljárások az ellenanyag és az antigén fajlagos kapcsolódását kihasználva nyújt információt az antigén fajlagosságról. A radioimmun próba úgy becsül ellenanyagszintet, hogy vagy meghatározza egy ellenanyag komplexképző kapacitását a radioaktív antigénnel, vagy méri az oldhatatlan antigénkészitményhez kötődő ellenanyag mennyiségét. Az ELISA-módszer magában foglalja antigének vagy ellenanyagok enzimmel történő kapcsolását. Az enzimeket általában kinetikájuk egyszerűsége alapján választják és színes reakciótermék segítségével mérhetők, például spektrofotometriásán. Az előnyös enzimek közé tartoznak az alkalikus foszfatáz, a béta-D-galaktozidáz és a torma-peroxidáz. Az ELISA alkalmazható mint primer kötési, vagy mint kompetíciós kötési próba. Vírussal fertőzött egyedből izolált limfociták szelektálhatok például úgy, hogy egy limfocitasejtvonal-tenyésztő folyadék felülúszójában megfelelően jelölt vírusantigént inkubálunk lehetőleg teljes vagy üres vírusrészecskék formájában. Az ellenanyag/antigén komplexeket ezután a fent leírtak szerint azonosíthatjuk és a megfelelő limfocita-sejtvonalat további vizsgálatok céljára kiválaszthatjuk.
Az ellenanyag működőképességének vizsgálata egy fertőző ágens esetén tartalmazhat kompetíciós neutralizációs vizsgálatokat, például vírusneutralizációt. A neutralizációs vizsgálatok kivitelezhetők radioimmunfokuszáló próbával (RIFA), amelyben azonos töménységű tisztított ellenanyagot a vírus tízszeres hígításainak azonos térfogatával inkubálunk, majd vírustitert vizsgálunk. Más megoldás szerint komplementet használunk és sejtlízist vizsgálunk.
Lehetséges humán vagy főemlős IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgE, vagy IgD ellenanyagot szekretáló sejtek előállítása. Ezek azonosíthatók Ouchterlony dupla diffúziós próbával vagy ELISA-val.
Egy kívánt antigénre fajlagos funkcionális ellenanyagot expresszáló limfocita-sejtvonal kiválasztása után a teljes sejt-RNS szokásos eljárásokkal izolálható, például Chomczynski és Sacchi szerint [Anal. Biochem., 162, 156-159, (1987)]. Az ellenanyagot kódoló fajlagos messenger RNS (mRNS) izolálására szintén szokásos eljárások alkalmazhatók [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press]. A mRNS-ból komplementer DNS-t (cDNS) szokásos rekombináns eljárásokkal szintetizálhatunk például ahogy azt a fent idézett kézikönyv leírja.
Teljes sejt-RNS izolálásához 1-3 χ 104 és 1-3 χ 107 közötti számú limfocita felhasználása lehetséges, azonban a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi teljes hosszúságú ellenanyaggének klónozását sokkal kevesebb sejtből, amint az kívánatos ellenanyagot termelő nem stabil hibridómák vagy kérdéses stabilitású EBV transzformált sejtek esetében. Ez az eljárás ezért különösen alkalmas humán vagy főemlős-ellenanyagok átmentésére nem stabil sejtvonalakból, de alkalmas bármely ellenanyag nehéz és/vagy könnyű láncának átmentésére. Ez a szokásos klónozási eljárásoknál alkalmazott kereskedelmi forgalomban kapható enzimek és vektorrendszerek reprodukálhatóságának és minőségének a fejlesztésével és mikro-RNS izolálási eljárás bevezetésével vált lehetségessé.
Ez a fejlesztett eljárás akár 1000 hibridomasejtből készített méretszelektált cDNS-könyvtár készítésével kivitelezhető. Ez a könyvtár, vagy annak egy része aztán szűrhető immunglobulinlánc génekre.
A találmány tárgya tehát teljes hosszúságú ellenanyag gének klónozására szolgáló eljárás, amelynek során i) mikro-RNS-t nyerünk körülbelül 1000 sejtből, ii) méret-szelektált cDNS-könyvtárat készítünk, iii) a könyvtárat szűrjük nehéz és könnyű láncot kódoló cDNS-re és iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t izoláljuk.
A találmány tárgya továbbá egy rekombináns ellenanyag előállítását szolgáló eljárás, amelynek során
i) mikro-RNS-t nyerünk körülbelül 1000 sejtből;
ii) méretszelektált cDNS-könyvtárat készítünk;
iii) a könyvtárat szüljük nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re és azokat izoláljuk;
iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t inszetáljuk expressziós vektorba;
HU 220 355 Β v) egy gazdasejtet transzfektálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral;
vi) a transzfektált gazdasejtet tenyésztjük és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.
Az ellenanyag nehéz- és könnyűlánc-fehérjéket kódoló cDNS-klónok azonosítása azok szaporítható vektorba, például plazmidba klónozásával, majd egy gazdasejt például a prokarióta E. coli transzformálásával történhet. Az így kapott könyvtár azután az alábbi eljárás szerint vizsgálható ellenanyag nehéz és könnyű lánc cDNS jelenlétére.
A vizsgálat történhet észlelhető jelöléssel ellátott nehéz és könnyű lánc DNS próbákkal és egy, az észleléshez szükséges eljárással, például a Gene Cloning című kézikönyvben leírtak szerint [Glover, D. M., Chapman and Hall Ltd., London]. Ezek az eljárások alapulhatnak radioaktív jelölésen és radiográfiás észlelésen, vagy nem radioaktív jelölésen például digoxigenin 11 dUTPvel és egy például a Boehringer Mannheim által forgalmazott nem radioaktív DNS-észlelő készleten. Ez a vizsgálóeljárás lehetővé teszi továbbá teljesen ismeretlen ellenanyagok izotípusának megállapítását kevert próbákkal, például humán gamma-, mű- és alfa-nehézláncvagy kappa- és lambda-könnyűlánc próbákkal.
A kiónok kiválaszthatók és szükség szerint az ellenanyag nehéz és könnyű láncok szekvenciája meghatározható. Ebben a stádiumban lehetséges továbbá módosításokat eszközölni az ellenanyag cDNS nukleinsavszekvenciában az expressziós vektor elkészítése előtt; a módosítás érinthet egyetlen kodont vagy egész régiót. Megoldható az ellenanyag-izotipus osztályra vagy fajra jellemző szakaszának kicserélése (azaz kiméra ellenanyagok készítése). Ez az izolált V régiók és a kívánt izotipus cDNS-fuziójának létrehozásával oldható meg. Miután a megfelelő sejtkolóniát kiválasztottuk, a könnyű- és nehézIánc-cDNS-szekvenciákat olyan vektorokba szubklónozzuk, amelyek alkalmasak egy gazdasejtbe történő inszertálásra azok expresszálásának céljából. Az expressziós vektorok előállítása a gyakorlatban szokásos eljárások szerint történhet [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Második kiadás, Cold Spring Harbor],
A gazdasejtnek képesnek kell lennie arra, hogy az ellenanyagot működőképes formában expresszálja, ezért, az előnyösen eukarióta, például emlőssejt, azaz mielóma- vagy kínaihörcsög-petefészeksejt (CHO) lehet, amelyek képesek transzláció utáni módosításokra, különös tekintettel a láncok megfelelő összehajtására és glikozilezésére, ami lényeges lehet az ellenanyag konstans régiójának hatásos működéséhez. Eukarióta sejtek sikeresen tenyészthetők in vitro és ismeretes, hogy képesek működőképes ellenanyagok expressziójára. Élesztő- és rovarsejtek is használhatók gazdasejtként, mivel azok szintén képesek a transzláció utáni kívánt módosítások elvégzésére.
A nehéz és könnyű láncok transzfektálhatók egyetlen vektorba, amint azt a WO 87/04462 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti, vagy kotranszfektálhatók két vektorba az alábbiak szerint. Egy gazdasejtvonal expressziós vektorral történő transzfektálására vonatkozó fenti és alábbi utalások értelemszerűen tartalmazzák egy gazdasejt kotranszfektálását egynél több vektorral, kivéve, ha a leírás egyértelműen kotranszfektálásra utal.
A kotranszfektálásra használt vektorok előnyösen egymástól független szelekciós markereket tartalmaznak, így a létrejött kolóniák mindkét markerre szelektálhatok. A mindkét szelekciós marker fenotípusát mutató kolóniák általában képesek mind a könnyű, mind a nehéz lánc koexpressziójára. A szelekciós markerek lehetnek domináns természetűek, vagy nem. A szelekciós markerek példái közé tartoznak az adenozin dezamináz [Kaufman és munkatársai, P. N. A. S., 83, 3136-3140, (1989)], aszparagin szintetáz [Cartier és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 7, 1623-1628, (1987)], E. coli trpB gén, valamint Salmonella hisD gén [Hartman és munkatársai, P. N. A. S„ 85, 8407-8451, (1988)], egér M2 ribonukleotid reduktáz [Thelander és munkatársai, EMBO J., 8, 2475-2479, (1989)], humán multidrogrezisztencia gén, [Kané és munkatársai, Gene, 84, 439-446, (1989)], glutamin szintetáz [Bebbington és munkatársai, DNA Cloning, III. kötet, 163-188, szerk. D. M. Glover, IRL Press], xantin guanin foszforibozil transzferáz (gpt) [Mulligen és munkatársai, Science, 209, 1422-1427, (1980)], hygromycin B [Santerre és munkatársai, Gene, 30, 147-156, (1984)], neomycin gén [Southern és munkatársai, J. Mól. Appl. Génét., 1, 327-341, (1982)], valamint dihidrofolát reduktáz [Subramani és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 1, 854-868, (1981)].
Az egyik vektor esetében előnyösen alkalmazható szelekciós marker a dhff, amelyet általában egy dhfffenotípusú CHO szülői sejtvonallal használunk [Urlaub és munkatársai, P. N. A. S., 77, 4216-4220,(1980)]. A sikeresen transzfektált CHO-sejtek dhfr+ fenotípussal rendelkeznek és könnyűszerrel szelektálhatok timidin- és hipoxantinmentes tápfolyadékban, amely tetszés szerint metotrexátot (MTX) is tartalmazhat. A másik típusú vektorok esetében előnyösen használható szelekciós marker egy domináns rezisztenciamarker, mint például a neomicin (neo) gén. Az ezzel a markerrel sikeresen transzfektált CHO-sejtek jól szelektálhatok a kolóniák Geneticin antibiotikumot, egy neomicinanalógot tartalmazó tápfolyadékban történő tenyésztésével.
Egy másik, CHO- vagy mielómasejtekhez használatos expressziós rendszer a glutamin szintetáz (GS) amplifíkációs rendszer, amelyet a WO 87/04462 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ismertet és amelyre mint irodalmi helyre hivatkozunk. Ez a rendszer tartalmazza egy glutamin dependens sejt transzfektálását a GS-enzimet és a kívánt nehéz és könnyű láncot kódoló génekkel. A glutaminmentes tápfolyadékban növekedni képes sejteket szelektáljuk. Az így szelektált kiónokat aztán GS-enzim-gátlásnak vetjük alá metionin szulfoximin (Msx) alkalmazásával. A sejtek saját túlélésük érdekében amplifikálják GS génjüket az ellenanyagot kódoló gén egyidejű amplifikálása mellett.
A fenti leírás szerint egy olyan szelekciós marker, mint a GS egyúttal lehetővé teszi a könnyű és nehéz láncokat kódoló gének amplifikálását is. Egy sejtvonal transzfektálásakor a vektor-DNS-ek a sejt kromoszómá6
HU 220 355 Β jában gyakran azonos lokuszba integrálódnak, ezért az amplifíkációval járó szelekciós markerek használata mindkét gén kópiaszámának párhuzamos növekedését eredményezi. Hasonlóképpen, a dhrf egy olyan szelekciós marker, amely lehetővé teszi a megfelelő amplifikációt az MTX gátlóanyag emelkedő koncentrációjának használatával.
A szelekciós markerek természetesen a DNS regulációs szakaszainak kontrollja alatt állnak, lehetővé téve azok expresszióját. A regulációs szakaszok előnyösen vírus, például DNS-tumor vírus eredetűek. Különösen előnyös az SV40 vagy az adenovírus fő késői promotere. Különösen előnyös ebben a vonatkozásban a promoter erősítő elemének eltávolítása, így annak hatékony „bénítása”. Ezen módosítások minden gátlóanyag-koncentráció mellett magasabb szintű génamplifikációt tesznek lehetővé, mint az egyébként egy erős promoter alkalmazása esetén történne. A GS mint szelektálható marker használatakor előnyös promoter például az egér-metallotionein promoter, vagy előnyösebben a WO 89/01036 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett humán cytomegalovírus (hCMV)-MIE promoter.
Az ellenanyag könnyű és nehéz lánc gének ugyancsak az expressziójukat lehetővé tevő DNS regulációs elemek szabályozása alatt állnak. Előnyös mindkét lánc esetében ugyanazon regulációs elemek alkalmazása, hogy azok expressziója lényegében kiegyensúlyozott legyen. A regulációs elemek lehetnek víruseredetűek, és lehetnek például a dhfr vagy a GS szelektálható markerek expressziójával kapcsolatban fent említettek. További példák a béta-aktin promoter, valamint az ezzel rokon béta-aktin poliadenilációs jel alkalmazása.
Az egyik vagy mindkét vektor tartalmazhat egy SV40 replikációs origót, amely lehetővé teszi a vektorkonstrukciók egy gyors ideiglenes vizsgálatban például COS-sejtekben való ellenőrzését.
A sejtvonal kotranszfektálását az expressziós vektorokkal egyszerűen végrehajthatjuk mindkét vektor egyenlő moláris koncentrációja és szokásos transzfekciós eljárások, például kalcium-foszfát-kicsapásos eljárás vagy lipofektin alkalmazásával. A kívánság szerinti kotranszfektált sejtvonal kiválogatását az adott szelektálható markerek esetében használatos szokásos eljárásokkal végezhetjük.
A találmány tehát kiteljed egy gazdasejt transzfektálására alkalmas, főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó vektorra.
A találmány kiteljed továbbá egy főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncának expresszálására szolgáló cDNS-sel transzfektált eukarióta sejtvonalra.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy főemlősellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS expresszálására szolgáló eljárás, amely magában foglalja egy eukarióta gazdasejt transzfektálását az említett cDNS expresszálására alkalmas vektorral vagy vektorokkal.
A sejtvonal tenyésztését szérumot tartalmazó vagy előnyösen szérummentes tápfolyadékban végezhetjük. A tisztítási folyamat során különösen előnyös, ha proteinmentes tápfolyadékot alkalmaztunk. CHO dhff+ +transzformáns sejtvonal alkalmazása esetén a tápfolyadék előnyösen nem tartalmaz hipoxantint és timidint és tartalmazhat MTX-et. A GS rendszer alkalmazásánál előnyös egy glutaminfüggő sejtvonal és glutaminmentes tápfolyadék alkalmazása. Mindkét láncnak lényegében egyenlő moláris mennyiségben való expresszálása lehetővé teszi, hogy optimális mennyiségű működőképes ellenanyagot kapjunk. A két lánc a sejten belül összekapcsolódik, majd működőképes ellenanyagként kiválasztódik a tápfolyadékba. A kapott rekombináns ellenanyag szokásos eljárásokkal tisztítható és készítménnyé alakítható.
A találmány kiteljed rekombináns nem humán főemlős-ellenanyagokra, pontosabban rekombináns, csimpánz vagy óvilágimajom-eredetű ellenanyagokra például rekombináns, cynomolgus majom-ellenanyagokra.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, az alábbi lépésekből álló eljárás szerint előállított vagy előállítható rekombináns főemlős-eredetű ellenanyag:
i) egy kívánt ellenanyag expresszálására alkalmas, főemlőslimfocita-eredetű sejtvonal kiválasztása;
ii) a sejtvonalból RNS izolálása és az mRNS elválasztása az egyéb így izolált RNS-től;
iii) az mRNS-ről cDNS előállítása és a cDNS inszertálása egy klönozási vektorba;
iv) egy gazdasejt transzformálása a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;
v) a génkönyvtárból az ellenanyagot kódoló cDNS kiválogatása;
vi) az ellenanyagot kódoló cDNS inszertálása egy expressziós vektorba;
vii) egy gazdasejt transzfektálása a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral; és viii) a transzfektált gazdasejt tenyésztése és a kívánság szerinti ellenanyag izolálása.
cDNS-sel transzfektált eukarióta sejtvonalak alkalmazásával várhatóan 50 mikrogramm/ml, előnyösen 250 mikrogramm/ml, vagy annál nagyobb mennyiségű ellenanyag nyerhető.
A találmány tárgya továbbá főemlős-eredetű ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS expresszálására képes eukarióta gazdasejtvonal tenyésztése útján előállított vagy előállítható, főemlős-eredetű rekombináns ellenanyag.
A kapott ellenanyag fajlagosságának megfelelően terápiás célra alkalmazható. Az alább leírt egyik példa egy hepatitisz A-fertőzés kezelésére alkalmas humán hepatitis A-ellenes ellenanyag. Előállíthatok egyéb vírusellenes ellenanyagok, amelyek célpontja egyéb hepatitisvírusok (például hepatitis B és C) vagy herpeszvírusok: herpesz simplex vírus, citomegalovírus, Epstein-Barr-vírus és varicella zooster vírus. A találmány szerint készíthetők HIV-ellenes ellenanyagok is. Ezek az ellenanyagok alkalmazhatók AIDS kezelésére, általuk megelőzhető vagy késleltethető a HIV-pozitív és ARC-betegekben az AIDS kialakulása vagy megelőzésképpen olyan személyeknél, akik a vírussal érintkeztek például tűszúrás-baleset során. Egy további alkalmazási lehetőség a vírus átterjedésének megelőzésére HIV7
HU 220 355 Β pozitív anyáról gyermekére a terhesség során vagy a szülés alatt. Ez magában foglalhatja az ellenanyaggal való kezelést a születés előtt, alatt és/vagy után.
A találmány szerint olyan ellenanyagok is előállíthatok amelyek célpontja más patogén organizmus például baktériumok, protozoonok stb. Ráksejtek is lehetséges célpontjai a humán ellenanyagoknak. Az ellenanyagok alkalmazhatók mint célbajuttató egységek, amelyek kémiai vagy biológiai vegyületeket hordoznak. Ezek endocitózis révén a sejtbe jutnak, ahol toxikus hatást fejtenek ki vagy toxikus vegyületté metabolizálódnak és elpusztítják a sejtet. A találmány szerinti ellenanyagok célpontjai lehetnek saját antigén ellenes ellenanyagok, mint amelyek jelen vannak például multiplex szklerózis vagy például gyulladásos kórképeknél mint az ízületi gyulladás. Állatmodell nem alkalmas anti-Rhesus Dellenanyag előállítására, ezért nagy jelentősége lenne egy humán ellenanyag vércsoport-meghatározás céljára használható diagnosztikai és/vagy terápiás célú alkalmazásának. Antirhesus D-ellenanyagok adagolhatok rhesusnegatív anyának a terhesség és a szülés bármely időpontjában, ezzel gátolva a magzatellenes, valamint a későbbi terhesség(ek) során képződő ellenanyagok kialakulását. A találmány tárgykörébe tartozik tehát humán rekombináns ellenanyag alkalmazása rhesus D-antigénnek kitett rhesusnegatív egyed kezelésére, vagy az antigénnel való találkozás megelőzésére.
A találmány szerint előállított ellenanyagok alkalmazhatók általános diagnosztikai eljárásokban.
A találmány leírása alapján érthető, hogy bár a találmány elsősorban teljes ellenanyag nehéz és könnyű lánc gének átmentésével foglalkozik, azok fragmensei például az F(ab) F(ab)2, valamint FV fragmensek is átmenthetők, expresszálhatók, és külön-külön alkalmazhatók. Ezek a fragmensek az „ellenanyag” meghatározás körébe tartoznak.
A találmány tárgya tehát főemlős-ellenanyagok alkalmazása valamely gyógyászati készítmény előállítása során a fenti kórképek és állapotok kezelése céljából, így a találmány kiterjed emberi kórképek és állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló olyan eljárásokra, amelyekben főemlős-ellenanyag hatásos adagját adagoljuk egy emberi lénynek. Az ilyen eljárások közé tartoznak a diagnosztikai módszerek is.
Az ellenanyagok adagja a kezelendő kórképtől és a kezelt személytől függhet, felnőtt beteg esetében 1-től 100 milligrammig terjedhet, előnyösen 1-től 10 milligrammig terjedő napi adag l-től 30 napig tartó kezelés során. Előnyös lehet egy két részből álló kezelési eljárás alkalmazása, amely szerint 5-től 10 nap alatt l-től 5 milligramm, majd további 5-től 10 nap időtartam alatt 6-15 milligramm ellenanyagot adunk naponta.
A találmány kiteljed továbbá rekombináns főemlősellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekre. Az ilyen készítmények az ellenanyagon kívül előnyösen tartalmaznak a gyógyszergyártásban szokásos oldószert vagy vivőanyagot, általában egyéb hatóanyagokkal például más ellenanyagokkal és/vagy antibiotikumokkal keverve. A megfelelő vivőanyagok közé tartozik a fiziológiás konyhasóoldat, a foszfátpufferes konyhasóoldat, a glükóz és a pufferolt konyhasóoldat. Más eljárás szerint az ellenanyag liofilezhető (fagyasztva szárítható) és használat előtt feloldható a fenti vizes pufferolt oldatok valamelyikének hozzáadásával. Az adagolás módja szokásosan parenterális, például vénába, izomba, bőr alá, és a hashártya mögé injektálás, vagy bejuttatás.
Az ábrák ismertetése
1. ábra: HT01 sejtek kariotípus vizsgálata, amelyen poliploid egérkromoszóma-készlet és számos humán kromoszóma látható.
2. és 3. ábra: D ellenanyag (IgD) nehéz, illetve könnyű láncának nukleotid- és kikövetkeztetett aminosavszekvenciája. Látható a pH210H2 inszert teljes szekvenciája. A jelzőpeptidet és a CDR-szekvenciákat aláhúztuk és a valószínű poliadenilációs jelet felső vonallal jelöltük. Az aminosavakat Kábát és munkatársai (1987) szerint számoztuk.
4. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc variábilis régió nukleotidsorrendjének összehasonlítása a humán, nyúl- és egérszekvenciákkal. A kodonokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.
5. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc variábilis régió aminosavsorrendjének összehasonlítása a humán, nyúl- és egérszekvenciákkal. Bejelöltük a CDR-ek helyzetét és pontok jelölik a humán Walker-szekvenciával való azonosságot. Az aminosavmaradékokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.
6. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc konstans régió nukleotidsorrendjének összehasonlítása a humán-, nyúl- és egérszekvenciákkal. Pontokkal jelöltük a humán őssejtszekvenciával való azonosságot. A kodonokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk. A tíz majomszekvenciából egy az aláhúzott nukleotidpozícióban G-t tartalmaz.
7. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc konstans régió aminosavsorrendjének összehasonlítása a humán-, nyúl- és egérszekvenciákkal. Pontokkal jelöltük a humán őssejtszekvenciával való azonosságot. Az aminosavmaradékokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.
A találmányt a következő példákkal szemléltetjük.
Humán/egér kiméra sejtek előállítása hibridzálás céljából
1. példa
Humán antihepatitis A ellenanyag készítése
a) A ΗΤΟΙ sejtvonal előállítása nappal tetanusztoxoiddal való emlékeztető oltást követően egészséges humán donortól 50 ml vért vettünk, és konzerválószer-mentes heparin alvadásgátlóval elkevertük. Ficoll/Hepaque rétegen [Boyum A., Scand. J. Clin. Invest., 21, 77-89, (1986)] elválasztottuk a mononukleáris sejteket, azokat Hanks-pufferes fiziológiás sóoldattal mostuk és szokásos eljárások alkalmazásával egér-myelomasejtvonallal fuzionáltattuk az alábbiak szerint.
Logaritmikus szaporodási fázisban levő tenyészetből NS-0 egér-myleomasejteket [Galfre G. és Milstein C., Immunology, 45, 125-128, (1982)] gyűjtöttünk és Hanks-pufferrel mostuk. A mononukleáris sejteket (4,7 xlO7) és az NS-O-sejteket (6xl07) összekevertük
HU 220 355 Β és egy 50 ml űrtartalmú vizsgálati csőben ülepítettük. A sejtüledéket ezután 1 ml 50%-os polietilénglikololdatban szuszpendáltuk és 1 percig szobahőmérsékleten óvatosan kevertük. A fuzionált sejteket 10% borjúszérumot tartalmazó RPMI tápfolyadékban szuszpendáltuk és 24 rekeszű lemezeken 60, egyenként 1 ml térfogatú azonos tápfolyadékba osztottuk szét cseppenként.
óra múlva mindegyik rekeszhez 1 ml hipoxantint, aminopterint és timidint (HAT), valamint 1 χ 106 Balb/c egérlépsejtet tartalmazó tápfolyadékot adtunk. A lemezt 37 °C-on 5% CO2 parciális nyomás mellett inkubáltuk.
A fúzió utáni 20. napon a felülúszókat radioimmunvizsgálattal antitoxoid ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk.
Egy kis sejtkolóniát (körülbelül 20 sejtet) tartalmazó rekeszt azonosítottunk. Ez a kolónia lassan növekedett, amely tulajdonság az ellenanyag-termelés tartós stabilitására jellemző a humán kromoszómák fokozott megtartása miatt. A sejteket új rekeszbe vittük át és három hét múlva határhígításos módszerrel klónoztuk. Mindegyik vizsgált szubklón pozitívnak bizonyult a radioimmunvizsgálattal (RIA).
Egy kiónt, a PB47 1. A1.B9.E10 kiónt HTOl-nek neveztük és a sejteket lefagyasztottuk. Ezek a sejtek humán IgM antitetanusz-toxoid ellenanyagot termeltek.
A kariotípus-vizsgálat szerint ezek a sejtek poliploid egérkromoszóma-készletet és számos humán kromoszómát tartalmaznak (lásd az 1. ábrát). Ezeket a sejteket választottuk kiindulási sejtvonalként egy poliploid fúziós partner készítéséhez további hibridómák előállításához.
A HT01 sejtvonalat, amely antitetanusz humán IgM ellenanyagot szekretált, használtuk kiindulási anyagként poliploid fúziós partner előállításához. A HAT-érzékeny sejteket 8-azoguanint 1-20 mikrogramm mennyiségben tartalmazó tápfolyadékban történő sorozatos passzálással válogattuk ki az aminopterinrezisztens HT01 sejtek közül.
Hogy a humán könnyű és nehéz lánc gének elvesztését meggyorsítsuk, a sejtek egy részét 90%-os halálos dózisú ultraibolya sugárzásnak tettük ki. A besugárzott sejteket határhígításos eljárással klónoztuk és számos kolóniát választottunk ki az antihumán Ig-vel való citoplazmafestődés hiánya és a sejtmag mérete alapján, amely arányos a kromoszómák számával. A HT01.A kiónt választottuk, miután kariotípus vizsgálattal 60-140 közötti kromoszómát tartalmazó poliploid sejtvonalnak bizonyult.
Erőteljesen szaporodó HT01.A sejteket úgy állítottunk elő, hogy egy sejtmintát prisztánnal (2,6,10,14tetrametil-pentadekán, Aldrich) kezelt egerek hasüregében passzáltunk. A túlélő sejtek egyedi kolóniák formájában nőttek mikrotitráló lemezeken. Ezeket tenyésztettük és megvizsgáltuk szaporodási készség, kariotípus és fúzióra való képesség szempontjából. Végül a HTO1.A.P1 kiónt választottuk a 135 egér és 3 humán kromoszómából álló készlet alapján. Ezt a sejtvonalat használtuk fúziós partnerként hepatitis A szeropozitív donortól nyert perifériásvér-limfocitákhoz.
b) Ellenanyag-termelő sejtek nyerése és stabilizálása
Vérmintát vettünk egy hepatitis A-virus (HAV) szeropozitív donortól körülbelül négy hónappal azután, hogy fertőzött élelmiszer fogyasztásával hepatitis Afertőzést kapott az Egyesült Királyságban.
A perifériásvér-limfocitákat Limphoprep. gradiensen (Flow Labs) elválasztottuk, Epstein-Barr-vírussal (EBV) transzformáltuk, majd fítohemagglutinint és 10% borjúszérumot tartalmazó tápfolyadékban 10 napon át tenyésztettük. Ezután fúzionáltattuk azokat a fent leírt humán/egér kiméra sejtekkel PEG 1500 alkalmazásával és HAT, valamint 10“5 mol/liter ouabin jelenlétében tenyésztettük 2 milliliter térfogatú rekeszekben. A tápfolyadék felülúszókat szendvics ELISA-eljárással vizsgáltuk anti-HAV ellenanyag jelenlétére tíz nappal a fúzió után, amikor különálló kolóniák váltak láthatóvá mikroszkóp alatt. Egyedi kolóniákat emeltünk ki a pozitív rekeszekből, és azokból monoklonális sejtvonalakat állítottunk elő kétszeri klónozással határhígításos eljárással. Az eredeti 42 darab 2 milliliteres rekeszből 17 bizonyult erősen pozitívnak a tápfolyadék alapos cseréjét követő kezdeti ELISA-vizsgálatok szerint, de ellenanyagot termelő monoklonális sejtvonalat azokból csak négyet sikerült előállítani. A többi klón az izolálás vagy klónozás (beleértve a kétszeri klónozás utánit) különböző fázisaiban abbahagyta az ellenanyagszekréciót, valószínűleg a heterohibridek kromoszómáinak eltérő instabilitása miatt.
c) Hibridöma kiválasztása
A fent leírt sejtvonalakból származó ellenanyagokat (A, B, C és D) szendvics és direkt ELISA-vizsgálattal titráltuk teljes és természetes üres vírusrészecskékkel szemben. A titereket, amelyeket azon hígítás mértékének 10-es alapú logaritmusának reciprok értékével fejeztünk ki, amely a maximális adszorbciós tetőzésnek az 50%-át adta, az la táblázat mutatja. Ezek az értékek az egyedi ellenanyagok szendvicspróba alapján észlelt, natív részecskékkel szembeni titereinek százalékában szerepelnek az lb táblázatban.
la táblázat
Humán ellenanyagok ELISA titerei teljes és természetesen üres HAV részecskéken vizsgálva
Ellenanyag-azonosító | Szendvics | Közvetlen | ||
teli | üres | teli | üres | |
Antitest A | 4,42 | 4,42 | 3,77 | 3,35 |
Antitest B | 4,85 | 4,78 | 4,13 | 3,80 |
Antitest C | 3,91 | 3,72 | 4,02 | 3,59 |
Antitest D | 4,10 | 4,15 | 3,92 | 3,60 |
HU 220 355 Β
Ib táblázat
Ellenanyagok ELISA-aktivitása a homológ ellenanyagok szendvicspróba alapján észlelt, teljes vírusrészecskékkel szembeni titereinek százalékában kifejezve
Ellenanyag-azonosító | Szendvics | Közvetlen | ||
teli | üres | teli | üres | |
Antitest A | 100 | 100 | 22 | 9 |
Antitest B | 100 | 85 | 19 | 9 |
Antitest C | 100 | 65 | 126 | 48 |
Antitest D | 100 | 112 | 66 | 32 |
d) Kompetíciós vizsgálatok
Az ellenanyagok azon képességét, hogy milyen mértékben gátolják egymást és az egérellenanyagokat a vírushoz való kötődésben szilárd fázisú radioimmunvizsgálattal és ELISA-próbával vizsgáltuk, amely eljárások csak az utolsó lépésben különböznek. Az eredmények, 20 amelyeket az ellenanyagpárok közötti maximális kompetíció százalékában fejeztünk ki a 2. táblázatban azt mutatják, hogy:
I) Az A és B ellenanyagok egymástól nem különböztethetők meg és hasonlatosak a K24F2 egérellenanyaghoz [MacGregor A. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 18, 1237, (1983)].
II) A D ellenanyag tulajdonságai alapján közel áll az egér B5B3 ellenanyaghoz [Stapleton J. T. és Lemmon S. M., J. Virol., 61, 491, (1987)] és csak az A ellenanyaggal interferál körülbelül maximum 30% mértékben a reciprok vizsgálatok szerint.
III) A C ellenanyag úgy tűnik funkcionálisan az A, valamint a D ellenanyagok közé esik.
IV) Mind az A, mind a D ellenanyag egyenként képes volt igen hatékonyan gátolni a humán HAV poliklonális szérum kötődését [Lemmon S. M. és munkatársai, J. Clinical Microb., 17, 834; Foxwell és Chulay],
A B5B3 ellen az A, valamint a B ellenanyaggal kapott magas kompetíciós értékeket 10-szeresen koncentrált ellenanyaggal nyertük, míg a szövettenyészet felül25 úszói csupán 20%-os, vagy alacsonyabb kompetíciót mutattak. Ezzel ellentétben ugyanezeket a felülúszókat lényegesen meg kellett hígítani ahhoz, hogy a K24F2, valamint a K.34C8 ellenanyagokkal [MacGregor A. és munkatársai, J. Clin. Microb., 18, 1237, (1983)] szem30 ben olyan teljes kompetíciós görbét kapjunk, mint amelyet a D ellenanyag felülúszója adott a B5B3 ellenanyaggal szemben.
2. táblázat
Az ellenanyagkötődés maximális kompetíciója (%) a 18F HAV törzshöz
4th Ab (detektálás) 3rd Ab (kompetitor) | A | D | K34C8 | K24F2 | B5B3 | Humán poliklonális antiszérum (Chulay) |
Antitest A | 100 | 32 | 90 | 100 | 96' | 94 |
Antitest B | 100 | 33 | 78 | 100 | >65' | |
Antitest C | 66 | 55 | 46 | 72 | 91 | |
Antitest D | 24 | 100 | 29 | 69 | 99 | 92 |
Antitest A&D | ||||||
1:1 mix | 99 | |||||
K34C8 | 100 | 32 | 100 | |||
K24F2 | 100 | 70 | 100 | |||
B5B3 | 69 | 100 | 100 | |||
Humán poliklonális antiszérum (NF) | 100 |
1: A maximális kompetícióhoz hígítatlan ellenanyag szükséges.
e) RlFA-vizsgálatok
Mindegyik, a kezdeti ELISA-vizsgálatokkal észlelt ellenanyag ugyancsak pozitív volt radioimmunfokuszáló vizsgálattal a 18f vírus ellen. [Daemer R. J. és munkatársai, Infect. & Immunoi., 32, 388, (1981); Stapleton J. T., és Lemmon S. M., J. Virol., 61, 492, (1987); valamint
Ping L. A. és munkatársai, 85, 821, (1987)]. Egyenlő térfogatú meghatározott koncentrációjú (1 mg/ml) affinitáskromatográfiával tisztított ellenanyag és a 18f, valamint a 43c vírus törzsek (a 43c törzset a 18f törzsből nyertük egér-monoklonálisellenanyag melletti passzálásokkal) 10-szeres hígításainak reagáltatásával kapott vírus10
HU 220 355 Β
RIFA-titer csökkenéseket a 3. táblázatban foglaltuk össze. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mutáns 43c törzset mindkét ellenanyag igen gyengén neutralizálja, azonban poliklonális Foxwell-szérummal szignifikáns, noha csökkent neutralizációt mutat.
Úgy tűnik mindkét ellenanyag sokkal kevésbé hatékonyan neutralizálja a 18f vírust, mint a poliklonális szérum, ez jórészt mindkét vírus hígításában megmaradó meglehetősen állandó számú túlélő plakknak tudható be, ami a Spearman-Karber-féle titerszámítás torzulását okozza. A poliklonális szérummal való reakció azonban minden plakk-képzést megakadályozott. Az ellenanyagok esetében a kompetíciós vizsgálatokban kapott, a poliklonális szérumhoz hasonló reakciógörbék és az ellenanyagok összesített ELISA-reaktivitása nem utal arra, hogy ezek alacsony affinitású ellenanyagok lennének.
3. táblázat
A HAV plakk-képző egység/ml log10 titer csökkenése Specifikus antitesttel reagáltatott izolátumok
HAV törzs | A 1 mg/ml | Antitest D 1 mg/ml | Poliklonális humán szérum (1/10) |
18f | 3,15 | 2,72 | >4,56 |
43c | 0,68 | 0,78 | 1,93 |
f) A hepatitis A-vírus elleni D monoklonális ellenanyag nehéz és könnyű láncának klónozása és szekvenálása
1. eljárás
D ellenanyagot expresszáló 2,5xlO7 sejtből teljes RNS-t izoláltunk Chomczynski és Sacchi eljárása szerint [Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987)] 1 χ 107 sejthez 1 ml extrakciós oldatot használva. A kapott RNSüledéket 50 mikroliter dietil-pirokarbonáttal (DEPC) kezelt desztillált vízben oldottuk, és spektrofotométerrel 4,4 mikrogramm/mikroliter koncentrációra állítottuk be. 75 mikrogramm teljes RNS-ből Dynabeads Oligo (dT)25 szemcsék (Dynal Winal, Egyesült Királyság) felhasználásával a poliadenilált RNS-t kivontuk a gyártó utasításai szerint.
2. eljárás
Más eljárás szerint (2) a poliadenilált RNS-t közvetlenül 103 D ellenanyag szekretáló sejtből izoláltuk MicroFastTrack mRNS-izoláló rendszer felhasználásával (Invitrogen, San Diego, USA) a gyártó utasításai szerint.
Megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy korlátozott számú sejtből klónozzuk a humán ellenanyaggéneket. Ezer D ellenanyag szekretáló sejtből izolált poliadenilált RNS felhasználásával a 2. eljárás szerint cDNS-génkönyvtárat létesítettünk. Számításaink szerint a génkönyvtár körülbelül 2000 válogatott méretű (>500 bázispár) cDNS-inszertet tartalmazhatott. A génkönyvtár felét lemezekre oltottuk és humán kappa-L-láncra nézve vizsgáltuk, így két pozitív kiónt találtunk. Részleges szekvenálás megerősítette, hogy mindkét klón tartalmazta a szignál peptidszekvenciákat magában foglaló teljes L-lánc-géneket. Bár ezt a génkönyvtárat a H-lánc-próbával nem vizsgáltuk, a kiindulási cDNS-génkönyvtárban kapott H-lánc-pozitív kiónok (2/500) előfordulási gyakorisága alapján számítva a teljes hosszúságú Hlánc-inszerteknek jelen kell lennie.
Az izolált mRNS-ről cDNS-t állítottunk elő, és azt a pSPORT-1 plazmidba klónoztuk a cDNS szintetizálására SUPERSCRIPT Plasmid System, valamint Plasmid Cloning készlet (GIBCO/BRL. Paisley, Egyesült Királyság) felhasználásával a gyártó által ajánlott utasítások szerint. A kapott cDNS/pSPORT -1 ligálás termékével Escherichia coli MAX EFFICIENCY DH5-alfa kompetens sejteket (GIBCO/BRL) transzformáltunk. Körülbelül 4500 kolóniát vittünk át Hybond-N nejlonszűrőkre (Amersham) és azokat lizáltuk, denaturáltuk és fixáltuk Buluwela és munkatársai eljárása szerint [Nucleic Acids Rés., 17, 452, (1989)]. A szűrőket proteináz-K-val kezeltük (50 mikrogramm/ml proteináz-K enzim 0,2 χ SSC, 0,1% SDS-pufferben oldva, 55 °C-on, 30 percig), majd a felesleges sejttörmeléket törlőkendővel eltávolítottuk. A génkönyvtárakat ezután nehéz- és könnyűlánc-próbák felhasználásával humán ellenanyag nehéz- és könnyűlánc-szekvenciákra nézve vizsgáltuk.
A nehézlánc-próba egy humán IgGl ellenanyag cDNS-inszert volt [patkány CAMPATH-1 (Campath a The Wellcome Foundation Limited védjegye) ellenanyag nehéz lánc CDR-ek humán NEW IgGl ellenanyag nehéz láncon újra kialakítva; Riechmann és munkatársai, Natúré, 382, 323-327, (1988)], amelyet a Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit (DNSjelölésre és kimutatásra szolgáló nem radiokatív készlet) (Boehringer Mannheim) felhasználásával digoxigenin-ll-dUTP-vel jelöltünk, és D ellenanyag nehéz láncra nézve körülbelül 500 átvitt kolóniát tartalmazó szűrők vizsgálatára használtunk a gyártó utasításai szerint. Két lehetséges pozitív kolóniát észleltünk, és ezeket további vizsgálat céljára kiválasztottuk. A Qiagen készlet (Diagen, Düsseldorf, Németország) felhasználásával, vagy Del Sál és munkatársai eljárása szerint [Nucleic Acids Rés., 16, 9878, (1988)] plazmid-DNS-t állítottunk elő és úgy találtuk, hogy mindkét lehetséges pozitív klón a humán immunglobulin nehéz lánc cDNSnek megfelelően várt méretű inszerteket tartalmaz. Egy pH210H2-nek nevezett kiónt kiválasztottunk és plazmid priming módszerrel a didezoxi-láncterminációs eljárással [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, (1977)] a Sequenase készlet (United States Biochemicals-USB, Cleveland, USA) utasításai szerint mindkét irányból szekvenáltuk. A nehéz lánc C régióját gamma-1-ként határoztuk meg. A variábilis régió szekvenciáját a 2. ábra mutatja.
A könnyűlánc-próbák humán lambda-cDNS-ek [humanizált anti-CD3 monoklonális ellenanyag (mAb) lambda-L lánc inszert (patkány anti-CD3-mAb L lánc CDR-ek humán lambda-Kem-Oz- ellenanyag L láncon átalakítva; E. Routledge, Eur. J. Immunoi., 21, 2717, (1991)], valamint egy Campath-1H kappa-L-lánc cDNSinszert [patkány Campath-1 mAb L lánc CDR-ek humán REI kappa-ellenanyag L láncán átalakítva; Page és Sydenham, Biotechnology, 9, 64, (1991)] voltak, amelyeket a Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit
HU 220 355 B (DNS jelölésre és kimutatásra szolgáló nem radioaktív készlet) (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) felhasználásával digoxigenin-ll-dUTP-vel jelöltünk, és D ellenanyag könnyű láncra nézve körülbelül 4000 átvitt kolóniát tartalmazó szűrők vizsgálatára használtunk a gyártó utasításai szerint. Húsz lehetséges pozitív kolóniát észleltünk, tizet további vizsgálat céljára kiválasztottunk. A Qiagen készlet (Diagen, Düsseldorf, Németország) felhasználásával, vagy Del Sál és munkatársai eljárása szerint (1988) plazmid-DNS-t állítottunk elő, nyolc klón a humán immunglobulin könnyű lánc cDNS-nek megfelelően várt méretű inszerteket tartalmazott. Egy pH210L2nek nevezett kiónt kiválasztottunk és plazmid priming módszerrel a didezoxi-láncterminációs eljárással [Sanger és munkatársai, (1977)] a Sequenase készlet (USB, Cleveland, USA) utasításai szerint mindkét irányból szekvenáltuk. A könnyű láncot lambda-szekvenciaként határoztuk meg, melynek variábilis régióját a 3. ábra mutatja, g) Expressziós konstrukciók összeállítása
g.i) példa
A pRDNl expressziós vektort a pLD9 plazmidból [Page és Sydenham M. A., Biotechnology, 9, 64-68, (1991)] alakítottuk át az alábbiak szerint. Az SV40 replikációs origó inszertálására használt Hindlll hasítási helyet, valamint a másik, a DHFR kódolószekvenciától 5’ irányban található Hindlll hasítási helyet Hindlll emésztéssel roncsoltuk, majd DNS-polimeráz Klenow-ffagmensével feltöltöttük és újraligáltuk. A mindkét restrikciós helytől mentes kiónt EcoRI enzimmel emésztettük, Klenow-enzimmel feltöltöttük és újból lígáltuk. Az így kapott, minden belső Hindlll és EcoRI hasítási helytől mentes plazmidba inszertáltuk a humán béta-aktin expressziós kazettát a DHFR transzkripciós egységtől 3’ irányba. Ez a plazmid rendelkezik egy funkcionális SV40 replikációs origóval, és a pRDNl plazmid a bétaaktin promotertől 3’ irányban rendelkezik egy-egy egyedi Hindlll és EcoRI hasítási hellyel. Az átalakított pRDNl vektort EcoRI enzimmel hasítottuk, Klenowenzimmel tompa végűvé tettük és boíjúbél-foszfatázzal defoszforileztúk. A megfelelő pH210H2, illetve pH210L2 kiónokból a D ellenanyag nehéz és könnyű lánc inszerteket Hindlll, illetve EcoRI enzimekkel kivágtuk, és Klenow-enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított inszerteket pRDNl plazmidba lígáltuk, és Escherichia coli MAX Efftciency DH5 kompetens sejtek (Bethesda Research Labs BRL) transzformálására használtuk. Számos így kapott kolóniából plazmidot állítottunk elő kis mennyiségben [Del Sál G. és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 16, 9878, (1988)] és az inszertek irányultságát megfelelő restrikciós enzim emésztésekkel meghatároztuk. Egy nehéz- és egy könnyúlánc-klónból (pRDHH9, illetve pRDHL27) Qiagen (védjegyű) oszlopokon (Hybaid) plazmid-DNS-t állítottunk elő a gyártó utasításai szerint.
COS-sejtek transzfektálása
2xl05 sejtet oltottunk egy 12 rekeszú szövettenyésztő lemez mindegyik rekeszébe (szérumot tartalmazó) D-MEM tápfolyadékba. 24 óra elteltével az egy rétegben növő sejteket szérummentes tápfolyadékkal kétszer mostuk, majd a rekeszekhez az egyes DNS-konstrukciók (pRDHH, valamint pRDHL27) 1 mikrogrammját, valamint 5 mikrogramm TRASFECTAM-ot (Northumbria Biologicals Limited) tartalmazó 0,5 ml szérummentes tápfolyadékot adtunk a gyártó utasításai szerint. További 6 órás inkubációt követően a transzfektáló tápfolyadékot leszívtuk, és 1 ml (szérumot tartalmazó) D-MEM tápfolyadékra cseréltük. 48-72 órás inkubálás után a tápfolyadékot eltávolítottuk és humán ellenanyag jelenlétére vizsgáltuk.
Humán ellenanyag ELISA-vizsgálatok
A COS-sejtek transzfektálásánál nyert tápfolyadékot megvizsgáltuk humán ellenanyag jelenlétére. Könnyúlánc-szintézis hiányában a sejtből nehéz láncok nem szekretálódnak, hanem a sejten belül lebomlanak [Hendershot L. és munkatársai, Immunoi. Today, 8, 111-114], Az ellenanyagok ily módon a tenyésztőfolyadékban nehéz lánc kimutatásával vizsgálhatók. Mikrolemezeket antihumán IgG-vel fedtünk, és a tenyésztő folyadékkal inkubáltunk. Ellenanyag jelenlétét antihumán gamma-láncra fajlagos peroxidáz konjugátummal láthatóvá téve mutattuk ki.
g-ii) példa
A H, illetve L láncot kódoló DNS-t a pEEőhCMV [Stephens és Cockett, Nucl. Acids Rés., M., 7110, (1989); Bebbington és munkatársai, Biotechnology, 10, 169, (1992)], illetve pEE12 [Rolfe, nem közölt] expressziós vektorokba klónoztuk. A pEE12 plazmid az SV40 korai promoter ellenőrzése alatt tartalmazza a hörcsög glutamin szintetáz gént [GS; a toxikus glutaminanalóg L-metionin-szulfoximin (MSX) segítségével szelektálható és amplifikálható markert], valamint a pSv2.GS-ből [Bebbington és Hentschel, DNA Cloning, III. kötet, New York Academic Glover DM kiadás, (1987)] átvett hasítási és poliadenilálási szignált. Ettől a szelekciós kazettától 3’ irányban található a humán cytomegalovírus (hCMV) fő közvetlen korai (MIÉ) génjének teljes erősítő, promoter, valamint 5’ UTR szekvenciája, amelyet az ellenanyag gén expresszálásának irányítására alkalmaztunk. Ezt az expressziós kazettát az azzal kapcsolt replikációs origóval és bétalaktamáz génnel a pEE.HCMV plazmidból [Stephens és Cockett, Nucl. Acids Rés., 17, 7110, (1989)] vettük át. A pEEőhCMV, valamint pEE12 vektorokkal transzformált sejtek tehát képesek glutaminmentes tápfolyadékban növekedni. A pEEőhCMV, valamint pEE12 plazmidokat a Celltech Ltd.-től szereztük be (Slough, Berkshire, SLI4EN, UK).
Rekombináns plazmidokkal (mindegyikből 5 mikrogramm) 5 χ 105 COS-1 sejtet, vagy 107 YO myelomasejtet transzfektáltunk Transfectam reagenssel (Promega, Southampton, UK) a gyártó utasításai szerint. Ennek eredményeképp a szelektálás csupán a pEE12 plazmid jelenlétén alapul, hatékony expresszálás a két plazmid egyidejű integrálódásától függ.
H és L láncokkal transzfektáltunk COS-sejteket, annak bizonyítására, hogy a konstrukciók a leolvasási keretbe helyesen inszertálódtak, hatékonyan átíródnak, transzlálódnak és a kapott humán ellenanyag megfelelően szekretálódik. Miután az ellenanyag átmeneti expresszálódását ELISA-módszerrel igazoltuk, a plaz12
HU 220 355 Β midokkal YO myelomasejteket transzfektáltunk. COS1 törzstenyészet sejteket (ECACC, Porton Down, UK) 10% borjúszérummal (APP, Dudley, UK) kiegészített DMEM tápfolyadékban (Flow, Irvine, UK) tartottunk fenn. A COS-sejtek transzfektálását DMEM tápfolyadékban (Flow, Irvine, UK) végeztük.
Az YO törzstenyészetsejteket (ECACC, Porton Down, UK) [glutamint és ferri-nitrátot nem tartalmazó, de nátrium-piruváttal (110 mg/1); GIBCO/BRL, Paisley, UK] kiegészített DMEM tápfolyadékot (Flow, Irvine, UK), lxnem létfontosságú aminosavakat és (Flow, Irvine, UK) 10% boíjúszérumot tartalmazó teljes tápfolyadékban tartottuk fenn. A transzfektált sejteket 50 mikroliter teljes tápfolyadékban 96 rekeszú lemezekre vittük át 3χ105, 7,5 x1ο4 és 1,5 x1ο4 sejt/ml sűrűségben, majd 37 °C-on, 24 órán át inkubáltuk. Ezt követően 100 mikroliter [glutamint és ferri-nitrátot nem tartalmazó, de nátrium-piruvátot (110 mg/1) tartalmazó, GIBCO/BRL, Paisley, UK] DMEM tápfolyadékot (Flow, Irvine, UK) tartalmazó, glutamáttal (60 mikrogramm/ml) aszparaginnal (60 mikrogramm/ml, Sigma, Poole, UK), 1 x nem létfontosságú aminosavakkal, egyenként 7 mg/1 koncentrációjú adenozinnal, cytidinnel, guanozinnal és uridinnal, 2,4 mg/1 timidinnel (Sigma, Poole, UK), 10% borjúszérummal (APP, Dudley, UK) és 4 mikromol MSX-el (az YO sejtekből az endogén glutamin szintetáz enzim kititrálására) kiegészített szelekciós tápfolyadékot adtunk a humán ellenanyag géneket tartalmazó transzfektált plazmiddal kiegészült kiónok kiválogatása céljából.
Négy nappal a transzfektálást követően a COS-1 sejtekről, valamint a plazmidkiegészülésre szelektáló tápfolyadékban tenyésztett YO sejtekről a tenyésztőfolyadékot egy szendvics ELISA-módszerrel vizsgáltuk elfogó ellenanyagként poliklonális antihumán IgG-vel (Sigma, Poole, UK) fedett hajlékony mikrolemezeken (Falcon, Becton-Dickinson, Plymouth, UK). A vizsgálati minta hozzáadása után a kimutatást egy antihumán gamma-láncra fajlagos peroxidázkonjugátummal (Sigma, Poole, UK), valamint szubsztrátként ortofenilén-diamin-HCl-dal (Sigma, Poole, UK) végeztük. A pozitív kiónokat a szelektáló tápfolyadékban való további tenyésztés céljából 24 rekeszú lemezekre vittük.
Három, a nem transzfektált YO sejtekre toxikus szintű MSX jelenlétében növekedni képes kiónt nyertünk. Ezek közül ELISA-módszerrel való meghatározás alapján kettő szekretált humán ellenanyagot, míg a másik sejtvonal álpozitívnak bizonyult.
2. példa
Cynomolgus majom-ellenanyaglánc szekvenciák meghatározása
a) Ouchterlony-féle immundiffuzió
Csimpánz, cynomolgus és aotus majmoktól vett szérum felhasználásával Ouchterlony immundiffuziós vizsgálatot végeztünk a humán és fóemlős-immunglobulinok proteinszekvenciái közötti esetleges hasonlóság kimutatására.
Az Ouchterlony-vizsgálathoz használt mikrolemezeket a The Binding Site cégtől szereztük be.
A birka antihumán IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4 szérumokat a The Binding Site cégtől szereztük be.
Kecske antihumán IgM-et és kecske antihumán IgA-t a Sigma cégtől szereztünk be.
Birka antihumán lg kappa-könnyúláncot a Serotec cégtől szereztünk be.
Birka antihumán lg lambda-könnyúláncot a Serotec cégtől szereztünk be.
Cynomolgus (óvilági) majomtól, aotus (újvilági) majomtól és csimpánztól (emberszabású majomtól) vett szérumokat egy antihumán immunglobulin-sorozattal adott reakcióra vizsgáltunk. A hígítatlan birka antihumán ellenanyagot (10 mikroliter) egy ouchterlony-lemez középső rekeszébe töltöttük és a főemlősből származó szérumokat (10 mikroliter) az azt körülvevő külső rekeszekbe töltöttük. Minden szérumot PBS-ben hígítottunk a gyártó utasításai szerint. A vizsgálatban nyúlás egérszérumot is használtunk kontrollként, pozitív kontrollként humán szérumot használtunk. A lemezt szobahőmérsékleten nedves kamrában inkubáltuk egy éjszakán át, vagy amíg a precipitációs csíkok láthatóvá váltak.
Precipitációs csíkok alakultak ki a csimpánzszérum és mindegyik antihumán immunglobulin-alosztály között. Néhány, azonban nem mindegyik humán Ig-osztály, nevezetesen az IgGl, IgM, IgA, valamint a kappaés lambda-könnyüláncok precipitációs csíkot adtak a cynomolgus majomszérummal. Az aotus majom- (újvilági majom) szérumot ismerte fel a legkevesebb antihumán lg ellenanyag - kizárólag az anti-kappa- és antilambda-könnyűláncokkal szemben láttunk erős reakciót. Meglepő módon, a nyúlszérum reagált az antihumán lambda-könnyúlánccal - ez arra utal, hogy a nyúl- és humán Ig-proteinszekvenciák között ellenanyag által felismerhető közös epitóp fordulhat elő. Az egérszérumot egyetlen antihumán Ig-osztály ellenanyag sem ismerte fel. Ez a vizsgálat a várt eredményt hozta figyelembe véve az egyes fajok emberhez viszonyított evolúciós rokonságának mértékét, azaz az újvilági majmok korábban váltak le, mint az óvilági majmok, amelyek nagyobb mértékű proteinhomológiát mutatnak az emberrel. Főemlősés humán lg gének nukleotid homológiájának vizsgálatára az óvilági cynomolgus majom kappa-könnyúláncát választottuk.
b) Cynomolgus majom teljes RNS-t 10 mililiter vérből származó perifériásvér-limfocitákból állítottunk elő a guanidium-tiocianátos REF extrakciós eljárással.
Az első cDNS-szálat a BRL Superscript rendszer (BRL) segítségével készítettük a teljes RNS-ből. A teljes RNS-készítményt (5 mikrogramm) 13 mikroliter térfogatban hozzáadtuk egy mikrolitemyi oligo-dT primerhez, 10 percig 70 °C-on hevítettük, majd jégen lehűtöttük.
Az első cDNS-szál reverz transzkripcióját 2 mikroliter reakciópuffert, 1 mikroliter dNTP keverék, 2 mikroliter DTT-t és 1 mikroliter reverz transzkriptázt tartalmazó elegyben végeztük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 10 percig, majd 42 °C-on 50 percig inkubáltuk. A reakciót 5 percig 90 °C-ra történő hevítéssel, majd 10 percig jégen tartással állítottuk le. A mRNS-temp13
HU 220 355 Β látót 1 mikroliter ribonukleáz-H enzimmel 20 percig 37 °C-on emésztettük, c) Az első cDNS-szál PCR-amplifikációja PCR-primerek
A151. számú primer a humán Vkappal szekvencia 5’ végével homológ, lásd az 1. szekvenciát:
5’ GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA A 301. számú primer a humán C-kappa-szekvencia 3’ végével homológ, lásd a 2. szekvenciát:
5i GATCAAGCTTCTAACACTCTCCCC Ezeket a printereket, valamint a továbbiakban említett PCR- és szekvenáló printereket egy oligonukleotidszintetizáló berendezésen állítottuk elő és 200 nanogramm/mikroliter töménységben használtuk.
Az első cDNS-szálat közvetlenül amplifikáltuk a 15 151. és a 301. primerek segítségével anélkül, hogy szükség lett volna második szál szintetizálására. A 151. primer a humán kappa-könnyülánc variábilis régiójának (FR1) az 5’ végére, míg a 301. primer a humán kappakönnyülánc konstans régiójának 3’ végére fajlagos.
A könnyű láncot az alábbi reakció szerint ampli5 fikáltuk: a teljes első cDNS-lánc reakciós elegyét hozzáadtuk 21 mikroliter desztillált vizet, 8 mikroliter szintézispuffert (Boehringer Mannheim), 4 mikroliter 301. prímért, 4 mikroliter 151. prímért és 0,5 mikroliter Taq polimerázt tartalmazó elegyhez. Ezt az ele10 gyet ásványi olajjal felülrétegeztük és 20 PCR-ciklusnak vetettük alá a fenti program szerint. A reakció végeredményét 1%-os agarózgélen ellenőriztük a már említettek szerint,
d) Cynomolgus kappa-könnyűláncok klónozása
A 260. számú primer a humán V-kappa- (HindlII restrikciós helyet tartalmaz) 5’ végével homológ, lásd a
3. szekvenciát:
’ GATCAAGCTTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA
i) Hindlll hasítási helyek beiktatása a könnyűláncfragmens valamelyik végére
A fenti PCR során nyert cynomolgus majom kappakönnyűláncot a pUC18 plazmid [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] HindlII hasítási helyébe klónoztuk. Az amplifikált könnyű lánc egy HindlII hasítási helyet tartalmaz a konstans régió 3’ végén a 301. primer szekvencia révén, de az 5’ végén ez a restrikciós hely hiányzik. Ezért, egy HindlII hasítási helyet vittünk be a variábilis régió 5’ végébe a 260. és 301. primerekkel végzett második PCR során, ezzel lehetővé vált a könnyű lánc direkt klónozása a pUC18 plazmidba. A 260. primer a 151. primerrel azonos szekvenciával rendelkezik, de 5’ végén egy HindlII hasítási helyet tartalmaz.
A reakcióelegyet a fent említettek szerint állítottuk össze 1 mikroliter cynomolgus cDNS-t (PCR-elegyből) használva 100 mikroliter végtérfogatban. A DNS-t 20 PCR-ciklussal amplifikáltuk és az eredményt 1%-os agarózgélen ellenőriztük. A gélen az amplifikált könnyű láncnak megfelelő sávokon kívül számtalan más sávot is észleltünk. Lehetséges, hogy a kis molekulatömegű végtermékek egy része a primerek összekapcsolódása, úgynevezett primer-dimer képződés eredménye.
ii) A PCR-végtermék tisztítása
A PCR-elegyből a könnyű láncot a pUC18 plazmidba klónozás előtt az alábbiak szerint tisztítottuk. A PCR-elegyet -20 °C-ra hűtöttük és a folyékony ásványi olajat leszívtuk. A DNS-t kétszer fenol/kloroform eleggyel, majd kloroformmal extraháltuk. Az oldatot 5 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 Tris (pH 8,0), és 0,5% SDS végkoncentrációra állítottuk be, majd ehhez 50 mikrogramm/ml végkoncentrációig proteináz K-t adtunk. A reakcióelegyet 30 percig 37 °C-on, majd 68 °C-on 10 percig inkubáltuk. A fenol/kloroform extrahálást megismételtük. A DNS-t 1/10 térfogat 3 mol/1 nátriumacetáttal és 2,5 térfogat abszolút etanollal (hordozóként 1 mikroliter dextrán-szulfát hozzáadásával) kicsaptuk. A DNS-t 30 percre -20 °C-ra hűtöttük, majd egy eppendorf centrifugában ülepítettük. Az üledéket 70%-os etanollal mostuk, szárítottuk és 17 mikroliter vízben szuszpendáltuk. Ezzel a tisztítási folyamattal megakadályozható, hogy a DNS-hez kötve maradt Taq polimeráz gátolja a restrikciósenzim-aktivitást.
iii) A HindlII fragmens előállítása klónozás céljából
A könnyű lánc DNS-t ezután HindlII restrikciós enzimmel emésztettük, hogy az a pUC18 HindlII hasítási helyére klónozhatóvá váljon. 17 mikroliter könnyű lánc DNS-hez 2 mikroliter B puffért, valamint 1 mikroliter nagy töménységű HindlII enzimet adtunk és 11 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Az emésztett DNS-t 1%-os agarózgélen szétválasztottuk, és a könnyű láncnak megfelelő csíkot a gélből kivágtuk. A DNS-t „Prep-a-gene” DNStisztító készlettel (BioRad Ltd.) az agaróztól megtisztítottuk a gyártó utasításai szerint.
e) Cynomolgus könnyű lánc ligálása pUC18 plazmidba
A tisztított HindlII fragmenst a pUC18 plazmid HindlII hasítási helyére klónoztuk az alábbiakban ismertetett eljárás szerint: 20 mikroliter cynomolgus DNS-t (80 mikroliter össztérfogatból) 1 mikroliter HindlII enzimmel emésztett pUC18 (50 mikrogramm/mikroliter, Pharmacia), 3 mikroliter ligázpuffer (Boehringer), 3 mikroliter T4 DNS ligáz (Boehringer) és 3 mikroliter desztillált víz elegyéhez adtunk. A reakcióelegyet 15 °C-on 3 órán át inkubáltuk.
f) DH5-kompetens sejtek transzformálása pUC18kappa-lánccal
E. coli DH5-alfa Maximum Efficiency sejteket (BRL) transzformáltunk a könnyűlánc-plazmiddal. 100 mikroliter sejtet lassan felolvasztottunk -70 °Cról, óvatosan összekevertük 5 mikroliter ligáit reakcióeleggyel, és 30 percig jégen tartottuk. A sejteket 45 másodpercig 42 °C-on inkubáltuk, majd 2 percig jégen hűtöttük. Az elegyhez 1 ml SOC tápfolyadékot (literenként 20 g bactotryptone, 5 g élesztőkivonat, 0,5 g NaCl, 10 ml 250 mmol/1 koncentrációjú KC1, 5 ml 2 mol/1 koncentrációjú MgCl2, 20 mmol/1 glükóz) adtunk, és 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A transzformációs reakciót öt darab ampicillin (100 mikrogramm/ml) tartalmú
HU 220 355 B
LB lemeztáptalajra (LB agarlemezek: literenként 12 g trypton, 24 g élesztőkivonat, 4 ml glicerin, 100 ml foszfátpuffer, 15 g bacto-agar) oltottuk ki, és azokat egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. Megszámoltuk lemezenként a kolóniákat, és kiszámítottuk a transzformáció hatásfokát.
A lemezekről öt kolóniát leszedtünk, és PCR-módszerrel megvizsgáltuk könnyű lánc inszertek jelenlétére. Mindegyik kolóniát 65,5 mikroliter desztillált vízben szuszpendáltuk, és a szokásos reakcióelegyben a 260., valamint a 301. számú primerek felhasználásával 20 PCR-ciklusnak vetettük alá. A PCR termékét az előbbiek szerint gélen futtattuk. Azt találtuk, hogy az ötből négy kolónia tartalmazta az inszertet, ami a klónozás sikerességére utalt.
g) pUC18-kappa-lánc plazmid minikészítmények
Az öt transzformációs lemezről húsz kolóniát gyűjtöttünk és azokat 2 ml térfogatú 100 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó L-Broth levestáptalajba oltottuk (az L-Broth összetétele megegyezik az LB lemezekével, azzal az eltéréssel, hogy nem tartalmaz agart). A tenyészeteket rázás mellett, egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. Mindegyik tenyészetből 1,5 ml-t centrifugáltunk, és az üledéket 1 mg/ml lyzozymmel kiegészített 200 mikroliter STET-pufferben (0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA, 5% Triton-X-100) szuszpendáltuk. A csöveket 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 45 másodpercig forraltuk és 10 percig centrifugáltuk. A kapott üledéket steril fogpiszkálóval eltávolítottuk és a felülúszóhoz 8 mikroliter 8%-os CTAB-puffert adtunk. A csöveket a plazmid-DNS ülepítése céljából 5 percig centrifugáltuk, majd azt vortexszel 300 mikroliter 1,2 mol/1 nátrium-kloridban szuszpendáltuk. A DNS-t 750 mikroliter etanol hozzáadásával kicsaptuk, vákuum alatt szárítottuk és 20 mikroliter TE-pufferben (10 mmol/1 Tris pH 7,4,1 mmol/1 EDTA) szuszpendáltuk.
A mini készítményekben restrikciósenzim-emésztéssel (10 egység/mikroliter HindlII restrikciós enzim és B puffer, Boehringer) ellenőriztük a könnyű lánc jelenlétét. Mindegyik DNS 2 mikroliterét 0,5 mikroliter B puffer, 1 mikroliter desztillált víz, 1 mikroliter ribonukleáz A, (500 mikrogramm/ml, Boehringer) és 0,5 mikroliter HindlII enzim elegyéhez adtuk. Az emésztendő DNS-t
1,5 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd 1%-os gélen futtattuk. A könnyű lánc jelenlétét egy körülbelül 700 bázispárból álló fragmens jelezte.
h) A kappa-könnyűlánc szekvenálása
A szekvenálásnál az alábbi printereket használtuk fel.
M13 reverzprimer: a pUC18 negatív szálához kapcsolódik a többszörös klónozási helytől 3’ irányban (Pharmacia), lásd a 4. szekvenciát:
5’ AAACAGCTATGACCATG.
-40 előre irányuló primer: a pUC18 pozitív szálához kapcsolódik a többszörös klónozási helytől 3’ irányban (USB), lásd az 5. szekvenciát:
GTTTTCCCAGTCACGAC.
299. számú primer: a humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer, lásd a 6. szekvenciát:
GCGTCAGGGTGCTGCTGAGG.
106. számú primer: a humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer (5’ végen), lásd a 7. szekvenciát:
5’ GGCGGGAAGATGAAGACAGA.
151. és 260. számú primerek: lásd a C és D pontokat.
261. számú primer: humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer, lásd a 8. szekvenciát:
5’ TTCAGCAGGCACACAACAGA.
Az előző lépésből származó tíz kiónt választottunk ki további szekvenálásra (az 1., 2., 4., 5., 9., 12., 14., 15., 18. és 20. kiónokat) a didezoxi-láncterminációs eljárással. A mini-DNS-készítmény megmaradt 18 mikroliterét 2 mikroliter NaOH-hoz (2 mol/l) adtuk, és 20 percig 68 °C-on hevítettük a DNS denaturálása céljából. A DNS-t lehűtöttük, és 8 mikroliter ammónium-acetát (5 mol/1) és 100 mikroliter etanol hozzáadásával 5 percig szárazjégen tartva kicsaptuk. A DNS-t ülepítettük, 70%-os etanollal mostuk, vákuum alatt szárítottuk és 20 mikroliter desztillált vízben szuszpendáltuk.
A DNS egy részét (7 mikrolitert) 2 mikroliter reakciós puffer és a megfelelő primer 1 mikroliterének elegyéhez adtuk és 2 percig 65 °C-on inkubáltuk, majd lassan 30 °C alá hűtöttük, hogy a primer és a templát összekapcsolódjon. A teljes kappa-könnyűlánc szekvenálásához szükség volt néhány különböző primer felhasználására, a szekvenálás részleteit az alábbiakban ismertetjük. A templát/primer elegyhez a következőket adtuk: 1 mikroliter DTT (0,1 m, USB), 2 mikroliter jelölőkeverék (5xUSB), 0,5 mikroliter 35S-dATP (10 mikroCi/mikroliter, Amersham), és 2 mikroliter Sequenase enzim. A reakcióelegyet egy 35S-jelölt vezetószekvencia szintézise céljából 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A jelölő reakció befejeződését követően egy több rekeszű lemez négy rekeszéhez, amelyek
2.5 mikroliter ddGTP-t, ddATP-t, ddTTp-t, illetve ddCTP-t tartalmaztak 3,5 mikroliter jelölókeveréket adtunk. A láncterminációs reakciót 5 percig 37 °C-on hagytuk végbemenni, majd 4 mikroliter leállítóoldatot adtunk mindegyik rekeszhez. A reakcióelegyeket felhasználásig jégen tároltuk.
Szilikonozott üveglapok közé egy 8%-os akrilamidgélt (A BRL cégtől beszerzett ultratisztaságú akrilamidgél keverék-8) öntöttünk, 40 mA-en egy óráig előfuttatást végeztünk futtatópufferként TBE-puffer (0,09 mol/1 TMS-borát, pH 8,0,0,002 mol/1 EDTA) felhasználásával. A rekeszeket az előfuttatás előtt és után pufferrel mostuk a levegőbuborékok és a karbmid eltávolítása céljából. A mintáknak a gélre töltése előtt azokat 2 percig 95 °C-on hevítettük, majd mindegyik minta 4 mikroliterét a gélre töltöttük. A mintákat 40 mA-en
1.5 órán át futtattuk, majd egy második sorozat mintát töltöttünk a gélre, és azt további 1,5 órán át futtattuk. Ez az eljárás mindegyik minta esetében egy rövid és egy hosszú futást eredményezett. Az üveglapokat szétszedtük és a gélt 10% ecetsav/10% metanol elegyébe helyeztük, mielőtt azt egy 3MM papírlapra vittük át. A gélt 1,5 óráig 80 °C-on szárítottuk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten röntgenfilmet exponáltunk vele. Az autoradiogrammot előhívtuk és a szekvenciát a rö15
HU 220 355 Β vid és hosszú futások átfedésének figyelembevételével alulról felfelé haladva leolvastuk.
j) A szekvenciaadatok összehasonlítása
A tíz klón teljes könnyű láncának szekvenciáit különböző primerek felhasználásával egy sorozat szekvenálási reakció futtatásával kaptuk. A szekvenciaadatok összehasonlítását a 4-7. ábra mutatja. Úgy találtuk, hogy a 14., valamint 5. klón csonkított könnyűláncszekvenciákat tartalmaznak. Ez legnagyobb valószínűség szerint az mRNS reverz transzkripciója, vagy a cDNS PCR-amplifikációja közben keletkezett műtermék. Lehetséges, hogy az mRNS vagy cDNS egy másodlagos szerkezetet vett fel, amelyen keresztül a megfelelő enzim nem volt képes az olvasást folytatni, és így egy részleges szekvenciát eredményeztek. A 15. kiónt választottuk, hogy ismert könnyűlánc-szekvenciákkal való további összehasonlítás révén annak azonosságát igazoljuk, valamint összehasonlítást végeztünk humán, nyúl és egér könnyűlánc-szekvenciákkal, hogy meghatározzuk a nukleotid- és aminosavszekvencia homológiákat. Az eredményeket a 4-7. táblázatok mutatják.
A cynomolgus könnyű lánc konstans régióját humán őssejt C-kappa-gén [Hieter P. A. és munkatársai, Cell, 22, 197, (1980)], egy egér MOPC21 C-kappamRNS [Hamlyn P. A. és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 9, 4485, (1981)], valamint nyúl C-kappa-mRNS (17D9) [McCartney-Francis N. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1794, (1984)] szekvenciákkal hasonlítottuk össze. A cynomolgus variábilis régiókat egy Walker-féle humán limfoid sejtvonallal [Klobek H. G. és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 12, 6995, (1984)] hasonlítottuk össze. Ez a sejtvonal egy olyan a V-kappal családba tartozó könnyű lánc gént expresszál, amely a J5 gén szegmenst hasznosítja. A 17D9 nyúlszekvenciát, valamint az S107A egér V-kappal szekvenciát [Kwan S. P. és munkatársai, J. Exp. Med., 153, 1366, (1981)] összehasonlítottuk a cynomolgus variábilis szekvenciákkal. Az utóbbi egy foszfokolin kötő IgA kappa-mieloma, amely az egér J1 gén szegmenst hasznosítja. A 15. klón variábilis régióját egy Daudi-féle humán ellenanyaggal is összehasonlítottuk (Klobek, 1984). Ez a könnyű lánc gén a V-kappal családba tartozik és a J5 gén szegmenst hasznosítja. A cynomolgus ellenanyag kappa-könnyűlánc konstans régiójának szekvenciája mind nukleotid (91,6%), mind aminosav (81,3%) szinten nagymértékű homológiát mutat a humán C-kappa-génével. Az egér C-kappa-szekvencia nagyobb mértékű homológiát mutatott a cynomolgus majom és a humán C-kappa-szekvenciával, mint a nyúl Ckappa-szekvencia. A százalékosan kifejezett homológia azonban nem különbözött drámai módon a humánés majomszekvenciák nyúl- és egér-, illetve a nyúlszekvencia egérszekvenciához való összehasonlításakor.
Az 5. és 6. táblázatokban megadtuk a homológia százalékban kifejezett mértékét a 15. klón mindegyik keretrégiója és mindegyik CDR-régiója esetében. A várakozásnak megfelelően a keretrégiók a CDR-régiókhoz viszonyítva a fajok között viszonylag megőrzöttek, míg az utóbbiak között figyelemreméltó variabilitást találunk. A 15-ös klón például 90-96% aminosavszekvencia homológiát mutat a humánnal az 1. és 3. keretrégiókban, azonban csupán 22% homológiát mutat a CDR 3 régióban. A 15-ös klón különösen az 1. és 3. keretrégióban nagymértékű homológiát mutat mind a Walker-féle, mind a Daudi-féle humán könnyűlánc-szekvenciákkal, bár nagyobb mértékű homológiát mutat a Walker-féle szekvenciával. A nyúl V-kappa-szekvencia mind a humán, mind a majomszekvenciákkal nagyobb mértékű homológiát mutat, mint az egéré. Ez magyarázatot adhat arra, hogy miért adott az ouchterlonyvizsgálatban a nyúlszérum pozitív reakciót néhány antihumán ellenanyaggal, egérszérummal azonban nem láttunk reakciót.
4. táblázat
Könnyű lánc konstans régió homológiák összehasonlítása
Species | % homológia DNS | % homológia AA |
Cynomolgus/ humán | 91,6 | 81,3 |
Cynomolgus/nyúl | 66,0 | 51,0 |
Cynomolgus / egér | 68,0 | 58,0 |
Cynomolgus/nyúl | 65,7 | 45,8 |
Cynomolgus /egér | 69,8 | 58,9 |
Cynomolgus /egér | 63,0 | 49,5 |
5. táblázat
Könnyűlánc-keret és CDR DNS-szekvencia homológja százalékban kifejezett mértéke Cynomolgus 15-ös klón
Humán W | Humán D | Nyúl | Egér | |
FR1 | 89,9 | 89,9 | 71,0 | 66,7 |
CDR1 | 84,8 | 66,7 | 60,6 | 42,4 |
FR2 | 95,6 | 80,0 | 86,7 | 75,6 |
CDR2 | 80,0 | 60,0 | 60,0 | 50,0 |
FR3 | 92,6 | 91,6 | 82,1 | 76,8 |
CDR3 | 50,0 | 61,5 | 26,9 | 57,7 |
FR4 | 75,8 | 75,8 | 66,7 | 66,7 |
6. táblázat Könnyűlánc-keret és CDR-aminosavszekvencia homológia mértéke százalékban kifejezve Cynomolgus 15-ös klón
Humán W | Humán D | Nyúl | Egér | |
FR1 | 95,7 | 95,7 | 52,2 | 47,8 |
CDR1 | 72,7 | 27,3 | 36,4 | 36,4 |
FR2 | 73,3 | 86,7 | 66,7 | 60,0 |
CDR2 | 71,4 | 42,9 | 71,4 | 28,6 |
FR3 | 90,6 | 96,9 | 78,1 | 78,1 |
CDR3 | 22,2 | 22,2 | 0,0 | 33,3 |
FR4 | 80,0 | 70,0 | 60,0 | 70,0 |
HU 220 355 Β
Claims (27)
1. Eljárás főemlős rekombináns ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) kiválasztunk egy kívánt ellenanyag expresszálására képes főemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;
(ii) a sejtvonalból mRNS-t izolálunk, és az mRNS-t elválasztjuk a többi így izolált RNS-től;
(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a cDNS-t egy klónozási vektorba inszertáljuk;
(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;
(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re;
(vi) a cDNS-t inszertáljuk egy expressziós vektorba;
(vii) egy gazdasejtet transzferálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral, és (viii) a transzfektált gazdasejtet tenyésztjük, és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő sejtvonalból indulunk ki.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás csimpánz vagy óvilágimajom-ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő sejtvonalból indulunk ki.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy óvilágimajom-ellenanyagként cynomolgus ellenanyagot állítunk elő.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy betegségből felgyógyult vagy a betegség remissziós stádiumában levő egyedtől nyert limfocitákból állítjuk elő.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy kórokozó organizmussal fertőzött, daganatos betegségben vagy autoimmun betegségben szenvedő, de a betegség teljes tünetegyüttesét nem mutató egyéntől nyert limfocitákból állítjuk elő.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat vírussal fertőződött egyéntől nyeljük.
8. Az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy antigénnel vakcinázott vagy beoltott és arra ellenanyag-termeléssel válaszoló egyéntől nyert limfocitákból állítjuk elő.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat stabilizáljuk vagy folyamatos szaporodásúvá tesszük.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy kívánt antigén elleni ellenanyag termelésének vizsgálatával választjuk ki.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat az ellenanyag működőképességére nézve tovább válogatjuk.
12. Eljárás egy rekombináns ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) körülbelül 1000 sejtből mikro-RNS-készítményt állítunk elő;
(ii) méret szerint válogatott cDNS-génkönyvtárat készítünk;
(iii) a génkönyvtárat átvizsgáljuk a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re, és ez utóbbit izoláljuk;
(iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t egy expressziós vektorba inszertáljuk;
(v) egy gazdasejtet transzfektálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral és (vi) a transzfektált gazdasejteket tenyésztjük és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.
13. Eljárás főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) kiválasztunk egy kívánt ellenanyag expresszálására képes főemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;
(ii) a sejtvonalból mRNS-t izolálunk, és az mRNS-t elválasztjuk a többi így izolált RNS-től;
(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a cDNS-t egy klónozási vektorba inszertáljuk;
(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;
(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re, és ez utóbbit izoláljuk.
14. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy valamely a 13. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-t tartalmaz.
15. Eukarióta sejtvonal, azzal jellemezve, hogy egy a 14. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzfektálva.
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitisvírus elleni rekombináns ellenanyagot állítunk elő.
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitisvírus elleni humán rekombináns ellenanyagot állítunk elő.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitis A-vírus elleni rekombináns ellenanyagot állítunk elő.
19. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként eukarióta sejtvonalat alkalmazunk.
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem humán főemlős rekombináns ellenanyagot állítunk elő.
21. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot, valamint a gyógyszergyártásban szokásos hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.
22. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy humán főemlős-ellenanyagot tartalmaz.
23. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy nem humán főemlős-ellenanyagot tartalmaz.
24. A 23. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy csimpánz- vagy óvilágimajomellenanyagot tartalmaz.
25. Eljárás vírusfertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal
HU 220 355 B jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígítóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
26. Eljárás daganatos megbetegedés kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
27. Eljárás Rh-negatív egyén Rh-D antigénnel való találkozásának kezelésére vagy megelőzésére szolgáló
5 gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított humán rekombináns ellenanyagot a gyógy szergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítmény10 nyé alakítunk.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB919115284A GB9115284D0 (en) | 1991-07-15 | 1991-07-15 | Production of antibodies |
GB919116594A GB9116594D0 (en) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | Production of antibodies |
GB929206284A GB9206284D0 (en) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | Production of antibodies |
PCT/GB1992/001282 WO1993002190A1 (en) | 1991-07-15 | 1992-07-14 | Production of antibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9400110D0 HU9400110D0 (en) | 1994-05-30 |
HUT69798A HUT69798A (en) | 1995-09-28 |
HU220355B true HU220355B (hu) | 2001-12-28 |
Family
ID=27265765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9400110A HU220355B (hu) | 1991-07-15 | 1992-07-14 | Eljárás antitest előállítására |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5876961A (hu) |
EP (1) | EP0523949B1 (hu) |
JP (1) | JP3502093B2 (hu) |
KR (1) | KR100255717B1 (hu) |
AT (1) | ATE243747T1 (hu) |
AU (1) | AU662752B2 (hu) |
CA (1) | CA2111858A1 (hu) |
DE (1) | DE69233104T2 (hu) |
ES (1) | ES2199216T3 (hu) |
FI (1) | FI940144A0 (hu) |
HU (1) | HU220355B (hu) |
IE (1) | IE922287A1 (hu) |
IL (1) | IL102490A0 (hu) |
NZ (1) | NZ243558A (hu) |
TW (1) | TW373023B (hu) |
WO (1) | WO1993002190A1 (hu) |
Families Citing this family (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
US6136310A (en) | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
US5756096A (en) * | 1991-07-25 | 1998-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant antibodies for human therapy |
MX9204374A (es) * | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
IL102640A0 (en) * | 1991-07-25 | 1993-01-14 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US6010861A (en) * | 1994-08-03 | 2000-01-04 | Dgi Biotechnologies, Llc | Target specific screens and their use for discovering small organic molecular pharmacophores |
US20020122807A1 (en) * | 1998-07-07 | 2002-09-05 | Dan Michael D. | Antigen binding fragments, designated 4B5, that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers |
US20030180284A1 (en) * | 1998-11-05 | 2003-09-25 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational and linear epitopes |
MXPA02008472A (es) | 2000-03-03 | 2004-03-26 | Cambridge Antibody Tech | Anticuerpos humanos contra la eotaxina y su uso. |
US6946546B2 (en) | 2000-03-06 | 2005-09-20 | Cambridge Antibody Technology Limited | Human antibodies against eotaxin |
AU2002234001B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-05-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US7396917B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US20040253242A1 (en) * | 2000-12-05 | 2004-12-16 | Bowdish Katherine S. | Rationally designed antibodies |
US20160279239A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-09-29 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
DK1523496T3 (da) | 2002-07-18 | 2011-10-17 | Merus B V | Rekombinant fremstilling af blanding af antistoffer |
ES2408582T3 (es) | 2003-05-30 | 2013-06-21 | Merus B.V. | Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
WO2005068622A2 (en) | 2004-01-20 | 2005-07-28 | Merus B.V. | Mixtures of binding proteins |
JP5143551B2 (ja) | 2004-07-06 | 2013-02-13 | バイオレン,インク. | ユニバーサル抗体のライブラリー |
US20160355591A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-12-08 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies |
ITRM20050297A1 (it) * | 2005-06-08 | 2006-12-09 | Univ Siena | Anticorpi diretti contro la proteina basica della mielina che riconoscono un epitopo del cd64 e uso di essi come immunodepressivi. |
CN101663390B (zh) | 2006-09-13 | 2013-10-23 | Abbvie公司 | 使用非动物源水解产物的分批补料细胞培养方法 |
US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
WO2008094316A2 (en) | 2006-09-22 | 2008-08-07 | Stowers Institute Of Medical Research | Novel branchiostoma derived fluorescent proteins |
EP2098536A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-09 | 4-Antibody AG | Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins |
JP2012508584A (ja) | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化 |
US9079942B2 (en) | 2009-02-09 | 2015-07-14 | Epitomics, Inc. | CDR-anchored amplification method |
US20100317539A1 (en) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Guo-Liang Yu | Library of Engineered-Antibody Producing Cells |
US8293483B2 (en) | 2009-09-11 | 2012-10-23 | Epitomics, Inc. | Method for identifying lineage-related antibodies |
US10585098B2 (en) | 2009-11-23 | 2020-03-10 | The Johns Hopkins University | Optimizing diagnostics for galactofuranose containing antigens |
WO2011063395A2 (en) * | 2009-11-23 | 2011-05-26 | The Johns Hopkins University | Lateral flow device for diagnosing microbial infections |
EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
CA2831572C (en) * | 2011-05-02 | 2019-11-26 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
EP3594232A1 (en) | 2012-04-20 | 2020-01-15 | Merus N.V. | Methods and means for the production of ig-like molecules |
WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
US9505833B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-11-29 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same |
WO2013158279A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Protein purification methods to reduce acidic species |
US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
EP2869845B1 (en) | 2012-07-06 | 2019-08-28 | Genmab B.V. | Dimeric protein with triple mutations |
US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
EP2890782A1 (en) | 2012-09-02 | 2015-07-08 | AbbVie Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
EP3470431A1 (en) | 2012-09-27 | 2019-04-17 | Merus N.V. | Bispecific igg antibodies as t cell engagers |
WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
US8921526B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-12-30 | Abbvie, Inc. | Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use |
US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
JP6205175B2 (ja) | 2013-05-16 | 2017-10-04 | 株式会社Resvo | 精神・神経疾患バイオマーカー |
US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
WO2015095195A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-25 | The Johns Hopkins University | Interferon-gamma release assays for diagnosis of invasive fungal infections |
JP6771385B2 (ja) | 2014-02-28 | 2020-10-21 | メルス ナムローゼ フェンノートシャップ | 二重特異性抗体および医薬組成物 |
KR20240042540A (ko) | 2014-02-28 | 2024-04-02 | 메뤼스 엔.페. | ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체 |
RS57928B1 (sr) | 2015-07-10 | 2019-01-31 | Merus Nv | Antitela koja vezuju humani cd3 |
PL3365373T3 (pl) | 2015-10-23 | 2021-08-23 | Merus N.V. | Molekuły wiążące, które hamują wzrost nowotworu |
CN110650752A (zh) | 2017-03-31 | 2020-01-03 | 美勒斯公司 | 用于治疗具有NRG1融合基因的细胞的ErbB-2和ErbB3结合双特异性抗体 |
EP3606964A4 (en) | 2017-04-03 | 2020-12-09 | Immunomedics, Inc. | SUBCUTANE ADMINISTRATION OF ANTIBODY DRUG CONJUGATES FOR CANCER THERAPY |
SG11202001050PA (en) | 2017-08-09 | 2020-03-30 | Merus Nv | Antibodies that bind egfr and cmet |
WO2019070047A1 (ja) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | 小野薬品工業株式会社 | 二重特異性抗体 |
TWI804572B (zh) | 2018-02-09 | 2023-06-11 | 日商小野藥品工業股份有限公司 | 雙特異性抗體 |
TW202102544A (zh) | 2019-04-04 | 2021-01-16 | 日商小野藥品工業股份有限公司 | 雙特異性抗體 |
EP3998081A4 (en) | 2019-07-05 | 2023-07-12 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | TREATMENT OF BLOOD CANCER WITH PD-1/CD3 DUAL SPECIFICITY PROTEIN |
WO2021020416A1 (ja) | 2019-07-30 | 2021-02-04 | 小野薬品工業株式会社 | 二重特異性抗体 |
US20220332825A1 (en) | 2019-08-08 | 2022-10-20 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Bispecific protein |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4296024A (en) * | 1974-12-09 | 1981-10-20 | Merck & Co., Inc. | Human immune serum globulin with high hepatitis A antibody titer |
US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
CH652145A5 (de) * | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
JPS6054687A (ja) * | 1983-07-19 | 1985-03-29 | スロ−ン−ケツタリング インステイテユ−ト フオ− キヤンサ− リサ−チ | ヒト モノクロ−ン抗体の製法 |
US4777245A (en) * | 1984-01-06 | 1988-10-11 | Genelabs Incorporated | Non-human primate monoclonal antibodies and methods |
US4997764A (en) * | 1987-04-23 | 1991-03-05 | New York University | Transformation of human B-lympocytes with Epstein Barr virus and c-myc containing vectors |
AU2083688A (en) * | 1987-07-09 | 1989-02-13 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Preparation of human monoclonal antibodies of selected specificity and isotypes |
FI884924A (fi) * | 1987-10-28 | 1989-04-29 | Oncogen | Humanimmuglobulin som producerats med hybrid-dna-teknik. |
WO1990004410A1 (en) * | 1988-10-19 | 1990-05-03 | The Dow Chemical Company | A novel family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment |
DE3921211C1 (hu) * | 1989-06-28 | 1990-11-29 | Idt Ag Fuer In Vivo Diagnostik Und Therapie, Zuerich, Ch | |
EP0493433B1 (en) * | 1989-09-19 | 1996-01-10 | Centocor, Inc. | Method for improving human monoclonal antibody production and cells used therein |
GB8925590D0 (en) * | 1989-11-13 | 1990-01-04 | Central Blood Lab Authority | Monoclonal antibodies |
ATE449853T1 (de) * | 1990-02-01 | 2009-12-15 | Siemens Healthcare Diagnostics | HERSTELLUNG UND VERWENDUNG VON GENBANKEN MENSCHLICHER ANTIKÖRPER(ßHUMAN-ANTIKÖRPER- BIBLIOTHEKENß) |
DE4002897A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Behringwerke Ag | Herstellung und verwendung von genbanken synthetischer menschlicher antikoerper ("synthetische human-antikoerper-bibliotheken") |
IL102640A0 (en) * | 1991-07-25 | 1993-01-14 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
-
1992
- 1992-07-14 ES ES92306420T patent/ES2199216T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-14 WO PCT/GB1992/001282 patent/WO1993002190A1/en active Application Filing
- 1992-07-14 IL IL102490A patent/IL102490A0/xx unknown
- 1992-07-14 AU AU22798/92A patent/AU662752B2/en not_active Ceased
- 1992-07-14 JP JP50245793A patent/JP3502093B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-14 IE IE228792A patent/IE922287A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-07-14 DE DE69233104T patent/DE69233104T2/de not_active Revoked
- 1992-07-14 CA CA002111858A patent/CA2111858A1/en not_active Abandoned
- 1992-07-14 TW TW081105557A patent/TW373023B/zh active
- 1992-07-14 KR KR1019940700121A patent/KR100255717B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-07-14 HU HU9400110A patent/HU220355B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-07-14 AT AT92306420T patent/ATE243747T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-14 EP EP92306420A patent/EP0523949B1/en not_active Revoked
- 1992-07-14 NZ NZ243558A patent/NZ243558A/en unknown
-
1994
- 1994-01-12 FI FI940144A patent/FI940144A0/fi unknown
-
1995
- 1995-01-26 US US08/378,939 patent/US5876961A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW373023B (en) | 1999-11-01 |
IL102490A0 (en) | 1993-01-14 |
CA2111858A1 (en) | 1993-02-04 |
IE922287A1 (en) | 1993-01-27 |
EP0523949A1 (en) | 1993-01-20 |
HUT69798A (en) | 1995-09-28 |
ES2199216T3 (es) | 2004-02-16 |
HU9400110D0 (en) | 1994-05-30 |
DE69233104T2 (de) | 2004-05-13 |
KR100255717B1 (ko) | 2000-05-01 |
EP0523949B1 (en) | 2003-06-25 |
AU2279892A (en) | 1993-02-23 |
AU662752B2 (en) | 1995-09-14 |
ATE243747T1 (de) | 2003-07-15 |
US5876961A (en) | 1999-03-02 |
WO1993002190A1 (en) | 1993-02-04 |
JP3502093B2 (ja) | 2004-03-02 |
FI940144A (fi) | 1994-01-12 |
JPH07502882A (ja) | 1995-03-30 |
DE69233104D1 (de) | 2003-07-31 |
NZ243558A (en) | 1994-06-27 |
FI940144A0 (fi) | 1994-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU220355B (hu) | Eljárás antitest előállítására | |
US6294654B1 (en) | Modified immunoglobulin molecule incorporating an antigen in a non-CDR loop region | |
EP0519596B1 (en) | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains | |
KR100490687B1 (ko) | Rsvf-단백질에특이적인고친화성인간모노클로날항체 | |
EP0931162B1 (en) | Production of a multimeric protein by cell fusion method | |
US6797492B2 (en) | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains | |
FI103131B (fi) | Menetelmä CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi | |
FI109768B (fi) | CD4-spesifinen yhdistelmävasta-aine | |
ES2362874T3 (es) | Diseño de anticuerpos monoclonales desinmunizados para la protección contra la exposición al vih y el tratamiento de la infección por vih. | |
EA015009B1 (ru) | АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ | |
CN101331150A (zh) | 人单克隆抗体人cd134(ox40)及其制备方法和应用 | |
CZ371296A3 (cs) | Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky | |
KR20010043470A (ko) | Cd23에 대한 항체, 이의 유도체 및 이들의 치료적 용도 | |
JP2006526414A (ja) | 脱免疫化抗cd3抗体 | |
JP2000506723A (ja) | 抗体変異物 | |
HU226194B1 (hu) | Humán szolubilis LDL-receptorra specifikus monoklonális ellenanyagok, elõállításuk és alkalmazásuk | |
EP0511308B2 (en) | Chimeric immunoglobulin for cd4 receptors | |
JP2001510329A (ja) | ヒトモノクローナル抗体 | |
USRE39548E1 (en) | Interleukin-5 specific recombinant antibodies | |
CN118184783B (zh) | Hla-g抗体及其制备方法和用途 | |
CN118146376B (zh) | Hla-g抗体及其制备方法和用途 | |
US20010051709A1 (en) | Chimeric immunoglobulin for CD4 receptors | |
JP2001510027A (ja) | T細胞活性化および増殖を阻害するLO−CD2a抗体およびその用途 | |
WO2009124378A1 (en) | Chimeric anti-measles antibody |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |