HU220355B - Eljárás antitest előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány főemlős rekombináns ellenanyagok DNS-technológiával,valamint mikro-RNS-eljárásokkal történő előállításával; nem humánfőemlős rekombináns ellenanyagokkal; az előbbieket tartalmazógyógyászati készítményekkel; valamint ilyen ellenanyagok diagnosztikaicélú felhasználásával foglalkozik. ŕ

Description

A találmány rekombináns főemlős ellenanyagok DNStechnológiával történő előállításával, azok eukarióta sejtvonalakban való expresszálásával, valamint az ellenanyagok humán célú terápiás és profilaktikus felhasználásával foglalkozik.

Az ellenanyagok, más néven immunglobulinok fehérjetermészetű bifúnkcionális molekulák. Egy régió, amely a különböző ellenanyagokat tekintve nagyon változékony, felelős egy antigénhez, például számos a szervezetre nézve fertőző ágenshez való kötődésért, míg egy másik állandó régiójuk felelős sejtek F_c-receptoraihoz való kötődésért, valamint aktiválja a sejtek lízisét eredményező összetett proteinrendszert, a komplement rendszert. Ily módon az ellenanyagok az idegen mikroorganizmusok és vírusok elpusztításával az emlősök immunválaszának életfontosságú alkotórészei.

Az ellenanyagokat állandó régiójuk szerkezete alapján különböző osztályokba soroljuk. Az emberben például öt fő eltérő szerkezetű osztály különíthető el, az immunglobulin-G, azaz IgG, az IgM, az IgA, az IgD, valamint az IgE. Az egyes osztályok fizikai és biológiai sajátságaik alapján különíthetők el, amelyek összefüggnek az immunrendszerben betöltött funkciójukkal. Az IgG-osztály a nehéz lánc aminosav-összetételében és a diszulfidkötésben (lásd az alábbi magyarázatot) kimutatható különbségek alapján, ami eltérő biológiai viselkedésükhöz vezet, további négy alosztályra osztható: IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4.

Az egyes osztályok és alosztályok ismertetése megtalálható: Iván Roitt, „Essential Immunology”, (Blackwell Scientific Publications).

Egy ellenanyag-molekulát két könnyű és két nehéz lánc alkot, melyeket a láncok közti diszulfidhidak kötnek össze. Mindegyik könnyű láncot diszulfidkötés kapcsol egy nehéz lánchoz, és a két nehéz láncot diszulfidkötések kapcsolják egymáshoz. Minden egyes nehéz lánc egyik végén egy variábilis dómén található, amelyet több állandó dómén követ és minden egyes könnyű lánc egyik végén egy variábilis, a másikon egy állandó dómén található. A könnyű lánc variábilis doménja a nehéz lánc variábilis doménjához igazodik. A könnyű lánc állandó doménja a nehéz lánc első állandó doménjához igazodik. A nehéz lánc fennmaradó állandó doménjai egymással rendeződnek sorba. A könnyű és nehéz lánc állandó doménjai nem vesznek részt közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kötődésében.

Egy könnyű és nehéz láncból álló pár variábilis doménjai képezik az antigénkötő helyet. Ezek ugyanazzal az általános szerkezettel rendelkeznek, mindegyik dómén négy régióból álló keretet tartalmaz, melyek szekvenciái viszonylag konzervatívak, és amelyeket három komplementaritást meghatározó szakasz (CDR-ek) köt össze. A négy keretrégió nagy része béta-sík-konformációt vesz fel, a CDR-szakaszok a béta-sík-szerkezetű szakaszokat összekötő, és esetenként annak részét alkotó hurkokat képeznek. A CDR-szakaszokat a keretrégiók szoros közelségben tartják, és a másik dómén CDR-szakaszaival együtt az antigénkötő hely kialakításában vesznek részt. Az ellenanyagláncokat különböző kromoszómákon elhelyezkedő három elkülönült lokuszon található gén kódolja. Egy lokusz kódolja a nehéz lánc izotípusokat, külön lokusz kódolja a kappa- és lambda-könnyűláncokat, a B-limfocitákban azonban ezek közül csak az egyik könnyűlánc-lokusz íródik át. Az ellenanyag variábilis doménokat kódoló gének a Blimfociták ontogenezise során keletkeznek a V, D, valamint J régiók kapcsolódását magában foglaló rekombinációs folyamat révén. Egy adott limfocita csak egy nehéz- és egy könnyűlánc-eredetű, rekombinációval keletkezett variábilis domént használ, biztosítandó, hogy csak egyetlen antigénre legyen fajlagos, így egyetlen Blimfocitában csak egy nehézlánc-allél és egy könnyűlánc-allél expresszálódik. Az előbbi jelenség allélikus kizárásként ismert.

Fertőzés vagy immunizálás révén egy állat találkozása egy antigénnel különböző fajlagossággal és affinitással rendelkező, különböző ellenanyagok termelődését eredményezi, így az immunizált állatból nyert antiszérum heterogén, és számos különböző limfocitaklón által termelt ellenanyagok összességét tartalmazza. Az így kapott ellenanyagokat poliklonális ellenanyagoknak nevezzük, ez a poliklonális jelleg a fő hátránya ezen ellenanyagok terápiás és diagnosztikai vizsgálatokban való alkalmazásának.

A fő előrelépést Köhler és Milstein közleménye jelentette 1975-ben [Natúré, 256, 495-497, (1975)], mely szerint egy antigénnel immunizált egér lépsejtjeit sikeresen fuzionálták egy egér-mielomasejtvonal sejtjeivel. Az így kapott hibridomáknak nevezett hibrid sejtek rendelkeztek a lépsejtek ellenanyag-termelő, és a mielomasejtek folyamatos szaporodási képességével. Mindegyik hibridoma egyetlen ellenanyagot szintetizál és választ ki az eredeti antigén egy meghatározott determinánsa ellen. Annak érdekében, hogy egy tenyészetben minden sejt azonos legyen, azaz egy meghatározott ellenanyag szintéziséhez szükséges genetikai információt tartalmazzák, a sejtfúzióból eredő hibridomákat klónozzák és szubklónozzák. így a klónozott hibridomák abból az eredeti állatfajból származó homogén ellenanyagot termelnek, amelyből a lépsejtek származtak.

A monoklonális ellenanyagok előállításának lehetősége forradalmasította sok betegség diagnózisát, és lehetővé tette számos kórtani elváltozás megelőzését és immunterápiáját. Sajnos vakcinázás vagy terápia céljából embernek ismételten adott idegen ellenanyagokat, nevezetesen nem humán fajból, például egérből vagy patkányból származó ellenanyagokat az egyed immunrendszere felismeri, és az nagy valószínűséggel nem kívánt antiimmunglobulin-választ vált ki. Ez az antiellenanyag-válasz az állandó doménok és a négy keretrégió idegen eredetének köszönhető. Ennek a válasznak a következménye valószínűleg a terápiás ellenanyag neutralizációja és káros anafilaxiás és allergiás reakciók kiváltása. A nem humán eredetű monoklonális ellenanyagok továbbá nem különösen jól kötődnek humán komplementhez, és az ellenanyag állandó régiójának effektor funkciójában kimutatható különbségek tükrében kisebb valószínűséggel váltanak ki nem specifikus sejteltávolító folyamatokat, mint például ellenanyagfüggő sejt közvetítette citotoxicitást (ADCC). A nem humán eredetű

HU 220 355 Β monoklonális ellenanyagok ezért nem olyan hatásosak, mint a humán ellenanyagok a fertőzött vagy beteg sejtek eltávolításában. Egy terápiás célra hatásos ellenanyagnak és antiellenanyag-válasz kiváltása nélkül a keringésben maradó ellenanyagnak tehát el kell kerülnie ezt, hogy a befogadó egyed immunrendszere felismerje.

A probléma egyik megoldása kiméra ellenanyagok előállítása [Morrison és munkatársai, P. N. A. S., 81, 6851-6855, (1984); valamint Neuberger és munkatársai, Natúré, 314, 268-270, (1985)], amelyekben egy idegen faj egy fent ismertetett hibridomából származó variábilis régióját humán ellenanyag állandó régiójába ültetik át. Ebben az esetben azonban a variábilis régió idegen marad a befogadó szervezet számára, így az felismerheti és jelentős immunogenitási problémát jelenthet. Egy ellenanyag Jones és munkatársai [Natúré, 321, 522-525, (1986)], valamint Riechmann és munkatársai [Natúré, 332, 323-327, (1988)] által ismertetett humanizálása, mely szerint egy humán ellenanyag keretrégiójába egy idegen ellenanyag CDR-régióit ültetik, sok fenti nehézség megoldását megkönnyítette. Az ellenanyagok CDR-régióinak átültetése azonban bonyolult folyamat, és a kapott ellenanyag a kötőaffinitás megtartása érdekében esetleg további módosítást igényel. Világos tehát, hogy a humán immunrendszer általi felismerést elkerülendő egy ellenanyag optimális formája egy humán ellenanyag, vagy egy humán ellenanyaggal alapvetően azonos ellenanyag.

Szóbeli közlések szerint laboratóriumi kísérleti állatként szokásosan használt emberszabású majmok (például csimpánzok) és majmok (például cynomolgus, rhesus, aotus) az emberéhez kellően közel álló immunválasszal rendelkeznek ahhoz, hogy fertőzési modellként jól alkalmazhatók legyenek. Feltételezték azt is, hogy ezek ellenanyagai elegendő homológiát mutatnak a humán ellenanyagokkal ahhoz, hogy leküzdjék például a rágcsáló-ellenanyagokkal kapcsolatos nehézségek egy részét. Nincs erre nézve nyomtatásban megjelent bizonyíték és csak néhány nem humán főemlőseredetű sejtvonal áll rendelkezésre a vizsgálatokhoz. Az ilyen ellenanyagok előállítására szolgáló eljárás ezért rendkívül problematikus. Készítettek humán limfocitákból sejtvonalakat, azonban az ilyen sejtvonalak alacsony stabilitással rendelkeznek, nem könnyen képeznek stabilabb hibrideket és in vivő tenyésztve rendszerint kevés ellenanyagot termelnek. Főemlős-eredetű sejtekben előfordulhat fertőző nukleinsav, például vírusból származó nukleinsav is, amely a kezelendő egyén keresztfertőzésének problémáját veti fel. Hosszadalmas tisztítási és/vagy sterilizálási eljárásokat kell alkalmazni, mielőtt az abból előállított ellenanyag embernek való beadás céljára alkalmassá válik.

A 314 161 számú európai szabadalmi leírás humán immunglobulin előállítására szolgáló eljárást ismertet eukarióta gazdasejtben. A gazdasejtet működőképesen összekapcsolt, humán nehéz lánc variábilis, illetve állandó doménjait kódoló első és második génnel transzfektálták. A gazdasejtet működőképesen összekapcsolt, humán könnyű lánc variábilis, illetve állandó doménjait kódoló génekkel is transzfektálták. Ezt a transzfektált sejtet tenyésztették, a sejttenyészetből a kívánt kötő fajlagosságú variábilis régiókkal rendelkező rekombináns humán immunglobulinok nyerhetők. Ez az eljárás azonban számos problémát vet fel: i) az eljárás kivitelezéséhez elegendő mennyiségű genomiális DNS előállításához nagyszámú limfocita szükséges. Az ismertetett eljárás szerint 1-2 xlO⁸ limfocitát használtak fel, melyből 121 mikrogramm genomiális DNS-t nyertek; ii) a genomiális DNS-ben mind a négy alléi (kettő a nehéz, kettő a könnyű láncnak) jelen van, és a további eljárás céljára a gének funkcionális párosítása (egy a nehéz és egy a könnyű lánchoz) alapos szekvenálást, klónozással történő válogatást, valamint az expresszálási és kötési tulajdonságok vizsgálatát igényli; iii) az említett találmány szerinti eljárással transzfektált sejtek tenyésztésével alacsony szintű ellenanyag-expressziót értek el. A találmány szerinti eljárással 6,7-34,5 mikrogramm/ml, átlagosan 20 mikrogramm/ml DNS-t nyertek, és egy citomegalovírus (CMV) expressziót fokozó konstrukció alkalmazásával csak 1 mikrogramm/ml DNS-t nyertek.

A WO 91/04336 számú közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés szintén egy humán monoklonális ellenanyagok előállítására szolgáló eljárást ismertet genomiális DNS nyerésén keresztül.

Nyilvánvaló, hogy az eljárás ugyanazokkal a hátrányokkal rendelkezik, mint a fent említett 314 161 számú európai szabadalmi leírás szerinti.

A PCR-technika bevezetése lehetővé tette kisszámú sejtből nyert mRNS-ből cDNS-klónok előállítását. Bár a PCR igen hatásos eszköz, az a tény, hogy ismemi kell a célzott cDNS 5’ és 3’ végének szekvenciáját, hátráltatja ennek a technikának az alkalmazását cDNS-klónok előállítására változatos szekvenciákkal rendelkező proteineket, különösen eltérő vezetőszekvenciával rendelkező szekretált termékeket, például humánellenanyagcsaládot kódoló mRNS-ből. Bár sok humán H-lánc-szekvenciát leírtak [Kábát E. A. és munkatársai, Sequences of Proteins of immunological Interest, 4. kiadás, US Dept. of Health and Humán Services, az Amerikai Egyesült Államok kormányának nyomdai szolgálata, 1987], és a PCR-primereket ezek konszenzus szekvenciái alapján tervezik, ezen primerek alkalmazásával nem mindegyik humán V régió amplifikálható, mivel a Taq polimerázzal a 3’ végi bázisokat nem tudjuk meghosszabbítani.

A találmány tárgyát egy új eljárás képezi, amely szokásos rekombináns cDNS-klónozási technika alkalmazásával megkönnyíti teljes humán nehéz, valamint könnyű lánc ellenanyag gének átmentését és expresszióját eukarióta sejtekben nagy hatékonyságú eukarióta expreszsziós vektorok alkalmazásával, ezáltal folyamatosan előállítható működőképes ellenanyagokat nyerve.

Kimutattuk továbbá, hogy egy nem humán főemlős perifériás vérének limfocitáiból klónozott cDNS, valamint az ebből előállított ellenanyaglánc gyakorlatilag elegendő homológiát mutat egy humán ellenanyaglánc szekvenciájával ahhoz, hogy alkalmazható terápiás szer legyen. A találmány kiteljed tehát egy nem humán eredetű nehéz és könnyű lánc ellenanyag gének előállításá3

HU 220 355 Β ra szolgáló eljárásra, valamint a gének expresszálására, amint azt fent ismertettük.

A találmány tárgyát képezi egy rekombináns, főemlős-eredetű ellenanyag előállítása, amelynek során (i) kiválasztunk egy a kívánt ellenanyag expreszszálására képes fóemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;

(ii) a sejtvonalból RNS-t izolálunk, valamint az mRNS-t elválasztjuk az így izolált egyéb RNS-től;

(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk és a cDNS-t inszertáljuk egy klónozási vektorba;

(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;

(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló génekre nézve;

(vi) a géneket kódoló cDNS-t inszertáljuk egy expressziós vektorba;

(vii) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral; és (viii) a transzfektált gazdasejteket tenyésztjük és a kívánság szerinti ellenanyagot izoláljuk.

A „főemlős” elnevezés alatt előmajmokat (például Lemurokat), újvilági majmokat (például aotus), óvilági majmokat (például cynomolgus), emberszabású majmokat (például csimpánzokat) és embert értünk.

Egy fóemlőslimfocita-eredetű sejtvonalon a találmány szerint egyetlen főemlős-limfocitából származó sejtvonalat értünk, amely egyetlen ellenanyagot termel. A sejtvonalnak elegendő stabilitással kell rendelkeznie ahhoz, hogy lehetővé tegye RNS előállítását, és előnyös esetben szokásos vírustranszformációs és/vagy hibridóma technikával stabilizáljuk vagy folyamatos növekedésűvé tesszük [lásd: Methods of Hybridoma Transformation, szerkesztők: Bartal és Hirsaut, Humana Press, Clifton, N. H., (1985)]. Ilyen sejtvonalak beszerezhetők sejtgyűjteményekből, például az American Type Culture Collection gyűjteményéből (Rockville MD, USA).

A sejtvonal előállítható például egy betegségen bizonyítottan átesett vagy annak gyógyulási szakaszában levő egyedből (humán, vagy nem humán főemlős), egy kórokozó organizmussal bizonyítottan fertőzött egyedből, vagy karcinomában vagy autoimmun betegségben szenvedő de a betegség teljes tünetegyüttesét nem mutató egyedből, egy antigénnel vakcinázott vagy beoltott, és arra ellenanyag-termeléssel válaszoló egyedből, vagy a keresett ellenanyagra nézve vizsgált egészséges egyedekből nyert perifériás vérből, nyirokcsomókból vagy lépből eltávolított limfocitákból, nevezetesen limfoblasztoid sejtekből vagy B-limfocitákból. A betegségállapot például lehet egy kórokozó organizmussal (például vírussal vagy baktériummal) való fertőzés, ahol a limfocitákat előnyösen a felépülés után két-három hónapon belül vagy a magas ellenanyagszint ideje alatt távolítjuk el, vagy egy antigénnel, például egy kórokozó organizmussal vakcinázott egyed, ahol a limfocitákat előnyösen az immunizálást követő két vagy három hónapon belül távolítják el. Olyan egyedek, akikben a kórokozó organizmus például vírus kimutatható, akiben azonban nem fejlődik ki egészében a betegség szintén különösen hasznos forrásai az ellenanyag-termelő sejteknek. Nyilvánvaló, hogy főemlősök alkalmazása esetén az organizmus gyengített formája helyett, amely gyakran az emberi vakcinázás céljára alkalmazott forma, lehetséges a kórokozó organizmussal való beoltás. Az erre az organizmusra adott immunválasz sokkal erősebb lehet, így előnyösebb forrásai az ellenanyag-termelő sejteknek, mint a vakcinázott egyed.

Előállíthatunk sejtvonalakat továbbá olyan egyedből nyert limfociták felhasználásával, aki tumor- vagy autoimmun betegségben szenved és kimutatható, hogy tumor- vagy saját antigénekkel szemben ellenanyagválaszt produkál. Nyerhetünk limfocitákat olyan egyedből is, akiről megállapítható tumorjának visszafejlődése (remissziója) vagy akit tumorantigénekkel vakcináztak és ellenanyagválaszt mutatott. Más megközelítés szerint a találmány szerinti hasznos limfociták azonosíthatók olyan csoportok egyedeinek szűrése során, amely egyedek bizonyos környezeti tényezők hatására vagy genetikai hajlam miatt nagyobb valószínűséggel kapnak tumoros betegséget, például a „tumoros családok”, melyekben a populáción belül az átlagosnál nagyobb gyakorisággal fordul elő rákbetegség. Ezek a csoportok különösen olyan egyedek kiválasztása céljából szűrhetők, amelyek tumorantigének ellen ellenanyag termelésre képesek és ezért nem kapnak rákbetegséget. Lehetséges egészséges egyedek szűrése is azon elmélet alapján, hogy tumorsejtek minden egyedben előfordulnak, azonban az immunrendszer általában képes válaszolni, nevezetesen ellenanyagok termelésével és a rákbetegség állapot elérése előtt a mutáns sejteket eltávolítja. Amennyiben ez így van, a találmány szerint hasznosítható limfociták bármely egyedből nyerhetők. Az így azonosított limfociták folyamatos sejtvonallá alakíthatók vírusos transzformáció és/vagy sejtfúzió segítségével az alább leírtak szerint.

Vírusos transzformálás előnyösen Epstein-Barr-vírus (EBV) alkalmazásával lehetséges. A perifériás vér B-limfocitáinak többsége rendelkezik EBV-receptorral és a vírussal történő fertőzés során az EBV-mag-antigén (EBNA) egyidejű expresszálódása mellett transzformálódnak. A sejteknek azonban csak körülbelül mintegy 20%-a válik in vitro folyamatos sejtvonallá, és ezek általában kis, nem aktivált B-sejtek. A plazmasejtekről (aktivált B-sejtekről) hiányzik az EBV-receptor, így a vírusfertőzéssel szembeni rezisztencia az érettség fokával arányosan növekedni látszik, ezzel csökkentve az érett limfociták vírusos transzformálásának hatásfokát.

Az EBV-t alkalmazó vírusos transzformáció céljára ezért célszerű nem plazmasejt perifériásvér-limfocitákat használni. Egy sejtvonal előállításához egy a vírust termelő sejtvonal például a B95.1 (Miller és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 383-387, 1972) felülúszója általában tartalmaz elegendő fertőző részecskét. A gyakorlat szerint akár 10⁷ sejtet tartalmazó üledéket szuszpendálunk a vírustenyészet felülúszójának 1 mililiterében és 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. Ez lehetővé teszi a vírusrészecskék kapcsolódását a B-sejtek fajlagos receptorához és a sejtbe jutásukat. Célszerű a kémcső óvatos rázogatása, ezzel gátolva a sejtek leülepedését. Az így fertőzött sejtek ezután tenyészthetők és a kívánt ellenanyag génjei klónozhatok.

HU 220 355 Β

Egy más megoldás szerint, vagy a vírusos transzformációt követő további lépésként mielómasejtekkel való fúzióval állítunk elő stabil (folyamatos) sejtvonalakat (Crawford, D. H., Humán Hybridomas and Monoclonal Antibodies, 1985 szerk.: E. G. Engelman, S. K. H. Foung, J. Larrick és A. Raubitschek, 37-50. oldal, vagy Roder, J. C. és munkatársai, The Epstein-Barr virushybridoma technique, ugyanott, 55-67. oldal). A mielóma lehet heterohibridóma, előnyösen egér/humán eredetű. Előállíthatunk a célnak megfelelő heterohibridómát például egy olyan ellenanyag-termelő sejtvonalból, mint a HT01. Megfelelő sejteket hipoxantin-, aminopterin- és timidinérzékenység alapján 8-azoguanintartalmú tápfolyadékban történő sorozatos passzálással válogathatjuk, mivel azok aminopterinéizékenyek.

Hogy egy ilyen heterohibridóma használható legyen, az endogén humán nehéz és könnyű láncokat kódoló géneket deletálni kell, különben a végső sejtvonal több mint egy ellenanyag termelésére lesz képes, és nem kizárólag a kívánt ellenanyag könnyű és nehéz láncát tartalmazza. Ez megoldható a sejtek 90%-os letalitású ultraibolya-besugárzásával, majd megfelelő kolóniák kiválasztásával antihumán IgG citoplazmafestéssel, valamint a kromoszómakészlet vizsgálata alapján, amely poliploid és 60-140 egérkromoszómát tartalmaz.

Előnyös továbbá erőteljesen szaporodó sejteket választani. Ez elérhető 2,6,10,14-tetrametil-pentadekánnal (azaz pristane-nal) kezelt egér hasüregében történő passzálással. A végső kiválasztás a szaporodási hajlam, kariotipus és fúzióra való hajlam alapján történik, melyek közül a kariotipus a legfontosabb. A találmány szerinti előnyös heterohibridóma főleg egérkromoszómákat tartalmaz.

Egy kívánt limfocita-sejtvonal kiválasztása lehetséges a kívánt antigénnel affinitást mutató ellenanyag termelésére, valamint ellenanyag-funkcióra történő vizsgálatával.

Az affinitásvizsgálatokat végezhetjük immunvizsgáló eljárásokkal például radioimmun próbával (RIA) vagy enzimes immunszorbens próbával (ELISA). Az ilyen immunvizsgáló eljárások az ellenanyag és az antigén fajlagos kapcsolódását kihasználva nyújt információt az antigén fajlagosságról. A radioimmun próba úgy becsül ellenanyagszintet, hogy vagy meghatározza egy ellenanyag komplexképző kapacitását a radioaktív antigénnel, vagy méri az oldhatatlan antigénkészitményhez kötődő ellenanyag mennyiségét. Az ELISA-módszer magában foglalja antigének vagy ellenanyagok enzimmel történő kapcsolását. Az enzimeket általában kinetikájuk egyszerűsége alapján választják és színes reakciótermék segítségével mérhetők, például spektrofotometriásán. Az előnyös enzimek közé tartoznak az alkalikus foszfatáz, a béta-D-galaktozidáz és a torma-peroxidáz. Az ELISA alkalmazható mint primer kötési, vagy mint kompetíciós kötési próba. Vírussal fertőzött egyedből izolált limfociták szelektálhatok például úgy, hogy egy limfocitasejtvonal-tenyésztő folyadék felülúszójában megfelelően jelölt vírusantigént inkubálunk lehetőleg teljes vagy üres vírusrészecskék formájában. Az ellenanyag/antigén komplexeket ezután a fent leírtak szerint azonosíthatjuk és a megfelelő limfocita-sejtvonalat további vizsgálatok céljára kiválaszthatjuk.

Az ellenanyag működőképességének vizsgálata egy fertőző ágens esetén tartalmazhat kompetíciós neutralizációs vizsgálatokat, például vírusneutralizációt. A neutralizációs vizsgálatok kivitelezhetők radioimmunfokuszáló próbával (RIFA), amelyben azonos töménységű tisztított ellenanyagot a vírus tízszeres hígításainak azonos térfogatával inkubálunk, majd vírustitert vizsgálunk. Más megoldás szerint komplementet használunk és sejtlízist vizsgálunk.

Lehetséges humán vagy főemlős IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgE, vagy IgD ellenanyagot szekretáló sejtek előállítása. Ezek azonosíthatók Ouchterlony dupla diffúziós próbával vagy ELISA-val.

Egy kívánt antigénre fajlagos funkcionális ellenanyagot expresszáló limfocita-sejtvonal kiválasztása után a teljes sejt-RNS szokásos eljárásokkal izolálható, például Chomczynski és Sacchi szerint [Anal. Biochem., 162, 156-159, (1987)]. Az ellenanyagot kódoló fajlagos messenger RNS (mRNS) izolálására szintén szokásos eljárások alkalmazhatók [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press]. A mRNS-ból komplementer DNS-t (cDNS) szokásos rekombináns eljárásokkal szintetizálhatunk például ahogy azt a fent idézett kézikönyv leírja.

Teljes sejt-RNS izolálásához 1-3 χ 10⁴ és 1-3 χ 10⁷ közötti számú limfocita felhasználása lehetséges, azonban a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi teljes hosszúságú ellenanyaggének klónozását sokkal kevesebb sejtből, amint az kívánatos ellenanyagot termelő nem stabil hibridómák vagy kérdéses stabilitású EBV transzformált sejtek esetében. Ez az eljárás ezért különösen alkalmas humán vagy főemlős-ellenanyagok átmentésére nem stabil sejtvonalakból, de alkalmas bármely ellenanyag nehéz és/vagy könnyű láncának átmentésére. Ez a szokásos klónozási eljárásoknál alkalmazott kereskedelmi forgalomban kapható enzimek és vektorrendszerek reprodukálhatóságának és minőségének a fejlesztésével és mikro-RNS izolálási eljárás bevezetésével vált lehetségessé.

Ez a fejlesztett eljárás akár 1000 hibridomasejtből készített méretszelektált cDNS-könyvtár készítésével kivitelezhető. Ez a könyvtár, vagy annak egy része aztán szűrhető immunglobulinlánc génekre.

A találmány tárgya tehát teljes hosszúságú ellenanyag gének klónozására szolgáló eljárás, amelynek során i) mikro-RNS-t nyerünk körülbelül 1000 sejtből, ii) méret-szelektált cDNS-könyvtárat készítünk, iii) a könyvtárat szűrjük nehéz és könnyű láncot kódoló cDNS-re és iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t izoláljuk.

A találmány tárgya továbbá egy rekombináns ellenanyag előállítását szolgáló eljárás, amelynek során

i) mikro-RNS-t nyerünk körülbelül 1000 sejtből;

ii) méretszelektált cDNS-könyvtárat készítünk;

iii) a könyvtárat szüljük nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re és azokat izoláljuk;

iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t inszetáljuk expressziós vektorba;

HU 220 355 Β ^v) ^egy gazdasejtet transzfektálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral;

vi) a transzfektált gazdasejtet tenyésztjük és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.

Az ellenanyag nehéz- és könnyűlánc-fehérjéket kódoló cDNS-klónok azonosítása azok szaporítható vektorba, például plazmidba klónozásával, majd egy gazdasejt például a prokarióta E. coli transzformálásával történhet. Az így kapott könyvtár azután az alábbi eljárás szerint vizsgálható ellenanyag nehéz és könnyű lánc cDNS jelenlétére.

A vizsgálat történhet észlelhető jelöléssel ellátott nehéz és könnyű lánc DNS próbákkal és egy, az észleléshez szükséges eljárással, például a Gene Cloning című kézikönyvben leírtak szerint [Glover, D. M., Chapman and Hall Ltd., London]. Ezek az eljárások alapulhatnak radioaktív jelölésen és radiográfiás észlelésen, vagy nem radioaktív jelölésen például digoxigenin 11 dUTPvel és egy például a Boehringer Mannheim által forgalmazott nem radioaktív DNS-észlelő készleten. Ez a vizsgálóeljárás lehetővé teszi továbbá teljesen ismeretlen ellenanyagok izotípusának megállapítását kevert próbákkal, például humán gamma-, mű- és alfa-nehézláncvagy kappa- és lambda-könnyűlánc próbákkal.

A kiónok kiválaszthatók és szükség szerint az ellenanyag nehéz és könnyű láncok szekvenciája meghatározható. Ebben a stádiumban lehetséges továbbá módosításokat eszközölni az ellenanyag cDNS nukleinsavszekvenciában az expressziós vektor elkészítése előtt; a módosítás érinthet egyetlen kodont vagy egész régiót. Megoldható az ellenanyag-izotipus osztályra vagy fajra jellemző szakaszának kicserélése (azaz kiméra ellenanyagok készítése). Ez az izolált V régiók és a kívánt izotipus cDNS-fuziójának létrehozásával oldható meg. Miután a megfelelő sejtkolóniát kiválasztottuk, a könnyű- és nehézIánc-cDNS-szekvenciákat olyan vektorokba szubklónozzuk, amelyek alkalmasak egy gazdasejtbe történő inszertálásra azok expresszálásának céljából. Az expressziós vektorok előállítása a gyakorlatban szokásos eljárások szerint történhet [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Második kiadás, Cold Spring Harbor],

A gazdasejtnek képesnek kell lennie arra, hogy az ellenanyagot működőképes formában expresszálja, ezért, az előnyösen eukarióta, például emlőssejt, azaz mielóma- vagy kínaihörcsög-petefészeksejt (CHO) lehet, amelyek képesek transzláció utáni módosításokra, különös tekintettel a láncok megfelelő összehajtására és glikozilezésére, ami lényeges lehet az ellenanyag konstans régiójának hatásos működéséhez. Eukarióta sejtek sikeresen tenyészthetők in vitro és ismeretes, hogy képesek működőképes ellenanyagok expressziójára. Élesztő- és rovarsejtek is használhatók gazdasejtként, mivel azok szintén képesek a transzláció utáni kívánt módosítások elvégzésére.

A nehéz és könnyű láncok transzfektálhatók egyetlen vektorba, amint azt a WO 87/04462 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti, vagy kotranszfektálhatók két vektorba az alábbiak szerint. Egy gazdasejtvonal expressziós vektorral történő transzfektálására vonatkozó fenti és alábbi utalások értelemszerűen tartalmazzák egy gazdasejt kotranszfektálását egynél több vektorral, kivéve, ha a leírás egyértelműen kotranszfektálásra utal.

A kotranszfektálásra használt vektorok előnyösen egymástól független szelekciós markereket tartalmaznak, így a létrejött kolóniák mindkét markerre szelektálhatok. A mindkét szelekciós marker fenotípusát mutató kolóniák általában képesek mind a könnyű, mind a nehéz lánc koexpressziójára. A szelekciós markerek lehetnek domináns természetűek, vagy nem. A szelekciós markerek példái közé tartoznak az adenozin dezamináz [Kaufman és munkatársai, P. N. A. S., 83, 3136-3140, (1989)], aszparagin szintetáz [Cartier és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 7, 1623-1628, (1987)], E. coli trpB gén, valamint Salmonella hisD gén [Hartman és munkatársai, P. N. A. S„ 85, 8407-8451, (1988)], egér M2 ribonukleotid reduktáz [Thelander és munkatársai, EMBO J., 8, 2475-2479, (1989)], humán multidrogrezisztencia gén, [Kané és munkatársai, Gene, 84, 439-446, (1989)], glutamin szintetáz [Bebbington és munkatársai, DNA Cloning, III. kötet, 163-188, szerk. D. M. Glover, IRL Press], xantin guanin foszforibozil transzferáz (gpt) [Mulligen és munkatársai, Science, 209, 1422-1427, (1980)], hygromycin B [Santerre és munkatársai, Gene, 30, 147-156, (1984)], neomycin gén [Southern és munkatársai, J. Mól. Appl. Génét., 1, 327-341, (1982)], valamint dihidrofolát reduktáz [Subramani és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 1, 854-868, (1981)].

Az egyik vektor esetében előnyösen alkalmazható szelekciós marker a dhff, amelyet általában egy dhfffenotípusú CHO szülői sejtvonallal használunk [Urlaub és munkatársai, P. N. A. S., 77, 4216-4220,(1980)]. A sikeresen transzfektált CHO-sejtek dhfr⁺ fenotípussal rendelkeznek és könnyűszerrel szelektálhatok timidin- és hipoxantinmentes tápfolyadékban, amely tetszés szerint metotrexátot (MTX) is tartalmazhat. A másik típusú vektorok esetében előnyösen használható szelekciós marker egy domináns rezisztenciamarker, mint például a neomicin (neo) gén. Az ezzel a markerrel sikeresen transzfektált CHO-sejtek jól szelektálhatok a kolóniák Geneticin antibiotikumot, egy neomicinanalógot tartalmazó tápfolyadékban történő tenyésztésével.

Egy másik, CHO- vagy mielómasejtekhez használatos expressziós rendszer a glutamin szintetáz (GS) amplifíkációs rendszer, amelyet a WO 87/04462 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ismertet és amelyre mint irodalmi helyre hivatkozunk. Ez a rendszer tartalmazza egy glutamin dependens sejt transzfektálását a GS-enzimet és a kívánt nehéz és könnyű láncot kódoló génekkel. A glutaminmentes tápfolyadékban növekedni képes sejteket szelektáljuk. Az így szelektált kiónokat aztán GS-enzim-gátlásnak vetjük alá metionin szulfoximin (Msx) alkalmazásával. A sejtek saját túlélésük érdekében amplifikálják GS génjüket az ellenanyagot kódoló gén egyidejű amplifikálása mellett.

A fenti leírás szerint egy olyan szelekciós marker, mint a GS egyúttal lehetővé teszi a könnyű és nehéz láncokat kódoló gének amplifikálását is. Egy sejtvonal transzfektálásakor a vektor-DNS-ek a sejt kromoszómá6

HU 220 355 Β jában gyakran azonos lokuszba integrálódnak, ezért az amplifíkációval járó szelekciós markerek használata mindkét gén kópiaszámának párhuzamos növekedését eredményezi. Hasonlóképpen, a dhrf egy olyan szelekciós marker, amely lehetővé teszi a megfelelő amplifikációt az MTX gátlóanyag emelkedő koncentrációjának használatával.

A szelekciós markerek természetesen a DNS regulációs szakaszainak kontrollja alatt állnak, lehetővé téve azok expresszióját. A regulációs szakaszok előnyösen vírus, például DNS-tumor vírus eredetűek. Különösen előnyös az SV40 vagy az adenovírus fő késői promotere. Különösen előnyös ebben a vonatkozásban a promoter erősítő elemének eltávolítása, így annak hatékony „bénítása”. Ezen módosítások minden gátlóanyag-koncentráció mellett magasabb szintű génamplifikációt tesznek lehetővé, mint az egyébként egy erős promoter alkalmazása esetén történne. A GS mint szelektálható marker használatakor előnyös promoter például az egér-metallotionein promoter, vagy előnyösebben a WO 89/01036 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett humán cytomegalovírus (hCMV)-MIE promoter.

Az ellenanyag könnyű és nehéz lánc gének ugyancsak az expressziójukat lehetővé tevő DNS regulációs elemek szabályozása alatt állnak. Előnyös mindkét lánc esetében ugyanazon regulációs elemek alkalmazása, hogy azok expressziója lényegében kiegyensúlyozott legyen. A regulációs elemek lehetnek víruseredetűek, és lehetnek például a dhfr vagy a GS szelektálható markerek expressziójával kapcsolatban fent említettek. További példák a béta-aktin promoter, valamint az ezzel rokon béta-aktin poliadenilációs jel alkalmazása.

Az egyik vagy mindkét vektor tartalmazhat egy SV40 replikációs origót, amely lehetővé teszi a vektorkonstrukciók egy gyors ideiglenes vizsgálatban például COS-sejtekben való ellenőrzését.

A sejtvonal kotranszfektálását az expressziós vektorokkal egyszerűen végrehajthatjuk mindkét vektor egyenlő moláris koncentrációja és szokásos transzfekciós eljárások, például kalcium-foszfát-kicsapásos eljárás vagy lipofektin alkalmazásával. A kívánság szerinti kotranszfektált sejtvonal kiválogatását az adott szelektálható markerek esetében használatos szokásos eljárásokkal végezhetjük.

A találmány tehát kiteljed egy gazdasejt transzfektálására alkalmas, főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS-t tartalmazó vektorra.

A találmány kiteljed továbbá egy főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncának expresszálására szolgáló cDNS-sel transzfektált eukarióta sejtvonalra.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy főemlősellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS expresszálására szolgáló eljárás, amely magában foglalja egy eukarióta gazdasejt transzfektálását az említett cDNS expresszálására alkalmas vektorral vagy vektorokkal.

A sejtvonal tenyésztését szérumot tartalmazó vagy előnyösen szérummentes tápfolyadékban végezhetjük. A tisztítási folyamat során különösen előnyös, ha proteinmentes tápfolyadékot alkalmaztunk. CHO dhff+ +transzformáns sejtvonal alkalmazása esetén a tápfolyadék előnyösen nem tartalmaz hipoxantint és timidint és tartalmazhat MTX-et. A GS rendszer alkalmazásánál előnyös egy glutaminfüggő sejtvonal és glutaminmentes tápfolyadék alkalmazása. Mindkét láncnak lényegében egyenlő moláris mennyiségben való expresszálása lehetővé teszi, hogy optimális mennyiségű működőképes ellenanyagot kapjunk. A két lánc a sejten belül összekapcsolódik, majd működőképes ellenanyagként kiválasztódik a tápfolyadékba. A kapott rekombináns ellenanyag szokásos eljárásokkal tisztítható és készítménnyé alakítható.

A találmány kiteljed rekombináns nem humán főemlős-ellenanyagokra, pontosabban rekombináns, csimpánz vagy óvilágimajom-eredetű ellenanyagokra például rekombináns, cynomolgus majom-ellenanyagokra.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy, az alábbi lépésekből álló eljárás szerint előállított vagy előállítható rekombináns főemlős-eredetű ellenanyag:

i) egy kívánt ellenanyag expresszálására alkalmas, főemlőslimfocita-eredetű sejtvonal kiválasztása;

ii) a sejtvonalból RNS izolálása és az mRNS elválasztása az egyéb így izolált RNS-től;

iii) az mRNS-ről cDNS előállítása és a cDNS inszertálása egy klönozási vektorba;

iv) egy gazdasejt transzformálása a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;

v) a génkönyvtárból az ellenanyagot kódoló cDNS kiválogatása;

vi) az ellenanyagot kódoló cDNS inszertálása egy expressziós vektorba;

vii) egy gazdasejt transzfektálása a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral; és viii) a transzfektált gazdasejt tenyésztése és a kívánság szerinti ellenanyag izolálása.

cDNS-sel transzfektált eukarióta sejtvonalak alkalmazásával várhatóan 50 mikrogramm/ml, előnyösen 250 mikrogramm/ml, vagy annál nagyobb mennyiségű ellenanyag nyerhető.

A találmány tárgya továbbá főemlős-eredetű ellenanyag nehéz és könnyű láncát kódoló cDNS expresszálására képes eukarióta gazdasejtvonal tenyésztése útján előállított vagy előállítható, főemlős-eredetű rekombináns ellenanyag.

A kapott ellenanyag fajlagosságának megfelelően terápiás célra alkalmazható. Az alább leírt egyik példa egy hepatitisz A-fertőzés kezelésére alkalmas humán hepatitis A-ellenes ellenanyag. Előállíthatok egyéb vírusellenes ellenanyagok, amelyek célpontja egyéb hepatitisvírusok (például hepatitis B és C) vagy herpeszvírusok: herpesz simplex vírus, citomegalovírus, Epstein-Barr-vírus és varicella zooster vírus. A találmány szerint készíthetők HIV-ellenes ellenanyagok is. Ezek az ellenanyagok alkalmazhatók AIDS kezelésére, általuk megelőzhető vagy késleltethető a HIV-pozitív és ARC-betegekben az AIDS kialakulása vagy megelőzésképpen olyan személyeknél, akik a vírussal érintkeztek például tűszúrás-baleset során. Egy további alkalmazási lehetőség a vírus átterjedésének megelőzésére HIV7

HU 220 355 Β pozitív anyáról gyermekére a terhesség során vagy a szülés alatt. Ez magában foglalhatja az ellenanyaggal való kezelést a születés előtt, alatt és/vagy után.

A találmány szerint olyan ellenanyagok is előállíthatok amelyek célpontja más patogén organizmus például baktériumok, protozoonok stb. Ráksejtek is lehetséges célpontjai a humán ellenanyagoknak. Az ellenanyagok alkalmazhatók mint célbajuttató egységek, amelyek kémiai vagy biológiai vegyületeket hordoznak. Ezek endocitózis révén a sejtbe jutnak, ahol toxikus hatást fejtenek ki vagy toxikus vegyületté metabolizálódnak és elpusztítják a sejtet. A találmány szerinti ellenanyagok célpontjai lehetnek saját antigén ellenes ellenanyagok, mint amelyek jelen vannak például multiplex szklerózis vagy például gyulladásos kórképeknél mint az ízületi gyulladás. Állatmodell nem alkalmas anti-Rhesus Dellenanyag előállítására, ezért nagy jelentősége lenne egy humán ellenanyag vércsoport-meghatározás céljára használható diagnosztikai és/vagy terápiás célú alkalmazásának. Antirhesus D-ellenanyagok adagolhatok rhesusnegatív anyának a terhesség és a szülés bármely időpontjában, ezzel gátolva a magzatellenes, valamint a későbbi terhesség(ek) során képződő ellenanyagok kialakulását. A találmány tárgykörébe tartozik tehát humán rekombináns ellenanyag alkalmazása rhesus D-antigénnek kitett rhesusnegatív egyed kezelésére, vagy az antigénnel való találkozás megelőzésére.

A találmány szerint előállított ellenanyagok alkalmazhatók általános diagnosztikai eljárásokban.

A találmány leírása alapján érthető, hogy bár a találmány elsősorban teljes ellenanyag nehéz és könnyű lánc gének átmentésével foglalkozik, azok fragmensei például az F(ab) F(ab)₂, valamint FV fragmensek is átmenthetők, expresszálhatók, és külön-külön alkalmazhatók. Ezek a fragmensek az „ellenanyag” meghatározás körébe tartoznak.

A találmány tárgya tehát főemlős-ellenanyagok alkalmazása valamely gyógyászati készítmény előállítása során a fenti kórképek és állapotok kezelése céljából, így a találmány kiterjed emberi kórképek és állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló olyan eljárásokra, amelyekben főemlős-ellenanyag hatásos adagját adagoljuk egy emberi lénynek. Az ilyen eljárások közé tartoznak a diagnosztikai módszerek is.

Az ellenanyagok adagja a kezelendő kórképtől és a kezelt személytől függhet, felnőtt beteg esetében 1-től 100 milligrammig terjedhet, előnyösen 1-től 10 milligrammig terjedő napi adag l-től 30 napig tartó kezelés során. Előnyös lehet egy két részből álló kezelési eljárás alkalmazása, amely szerint 5-től 10 nap alatt l-től 5 milligramm, majd további 5-től 10 nap időtartam alatt 6-15 milligramm ellenanyagot adunk naponta.

A találmány kiteljed továbbá rekombináns főemlősellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekre. Az ilyen készítmények az ellenanyagon kívül előnyösen tartalmaznak a gyógyszergyártásban szokásos oldószert vagy vivőanyagot, általában egyéb hatóanyagokkal például más ellenanyagokkal és/vagy antibiotikumokkal keverve. A megfelelő vivőanyagok közé tartozik a fiziológiás konyhasóoldat, a foszfátpufferes konyhasóoldat, a glükóz és a pufferolt konyhasóoldat. Más eljárás szerint az ellenanyag liofilezhető (fagyasztva szárítható) és használat előtt feloldható a fenti vizes pufferolt oldatok valamelyikének hozzáadásával. Az adagolás módja szokásosan parenterális, például vénába, izomba, bőr alá, és a hashártya mögé injektálás, vagy bejuttatás.

Az ábrák ismertetése

1. ábra: HT01 sejtek kariotípus vizsgálata, amelyen poliploid egérkromoszóma-készlet és számos humán kromoszóma látható.

2. és 3. ábra: D ellenanyag (IgD) nehéz, illetve könnyű láncának nukleotid- és kikövetkeztetett aminosavszekvenciája. Látható a pH210H2 inszert teljes szekvenciája. A jelzőpeptidet és a CDR-szekvenciákat aláhúztuk és a valószínű poliadenilációs jelet felső vonallal jelöltük. Az aminosavakat Kábát és munkatársai (1987) szerint számoztuk.

4. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc variábilis régió nukleotidsorrendjének összehasonlítása a humán, nyúl- és egérszekvenciákkal. A kodonokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.

5. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc variábilis régió aminosavsorrendjének összehasonlítása a humán, nyúl- és egérszekvenciákkal. Bejelöltük a CDR-ek helyzetét és pontok jelölik a humán Walker-szekvenciával való azonosságot. Az aminosavmaradékokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.

6. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc konstans régió nukleotidsorrendjének összehasonlítása a humán-, nyúl- és egérszekvenciákkal. Pontokkal jelöltük a humán őssejtszekvenciával való azonosságot. A kodonokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk. A tíz majomszekvenciából egy az aláhúzott nukleotidpozícióban G-t tartalmaz.

7. ábra: Cynomolgus kappa-könnyűlánc konstans régió aminosavsorrendjének összehasonlítása a humán-, nyúl- és egérszekvenciákkal. Pontokkal jelöltük a humán őssejtszekvenciával való azonosságot. Az aminosavmaradékokat Kábát és munkatársai szerint számoztuk.

A találmányt a következő példákkal szemléltetjük.

Humán/egér kiméra sejtek előállítása hibridzálás céljából

1. példa

Humán antihepatitis A ellenanyag készítése

a) A ΗΤΟΙ sejtvonal előállítása nappal tetanusztoxoiddal való emlékeztető oltást követően egészséges humán donortól 50 ml vért vettünk, és konzerválószer-mentes heparin alvadásgátlóval elkevertük. Ficoll/Hepaque rétegen [Boyum A., Scand. J. Clin. Invest., 21, 77-89, (1986)] elválasztottuk a mononukleáris sejteket, azokat Hanks-pufferes fiziológiás sóoldattal mostuk és szokásos eljárások alkalmazásával egér-myelomasejtvonallal fuzionáltattuk az alábbiak szerint.

Logaritmikus szaporodási fázisban levő tenyészetből NS-0 egér-myleomasejteket [Galfre G. és Milstein C., Immunology, 45, 125-128, (1982)] gyűjtöttünk és Hanks-pufferrel mostuk. A mononukleáris sejteket (4,7 xlO⁷) és az NS-O-sejteket (6xl0⁷) összekevertük

HU 220 355 Β és egy 50 ml űrtartalmú vizsgálati csőben ülepítettük. A sejtüledéket ezután 1 ml 50%-os polietilénglikololdatban szuszpendáltuk és 1 percig szobahőmérsékleten óvatosan kevertük. A fuzionált sejteket 10% borjúszérumot tartalmazó RPMI tápfolyadékban szuszpendáltuk és 24 rekeszű lemezeken 60, egyenként 1 ml térfogatú azonos tápfolyadékba osztottuk szét cseppenként.

óra múlva mindegyik rekeszhez 1 ml hipoxantint, aminopterint és timidint (HAT), valamint 1 χ 10⁶ Balb/c egérlépsejtet tartalmazó tápfolyadékot adtunk. A lemezt 37 °C-on 5% CO₂ parciális nyomás mellett inkubáltuk.

A fúzió utáni 20. napon a felülúszókat radioimmunvizsgálattal antitoxoid ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk.

Egy kis sejtkolóniát (körülbelül 20 sejtet) tartalmazó rekeszt azonosítottunk. Ez a kolónia lassan növekedett, amely tulajdonság az ellenanyag-termelés tartós stabilitására jellemző a humán kromoszómák fokozott megtartása miatt. A sejteket új rekeszbe vittük át és három hét múlva határhígításos módszerrel klónoztuk. Mindegyik vizsgált szubklón pozitívnak bizonyult a radioimmunvizsgálattal (RIA).

Egy kiónt, a PB47 1. A1.B9.E10 kiónt HTOl-nek neveztük és a sejteket lefagyasztottuk. Ezek a sejtek humán IgM antitetanusz-toxoid ellenanyagot termeltek.

A kariotípus-vizsgálat szerint ezek a sejtek poliploid egérkromoszóma-készletet és számos humán kromoszómát tartalmaznak (lásd az 1. ábrát). Ezeket a sejteket választottuk kiindulási sejtvonalként egy poliploid fúziós partner készítéséhez további hibridómák előállításához.

A HT01 sejtvonalat, amely antitetanusz humán IgM ellenanyagot szekretált, használtuk kiindulási anyagként poliploid fúziós partner előállításához. A HAT-érzékeny sejteket 8-azoguanint 1-20 mikrogramm mennyiségben tartalmazó tápfolyadékban történő sorozatos passzálással válogattuk ki az aminopterinrezisztens HT01 sejtek közül.

Hogy a humán könnyű és nehéz lánc gének elvesztését meggyorsítsuk, a sejtek egy részét 90%-os halálos dózisú ultraibolya sugárzásnak tettük ki. A besugárzott sejteket határhígításos eljárással klónoztuk és számos kolóniát választottunk ki az antihumán Ig-vel való citoplazmafestődés hiánya és a sejtmag mérete alapján, amely arányos a kromoszómák számával. A HT01.A kiónt választottuk, miután kariotípus vizsgálattal 60-140 közötti kromoszómát tartalmazó poliploid sejtvonalnak bizonyult.

Erőteljesen szaporodó HT01.A sejteket úgy állítottunk elő, hogy egy sejtmintát prisztánnal (2,6,10,14tetrametil-pentadekán, Aldrich) kezelt egerek hasüregében passzáltunk. A túlélő sejtek egyedi kolóniák formájában nőttek mikrotitráló lemezeken. Ezeket tenyésztettük és megvizsgáltuk szaporodási készség, kariotípus és fúzióra való képesség szempontjából. Végül a HTO1.A.P1 kiónt választottuk a 135 egér és 3 humán kromoszómából álló készlet alapján. Ezt a sejtvonalat használtuk fúziós partnerként hepatitis A szeropozitív donortól nyert perifériásvér-limfocitákhoz.

b) Ellenanyag-termelő sejtek nyerése és stabilizálása

Vérmintát vettünk egy hepatitis A-virus (HAV) szeropozitív donortól körülbelül négy hónappal azután, hogy fertőzött élelmiszer fogyasztásával hepatitis Afertőzést kapott az Egyesült Királyságban.

A perifériásvér-limfocitákat Limphoprep. gradiensen (Flow Labs) elválasztottuk, Epstein-Barr-vírussal (EBV) transzformáltuk, majd fítohemagglutinint és 10% borjúszérumot tartalmazó tápfolyadékban 10 napon át tenyésztettük. Ezután fúzionáltattuk azokat a fent leírt humán/egér kiméra sejtekkel PEG 1500 alkalmazásával és HAT, valamint 10“⁵ mol/liter ouabin jelenlétében tenyésztettük 2 milliliter térfogatú rekeszekben. A tápfolyadék felülúszókat szendvics ELISA-eljárással vizsgáltuk anti-HAV ellenanyag jelenlétére tíz nappal a fúzió után, amikor különálló kolóniák váltak láthatóvá mikroszkóp alatt. Egyedi kolóniákat emeltünk ki a pozitív rekeszekből, és azokból monoklonális sejtvonalakat állítottunk elő kétszeri klónozással határhígításos eljárással. Az eredeti 42 darab 2 milliliteres rekeszből 17 bizonyult erősen pozitívnak a tápfolyadék alapos cseréjét követő kezdeti ELISA-vizsgálatok szerint, de ellenanyagot termelő monoklonális sejtvonalat azokból csak négyet sikerült előállítani. A többi klón az izolálás vagy klónozás (beleértve a kétszeri klónozás utánit) különböző fázisaiban abbahagyta az ellenanyagszekréciót, valószínűleg a heterohibridek kromoszómáinak eltérő instabilitása miatt.

c) Hibridöma kiválasztása

A fent leírt sejtvonalakból származó ellenanyagokat (A, B, C és D) szendvics és direkt ELISA-vizsgálattal titráltuk teljes és természetes üres vírusrészecskékkel szemben. A titereket, amelyeket azon hígítás mértékének 10-es alapú logaritmusának reciprok értékével fejeztünk ki, amely a maximális adszorbciós tetőzésnek az 50%-át adta, az la táblázat mutatja. Ezek az értékek az egyedi ellenanyagok szendvicspróba alapján észlelt, natív részecskékkel szembeni titereinek százalékában szerepelnek az lb táblázatban.

la táblázat

Humán ellenanyagok ELISA titerei teljes és természetesen üres HAV részecskéken vizsgálva

Ellenanyag-azonosító	Szendvics	Közvetlen
teli	üres	teli	üres
Antitest A	4,42	4,42	3,77	3,35
Antitest B	4,85	4,78	4,13	3,80
Antitest C	3,91	3,72	4,02	3,59
Antitest D	4,10	4,15	3,92	3,60

HU 220 355 Β

Ib táblázat

Ellenanyagok ELISA-aktivitása a homológ ellenanyagok szendvicspróba alapján észlelt, teljes vírusrészecskékkel szembeni titereinek százalékában kifejezve

Ellenanyag-azonosító	Szendvics	Közvetlen
teli	üres	teli	üres
Antitest A	100	100	22	9
Antitest B	100	85	19	9
Antitest C	100	65	126	48
Antitest D	100	112	66	32

d) Kompetíciós vizsgálatok

Az ellenanyagok azon képességét, hogy milyen mértékben gátolják egymást és az egérellenanyagokat a vírushoz való kötődésben szilárd fázisú radioimmunvizsgálattal és ELISA-próbával vizsgáltuk, amely eljárások csak az utolsó lépésben különböznek. Az eredmények, 20 amelyeket az ellenanyagpárok közötti maximális kompetíció százalékában fejeztünk ki a 2. táblázatban azt mutatják, hogy:

I) Az A és B ellenanyagok egymástól nem különböztethetők meg és hasonlatosak a K24F2 egérellenanyaghoz [MacGregor A. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 18, 1237, (1983)].

II) A D ellenanyag tulajdonságai alapján közel áll az egér B5B3 ellenanyaghoz [Stapleton J. T. és Lemmon S. M., J. Virol., 61, 491, (1987)] és csak az A ellenanyaggal interferál körülbelül maximum 30% mértékben a reciprok vizsgálatok szerint.

III) A C ellenanyag úgy tűnik funkcionálisan az A, valamint a D ellenanyagok közé esik.

IV) Mind az A, mind a D ellenanyag egyenként képes volt igen hatékonyan gátolni a humán HAV poliklonális szérum kötődését [Lemmon S. M. és munkatársai, J. Clinical Microb., 17, 834; Foxwell és Chulay],

A B5B3 ellen az A, valamint a B ellenanyaggal kapott magas kompetíciós értékeket 10-szeresen koncentrált ellenanyaggal nyertük, míg a szövettenyészet felül25 úszói csupán 20%-os, vagy alacsonyabb kompetíciót mutattak. Ezzel ellentétben ugyanezeket a felülúszókat lényegesen meg kellett hígítani ahhoz, hogy a K24F2, valamint a K.34C8 ellenanyagokkal [MacGregor A. és munkatársai, J. Clin. Microb., 18, 1237, (1983)] szem30 ben olyan teljes kompetíciós görbét kapjunk, mint amelyet a D ellenanyag felülúszója adott a B5B3 ellenanyaggal szemben.

2. táblázat

Az ellenanyagkötődés maximális kompetíciója (%) a 18F HAV törzshöz

4th Ab (detektálás) 3rd Ab (kompetitor)	A	D	K34C8	K24F2	B5B3	Humán poliklonális antiszérum (Chulay)
Antitest A	100	32	90	100	96'	94
Antitest B	100	33	78	100	>65'
Antitest C	66	55	46	72	91
Antitest D	24	100	29	69	99	92
Antitest A&D
1:1 mix						99
K34C8	100	32	100
K24F2	100	70		100
B5B3	69	100			100
Humán poliklonális antiszérum (NF)						100

¹: A maximális kompetícióhoz hígítatlan ellenanyag szükséges.

e) RlFA-vizsgálatok

Mindegyik, a kezdeti ELISA-vizsgálatokkal észlelt ellenanyag ugyancsak pozitív volt radioimmunfokuszáló vizsgálattal a 18f vírus ellen. [Daemer R. J. és munkatársai, Infect. & Immunoi., 32, 388, (1981); Stapleton J. T., és Lemmon S. M., J. Virol., 61, 492, (1987); valamint

Ping L. A. és munkatársai, 85, 821, (1987)]. Egyenlő térfogatú meghatározott koncentrációjú (1 mg/ml) affinitáskromatográfiával tisztított ellenanyag és a 18f, valamint a 43c vírus törzsek (a 43c törzset a 18f törzsből nyertük egér-monoklonálisellenanyag melletti passzálásokkal) 10-szeres hígításainak reagáltatásával kapott vírus10

HU 220 355 Β

RIFA-titer csökkenéseket a 3. táblázatban foglaltuk össze. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mutáns 43c törzset mindkét ellenanyag igen gyengén neutralizálja, azonban poliklonális Foxwell-szérummal szignifikáns, noha csökkent neutralizációt mutat.

Úgy tűnik mindkét ellenanyag sokkal kevésbé hatékonyan neutralizálja a 18f vírust, mint a poliklonális szérum, ez jórészt mindkét vírus hígításában megmaradó meglehetősen állandó számú túlélő plakknak tudható be, ami a Spearman-Karber-féle titerszámítás torzulását okozza. A poliklonális szérummal való reakció azonban minden plakk-képzést megakadályozott. Az ellenanyagok esetében a kompetíciós vizsgálatokban kapott, a poliklonális szérumhoz hasonló reakciógörbék és az ellenanyagok összesített ELISA-reaktivitása nem utal arra, hogy ezek alacsony affinitású ellenanyagok lennének.

3. táblázat

A HAV plakk-képző egység/ml log₁₀ titer csökkenése Specifikus antitesttel reagáltatott izolátumok

HAV törzs	A 1 mg/ml	Antitest D 1 mg/ml	Poliklonális humán szérum (1/10)
18f	3,15	2,72	>4,56
43c	0,68	0,78	1,93

f) A hepatitis A-vírus elleni D monoklonális ellenanyag nehéz és könnyű láncának klónozása és szekvenálása

1. eljárás

D ellenanyagot expresszáló 2,5xlO⁷ sejtből teljes RNS-t izoláltunk Chomczynski és Sacchi eljárása szerint [Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987)] 1 χ 10⁷ sejthez 1 ml extrakciós oldatot használva. A kapott RNSüledéket 50 mikroliter dietil-pirokarbonáttal (DEPC) kezelt desztillált vízben oldottuk, és spektrofotométerrel 4,4 mikrogramm/mikroliter koncentrációra állítottuk be. 75 mikrogramm teljes RNS-ből Dynabeads Oligo (dT)₂₅ szemcsék (Dynal Winal, Egyesült Királyság) felhasználásával a poliadenilált RNS-t kivontuk a gyártó utasításai szerint.

2. eljárás

Más eljárás szerint (2) a poliadenilált RNS-t közvetlenül 10³ D ellenanyag szekretáló sejtből izoláltuk MicroFastTrack mRNS-izoláló rendszer felhasználásával (Invitrogen, San Diego, USA) a gyártó utasításai szerint.

Megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy korlátozott számú sejtből klónozzuk a humán ellenanyaggéneket. Ezer D ellenanyag szekretáló sejtből izolált poliadenilált RNS felhasználásával a 2. eljárás szerint cDNS-génkönyvtárat létesítettünk. Számításaink szerint a génkönyvtár körülbelül 2000 válogatott méretű (>500 bázispár) cDNS-inszertet tartalmazhatott. A génkönyvtár felét lemezekre oltottuk és humán kappa-L-láncra nézve vizsgáltuk, így két pozitív kiónt találtunk. Részleges szekvenálás megerősítette, hogy mindkét klón tartalmazta a szignál peptidszekvenciákat magában foglaló teljes L-lánc-géneket. Bár ezt a génkönyvtárat a H-lánc-próbával nem vizsgáltuk, a kiindulási cDNS-génkönyvtárban kapott H-lánc-pozitív kiónok (2/500) előfordulási gyakorisága alapján számítva a teljes hosszúságú Hlánc-inszerteknek jelen kell lennie.

Az izolált mRNS-ről cDNS-t állítottunk elő, és azt a pSPORT-1 plazmidba klónoztuk a cDNS szintetizálására SUPERSCRIPT Plasmid System, valamint Plasmid Cloning készlet (GIBCO/BRL. Paisley, Egyesült Királyság) felhasználásával a gyártó által ajánlott utasítások szerint. A kapott cDNS/pSPORT -1 ligálás termékével Escherichia coli MAX EFFICIENCY DH5-alfa kompetens sejteket (GIBCO/BRL) transzformáltunk. Körülbelül 4500 kolóniát vittünk át Hybond-N nejlonszűrőkre (Amersham) és azokat lizáltuk, denaturáltuk és fixáltuk Buluwela és munkatársai eljárása szerint [Nucleic Acids Rés., 17, 452, (1989)]. A szűrőket proteináz-K-val kezeltük (50 mikrogramm/ml proteináz-K enzim 0,2 χ SSC, 0,1% SDS-pufferben oldva, 55 °C-on, 30 percig), majd a felesleges sejttörmeléket törlőkendővel eltávolítottuk. A génkönyvtárakat ezután nehéz- és könnyűlánc-próbák felhasználásával humán ellenanyag nehéz- és könnyűlánc-szekvenciákra nézve vizsgáltuk.

A nehézlánc-próba egy humán IgGl ellenanyag cDNS-inszert volt [patkány CAMPATH-1 (Campath a The Wellcome Foundation Limited védjegye) ellenanyag nehéz lánc CDR-ek humán NEW IgGl ellenanyag nehéz láncon újra kialakítva; Riechmann és munkatársai, Natúré, 382, 323-327, (1988)], amelyet a Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit (DNSjelölésre és kimutatásra szolgáló nem radiokatív készlet) (Boehringer Mannheim) felhasználásával digoxigenin-ll-dUTP-vel jelöltünk, és D ellenanyag nehéz láncra nézve körülbelül 500 átvitt kolóniát tartalmazó szűrők vizsgálatára használtunk a gyártó utasításai szerint. Két lehetséges pozitív kolóniát észleltünk, és ezeket további vizsgálat céljára kiválasztottuk. A Qiagen készlet (Diagen, Düsseldorf, Németország) felhasználásával, vagy Del Sál és munkatársai eljárása szerint [Nucleic Acids Rés., 16, 9878, (1988)] plazmid-DNS-t állítottunk elő és úgy találtuk, hogy mindkét lehetséges pozitív klón a humán immunglobulin nehéz lánc cDNSnek megfelelően várt méretű inszerteket tartalmaz. Egy pH210H2-nek nevezett kiónt kiválasztottunk és plazmid priming módszerrel a didezoxi-láncterminációs eljárással [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, (1977)] a Sequenase készlet (United States Biochemicals-USB, Cleveland, USA) utasításai szerint mindkét irányból szekvenáltuk. A nehéz lánc C régióját gamma-1-ként határoztuk meg. A variábilis régió szekvenciáját a 2. ábra mutatja.

A könnyűlánc-próbák humán lambda-cDNS-ek [humanizált anti-CD3 monoklonális ellenanyag (mAb) lambda-L lánc inszert (patkány anti-CD3-mAb L lánc CDR-ek humán lambda-Kem-Oz- ellenanyag L láncon átalakítva; E. Routledge, Eur. J. Immunoi., 21, 2717, (1991)], valamint egy Campath-1H kappa-L-lánc cDNSinszert [patkány Campath-1 mAb L lánc CDR-ek humán REI kappa-ellenanyag L láncán átalakítva; Page és Sydenham, Biotechnology, 9, 64, (1991)] voltak, amelyeket a Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit

HU 220 355 B (DNS jelölésre és kimutatásra szolgáló nem radioaktív készlet) (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) felhasználásával digoxigenin-ll-dUTP-vel jelöltünk, és D ellenanyag könnyű láncra nézve körülbelül 4000 átvitt kolóniát tartalmazó szűrők vizsgálatára használtunk a gyártó utasításai szerint. Húsz lehetséges pozitív kolóniát észleltünk, tizet további vizsgálat céljára kiválasztottunk. A Qiagen készlet (Diagen, Düsseldorf, Németország) felhasználásával, vagy Del Sál és munkatársai eljárása szerint (1988) plazmid-DNS-t állítottunk elő, nyolc klón a humán immunglobulin könnyű lánc cDNS-nek megfelelően várt méretű inszerteket tartalmazott. Egy pH210L2nek nevezett kiónt kiválasztottunk és plazmid priming módszerrel a didezoxi-láncterminációs eljárással [Sanger és munkatársai, (1977)] a Sequenase készlet (USB, Cleveland, USA) utasításai szerint mindkét irányból szekvenáltuk. A könnyű láncot lambda-szekvenciaként határoztuk meg, melynek variábilis régióját a 3. ábra mutatja, g) Expressziós konstrukciók összeállítása

g.i) példa

A pRDNl expressziós vektort a pLD9 plazmidból [Page és Sydenham M. A., Biotechnology, 9, 64-68, (1991)] alakítottuk át az alábbiak szerint. Az SV40 replikációs origó inszertálására használt Hindlll hasítási helyet, valamint a másik, a DHFR kódolószekvenciától 5’ irányban található Hindlll hasítási helyet Hindlll emésztéssel roncsoltuk, majd DNS-polimeráz Klenow-ffagmensével feltöltöttük és újraligáltuk. A mindkét restrikciós helytől mentes kiónt EcoRI enzimmel emésztettük, Klenow-enzimmel feltöltöttük és újból lígáltuk. Az így kapott, minden belső Hindlll és EcoRI hasítási helytől mentes plazmidba inszertáltuk a humán béta-aktin expressziós kazettát a DHFR transzkripciós egységtől 3’ irányba. Ez a plazmid rendelkezik egy funkcionális SV40 replikációs origóval, és a pRDNl plazmid a bétaaktin promotertől 3’ irányban rendelkezik egy-egy egyedi Hindlll és EcoRI hasítási hellyel. Az átalakított pRDNl vektort EcoRI enzimmel hasítottuk, Klenowenzimmel tompa végűvé tettük és boíjúbél-foszfatázzal defoszforileztúk. A megfelelő pH210H2, illetve pH₂10L2 kiónokból a D ellenanyag nehéz és könnyű lánc inszerteket Hindlll, illetve EcoRI enzimekkel kivágtuk, és Klenow-enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított inszerteket pRDNl plazmidba lígáltuk, és Escherichia coli MAX Efftciency DH5 kompetens sejtek (Bethesda Research Labs BRL) transzformálására használtuk. Számos így kapott kolóniából plazmidot állítottunk elő kis mennyiségben [Del Sál G. és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 16, 9878, (1988)] és az inszertek irányultságát megfelelő restrikciós enzim emésztésekkel meghatároztuk. Egy nehéz- és egy könnyúlánc-klónból (pRDHH9, illetve pRDHL27) Qiagen (védjegyű) oszlopokon (Hybaid) plazmid-DNS-t állítottunk elő a gyártó utasításai szerint.

COS-sejtek transzfektálása

2xl0⁵ sejtet oltottunk egy 12 rekeszú szövettenyésztő lemez mindegyik rekeszébe (szérumot tartalmazó) D-MEM tápfolyadékba. 24 óra elteltével az egy rétegben növő sejteket szérummentes tápfolyadékkal kétszer mostuk, majd a rekeszekhez az egyes DNS-konstrukciók (pRDHH, valamint pRDHL27) 1 mikrogrammját, valamint 5 mikrogramm TRASFECTAM-ot (Northumbria Biologicals Limited) tartalmazó 0,5 ml szérummentes tápfolyadékot adtunk a gyártó utasításai szerint. További 6 órás inkubációt követően a transzfektáló tápfolyadékot leszívtuk, és 1 ml (szérumot tartalmazó) D-MEM tápfolyadékra cseréltük. 48-72 órás inkubálás után a tápfolyadékot eltávolítottuk és humán ellenanyag jelenlétére vizsgáltuk.

Humán ellenanyag ELISA-vizsgálatok

A COS-sejtek transzfektálásánál nyert tápfolyadékot megvizsgáltuk humán ellenanyag jelenlétére. Könnyúlánc-szintézis hiányában a sejtből nehéz láncok nem szekretálódnak, hanem a sejten belül lebomlanak [Hendershot L. és munkatársai, Immunoi. Today, 8, 111-114], Az ellenanyagok ily módon a tenyésztőfolyadékban nehéz lánc kimutatásával vizsgálhatók. Mikrolemezeket antihumán IgG-vel fedtünk, és a tenyésztő folyadékkal inkubáltunk. Ellenanyag jelenlétét antihumán gamma-láncra fajlagos peroxidáz konjugátummal láthatóvá téve mutattuk ki.

g-ii) példa

A H, illetve L láncot kódoló DNS-t a pEEőhCMV [Stephens és Cockett, Nucl. Acids Rés., M., 7110, (1989); Bebbington és munkatársai, Biotechnology, 10, 169, (1992)], illetve pEE12 [Rolfe, nem közölt] expressziós vektorokba klónoztuk. A pEE12 plazmid az SV40 korai promoter ellenőrzése alatt tartalmazza a hörcsög glutamin szintetáz gént [GS; a toxikus glutaminanalóg L-metionin-szulfoximin (MSX) segítségével szelektálható és amplifikálható markert], valamint a pSv2.GS-ből [Bebbington és Hentschel, DNA Cloning, III. kötet, New York Academic Glover DM kiadás, (1987)] átvett hasítási és poliadenilálási szignált. Ettől a szelekciós kazettától 3’ irányban található a humán cytomegalovírus (hCMV) fő közvetlen korai (MIÉ) génjének teljes erősítő, promoter, valamint 5’ UTR szekvenciája, amelyet az ellenanyag gén expresszálásának irányítására alkalmaztunk. Ezt az expressziós kazettát az azzal kapcsolt replikációs origóval és bétalaktamáz génnel a pEE.HCMV plazmidból [Stephens és Cockett, Nucl. Acids Rés., 17, 7110, (1989)] vettük át. A pEEőhCMV, valamint pEE12 vektorokkal transzformált sejtek tehát képesek glutaminmentes tápfolyadékban növekedni. A pEEőhCMV, valamint pEE12 plazmidokat a Celltech Ltd.-től szereztük be (Slough, Berkshire, SLI4EN, UK).

Rekombináns plazmidokkal (mindegyikből 5 mikrogramm) 5 χ 10⁵ COS-1 sejtet, vagy 10⁷ YO myelomasejtet transzfektáltunk Transfectam reagenssel (Promega, Southampton, UK) a gyártó utasításai szerint. Ennek eredményeképp a szelektálás csupán a pEE12 plazmid jelenlétén alapul, hatékony expresszálás a két plazmid egyidejű integrálódásától függ.

H és L láncokkal transzfektáltunk COS-sejteket, annak bizonyítására, hogy a konstrukciók a leolvasási keretbe helyesen inszertálódtak, hatékonyan átíródnak, transzlálódnak és a kapott humán ellenanyag megfelelően szekretálódik. Miután az ellenanyag átmeneti expresszálódását ELISA-módszerrel igazoltuk, a plaz12

HU 220 355 Β midokkal YO myelomasejteket transzfektáltunk. COS1 törzstenyészet sejteket (ECACC, Porton Down, UK) 10% borjúszérummal (APP, Dudley, UK) kiegészített DMEM tápfolyadékban (Flow, Irvine, UK) tartottunk fenn. A COS-sejtek transzfektálását DMEM tápfolyadékban (Flow, Irvine, UK) végeztük.

Az YO törzstenyészetsejteket (ECACC, Porton Down, UK) [glutamint és ferri-nitrátot nem tartalmazó, de nátrium-piruváttal (110 mg/1); GIBCO/BRL, Paisley, UK] kiegészített DMEM tápfolyadékot (Flow, Irvine, UK), lxnem létfontosságú aminosavakat és (Flow, Irvine, UK) 10% boíjúszérumot tartalmazó teljes tápfolyadékban tartottuk fenn. A transzfektált sejteket 50 mikroliter teljes tápfolyadékban 96 rekeszú lemezekre vittük át 3χ10⁵, 7,5 x1ο⁴ és 1,5 x1ο⁴ sejt/ml sűrűségben, majd 37 °C-on, 24 órán át inkubáltuk. Ezt követően 100 mikroliter [glutamint és ferri-nitrátot nem tartalmazó, de nátrium-piruvátot (110 mg/1) tartalmazó, GIBCO/BRL, Paisley, UK] DMEM tápfolyadékot (Flow, Irvine, UK) tartalmazó, glutamáttal (60 mikrogramm/ml) aszparaginnal (60 mikrogramm/ml, Sigma, Poole, UK), 1 x nem létfontosságú aminosavakkal, egyenként 7 mg/1 koncentrációjú adenozinnal, cytidinnel, guanozinnal és uridinnal, 2,4 mg/1 timidinnel (Sigma, Poole, UK), 10% borjúszérummal (APP, Dudley, UK) és 4 mikromol MSX-el (az YO sejtekből az endogén glutamin szintetáz enzim kititrálására) kiegészített szelekciós tápfolyadékot adtunk a humán ellenanyag géneket tartalmazó transzfektált plazmiddal kiegészült kiónok kiválogatása céljából.

Négy nappal a transzfektálást követően a COS-1 sejtekről, valamint a plazmidkiegészülésre szelektáló tápfolyadékban tenyésztett YO sejtekről a tenyésztőfolyadékot egy szendvics ELISA-módszerrel vizsgáltuk elfogó ellenanyagként poliklonális antihumán IgG-vel (Sigma, Poole, UK) fedett hajlékony mikrolemezeken (Falcon, Becton-Dickinson, Plymouth, UK). A vizsgálati minta hozzáadása után a kimutatást egy antihumán gamma-láncra fajlagos peroxidázkonjugátummal (Sigma, Poole, UK), valamint szubsztrátként ortofenilén-diamin-HCl-dal (Sigma, Poole, UK) végeztük. A pozitív kiónokat a szelektáló tápfolyadékban való további tenyésztés céljából 24 rekeszú lemezekre vittük.

Három, a nem transzfektált YO sejtekre toxikus szintű MSX jelenlétében növekedni képes kiónt nyertünk. Ezek közül ELISA-módszerrel való meghatározás alapján kettő szekretált humán ellenanyagot, míg a másik sejtvonal álpozitívnak bizonyult.

2. példa

Cynomolgus majom-ellenanyaglánc szekvenciák meghatározása

a) Ouchterlony-féle immundiffuzió

Csimpánz, cynomolgus és aotus majmoktól vett szérum felhasználásával Ouchterlony immundiffuziós vizsgálatot végeztünk a humán és fóemlős-immunglobulinok proteinszekvenciái közötti esetleges hasonlóság kimutatására.

Az Ouchterlony-vizsgálathoz használt mikrolemezeket a The Binding Site cégtől szereztük be.

A birka antihumán IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4 szérumokat a The Binding Site cégtől szereztük be.

Kecske antihumán IgM-et és kecske antihumán IgA-t a Sigma cégtől szereztünk be.

Birka antihumán lg kappa-könnyúláncot a Serotec cégtől szereztünk be.

Birka antihumán lg lambda-könnyúláncot a Serotec cégtől szereztünk be.

Cynomolgus (óvilági) majomtól, aotus (újvilági) majomtól és csimpánztól (emberszabású majomtól) vett szérumokat egy antihumán immunglobulin-sorozattal adott reakcióra vizsgáltunk. A hígítatlan birka antihumán ellenanyagot (10 mikroliter) egy ouchterlony-lemez középső rekeszébe töltöttük és a főemlősből származó szérumokat (10 mikroliter) az azt körülvevő külső rekeszekbe töltöttük. Minden szérumot PBS-ben hígítottunk a gyártó utasításai szerint. A vizsgálatban nyúlás egérszérumot is használtunk kontrollként, pozitív kontrollként humán szérumot használtunk. A lemezt szobahőmérsékleten nedves kamrában inkubáltuk egy éjszakán át, vagy amíg a precipitációs csíkok láthatóvá váltak.

Precipitációs csíkok alakultak ki a csimpánzszérum és mindegyik antihumán immunglobulin-alosztály között. Néhány, azonban nem mindegyik humán Ig-osztály, nevezetesen az IgGl, IgM, IgA, valamint a kappaés lambda-könnyüláncok precipitációs csíkot adtak a cynomolgus majomszérummal. Az aotus majom- (újvilági majom) szérumot ismerte fel a legkevesebb antihumán lg ellenanyag - kizárólag az anti-kappa- és antilambda-könnyűláncokkal szemben láttunk erős reakciót. Meglepő módon, a nyúlszérum reagált az antihumán lambda-könnyúlánccal - ez arra utal, hogy a nyúl- és humán Ig-proteinszekvenciák között ellenanyag által felismerhető közös epitóp fordulhat elő. Az egérszérumot egyetlen antihumán Ig-osztály ellenanyag sem ismerte fel. Ez a vizsgálat a várt eredményt hozta figyelembe véve az egyes fajok emberhez viszonyított evolúciós rokonságának mértékét, azaz az újvilági majmok korábban váltak le, mint az óvilági majmok, amelyek nagyobb mértékű proteinhomológiát mutatnak az emberrel. Főemlősés humán lg gének nukleotid homológiájának vizsgálatára az óvilági cynomolgus majom kappa-könnyúláncát választottuk.

b) Cynomolgus majom teljes RNS-t 10 mililiter vérből származó perifériásvér-limfocitákból állítottunk elő a guanidium-tiocianátos REF extrakciós eljárással.

Az első cDNS-szálat a BRL Superscript rendszer (BRL) segítségével készítettük a teljes RNS-ből. A teljes RNS-készítményt (5 mikrogramm) 13 mikroliter térfogatban hozzáadtuk egy mikrolitemyi oligo-dT primerhez, 10 percig 70 °C-on hevítettük, majd jégen lehűtöttük.

Az első cDNS-szál reverz transzkripcióját 2 mikroliter reakciópuffert, 1 mikroliter dNTP keverék, 2 mikroliter DTT-t és 1 mikroliter reverz transzkriptázt tartalmazó elegyben végeztük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 10 percig, majd 42 °C-on 50 percig inkubáltuk. A reakciót 5 percig 90 °C-ra történő hevítéssel, majd 10 percig jégen tartással állítottuk le. A mRNS-temp13

HU 220 355 Β látót 1 mikroliter ribonukleáz-H enzimmel 20 percig 37 °C-on emésztettük, c) Az első cDNS-szál PCR-amplifikációja PCR-primerek

A151. számú primer a humán Vkappal szekvencia 5’ végével homológ, lásd az 1. szekvenciát:

5’ GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA A 301. számú primer a humán C-kappa-szekvencia 3’ végével homológ, lásd a 2. szekvenciát:

5i GATCAAGCTTCTAACACTCTCCCC Ezeket a printereket, valamint a továbbiakban említett PCR- és szekvenáló printereket egy oligonukleotidszintetizáló berendezésen állítottuk elő és 200 nanogramm/mikroliter töménységben használtuk.

Az első cDNS-szálat közvetlenül amplifikáltuk a 15 151. és a 301. primerek segítségével anélkül, hogy szükség lett volna második szál szintetizálására. A 151. primer a humán kappa-könnyülánc variábilis régiójának (FR1) az 5’ végére, míg a 301. primer a humán kappakönnyülánc konstans régiójának 3’ végére fajlagos.

A könnyű láncot az alábbi reakció szerint ampli5 fikáltuk: a teljes első cDNS-lánc reakciós elegyét hozzáadtuk 21 mikroliter desztillált vizet, 8 mikroliter szintézispuffert (Boehringer Mannheim), 4 mikroliter 301. prímért, 4 mikroliter 151. prímért és 0,5 mikroliter Taq polimerázt tartalmazó elegyhez. Ezt az ele10 gyet ásványi olajjal felülrétegeztük és 20 PCR-ciklusnak vetettük alá a fenti program szerint. A reakció végeredményét 1%-os agarózgélen ellenőriztük a már említettek szerint,

d) Cynomolgus kappa-könnyűláncok klónozása

A 260. számú primer a humán V-kappa- (HindlII restrikciós helyet tartalmaz) 5’ végével homológ, lásd a

3. szekvenciát:

’ GATCAAGCTTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA

i) Hindlll hasítási helyek beiktatása a könnyűláncfragmens valamelyik végére

A fenti PCR során nyert cynomolgus majom kappakönnyűláncot a pUC18 plazmid [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] HindlII hasítási helyébe klónoztuk. Az amplifikált könnyű lánc egy HindlII hasítási helyet tartalmaz a konstans régió 3’ végén a 301. primer szekvencia révén, de az 5’ végén ez a restrikciós hely hiányzik. Ezért, egy HindlII hasítási helyet vittünk be a variábilis régió 5’ végébe a 260. és 301. primerekkel végzett második PCR során, ezzel lehetővé vált a könnyű lánc direkt klónozása a pUC18 plazmidba. A 260. primer a 151. primerrel azonos szekvenciával rendelkezik, de 5’ végén egy HindlII hasítási helyet tartalmaz.

A reakcióelegyet a fent említettek szerint állítottuk össze 1 mikroliter cynomolgus cDNS-t (PCR-elegyből) használva 100 mikroliter végtérfogatban. A DNS-t 20 PCR-ciklussal amplifikáltuk és az eredményt 1%-os agarózgélen ellenőriztük. A gélen az amplifikált könnyű láncnak megfelelő sávokon kívül számtalan más sávot is észleltünk. Lehetséges, hogy a kis molekulatömegű végtermékek egy része a primerek összekapcsolódása, úgynevezett primer-dimer képződés eredménye.

ii) A PCR-végtermék tisztítása

A PCR-elegyből a könnyű láncot a pUC18 plazmidba klónozás előtt az alábbiak szerint tisztítottuk. A PCR-elegyet -20 °C-ra hűtöttük és a folyékony ásványi olajat leszívtuk. A DNS-t kétszer fenol/kloroform eleggyel, majd kloroformmal extraháltuk. Az oldatot 5 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 Tris (pH 8,0), és 0,5% SDS végkoncentrációra állítottuk be, majd ehhez 50 mikrogramm/ml végkoncentrációig proteináz K-t adtunk. A reakcióelegyet 30 percig 37 °C-on, majd 68 °C-on 10 percig inkubáltuk. A fenol/kloroform extrahálást megismételtük. A DNS-t 1/10 térfogat 3 mol/1 nátriumacetáttal és 2,5 térfogat abszolút etanollal (hordozóként 1 mikroliter dextrán-szulfát hozzáadásával) kicsaptuk. A DNS-t 30 percre -20 °C-ra hűtöttük, majd egy eppendorf centrifugában ülepítettük. Az üledéket 70%-os etanollal mostuk, szárítottuk és 17 mikroliter vízben szuszpendáltuk. Ezzel a tisztítási folyamattal megakadályozható, hogy a DNS-hez kötve maradt Taq polimeráz gátolja a restrikciósenzim-aktivitást.

iii) A HindlII fragmens előállítása klónozás céljából

A könnyű lánc DNS-t ezután HindlII restrikciós enzimmel emésztettük, hogy az a pUC18 HindlII hasítási helyére klónozhatóvá váljon. 17 mikroliter könnyű lánc DNS-hez 2 mikroliter B puffért, valamint 1 mikroliter nagy töménységű HindlII enzimet adtunk és 11 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Az emésztett DNS-t 1%-os agarózgélen szétválasztottuk, és a könnyű láncnak megfelelő csíkot a gélből kivágtuk. A DNS-t „Prep-a-gene” DNStisztító készlettel (BioRad Ltd.) az agaróztól megtisztítottuk a gyártó utasításai szerint.

e) Cynomolgus könnyű lánc ligálása pUC18 plazmidba

A tisztított HindlII fragmenst a pUC18 plazmid HindlII hasítási helyére klónoztuk az alábbiakban ismertetett eljárás szerint: 20 mikroliter cynomolgus DNS-t (80 mikroliter össztérfogatból) 1 mikroliter HindlII enzimmel emésztett pUC18 (50 mikrogramm/mikroliter, Pharmacia), 3 mikroliter ligázpuffer (Boehringer), 3 mikroliter T4 DNS ligáz (Boehringer) és 3 mikroliter desztillált víz elegyéhez adtunk. A reakcióelegyet 15 °C-on 3 órán át inkubáltuk.

f) DH5-kompetens sejtek transzformálása pUC18kappa-lánccal

E. coli DH5-alfa Maximum Efficiency sejteket (BRL) transzformáltunk a könnyűlánc-plazmiddal. 100 mikroliter sejtet lassan felolvasztottunk -70 °Cról, óvatosan összekevertük 5 mikroliter ligáit reakcióeleggyel, és 30 percig jégen tartottuk. A sejteket 45 másodpercig 42 °C-on inkubáltuk, majd 2 percig jégen hűtöttük. Az elegyhez 1 ml SOC tápfolyadékot (literenként 20 g bactotryptone, 5 g élesztőkivonat, 0,5 g NaCl, 10 ml 250 mmol/1 koncentrációjú KC1, 5 ml 2 mol/1 koncentrációjú MgCl₂, 20 mmol/1 glükóz) adtunk, és 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A transzformációs reakciót öt darab ampicillin (100 mikrogramm/ml) tartalmú

HU 220 355 B

LB lemeztáptalajra (LB agarlemezek: literenként 12 g trypton, 24 g élesztőkivonat, 4 ml glicerin, 100 ml foszfátpuffer, 15 g bacto-agar) oltottuk ki, és azokat egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. Megszámoltuk lemezenként a kolóniákat, és kiszámítottuk a transzformáció hatásfokát.

A lemezekről öt kolóniát leszedtünk, és PCR-módszerrel megvizsgáltuk könnyű lánc inszertek jelenlétére. Mindegyik kolóniát 65,5 mikroliter desztillált vízben szuszpendáltuk, és a szokásos reakcióelegyben a 260., valamint a 301. számú primerek felhasználásával 20 PCR-ciklusnak vetettük alá. A PCR termékét az előbbiek szerint gélen futtattuk. Azt találtuk, hogy az ötből négy kolónia tartalmazta az inszertet, ami a klónozás sikerességére utalt.

g) pUC18-kappa-lánc plazmid minikészítmények

Az öt transzformációs lemezről húsz kolóniát gyűjtöttünk és azokat 2 ml térfogatú 100 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó L-Broth levestáptalajba oltottuk (az L-Broth összetétele megegyezik az LB lemezekével, azzal az eltéréssel, hogy nem tartalmaz agart). A tenyészeteket rázás mellett, egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. Mindegyik tenyészetből 1,5 ml-t centrifugáltunk, és az üledéket 1 mg/ml lyzozymmel kiegészített 200 mikroliter STET-pufferben (0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA, 5% Triton-X-100) szuszpendáltuk. A csöveket 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 45 másodpercig forraltuk és 10 percig centrifugáltuk. A kapott üledéket steril fogpiszkálóval eltávolítottuk és a felülúszóhoz 8 mikroliter 8%-os CTAB-puffert adtunk. A csöveket a plazmid-DNS ülepítése céljából 5 percig centrifugáltuk, majd azt vortexszel 300 mikroliter 1,2 mol/1 nátrium-kloridban szuszpendáltuk. A DNS-t 750 mikroliter etanol hozzáadásával kicsaptuk, vákuum alatt szárítottuk és 20 mikroliter TE-pufferben (10 mmol/1 Tris pH 7,4,1 mmol/1 EDTA) szuszpendáltuk.

A mini készítményekben restrikciósenzim-emésztéssel (10 egység/mikroliter HindlII restrikciós enzim és B puffer, Boehringer) ellenőriztük a könnyű lánc jelenlétét. Mindegyik DNS 2 mikroliterét 0,5 mikroliter B puffer, 1 mikroliter desztillált víz, 1 mikroliter ribonukleáz A, (500 mikrogramm/ml, Boehringer) és 0,5 mikroliter HindlII enzim elegyéhez adtuk. Az emésztendő DNS-t

1,5 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd 1%-os gélen futtattuk. A könnyű lánc jelenlétét egy körülbelül 700 bázispárból álló fragmens jelezte.

h) A kappa-könnyűlánc szekvenálása

A szekvenálásnál az alábbi printereket használtuk fel.

M13 reverzprimer: a pUC18 negatív szálához kapcsolódik a többszörös klónozási helytől 3’ irányban (Pharmacia), lásd a 4. szekvenciát:

5’ AAACAGCTATGACCATG.

-40 előre irányuló primer: a pUC18 pozitív szálához kapcsolódik a többszörös klónozási helytől 3’ irányban (USB), lásd az 5. szekvenciát:

GTTTTCCCAGTCACGAC.

299. számú primer: a humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer, lásd a 6. szekvenciát:

GCGTCAGGGTGCTGCTGAGG.

106. számú primer: a humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer (5’ végen), lásd a 7. szekvenciát:

5’ GGCGGGAAGATGAAGACAGA.

151. és 260. számú primerek: lásd a C és D pontokat.

261. számú primer: humán C-kappa-régióhoz kapcsolódó primer, lásd a 8. szekvenciát:

5’ TTCAGCAGGCACACAACAGA.

Az előző lépésből származó tíz kiónt választottunk ki további szekvenálásra (az 1., 2., 4., 5., 9., 12., 14., 15., 18. és 20. kiónokat) a didezoxi-láncterminációs eljárással. A mini-DNS-készítmény megmaradt 18 mikroliterét 2 mikroliter NaOH-hoz (2 mol/l) adtuk, és 20 percig 68 °C-on hevítettük a DNS denaturálása céljából. A DNS-t lehűtöttük, és 8 mikroliter ammónium-acetát (5 mol/1) és 100 mikroliter etanol hozzáadásával 5 percig szárazjégen tartva kicsaptuk. A DNS-t ülepítettük, 70%-os etanollal mostuk, vákuum alatt szárítottuk és 20 mikroliter desztillált vízben szuszpendáltuk.

A DNS egy részét (7 mikrolitert) 2 mikroliter reakciós puffer és a megfelelő primer 1 mikroliterének elegyéhez adtuk és 2 percig 65 °C-on inkubáltuk, majd lassan 30 °C alá hűtöttük, hogy a primer és a templát összekapcsolódjon. A teljes kappa-könnyűlánc szekvenálásához szükség volt néhány különböző primer felhasználására, a szekvenálás részleteit az alábbiakban ismertetjük. A templát/primer elegyhez a következőket adtuk: 1 mikroliter DTT (0,1 m, USB), 2 mikroliter jelölőkeverék (5xUSB), 0,5 mikroliter ³⁵S-dATP (10 mikroCi/mikroliter, Amersham), és 2 mikroliter Sequenase enzim. A reakcióelegyet egy ³⁵S-jelölt vezetószekvencia szintézise céljából 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A jelölő reakció befejeződését követően egy több rekeszű lemez négy rekeszéhez, amelyek

2.5 mikroliter ddGTP-t, ddATP-t, ddTTp-t, illetve ddCTP-t tartalmaztak 3,5 mikroliter jelölókeveréket adtunk. A láncterminációs reakciót 5 percig 37 °C-on hagytuk végbemenni, majd 4 mikroliter leállítóoldatot adtunk mindegyik rekeszhez. A reakcióelegyeket felhasználásig jégen tároltuk.

Szilikonozott üveglapok közé egy 8%-os akrilamidgélt (A BRL cégtől beszerzett ultratisztaságú akrilamidgél keverék-8) öntöttünk, 40 mA-en egy óráig előfuttatást végeztünk futtatópufferként TBE-puffer (0,09 mol/1 TMS-borát, pH 8,0,0,002 mol/1 EDTA) felhasználásával. A rekeszeket az előfuttatás előtt és után pufferrel mostuk a levegőbuborékok és a karbmid eltávolítása céljából. A mintáknak a gélre töltése előtt azokat 2 percig 95 °C-on hevítettük, majd mindegyik minta 4 mikroliterét a gélre töltöttük. A mintákat 40 mA-en

1.5 órán át futtattuk, majd egy második sorozat mintát töltöttünk a gélre, és azt további 1,5 órán át futtattuk. Ez az eljárás mindegyik minta esetében egy rövid és egy hosszú futást eredményezett. Az üveglapokat szétszedtük és a gélt 10% ecetsav/10% metanol elegyébe helyeztük, mielőtt azt egy 3MM papírlapra vittük át. A gélt 1,5 óráig 80 °C-on szárítottuk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten röntgenfilmet exponáltunk vele. Az autoradiogrammot előhívtuk és a szekvenciát a rö15

HU 220 355 Β vid és hosszú futások átfedésének figyelembevételével alulról felfelé haladva leolvastuk.

j) A szekvenciaadatok összehasonlítása

A tíz klón teljes könnyű láncának szekvenciáit különböző primerek felhasználásával egy sorozat szekvenálási reakció futtatásával kaptuk. A szekvenciaadatok összehasonlítását a 4-7. ábra mutatja. Úgy találtuk, hogy a 14., valamint 5. klón csonkított könnyűláncszekvenciákat tartalmaznak. Ez legnagyobb valószínűség szerint az mRNS reverz transzkripciója, vagy a cDNS PCR-amplifikációja közben keletkezett műtermék. Lehetséges, hogy az mRNS vagy cDNS egy másodlagos szerkezetet vett fel, amelyen keresztül a megfelelő enzim nem volt képes az olvasást folytatni, és így egy részleges szekvenciát eredményeztek. A 15. kiónt választottuk, hogy ismert könnyűlánc-szekvenciákkal való további összehasonlítás révén annak azonosságát igazoljuk, valamint összehasonlítást végeztünk humán, nyúl és egér könnyűlánc-szekvenciákkal, hogy meghatározzuk a nukleotid- és aminosavszekvencia homológiákat. Az eredményeket a 4-7. táblázatok mutatják.

A cynomolgus könnyű lánc konstans régióját humán őssejt C-kappa-gén [Hieter P. A. és munkatársai, Cell, 22, 197, (1980)], egy egér MOPC21 C-kappamRNS [Hamlyn P. A. és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 9, 4485, (1981)], valamint nyúl C-kappa-mRNS (17D9) [McCartney-Francis N. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1794, (1984)] szekvenciákkal hasonlítottuk össze. A cynomolgus variábilis régiókat egy Walker-féle humán limfoid sejtvonallal [Klobek H. G. és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 12, 6995, (1984)] hasonlítottuk össze. Ez a sejtvonal egy olyan a V-kappal családba tartozó könnyű lánc gént expresszál, amely a J5 gén szegmenst hasznosítja. A 17D9 nyúlszekvenciát, valamint az S107A egér V-kappal szekvenciát [Kwan S. P. és munkatársai, J. Exp. Med., 153, 1366, (1981)] összehasonlítottuk a cynomolgus variábilis szekvenciákkal. Az utóbbi egy foszfokolin kötő IgA kappa-mieloma, amely az egér J1 gén szegmenst hasznosítja. A 15. klón variábilis régióját egy Daudi-féle humán ellenanyaggal is összehasonlítottuk (Klobek, 1984). Ez a könnyű lánc gén a V-kappal családba tartozik és a J5 gén szegmenst hasznosítja. A cynomolgus ellenanyag kappa-könnyűlánc konstans régiójának szekvenciája mind nukleotid (91,6%), mind aminosav (81,3%) szinten nagymértékű homológiát mutat a humán C-kappa-génével. Az egér C-kappa-szekvencia nagyobb mértékű homológiát mutatott a cynomolgus majom és a humán C-kappa-szekvenciával, mint a nyúl Ckappa-szekvencia. A százalékosan kifejezett homológia azonban nem különbözött drámai módon a humánés majomszekvenciák nyúl- és egér-, illetve a nyúlszekvencia egérszekvenciához való összehasonlításakor.

Az 5. és 6. táblázatokban megadtuk a homológia százalékban kifejezett mértékét a 15. klón mindegyik keretrégiója és mindegyik CDR-régiója esetében. A várakozásnak megfelelően a keretrégiók a CDR-régiókhoz viszonyítva a fajok között viszonylag megőrzöttek, míg az utóbbiak között figyelemreméltó variabilitást találunk. A 15-ös klón például 90-96% aminosavszekvencia homológiát mutat a humánnal az 1. és 3. keretrégiókban, azonban csupán 22% homológiát mutat a CDR 3 régióban. A 15-ös klón különösen az 1. és 3. keretrégióban nagymértékű homológiát mutat mind a Walker-féle, mind a Daudi-féle humán könnyűlánc-szekvenciákkal, bár nagyobb mértékű homológiát mutat a Walker-féle szekvenciával. A nyúl V-kappa-szekvencia mind a humán, mind a majomszekvenciákkal nagyobb mértékű homológiát mutat, mint az egéré. Ez magyarázatot adhat arra, hogy miért adott az ouchterlonyvizsgálatban a nyúlszérum pozitív reakciót néhány antihumán ellenanyaggal, egérszérummal azonban nem láttunk reakciót.

4. táblázat

Könnyű lánc konstans régió homológiák összehasonlítása

Species	% homológia DNS	% homológia AA
Cynomolgus/ humán	91,6	81,3
Cynomolgus/nyúl	66,0	51,0
Cynomolgus / egér	68,0	58,0
Cynomolgus/nyúl	65,7	45,8
Cynomolgus /egér	69,8	58,9
Cynomolgus /egér	63,0	49,5

5. táblázat

Könnyűlánc-keret és CDR DNS-szekvencia homológja százalékban kifejezett mértéke Cynomolgus 15-ös klón

	Humán W	Humán D	Nyúl	Egér
FR1	89,9	89,9	71,0	66,7
CDR1	84,8	66,7	60,6	42,4
FR2	95,6	80,0	86,7	75,6
CDR2	80,0	60,0	60,0	50,0
FR3	92,6	91,6	82,1	76,8
CDR3	50,0	61,5	26,9	57,7
FR4	75,8	75,8	66,7	66,7

6. táblázat Könnyűlánc-keret és CDR-aminosavszekvencia homológia mértéke százalékban kifejezve Cynomolgus 15-ös klón

	Humán W	Humán D	Nyúl	Egér
FR1	95,7	95,7	52,2	47,8
CDR1	72,7	27,3	36,4	36,4
FR2	73,3	86,7	66,7	60,0
CDR2	71,4	42,9	71,4	28,6
FR3	90,6	96,9	78,1	78,1
CDR3	22,2	22,2	0,0	33,3
FR4	80,0	70,0	60,0	70,0

HU 220 355 Β

Claims (27)

1. Eljárás főemlős rekombináns ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) kiválasztunk egy kívánt ellenanyag expresszálására képes főemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;

(ii) a sejtvonalból mRNS-t izolálunk, és az mRNS-t elválasztjuk a többi így izolált RNS-től;

(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a cDNS-t egy klónozási vektorba inszertáljuk;

(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;

(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re;

(vi) a cDNS-t inszertáljuk egy expressziós vektorba;

(vii) egy gazdasejtet transzferálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral, és (viii) a transzfektált gazdasejtet tenyésztjük, és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő sejtvonalból indulunk ki.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás csimpánz vagy óvilágimajom-ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő sejtvonalból indulunk ki.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy óvilágimajom-ellenanyagként cynomolgus ellenanyagot állítunk elő.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy betegségből felgyógyult vagy a betegség remissziós stádiumában levő egyedtől nyert limfocitákból állítjuk elő.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy kórokozó organizmussal fertőzött, daganatos betegségben vagy autoimmun betegségben szenvedő, de a betegség teljes tünetegyüttesét nem mutató egyéntől nyert limfocitákból állítjuk elő.

7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat vírussal fertőződött egyéntől nyeljük.

8. Az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy antigénnel vakcinázott vagy beoltott és arra ellenanyag-termeléssel válaszoló egyéntől nyert limfocitákból állítjuk elő.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat stabilizáljuk vagy folyamatos szaporodásúvá tesszük.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat egy kívánt antigén elleni ellenanyag termelésének vizsgálatával választjuk ki.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat az ellenanyag működőképességére nézve tovább válogatjuk.

12. Eljárás egy rekombináns ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) körülbelül 1000 sejtből mikro-RNS-készítményt állítunk elő;

(ii) méret szerint válogatott cDNS-génkönyvtárat készítünk;

(iii) a génkönyvtárat átvizsgáljuk a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re, és ez utóbbit izoláljuk;

(iv) a nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-t egy expressziós vektorba inszertáljuk;

(v) egy gazdasejtet transzfektálunk a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral és (vi) a transzfektált gazdasejteket tenyésztjük és a kívánt ellenanyagot izoláljuk.

13. Eljárás főemlős-ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) kiválasztunk egy kívánt ellenanyag expresszálására képes főemlőslimfocita-eredetű sejtvonalat;

(ii) a sejtvonalból mRNS-t izolálunk, és az mRNS-t elválasztjuk a többi így izolált RNS-től;

(iii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a cDNS-t egy klónozási vektorba inszertáljuk;

(iv) egy gazdasejtet transzformálunk a cDNS-t tartalmazó vektorral génkönyvtár előállítása céljából;

(v) a génkönyvtárat átvizsgáljuk az ellenanyag nehéz és könnyű láncokat kódoló cDNS-re, és ez utóbbit izoláljuk.

14. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy valamely a 13. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-t tartalmaz.

15. Eukarióta sejtvonal, azzal jellemezve, hogy egy a 14. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzfektálva.

16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitisvírus elleni rekombináns ellenanyagot állítunk elő.

17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitisvírus elleni humán rekombináns ellenanyagot állítunk elő.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatitis A-vírus elleni rekombináns ellenanyagot állítunk elő.

19. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként eukarióta sejtvonalat alkalmazunk.

20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem humán főemlős rekombináns ellenanyagot állítunk elő.

21. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot, valamint a gyógyszergyártásban szokásos hígító- vagy hordozóanyagot tartalmaz.

22. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy humán főemlős-ellenanyagot tartalmaz.

23. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy nem humán főemlős-ellenanyagot tartalmaz.

24. A 23. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy csimpánz- vagy óvilágimajomellenanyagot tartalmaz.

25. Eljárás vírusfertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal

HU 220 355 B jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígítóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

26. Eljárás daganatos megbetegedés kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított főemlős rekombináns ellenanyagot a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

27. Eljárás Rh-negatív egyén Rh-D antigénnel való találkozásának kezelésére vagy megelőzésére szolgáló

5 gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított humán rekombináns ellenanyagot a gyógy szergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítmény10 nyé alakítunk.