HUT77342A

HUT77342A - Immunoszupresszív aktivitással rendelkező monoklonális antitest fragmensek

Info

Publication number: HUT77342A
Application number: HU9702311A
Authority: HU
Inventors: Zoltan Nagy; Damir Vidovic
Original assignee: F.Hoffmann-La Roche Ag.
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-11-25
Publication date: 1998-03-30
Also published as: TR199501542A2; MA23739A1; CZ172497A3; EP0787151A1; JP2001506122A; MX9704225A; NO972522L; CN1168679A; IL116228A0; PL320610A1; FI972430A0; CA2206471A1; WO1996017874A1; BR9509902A; AR002005A1; NO972522D0; AU4256096A; PE52996A1; CO4480041A1; ZA9510195B

Description

A II. osztályba tartozó fő hisztokompatibilis komplex (MHC) molekulák az antigén peptid fragmenseket megkötik és a helper (CD4⁺) T sejtek („Th cells) (Ref. 1) számára hozzáférhetővé teszik. A II. osztályba tartozó MHC molekulákra specifikus monoklonális antitestek (mAb) in vitro a Th sejtválaszok rendkívül potens szelektív inhibitorai (Ref.2). Ezeket az anyagokat felfedezésük óta autoimmun rendellenességek (pl. reumatoid arthritis) szelektív immunoszupresszív kezelésére szolgáló potenciális gyógyszernek tekintik. Kezdeti in vivő vizsgálatok kimutatták, hogy ezek a monoklonális antitestek Th-sejt által közvetített hetero- és autoimmun válaszokra kedvező hatást fejtenek ki (Ref. 3-6). Bizonyos esetekben azonban a

II. osztályba tartozó MHC-specifikus monoklonális antitestek in vivő alkalmazása váratlan komplikációkkal járt és ez a laboratóriumi prímátok halálához vezetett (ref. 7,8). E megfigyelés miatt az MHC-specifikus monoklonális antitestek által előidézett immunomoduláció iránti érdeklődés háttérbe szorult. Nemrégen megjelent közleményben leírták, hogy a II. osztályba tartozó MHC kifejezés 10szeres csökkentése transzgenetikus egérben a nemhatékony antigén jelenlét következtében a Th sejtekre való reagálás hiányát idézi elő (Ref. 19). Ez igazolja, hogy a II. osztályba tartozó MHC kifejezés csökkentése in vivő modellben az immunoszupresszióval összefügg.

Találmányunk értelmében meglepő módon azt találtuk, hogy a HLA-DR kifejezés alulszabályozására képes egyértékű monoklonális antitest fragmensek (Fab) önmagukban képesek az ilyen HLA-DR kifejezés alulszabályozására, • · · · anélkül, hogy a monoklonális antitestek vagy kétértékű fragmenseik (F(ab)'2) citotoxicitását mutatnák. A találmányunk szerinti Fab fragmensek citotoxikus mellékhatások nélküli potens II. osztályba tartozó MHC-specifikus immuno-szupresszív vegyületek.

Találmányunk részletes ismertetése előtt az alábbiakban közöljük az ábrák magyarázatát.

1. ábra. DR kötődő kompétitor peptidek és DR-specifikus mAb hatása EBV transzformált Priess B sejtvonalra .

2. ábra. L243 mAb LG2-re kifejtett modulációs és citotoxikus hatásainak időben lefolyása.

3. ábra. L243 LG2-re kifejtett modulációs és citotoxikus hatásainak időtartama, mAb eltávolítása után.

4. ábra. HLA-DR kifejezés alulszabályozása különböző APC populációkon, DR specifikus mAb L243-el és fragmenseivel történő együttes tenyésztés után.

5. ábra. DR specifikus Fab fragmens emelkedő koncentrációinak hatása EBV transzformált B LG2 sejtvonalra .

6. ábra. L243 és fragmensei hosszabb időn át végzett együttes tenyésztésének hatása LG2 sejtekre.

7. ábra. EBV-LCL citotoxicitás dependenciája DR térhálósodáson.

8. ábra. DR alulszabályozás szelektivitása nyugalomban levő B sejteken és monocitákon/makrofágokon.

9. ábra. DR alulszabályozás szelektivitása B sej tblasztokon.

10. ábra. DR alulszabályozás szelektivitása LG2 sej teken.

·· · ·

11. ábra. DR alulszabályozás allotip szelektivitásának hiánya mAb által.

12. ábra. Pan II osztályú alulszabályozás TS-10 sejteken 1-1C4 Fab által.

13. ábra. TNFa kiválasztás növekedés hiánya LG2 és Priess sejtekkel, valamint L243-al és fragmenseivel történő együttes tenyésztés hatására.

14. ábra. Th sejt gátlás és DR alulszabályozás antitest koncentráció igénye.

15. ábra. Anti-DR mAb és Fab fragmensek hatása rögzített APC által rendelkezésre bocsájtott antigénekre.

16. ábra. Antigén terhelés hatása mAb, Fab és peptid antagonisták hatáserősségére.

17. ábra. Fab és peptid relatív hatásai antigén dózisreagálás-görbékre.

18. ábra. II. osztályba tartozó antagonisták hatása folyamatban levő Th sejt válaszra.

HLA-DR-re [„DR típusú Humán Leukocita Antigén; II. osztályba tartozó Fő Hisztokompatibilis Komplex („MHC) molekula] specifikus bizonyos monoklonális antitestek (mAb-k) antigéneket tartalmazó sejtként („APC) működő leukociták felületén a HLA-DR molekulák kifejezésének kb. 90 %-os alulszabályozására képesek. Ezek a monoklonális antitestek egyúttal azon humán Th sejt kiónok aktivitását is gátolják, amelyek az aktiváláshoz a HLA-DR molekulák által rendelkezésre bocsájtott antigén jelenlétet igénylik. Ezen monoklonális antitestek gátló aktivitása a jelenleg rendelkezésre álló peptid antagonisták aktivitásánál néhány százszor-néhány ezerszer magasabb (lásd alábbi 1. táblázat). A HLA-DR kifejezés • · » · fenti alulszabályozása és a Th sejtek aktivitásának fentemlített gátlása immuno-szupressziót előidéző farmakológiai aktivitás. Ez az immunoszupresszió autoimmun betegségek (különösen reumatoid arthritis) kezelésénél hasznos szerepet játszik.

Találmányunk szerint meglepő módon azt találtuk, hogy HLA-DR kifejezés alulszabályozására képes monoklonális antitestek egyértékű antigén-megkötő fragmensei (Fab) maguk is képesek az ilyen HLA-DR kifejezés alulszabályozására anélkül, hogy a monoklonális antitestek vagy kétértékű fragmenseik (F(ab)^f2) citotoxicitását mutatnák. A találmányunk szerinti Fab fragmensek ezért citotoxikus mellékhatásokat nem mutató potens II. osztályba tartozó MHC-specifikus immunoszupressziv vegyületek.

Találmányunk tárgya ennek megfelelően valamely anti-HLA-DR mAb Fab fragmense, mimellett az intakt mAb az antigént tartalmazó sejtekkel szemben citotoxikus, és a maradék antigént tartalmazó sejtek HLA-DR kifejezését alulszabályozza. Az ilyen mAb a Th sejtaktivitást gátolja. Valamennyi monoklonális antitest, amelyekből a találmányunk szerinti Fab fragmenseket leszármaztatjuk, a HLA-DR első tartományához kötődik.

A találmányunk szerint felhasználható alulszabályozó monoklonális antitestek közül példálódzó jelleggel az alábbiakat említjük meg:

LB3.1 (egér IgG2k>/ pan-DRal-specifikus; ref. 9-10); L243 (egér IgG2az pan-DRal-specifikus; ref. 10-11);

ATCC No. HB55); és • *· ·

SFR3-DR5 (patkány IgG2b/ DRBl*110X-specifikus; ref. 13; ATCC No. HB-151).

Ezenkívül a HLA-DQ-t és -DP-t is alulszabályozó valamely HLA-DR alulszabályozó 1-1C4 monoklonális antitestet (egér IgG2az β-lánc specifikus; ref. 14) a 22. példában leírt módon szokásos módszerekkel készítünk el. Találmányunk a fenti monoklonális antitestek Fab fragmenseire is kiterjed.

A monoklonális antitestek alulszabályozó aktivitásával és a Th sejtaktivitás gátló hatásával összhangban 5 nem-alulszabályozó monoklonális antitest a Th sejtaktivitást csupán nagyon gyengén vagy egyáltalán nem gátolja. Ezek az alábbiak: CCCL20 (egér IgG2b, három DRB1 (β-lánc) formára specifikus (DRBl*0101, DRB1*O4O1, DRBl*0404); ref. 12) és 8D1, 9F1, 9F2, 10F12 (mind a négy egér IgGl).

Az aktív monoklonális antitestek B limfoblasztoid sejtekkel szemben és kis mértékben normál aktivált B sejtekkel szemben citotoxikusak. A monoklonális antitestekhez hasonlóan ezek kétértékű F(ab)^f2 fragmensei az alulszabályozást közvetítik, azonban ugyancsak citotoxikusak. Találmányunk értelmében azonban a fenti monoklonális antitestek egyértékű Fab fragmensei a citotoxicitást elvesztik, ugyanakkor azonban meglepő módon a szülő monoklonális antitest alulszabályozó tulajdonságait megtartj ák.

A találmányunk szerinti Fab fragmensek készítéséhez felhasznált anti-HLA-DR monoklonális antitesteket bármely szokásos módszerrel termelhetjük, így pl. általában az először Kohler és Milstein által leírt eljárás segítségével. Egérbe, patkányba, nyúlba, bárányba vagy hasonló állatba (előnyösen egérbe) antigént befecskendezve monoklonális antitesteket készítünk oly módon, hogy az immunizált állatból az antitesteket termelő sejteket kinyerjük és az így nyert sejteket szokásos módszerekkel immortalizáljuk. Az immortalizálás pl. myeloma sejtekkel történő fúzióval végezhetjük el, pl. PAI egér myeloma sejtek, SP2/0- vagy SP2/0-Agl4 sejtek (ATCC No. CRL 1581; ATCC No. CRL 8287) [lásd antitestek termelésére szolgáló általános irányelvek pl. „Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow & Lee, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]. Az ilyen hibridómák tenyészetének felülúszóit szokásos módszerekkel (pl. radioimmun-, enzimimmun- vagy dot-immuno-kötődés vagy immunofluoreszcencia teszt) monoklonális antitestekre screeneljük. A monoklonális antitesteket a hibridóma felülúszókból szokásos kromatográfiás módszerekkel tisztíthatjuk (pl. ioncserélő kromatográfia; szilárd hordozóhoz kötött A-fehérj én antiimmuno-globulin-antitesteken vagy az antigénen vagy valamely részén végzett affinitás kromatográfia; HPLC stb.). A találmányunk szerint felhasználható monoklonális antitestek termelését a 22. példában mutatjuk be.

Nagymennyiségű monoklonális antitest termelése céljából az irodalomból jólismert módszerek szerint a kívánt antitestet kiválasztó hibridomákat előkezelt (pl. pristannal) egerekbe intraperitoniálisan befecskendezzük. Egy egérben kialakuló aszcitikus tumorokból kb. 100 mg-ig terjedő mennyiségű monoklonális antitest termelhető. A monoklonális antitesteket a tumorok által termelt aszcitikus folyadékból a fentiekben leírt módszerekkel tisztíthatjuk.

A monoklonális antitestek alosztályuk szerint ismert módszerekkel jellemezhetők (pl. Ouchterlony immunodiffúzió). Ismeretes továbbá az irodalomból, hogy monoklonális antitestek különböző felhasználásokhoz módosíthatók vagy antigének megkötésére még képes fragmenseik képezhetők. Az ilyen fragmenseket pl. oly módon képezhetjük, hogy a monoklonális antitesteket papainnal, pepszinnel stb. történő enzimes emésztésnek vetjük alá.

Találmányunk szerint monoklonális antitestek készítésére immunogénként előnyösen HLA-DR β-láncot alkalmazhatunk [WO92/10589; J. Bioi. Chemistry 262, 8748-8758 (1987)]; a szekvenciára vonatkozó információk szekvencia adatbankokból is beszerezhetők, mint pl. Genbank (Intelligenetics, California, USA) European Bioinformatics Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB) NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA és Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Medision, Wisconsin, USA) . Az ilyen szekvenciák az irodalomból ismert módszerekkel használhatók fel antigén termelésre; a találmányunk szerint alkalmazható monoklonális antitestek készítésénél, ezeket szokásos módszerekkel (pl. SDS-PAGE) tisztítjuk.

Az APC-vel szemben citotoxikus és HLA-DR kifejezés alulszabályozására képes fentiekben leírt anti-HLA-DR monoklonális antitestek azonosítását bármely szokásos módszerrel elvégezhetjük. Az anti-HLA-DR monoklonális antitestek azonosítását előnyösen a 3. példa szerint hajthatjuk végre; ennek során APC (különösen aktivált B sej9

tek) modellként Epstein-Barr Vírus által transzformált humán B-limfoblaszt sejtvonalat (EBV-LCL) alkalmazunk. Előnyösen legalább 1 ml, kb. 10⁵ EBV-LCL sejt/ml tartalmazó tenyészeteket alkalmazhatunk. A tenyészetet 20 nM anti-HLA-DR monoklonális antitesttel 16 órán át inkubáljuk, majd az elpusztult sejtek számát és a megmaradt életképes sejtek által előidézett HLA-DR kifejezést szokásos módon meghatározzuk. Találmányunk szempontjából a citotoxicitást és alulszabályozást a következőképpen határozzuk meg:

1) A monoklonális antitestet akkor tekintjük az antigént tartalmazó sejttel szemben citotoxikusnak, ha a fenti körülmények között az intakt monoklonális antitest az EBV-LCL antigént tartalmazó sejtek legalább 25 %át, előnyösen 40 %-át elpusztítja; és

2) a monoklonális antitestet akkor tekintjük az antigént tartalmazó sejteken HLA-DR kifejezést alulszabályozónak, ha a fenti körülmények között az életben maradt EBV-LCL antigént tartalmazó sejtek felületén a HLA-DR molekulák számát átlagosan kb. 50 %-kal csökkenti.

Az EBV-LCL antigént tartalmazó sejteket az elpusztult sejtek kimutatása és a megmaradt életképes sejteken a HLA-DR kifejezés mérése céljából szokásos immunofluoreszcencia segítségével jelezzük. A sejteket áramlás citométer (pl. FACScan, Becton-Dickinson, San Jose, California) felhasználásával analizáljuk és az elpusztult sejtek százalékát, valamint a megmaradt sejteken a HLD-DR kifejezés csökkenését szokásos módszerekkel kiszámítjuk, előnyösen az áramlás citométerben (pl. LYSIS ható. A közül pl.

II software FACScan citométerrel) általánosan használt software felhasználásával.

A kívánt tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitestekre történő screeneléshez felhasznált EBV-LCL megválasztása nem döntő jelentőségű tényező. Találmányunk szerint bármely szokásos EBV-LCL felhasználtalálmányunk szerint alkalmazható EBV-LCL-k az alábbiakat említjük meg; Priess (ECACC

Salisbury, UK No. 86052111), LG2 (Istituto Nazionale Per La Ricerca Sül Cancro (Genova, Italy) No. G201 12301) és TS-10 (ECACC (Salisbury, UK) No. 85102911).

A fentiekben leírt monoklonális antitestek Fab fragmenseit bármely szokásos módszerrel termelhetjük. A Fab fragmenst oly módon termelhetjük, hogy a szülő monoklonális antitestet pepszinnel emésztjük és a Fab fragmenseket az irodalomból ismert módszerekkel izoláljuk (pl. Andrew és Titus, „Fragmentation of immunoglobulin G, Current Protocols in Immunology, Coligan et al., kiadó (Greene & Wiley 1994).

Fentiek értelmében találmányunk továbbá a fenti eljárásokra, valamint a fenti eljárásokkal előállított Fab fragmensekre is kiterjed.

A találmányunk szerinti Fab fragmenseket előnyösen a kívánt Fab fragmenst kódoló gént kifejező rekombináns sejtvonal segítségével termelhetjük. Az ilyen rekombináns sejtvonalakat bármely szokásos módszerrel termelhetjük. így pl. a Fab fragmenst kódoló gén egy részletét a Fab fragmens szülő monoklonális antitestét kiválasztó hibridómából szokásos módon klónozzuk. Ezután a Fab fragmens cDNS-t szokásos módon valamely kifejező vek11 torba építjük be, amelyet megfelelő sejtvonal transzfektálására használunk fel.

A találmányunk szerinti előnyös Fab fragmensek „humanizáltak, azaz embernek beadva kevésbé antigének, mint az állat (előnyösen egér vagy patkány) monoklonális antitestből közvetlenül termelt Fab fragmens. A találmányunk szerinti Fab fragmensek humanizálására felhasznált módszer megválasztása nem döntő jelentőségű tényező, e célra az irodalomból ismert bármely szokásos módszer felhasználható. Az ilyen módszerek azt a tényt használják fel, hogy bármely immunoglobulin lg (pl. monoklonális antitest) konstans tartományból és az antigén kötődés helyéül szolgáló változó tartományból áll. A változó tartomány egy kerettartományba beágyazott 6 komplementeritást meghatározó tartományból („CDR) áll (3-3 CDR az lg könynyűláncán és nehézláncán; Ref. 42) . A monoklonális antitest specifikusságáért a CDR-ek felelősek. Minthogy a monoklonális antitestek egér, patkány vagy más állatfaj eredetűek, a monoklonális antitestek humanizálását lényegében oly módon végezzük el, hogy a humán immuno-globulin legalább egy - előnyösen mind a hat - CDR-jét a kívánt specifikussággal rendelkező állati monoklonális antitest megfelelő CDR-jével helyettesítjük. Ezáltal a humán lg az állati CDR-ek keretének szerepét tölti be. A fenti eljárásoknál az állati - előnyösen egér vagy patkány - monoklonális antitestet „donor-nak és a humán Ig-t „akceptor-nak nevezzük.

A humanizált monoklonális antitest aminosavszekvenciájának további „finombeállítását az irodalomban leírt módon, a humanizált monoklonális antitest antigén • · specifikusságának optimalizálása céljából végezhetjük el. így pl. a WO 90/7861 sz. nemzetközi közrebocsájtási irat szerint egy 10-20 humán Ig-ből álló panelt screenelünk, és akceptorként azt a humán Ig-t alkalmazzuk, amelynek a változó tartománya az egér vagy patkány donor monoklonális antitest változó tartományával a legnagyobb mértékű homológiát mutat, éspedig általában 65-70 %-ban vagy nagyobb mértékben homológ. Az akceptor aminosavak további donor aminosavakkal történő helyettesítése (általában kb. három helyettesítés) a CDR-en kívül végezhető el, a WO 90/7681 sz. nemzetközi közrebocsájtási irat 12-15. oldalán leírt négy követelmény alapján.

A 620 276 sz. európai szabadalmi leírásban a humanizációs eljárás másik példáját ismertetik. Ebben a szabadalmi leírásban az egyes helyettesítések hiearchiáját írják le, amelyeket az akceptor Ig-en a beojtott donor CDR-en kívül, a humanizált monoklonális antitest specifikusságának növelése céljából végzünk el. E helyettesítések segítségével fölöslegessé válik a donor monoklonális antitest változó tartományával magasfokú homológiát mutató változó tartománnyal rendelkező humán akceptor lg kiválasztása. A humanizálás specifikus jegyzőkönyve a 620 276 sz. európai szabadalmi leírás 8-9. oldalán került ismertetésre.

A találmányunk szerinti Fab fragmensek előállításánál felhasználható, humanizált intakt monoklonális antitest gazdasejtjében kifejezhető DNS szekvenciák kialakítására szolgáló módszerek, vagy a találmányunk szerinti humanizált Fab fragmens kifejezésére szolgáló eljárások megválasztása nem döntő jelentőségű tényező. Az ··· · • · ilyen módszerek közül pl. az alábbiakat említjük meg: helyreirányított mutagenézis; az egész változó tartomány felépítése az állati CDR-eket humán keretbe beépítő átlapoló oligonukleotidok felhasználásával; és PCR beojtás (WO 90/7861, EP 0 620 276, Ref. 43) .

Találmányunk tárgya továbbá valamely immunoglobulin Fab fragmenst és ebben az immunoglobulin Fab fragmensben 6 komplementeritást meghatározó tartományt tartalmazó Fab fragmens, mimellett a fenti komplementeritás-meghatározó tartományok közül egy-hat az alábbi tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitest komplementeritás-meghatározó tartománya/i/:

1) a monoklonális antitest a HLA-DR első tartományához kötődik;

2) a monoklonális antitest a HLA-DR-t kifejező antigént tartalmazó sejtekkel szemben citotoxikus;

3) a monoklonális antitest az antigént tartalmazó sejteken a HLA-DR kifejezést alulszabályozza.

Találmányunk előnyös kiviteli alakja az olyan humanizált Fab fragmens, amelynél - a fentieknek megfelelően - az immunoglobulin Fab fragmens humán és az 1-3. tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitest állati, előnyösen egér vagy patkány. Ez a humanizált Fab fragmens olyan humán immunoglobulin Fab fragmens, amelyben a bennelevő CDR-ek közül egy-hat az állati monoklonális antitest megfelelő CDR-jével van helyettesítve. A találmányunk szerinti előnyös Fab fragmens tehát valamely humán immunoglobulin Fab fragmenst és ezen humán immunoglobulin ·· ···· • ·

Fab fragmensben hat komplementeritás-meghatározó tartományt tartalmaz, mimellett a fenti komplementeritás-meghatározó tartományok közül egy-hat a fenti 1-3. tulajdonsággal rendelkező monoklonális antitest komplementermeghatározó tartománya/i/.

A találmányunk szerinti humanizált Fab fragmens előnyösen az állati mAb mind a hat CDR-jét tartalmazza.

Amennyiben az immunoglobulin Fab fragmens állati eredetű, úgy a találmányunk szerinti Fab fragmens az 1-3. tulajdonsággal rendelkező monoklonális antitest Fab fragmense lehet. Az ilyen Fab fragmens közbenső termékként használható a találmányunk szerinti előnyös humanizált Fab fragmensben levő állati CDR-ek előállításánál.

A találmányunk szerinti előnyös Fab fragmensek tulajdonságai a fentiekben leírt LB3.1, L243, SFR3-DR5 és 1-1C4 monoklonális antitestekből kapott Fab fragmensekhez hasonlóak. Minthogy a találmány szerinti Fab fragmensek a Th sejt aktiválódást gátolják, eredményesen alkalmazhatók olyan betegségek kezelésénél, amelyekben aktivált Th sejtek a betegség, károsodás vagy tünetek forrásai. Ilyen betegség pl. a reumatoid arthritis (Ref. 33). Reumatoid arthritisben szenvedő betegen a HLA-DR alulszabályozása és ezáltal a Th sejt aktiválódás gátlása a betegség előrehaladását lassítja vagy megállítja. Reumatoid arthritisben szenvedő betegben a Th sejt aktiválódás gátlása a tüneteket (pl. fájdalom és gyulladás) enyhíti, a tüneteket előidéző közvetítő anyagok felszabadulásának csökkentése vagy leállítása által.

Találmányunk tárgya továbbá a fentiekben leírt Fab fragmens és annak gyógyászati hatóanyagként, különö···· • · sen immuno-szupresszív gyógyszerként történő felhasználása, különösen reumatoid arthritis kezelésére.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás immunválasz visszaszorítására oly módon, hogy a kezelésre rászoruló betegnek gyógyászatilag hatékony mennyiségben valamely találmányunk szerinti Fab fragmenst adunk be.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás reumatoid arthritis kezelésére oly módon, hogy a betegnek gyógyászatilag hatékony mennyiségben valamely találmányunk szerinti Fab fragmenst adunk be.

A Fab fragmens beadagolandó mennyiségét szokásos módszerekkel határozzuk meg. A találmányunk szerinti Fab fragmens beadása szintén szokásos módszerekkel történik.

A találmányunk szerinti Fab fragmenst gyógyászati készítmények formájában alkalmazzuk. Találmányunk tárgya továbbá hatóanyagként valamely találmányunk szerinti Fab fragmenst tartalmazó gyógyászati készítmény. A gyógyászati készítmények parenterálisan (szubkutáns, intramuszkuláris vagy intravénás úton, előnyösen intravénásán) adagolhatok. A Th sejt aktiválás gátlásához és ezáltal a reumatoid arthritis kezeléséhez szükséges dózist szokásos módszerekkel határozhatjuk meg, pl. dóziskorlátozó klinikai vizsgálatokkal. Előnyösen kb. 1-10 mg/nap i.v., különösen kb. 3-7 mg/nap, különösen előnyösen kb. 5 mg/g nap dózist alkalmazhatunk (Ref. 34, 35), előnyösen bólus alakjában. A kezelést előnyösen 1 héten át vagy rövidebb ideig naponta egyszer végezzük, azonban szükség esetén a naponta történő kezelés három héten át is folytatható.

··· · ·«·· ·

A találmányunk szerinti Fab fragmenseket folyékony gyógyászati készítmények formájában is alkalmazhatjuk, pl. parenterális adagolás esetén. Ezek a készítmények a találmányunk szerinti Fab fragmenst szokásos gyógyászatilag alkalmas folyékony hordozóanyagban oldva tartalmazzák. A készítmény további gyógyászati hatóanyagokat is tartalmazhat. A készítmény előnyösen kb. 0,5-5 mg/ml, különösen előnyösen kb. 1-2 mg/ml találmányunk szerinti Fab fragmenst tartalmazhat. Folyékony hordozóanyagként előnyösen steril fiziológiás konyhasó-oldat alkalmazható .

Az 1-7. példában feltüntetett eredmények igazolják, hogy a Th sejt aktiválódás HLA-DR-specif ikus monoklonális antitest által történő gátlása több hatás együttes kifejtése révén jön létre:

a. ) a rendelkezésre álló APC kiküszöbölése közvetlen citotoxicitás által;

b. ) a rendelkezésre álló HLA-DR molekulák csökkentése a maradék életképes APC-n, a sejtfelület kifejezés alulszabályozása által;

c. ) a II. osztályba tartozó MHC-TcR interakció gátlása.

A Th sejtgátlást az is előidézheti, hogy a monoklonális antitest a DR molekulán a peptidet megkötő mélyedést blokkolja és ezáltal az antigén (30) számára hozzáférhetetlenné teszi. Fentiek alapján érthetővé válik, hogy a monoklonális antitestek miért rendelkeznek a rendelkezésre álló peptid antagonistákat felülmúló Th sejt gátló tulajdonságokkal; az ismert peptid antago• · nisták hatása ugyanis kizárólag a HLA-DR molekulák antigén kötőhelyének blokkolásán alapul.

Az antitest által kifejtett citotoxicitás és II. osztályba tartozó alulszabályozás mechanizmusa további vizsgálatokra szorul. Mindenesetre nyilvánvaló, hogy a citotoxicitás térhálósodást igényel, és az alulszabályozás a találmányunk szerinti egyértékű Fab fragmensek segítségével a szülő monoklonális antitest citotoxicitása nélkül is elérhető. Ez az eltérés lehetővé teszi a fenti két tulajdonság antitest fragmentáció által történő szétválasztását. Annak feltételezésével, hogy II anti-osztályba tartozó antitestek korábban megfigyelt mellékhatásai (Ref. 7,8) legalább részben közvetlen citotoxicitásal társulnak, a találmányunk szerinti Fab fragmensek lehetővé teszik ezen antitestek immuno-szupresszánsként történő gyógyászati felhasználását káros mellékhatások nélkül.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

1. példa

Anti-DR mAb izotipikus specifikussága

A monoklonális antitestek pontos specifikusságát oly módon határozzuk meg, hogy mérjük a humán HLA II. osztályba tartozó génekkel transzfektált egér sejtvonalakat megfestő képességüket.

Módszer:

A megadott humán II. osztályba tartozó génekkel (15) transzfektált egér fibroblaszt vonalakat és nemtranszfektált gazdasejteket (Lmtk^-) standard közvetett • · · ··· immunofluoreszcenciával megfestünk, primer illetve szekunder reagensként DR-specifikus mAb FITC konjugált kecske-anti egér lg [Southern, Birmingham, Alabama] felhasználásával. A mintákat FACScan áramlás citométeren (Becton-Dickinson, San Jose, California) analizáljuk. Az eredményeket az 1. Táblázatban ismertetjük. „+ és az antitest-kötődés jelenlétét vagy hiányát jelzi; „NT=nem teszteltük.

Következtetés:

A 8D1, 9F1, 9F2 és 10F12 antitestek pan-DR specifikusak, míg az 1-1C4 mind a három humán II. osztályba tartozó izotipust (DR, DP és DQ) felismeri.

·· ··· • · · ·· ··* pan-DR-specifikus mAb megfestés! profilja

«· · · ··· ·

Táblázat (folytatás)

··' ί

2. példa

Anti HLA-DR monoklonális antitestek lánc és tartomány specifikussága

Módszer:

Standard gén klónozási, rekombinációs és transzfekciós technológia (10) felhasználásával kimer humán/egér II osztályba tartozó molekulákat kifejező két egér B sejtvonalat készítünk. Az egér II. osztály-negatív M12.C3 (15) sejtvonalból leszármaztatott M12C3.25 transzfektáns azt az MHC terméket fejezi ki, amely a humán HLA-DRA*0101/DRB1*0401 molekulából leszármaztatott al és βΐ tartományból, valamint a DR-specifikus reagenst meg nem kötő egér IE fehérje a2 és β2 tartományából áll. Az egér II. osztály-pozitív CH27 sejtvonalból (16) leszármaztatott CH27.105 transzfektáns a fentiekben leírt kimer humán/egér a lánccal asszociált eredeti egér Εβ láncot kifejezi. A standard közvetett immuno-fluoreszcencia megfestést a megadott IgG2 és IgGi antitest felhasználásával, fehérje A-FITC-vel (Boehringer, Mannheim, Germany), illetve kecske anti-egér IgGi-FITC-vel (Southern, Birmingham, Alabama) együtt végezzük el. A mintákat FACScan áramlás citométeren (Becton-Dickinson, San Jose, California) elemezzük. Az eredményeket a 2. Táblázatban ismertetjük. A szimbólumok illetve rövidítések jelentése az 1. Táblázatnál megadott.

·<· · · ·* ·

Következtetés :

Az eredmények az LB3.1 és L243 korábbiakban közölt DRal specifikusságát (10) alátámasztják. A 8D1 és 1-1C4 antitest βΐ-specifikus, míg a CCCL20 által felismert epitóp β2 tartomány-dependensnek tűnik. Úgy tűnik, hogy a maradék reagensek (9F1, 9F2, 10F12) megfelelő epitópja ezen transzfektánsok felhasználásával nem térképezhető fel, mert a SFR3-DR5 a DRBl*0401 allotipust nem ismeri fel.

·*·

Anti-DR mAb kötődése kimer humánN w

c (0

4-1

Cl

Ü

CM

·.· ♦·· • · .· ·.* <D

Αί a:

<u c

'Φ σ

'0

N

4-1

U

0» w

ki '4» ω

a

-j í-l cm

O! oe cm : »♦

5.

·—! O » · · · · · • · · • · · · · • · · • · · ·

Anti-DR monoklonális antitestek és fragmenseik hatása

HLA-DR kifejezésre és a sejt életképességre

A DR-kötődő kompetitor aXA peptiddel (17) vagy DR-specifikus mAb-val előtenyésztett, antigént tartalmazó sejtek DR kifejezését és életképességét olyan koncentrációban vizsgáljuk, amely aXA és két mAb (LB3.1, 1-1C4) esetében a Th sejtek antigén átadását blokkolja. Az APChez hasonlóan Epstein-Barr vírussal transzformált humán B-limfoblaszt sejtvonalat (EBV-LCL) alkalmazunk.

3. példa

DR megkötő kompetitor peptid és DR-specifikus mAb hatása EBV-LCL-re

Módszer:

EBV-LCL-t [Priess, ECACC (Salisbury, UK) No. 86052111) (10⁵ sejt/ml] DR-specifikus mAb (LB3.1, 1-1C4,

CCCL20) vagy aX-A peptid (aXAAAKTAAAAa-NH₂; ref. 17) jelenlétében, az 1. ábrán megadott koncentrációkban 16 órán át tenyésztünk. Ezután a sejteket mossuk és standard immunofluoreszcenciával, primer, illetve szekunder reagensként DR-specifikus mAb [LB3.1 (a), CCCL20 (b) , 1-1C4 (c)] és FITC-konjugált kecske-anti egér lg (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham) felhasználásával megfestjük. A mintákat FACScan áramlás citométeren (Becton-Dickinson, San Jose, California) elemezzük. Az eredményeket az 1. ábrán tüntetjük fel. A X-tengelyen a HLA-DR kifejezést és az Y-tengelyen a propidium-jodiddal megfestett elpusztult sejtek fluoreszcenciáját tüntetjük fel; mindkét tengelyen önkényes fluoreszcencia-egységeket • · ··· · ábrázolunk. A „háttér a normál táptalajban 16 órán át tenyésztett, majd primer reagens nélkül utólag jelzett kontroll sejtpopulációt jelenti.

Következtetés:

A aXA peptiddel (la ábra) végzett előtenyésztés a sejt életképességet vagy a DR kifejezést szignifikánsan nem befolyásolja; ezzel szemben a DR specifikus mAb LB3.1 (la ábra) és 1-1C4 (le ábra) magas citotoxicitást idéz elő és a maradék életképes sejteken a DR kifejezést csökkenti. A fenti tulajdonsággal azonban nem rendelkezik valamennyi anti-DR monoklonális antitest, minthogy a CCCL20 az életképességet és a DR kifejezést még magasabb koncentrációban sem befolyásolja (lb ábra).

DR-alulmodulálás és citotoxicitás EBV-LCL-n két további DR specifikus monoklonális antitesttel (L243 és SFR-DR5) előidézhető, míg négy további anti-DR monoklonális antitest (8D1, 9F1, 9F2 és 10F12) nem citotoxikus és a DR kifejezést sem csökkenti (az eredményeket nem tüntettük fel).

4. példa

L243 mAb modulációs és citotoxikus hatásainak időbeni lefolyása LG2-n

Módszer:

EBV-LCL LG2-t [Istituto Nazionale Per La Ricerca Sül Cancro (Genova, Italy) No. G201 12301) (10⁵ sejt/ml]

DR-specifikus L243 mAb (Becton-Dickinson) jelenlétében 10 nM koncentráció mellett a megadott ideig tenyésztünk. A sejteket ezután mossuk és standard közvetett immuno26 ·· fluoreszcenciával, primer illetve szekunder reagensként DR-specifikus mAb243 és FITC-konjugált kecske-anti egér lg (Southern, Birmingham, Alabama) felhasználásával megfestjük. Az elpusztult sejteket propidium-bromiddal megfestjük és a mintákat FACScan á-ramlás citométeren elemezzük. Az eredményeket a 2. ábrán tüntetjük fel. A hisztogrammok az elpusztult sejtek relatív számát (világos) és csökkent mennyiségű HLA-DR-t kifejező élő sejteket (sötét) jelentik.

Következtetés:

Kinetikus in vitro vizsgálatok két óra után kimutatható mAb citotoxicitást és 8 óra után plató toxicitást mutatnak. A DR aluszabályozás 4 óra után válik kimutathatóvá és a csúcsot 8 óra után éri el.

5. példa

L243 modulációs és citotoxikus hatásainak időtartama Lg2-n, a mAb eltávolítása után

Módszer:

EBV-LCL LG2-t (10⁵ sejt/ml) DR-specifikus mAb L243 (Becton-Dickinson) jelenlétében 10 nM koncentrációban a megadott ideig tenyésztünk. Az antitesteket háromszori mosással eltávolítjuk, majd a sejttenyészetet azonos térfogatú friss táptalajban ismét elkészítjük. A sejteket mossuk és standard közvetett immunofluoreszcenciával, primer illetve szekunder reagensként DR-specifikus mAb L243 és FITC-konjugált kecske-anti egér lg (Southern, Birmingham, Alabama) felhasználásával megfestjük. Az elpusztult sejteket propidium-bromiddal színezzük és a mintákat FACScan áramlás citométeren elemezzük. Az • · « eredményeket a 3. ábrán tüntetjük fel. A hisztogrammok az elpusztult sejtek relatív számát (világos) és csökkent mennyiségű HLA-DR-t kifejező élő sejteket (sötét) jelentik.

Következtetés:

Az antitest által indukált DR alulszabályozás az mAb eltávolítása után 16 órán át tart.

6. példa

HLA-DR kifejezés alulszabályozása különböző APC populációkon, DR specifikus mAb L243-al és fragmenseivel végzett együttes tenyésztés után

Tovább vizsgáljuk az anti DR mAb hatásait különböző transzformálatlan MHC II osztályba tartozó pozitív sejt alpopulációkon: nyugalomban levő és aktivált B sejteken, monocitákon/makrofágokon és aktivált Th sejteken. Módszer:

A B-sejteket és monocitákat/makrofágokat friss perifériás vérből olymódon izoláljuk, hogy a T-sejteket és a monocitákat vagy B sejteket (ahol lehetett) tenyésztés előtt eltávolítjuk, CD3-al (SK7) és CD14-el (ΜΦΡ9), illetve CD19-el (4G7) (Beckon-Dickinson) szemben specifikus mAb-vel előre bevont mágneses részecskék (Dynal) felhasználásával. A Th és B sejtblasztokat 3-5 napon át képezzük a perifériás mononukleáris vérsejtek fitohemagglutininnel (1 pg/ml; Sigma) és alkörmös mitogénnel (2,5 pg/ml Sigma) történő in vitro ingerlésével. L243-t a F(ab)^f2 és Fab fragmensek izolálása céljából pepszinnel, illetve papainnal emésztjük (lásd Ref. 18) . Az emésztet• · · • · len antitesteket és Fc frag-menseiket fehérje G oszlopon végzett affinitás kromatográfiával eltávolítjuk. APC-t (10⁵ sejt/ml) ekvivalens koncentrációjú teljes L243 antitest (10 nM) vagy F(ab)^f2 fragmense (10 nM) és Fab (20 nM) fragmens jelenlétében 16 órán át tenyésztünk, a 4. ábrán megjelölt módon. A sejteket ezután a 3. példában leírt módon mossuk és megfestjük. Az eredményeket a 4. ábrán tüntetjük fel. Az X-tengelyen a HLA-DR kifejezést, míg az Y-tengelyen a propidium-jodiddal megfestett, elpusztított sejtek fluoreszcenciáját tüntetjük fel, mindkettőt tetszőleges fluoreszcencia egységekben. A számok a megfelelő kvadránsokban levő sejtek százalékát jelölik. A „DR-FITC megfestés és „háttér FITC megfestés a normál közegben 16 órán át tenyésztett, majd primer reagens jelenlétében illetve anélkül utólag jelzett kontroll sejtpopulációt jelenti.

Következtetés:

Teljes mAb, valamint kétértékű és egyértékű F(ab)^f2 illetve Fab fragmensei jelenlétében a DR molekulák sejtfelület kifejezése valamennyi populációban csökken. A DR csökkenés mértéke B-sejtekben magas (80-90 %) , monocitikus APC-ben közepes (50-65 %) és Th-sejtblasztokban alacsony (50 %-nál kisebb). EBV-LCL és előaktivált V-sejtblasztok kétértékű anti-DR reagensekkel [teljes mAb és F(ab)'2 1 végzett együttes tenyésztése magas (60-70 %), illetve marginális (5-15 %) citotoxicitást eredményez, míg egyértékű fragmensek (Fab) csak alulszabályozást indukálnak, szignifikáns sejtpusztulás nélkül. A kísérletekben használt DR-specifikus mAb bármely formájával előinkubált nyugalomban levő B-sejtek, aktivált Th limfociták és monociták/makrofágok alpopulációiból a citosztatikus hatás teljesen hiányzik.

Teljes mAb 1-1C4 és LB3.1 és Fab fragmenseik felhasználásával hasonló profilokat kapunk (a következő szekciókban részben bemutatjuk). [Az LB3.1 antitest F(ab)^f2 fragmense nem képezhető, mert izotópja a papainos emésztést nem teszi lehetővé].

7. példa

DR specifikus Fab fragmens emelkedő koncentrációinak hatása EBV transzformált B sejtvonal LG2-re

Az egyértékű és kétértékű mAb reagensek citotoxicitásában jelentkező különbséget vizsgáljuk annak meghatározása céljából, hogy csupán mennyiségi eltérésről van-e szó, vagy minőségileg különböző hatásmechanizmusról beszélhetünk-e.

Módszer:

Lásd 3. és 6. példa. Az eredményeket az 5. ábrán tüntetjük fel; az értelmezés az 1. ábránál megadott.

Következtetés:

L243-Fab emelkedő koncentrációja az APC életképesség szignifikáns csökkenését nem idézi elő.

·· · · ··« «

···

8. példa

L243 és fragmensei hosszabb időn át végzett együttes tenyésztésének hatása LG2 sejtekre

Módszer:

APC-t [10⁵/ml] ekvivalens koncentrációjú teljes L243 antitest (10 nM) vagy Fab fragmense (20 nM) jelenlétében a megadott időtartamon át tenyésztünk. A sejteket ezután a 6. példában leírt módon mossuk és megfestjük. Az eredményeket a 6. ábrán tüntetjük fel. Az értelmezés a 2. ábránál megadott.

Következtetés:

Hosszabb időn át végzett együttes előtenyésztés az APC életképesség szignifikáns csökkenését nem idézi elő.

9. példa

EBV-LCL citotoxicitása a DR térhálósodástólfügg

Módszer:

EBV-LCL-t (Priess) [10⁵ sejt/ml] a sejtmembránhoz kötött Fab fragmensek térhálósítása céljából L243 Fab (20 nM) fragmensek és kecske anti-egér IgG előre bevont mágneses részecskék („anti-Ig; Dynal) jelenlétében 16 órán át tenyésztünk. A sejteket ezután a 6. példában leírt módon mossuk és megfestjük. Az eredményeket a 7. ábrán tüntetjük fel; az értelmezés az 1. ábránál megadott.

···« ·· ·9· · ·♦· ···

Következtetés :

A HLA-DR-kötött Fab térhálósítása EBV-LCL-n citotoxikus hatást idéz elő.

A fenti eredményekből az alábbi következtetések vonhatók le:

a) Bármely mononukleáris vérsejttipuson kifejezett HLA-DR specifikus mAb által történő ligáláskor alulszabályozható .

b) Egyértékű reagensekkel (Fab) végzett DR ligálás előre nem látható módon szintén DR alulszabályozáshoz vezethet.

c) Minthogy citotoxicitás csak EBV-n (aktivált B sejtek modellje) és mitogén előaktivált B sejteken jelentkezik, valószínűleg a B sejtek aktivált stádiumától függ; és

d) a citotoxicitás a kétértékű ligandok [teljes mAb és F(ab)^f2 térhálósított Fab] által előidézett DR-térhálósodás következménye, és nem igényli az antitest Fc részét.

Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy II. osztályba tartozó molekulák teljes mAb-val vagy T-sejt receptorokkal történő ligálása az APC-ben egy sor változást jelez, mint pl. citokin kiválasztást (Ref. 19-20), a sejtnövekedés és immunoglobulin kiválasztás modulálását (Ref. 21-28), a kostimuláció (Ref. 15) és a sejthez tapadó molekulák f elülszabályozását (Ref. 20, 29) és a CD23 alulszabályozását (Ref. 25). Fontos volt ezért annak megállapítása, hogy a DR kifejezés mAb-vel végzett előte32 nyésztéskor bekövetkezett csökkenése az antitest által ligáit II. osztályba tartozó molekulákra korlátozódik-e, vagy számos sejtfelület fehérje globálisan indukált alulszabályozásának része-e. HLA II. osztályú DP és DQ izotópok, HLA I. osztályba tartozó molekulák és egy MHC-vel nem összefüggő tapadó CD 18 fehérje analízisét L243 F(ab)^Z2 vagy Fab fragmenseivel végzett előtenyésztés után különböző ABC alpopulációkon végezzük el.

10. példa

PC alulszabályozás szelektivitása nyugalomban levő B sejteken és monocitákon/makrofágokon

Módszer:

A 6. példában leírtak szerint járunk el. Standard közvetett immunofluoreszcencia megfestést végzünk el HLA-DP-re [Klón B7/21], -DQ-ra (SK10) , CD18-ra (L130)-ra (valamennyi IgGi alosztály, Becton-Dickinson és I. osztályba tartozó anti HLA-ra (W6-32 IgG2a, Accurate, Westbury, New York) specifikus mAb reagensek felhasználásával, kecske anti-egér IgGi-FITC-vel, illetve FITCjelzett A-fehérjével (Boehringer) kombinálva. Ez az eljárás kizárja a maradék membránhoz kötött DR-specifikus antitest fragmens további közvetett FITC-jelzését. Az eredményeket a 8. ábrán tüntetjük fel, az értelmezés a 4. ábránál megadott. „Kontroll normál táptalajban 16 órát tenyésztett, majd A-fehérjével és FITC-konjugált kecske anti-egér IgGl-el együttesen jelzett sejtpopulációt jelent .

» · ·* · * · «

*·*

Következtetés:

Míg a DR molekulák csökkentett kifejezést mutatnak, addig a DP, DQ, I. osztályba tartozó és CD 18 molekulák mind nyugalomban levő B sejtekben, mind F(ab)^r2 fragmensekkel előtenyésztett monocitákban/makrofágokban változatlanok maradnak.

11. példa

DR alulszabályozás szelektivitása B sejt blasztokon

Módszer:

Lásd 10. példa. Az eredményeket a 9. ábrán tüntetjük fel; az értelmezés a 4. ábránál megadott. Következtetés:

Míg a DR molekulák alulszabályozottak, a DP, DQ, I. osztályba tartozó és CD18 molekulák F(ab)^f2 fragmensekkel előtenyésztett B sejtblasztokban változatlanok maradnak.

12. példa

DR alulszabályozás LG12 sejteken

Módszer:

Lásd 10. példa. Az eredményeket a 10. ábrán tüntetjük fel; az értelmezés a 4. ábránál megadott.

Következtetés:

Míg a DR molekulák kifejezése FAB által történő ligáláskor szelektíven csökkenni látszik, a kétértékű F(ab)^f2 fragmensek más II. osztályba tartozó izotipusok, I. osztályba tartozó molekulák és CD18 szignifikáns alulszabályozását indukálják. Minthogy a nemszelektív modulá► ·* · lás mindössze kétszeres és a DR csökkenés tízszeres, joggal feltételezzük, hogy az egyéb felületaktív molekulák kifejezésének csökkenése a kétértékű reagensek EBV-LCL-en kifejtett általános káros hatásával jár együtt.

13. példa

DR alulszabályozás roAb által előidézett allotip nemszelektivitása

A modulációs mAb LB3.1, L243 és 1-1C4 pan-DR specifikusak, azaz a HLA-DR különböző alléi formái között semmilyen megkülönböztetést sem mutatnak, ezért a DR alulszabályozás allotip specifikusságának tesztelésére nem alkalmasak. Felmerül azonban a DRBl*110X-re (korábban DR5; ref. 13) kizárólagosan specifikus alulszabályozó mAb SFR3-DR5 alkalmazásának lehetősége.

Módszer:

B sejteket (a 6. példában leírt módon, heterozigóta DRBl*0101/1101X donor friss perifériás véréből izoláljuk)DRBl*110X-specifikus mAb SFR3-DR5 (20 % hibridóma felülúszó folyadék; ref. 14) jelenlétében tenyésztünk. A sejteket ezután mossuk és standard közvetett immunofluoreszcenciával DRBl*110X-specifikus mAb SFR3-DR5 vagy DRBl*1101-specifikus mAb CCCL20 (12) felhasználásával kecske anti-egér és patkány Ig-vel (Southern) kombinálva megfestjük. Az eredményeket a 11. ábrán tüntetjük fel; az értelmezés a 4. ábránál megadott.

. „-.-9 ··*· ’ .♦ :,. · í .*

Következtetés:

A DRBl*110X-specifikus SFR3-DR5 reagens heterozigóta nyugalomban levő B-sejtek által kifejezett mindkét DR allomorf alulszabályozását indukálja, egyúttal a mAb által fel nem ismert DR allotipust is befolyásolva. Ezért úgy tűnik, hogy a DR alulszabályozás nem allotipus specifikus .

14. példa

1-1C4 Fab által történő Pan-II. osztályú alulszabályozás,

TS-10 sejteken

Minthogy a mAb 1-1C4 mindhárom HLA II. osztályba tartozó izotipus (DR, DP, DQ) β-láncát felismerni képes, fontosnak bizonyult annak meghatározása, hogy a kifejezés csökkentésére is képes-e.

Módszer:

EBV-LCL TS-10-t (ECACC (Salisbury, UK) No. 85102911) 1-1C4 Fab (20 nM), anti-DP mAb (10 nM) vagy anti-DQ mAb (10 nM) jelenlétében a megadott módon 16 órán át tenyésztünk. A sejteket ezután a 6. és 10. példában leírt módon mossuk és megfestjük. Az eredményeket a 12. ábrán tüntetjük fel. Az élő bezárt sejtek megfestett profiljának hisztogramját mutatjuk be. Az X-tengelyen a fluoreszcencia intenzitását önkényes egységekben tüntetjük fel, míg az Y-tengelyen a relatív sejtszámot ábrázoljuk. A nyitott hisztogrammok a megfelelő szekunder reagenssel jelzett kontroll sejtpopulációkat mutatják be.

• · ·

Következtetés :

Az 1-1C4 Fab mindhárom II. osztályba tartozó izotipus (DR, DP, DQ) kifejezését alulszabályozza; a csökkenés erőssége az izotóp-specifikus mAb (anti-DP, anti-DQ) által elérthez hasonló. Az 1-1C4 Fab által kifejtett fenti pan-II. osztályú alulmodulálás szelektív, minthogy a HLA I. osztályba tartozó és CD18 molekulák változatlanok maradtak. Ezért a találmányunk szerinti, pan-II. osztályú monoklonális antitestekből (pl. 1-1C4) kapott fragmensek a HLR-DR-el összefüggő indikációk (pl. reumatoid arthritis) kezelésén kívül HLA-DP és -DQ kifejezéssel kapcsolatos betegségek (pl. sclerosis multiplex, I. típusú diabetes mellitus, myasthenia gravis, erythematosus, szerv transzplantátum kilökődések és beojtás versus gazdaszervezet) betegségekkel szemben is alkalmazhatók (ref. 36-41).

15. példa

TNFa kiválasztás növekedésének hiánya LG2-el és Priess sejtekkel, valamint L243-al és fragmenseivel végzett együttes tenyésztéskor

Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy DR molekulák L243 által történő térhálósítása EBV-transzformált B sejtvonalakon JY a TNFa kiválasztást növeli (20). Minthogy ez lehet a citotoxicitás lehetséges mechanizmusa, mérjük az ugyanazon mAb L243-al és fragmenseivel együtt tenyésztett Priess és LG2 sejtek által előidézett TNFa felszabadulást.

···· ·· ···

Módszer:

APC-t [10⁵ sejt/ml] ekvivalens koncentrációjú teljes L243 antitest (10 nM) vagy F(ab)^f2 (10 nM) és Fab (20 nM) fragmense jelenlétében 16 órán át a megadott módon tenyésztünk. A felülúszók TNFa koncentrációját belsőleg ellenőrzött standard ELISA kit (T sejt Diagnostics, Cambridge, Massachusetts) felhasználásával mérjük. A monoklonális reagensek citotoxikus és DR-moduláló hatásait a 4 . példában leírt módon immuno-fluoreszcenciával határozzuk meg (az adatokat nem tüntetjük fel) . Az eredményeket a 13. ábrán mutatjuk be.

Következtetés:

Ezekben a tenyészetekben szignifikáns TNFa növekedést nem mutattunk ki. Ezért a citotoxicitás mechanizmusa - a szelektív DR alulmoduláláshoz hasonlóan - további kutatást igényel.

Anti-DR monoklonális antitestek és fragmenseik által előidézett Th sejtválasz gátlás

16. példa

Th sejtválasz gátlása anti-DR mAb, fragmensei és DR-kötődő peptidek által

Módszer:

A ref. 32 szerint előállított NBHAC25, KMHA25 és DSHABB10 CD4 pozitív Th sejtklónok DRA/DRBl*0101, DRA/DRBl*0401 és DRA/DRB1*0401 által rendelkezésre bocsájtott influenza vírus hemagglutinin (HA) HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT) peptidre reagálnak. A sejteket mitomicin • ·

C-vel kezelt APC-vel, antigénnel (134 nM) és inhibitoraival inkubáljuk. Az antigén specifikus Th sejtburjánzást standard H-timidin beépülés assay segítségével mérjük. Az eredményeket a 3. táblázatban tüntetjük fel.

Következtetés:

A LB 3.1, L243 és 1-1C4 monoklonális antitestek - azaz a DR-molekulák alulszabályozását indukáló monoklonális antitestek - egyúttal a Th helper sejt aktivitás potens inhibitorai. Ezzel szemben az mAb nem idézi elő a DR (CCCL20, 8D1, 9F1, 9F2, 10F12) alulszabályozását, továbbá a Th sejtválaszokat sem befolyásolja vagy marginális gátló hatást sem indukál (3. Táblázat) . Ezért a DR alulszabályozó hatása a gátló aktivitással összhangban van. A fenti eredmények továbbá azt mutatják, hogy az alulszabályozó mAb felismeri a II. osztályba tartozó molekulák peptid kötőhelyein (al és βΐ) elhelyezkedő epitópokat.

• ··

4J

Ν '«Ο r-l

Λ '<0

Η (0

4J (—4 '<0 α:

φ

Ό •Η

4J

QJ

Φ

Ω] *0

Ό »0

4J :Ο α;

ι κ

α

Μ 'Φ α:

•Η φ

(0

C φ

ε

Οι <0

Μ

Μ-Ι η

<

ε κ

Ω ι

•Η

4J

C «0 <0 w '10 ι—I 4J '(0 σ

Ν Μ <0 ι—I '(0 > 4-1 -rí Φ υι ι ε-«;

>1

C 'fO ε

υ >, ο -τ Οά» ; σ\ ίο Μ

Ο > <0

Ο

ΓΜ ό

ΓΜ

Ο

C ν-ι

Ο

ΡΜ

Ο \Ο ό

ΓΜ <

'χ

Ζ <

-κ

Ζ ' S . C ιη σ> ti c <0 (0»m > 4-) g θ'

Ο

ΓΜ <

X.

Ζ <

-Μ.

Ζ ο

ό§

ΓΜ

Λ η

<#> '/0 • I—I

X 4J (0 '(0 ε σι ι γ-4 ι η f—'I '(0 '(0 10 Λ Ν ι

Μ (0 ο

ΓΜ οο ό

ΓΜ ττ

ΓΜ νι

ΓΜ

5Τ «Ο

Γοό <0 Ο Ν >, W γΗ

C’ '<t ι ν η σ +J ίο ο :

I ε Φ α;

« Ο CU-H α 4-ι ω ρ

ο

4J

Ή

X) •Η χ:

c c

'<υ

Ö0

ΓΜ oS

Ο CQ Ο» C6 < Ο

JZ

Η

ΙΛ

ΓΜ <

Ζ

Χ5 ί3

ΓΜ

ÍM ΛΓ

ΓΜ

Γ*

Ο

ΓΜ

Λ α

w

5J ο

ΓΜ ΰ

U

X <

C c*t ts.

Ο

Λ <

ΓΜ ο

<_ S- <1 χ 2} <£, < s7 χ — « I §

rw tn '(0

Ρ (0

4J >

o

M-t

4-1 «ti

N '<0 r-H

X) '«ti

Eh r* •ű *3

00	©	©	o
	rx	00
	00	r*.	00
	<*>
©	©	O	©
©	©	©	©

+	*	4-	*

e	aO	«0	0
< c	Λ	Fab	Fab
	v u		m
re			M
2£	1
	•4

© m

I r**

O ne <

</)

0/ rsi

UO • · • ·· ····· ···· ·· ··· · ··

A Th kiónok antigénjeit tartalmazó DR molekulák. mAb és fragmenseik esetében 60 nM mellett és antagonista peptidek esetében 10 μΜ mellett kapott eredmények.

Antigén specifikus burjánzó Th válasz 50 %-os gátlásához szükséges koncentráció. Három-négy kísérletből nyert felső és alsó érték.

Antigén specifikus burjánzó Th reagálás 94 %-os gátlásához szükséges koncentráció. Három-négy kísérletből nyert felső és alsó érték.

Nem alkalmazható; az IC50 és IC94 értékek nem határozhatók meg, mivel a mért gátlási szint 50 % illetve 94 % alatti érték.

aXA (peptid CY760.50, aXAAAKTAAAAa-NH₂; ref. 17) és aXRA (aXRAMKTLAAAa-NH₂) ekvivalens a T sejt gátló kapacitáshoz .

Az antigén terheléstől függ (HA307-319;13,4 pMtől 134 nM-ig).

Ac-YRAMATLA-NH₂ .

17. példa

Th sejtszabályozás és DR alulszabályozás antitest koncentráció igénye

A 16. példában bemutatott összefüggés további kiaknázása céljából az alulszabályozás és gátlás antitest koncentráció igényét meghatározzuk.

• · · ·

Módszer:

KMHA25 és DSHABB10 (lásd 3. Táblázat) Th-sejtklónokat mitomicin C-kezelt Priess sejtekkel, mint APC, HA307-319 peptid és antigén (330 nM) és a megadott koncentrációjú mAb LB3.1-el inkubálunk. Az antigén specifikus Th sejtburjánzást (felső mező) H-timidin beépülésen keresztül 3 nap múlva mérjük. A 3. példában leírt módon mAb LB3.1.-el (alsó mező) kezelt Priess sejtek áramlás citometriáját elvégezzük. Az eredményeket a 14. ábrán tüntetjük fel.

Következtetés:

A Th válaszok csaknem teljes gátlását érjük el olyan mAb koncentráció mellett, amely az APC kb. kétharmadában a DR 90 %-os alulszabályozását idézte elő (elpusztítás nélkül); ez arra utal, hogy a két folyamat koncentráció igénye hasonló.

18. példa

Anti DR mAb és Fab fragmensek hatása rögzített APC-n levő antigénre

Megvizsgáltuk, vajon a Th sejtválasz gátlásában a DR alulszabályozás az egyetlen mechanizmus-e.

Módszer:

APC-t (LG-2) glutáraldehiddel fixálunk (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland). A mitomicinnel kezelt („My) vagy rögzített („Fix) LG2 plusz HA307-319-re (134 nM) • · · · · · · • ······ · * • ·· ····· ·······* · ·♦ mAb vagy Fab jelenlétében adott Th NBHAC25 sejtklón választ a 17. példában leírt módon mérjük. Az eredményeket a 15. ábrán tüntetjük fel.

Következtetés:

Az anti-II. osztályba tartozó monoklonális antitestek és Fab fragmenseik a rögzített (azaz elpusztult) APC-n levő antigén peptiddel szembeni Th sejtválaszt is gátolni képesek, aholis a II. osztályba tartozó molekulák alulszabályozása nem lehetséges. Ez igazolja, hogy a Th sejtgátlásban legalább egy további mechanizmus - valószínűleg a II. osztályba tartozó Th sejt antigén receptor (TCR)interakció térbeli gátlása - is szerepet játszik.

19. példa

Antigén terhelés hatása mAb, Fab és peptid antagonisták hatékonyságára

Az anti-II. osztályba tartozó monoklonális antitestek, fragmenseik és peptidkötőhely antagonisták Th sejtválasz gátló hatásának relatív hatékonyságát hasonlítjuk össze.

Módszer:

Lásd 15. példa. Th klón NBHAC25; APC LG2. Felső mező HA 307-319, 13, 4 nM, alsó mező 330 nM. A 3. Táblázatnál felsorolt peptideket alkalmazzuk. Az eredményeket a 16. ábrán tüntetjük fel.

Következtetés:

Az antitestek és Fab fragmensek gátló kapacitása összehasonlítható; az utóbbi csupán kis mértékben kevésbé • · hatékony, mint az előző. Mind az antitestek, mind a Fab fragmensek többszázszor hatékonyabbak a peptideknél. Igen fontos körülmény, hogy az antigén koncentráció növelése (a 16. ábra alsó mezőjében 30x magasabb, mint a felső mezőben) a peptid antagonista hatékonyságát csökkentette, azonban az mAb hatékonyságát nem befolyásolta. Ez a megfigyelés a gátlási mechanizmusokban levő különbségekkel magyarázható; mig a peptidek a II. osztályú kötőhelyekért az antigénnel közvetlenül versenyeznek, addig az antitestek a II. osztályú kifejezés alulszabályozása mellett az MHC-TCR interakciót is gátolják.

20. példa

FAB és peptid relatív hatásai antigén dózis-válasz görbékre

Fab fragmensek és peptidek Th sejtválasz gátló hatását az antigén koncentrációk tág tartományában összehasonlítjuk.

Módszer:

Lásd 16. példa. Th klón, NBHAC25; APC, LG-2; HA307-319, 13, 4 pM-től 134 nM-ig; Fab, 100 nM; aXA peptid, 100 pM. Az eredményeket a 17. ábrán tüntetjük fel.

Következtetés:

A fenti eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy Fab fragmensek a Th sejtválaszt «1000-szer nagyobb antigén koncentrációk mellett gátolják, mint a peptidek, • · · · · és ez a különbség az antigén koncentrációk teljes tartományában megmarad.

21. példa

II. osztályba tartozó antagonisták hatása folyamatban levő Th sejtválaszra

Fontos volt annak meghatározása, hogy a különböző tipusú, II. osztályba tartozó antagonisták a folyamatban levő Th sejtválaszt befolyásolni képesek-e. Bár ez a kérdés az in vitro Th sejtválasz rövid időtartamán belül kellően nem vizsgálható, megkíséreltük az APC-antigén-Th sejtrendszerhez különböző időpontokban hozzáadott Fab fragmensek és peptidek összehasonlítását.

Módszer:

Lásd 17. példa. Th klón, NBHAC25; APC, LG2; HA307-319, 4 nM. Az APC HA-val történő inkubálását a -2.

órától végezzük. A kiónt a 0. órában adjuk hozzá. LB3.1 Fab-ot alkalmazunk. Az eredményeket a 18. ábrán tüntetjük fel.

Következtetés:

A peptid antagonista késleltetett hozáadása az inhibitor aktivitás fokozatos időtől függő megszűnését eredményezi, amely a kompetitor koncentrációjának növelésével nem állítható vissza. Ezzel szemben Fab fragmensek csaknem teljes gátlást okoznak még abban az esetben is, amikor a Th sejtek után 2 órával adjuk hozzá; a késleltetett adagoláskor bekövetkező inhibitor potenciálcsökkenés a Fab koncentráció növelésével kompenzálható. A Fab fragmensek tehát folyamatban levő Th sejtválaszba való • · • ·»···· · · • ·· ····* ··*· ·» ··· · ·· beavatkozáskor a jelenleg beszerezhető peptid kompetitoroknál hatékonyabbnak tűnnek.

22. példa mAb 1-1C4 termelése

HLA-DR-t EBV-LCL Priesből mAb L243 felhasználásával immunológiailag kicsapunk, majd a HLA-DR a- és βláncokat SDS-PAGE segítségével elválasztjuk. A DR-β láncot tartalmazó 28k elek-troforetikus sávot a gélből kivágjuk és BALB/c egerek immunizálásához felhasználjuk. Egér immun B sejteket ezután PAI-0 mieloma vonallal [Stocker, W. et al., Research Disclosure, 217 155-157 (1982)] történő fúzióval imortalizálunk, a mAb-ot kiválasztó hibridómák kinyerése céljából. A hibridóma tenyészet felülúszókat antigén HA 307-319 és Priess mint APC jelenlétében HA/DRBl*0401 Th sejt klón KMHA25 (lásd 3. Táblázat) aktivitás gátlására scre-enelünk. A hibridóma l-lC4-et a gátló hatású mAb kiválasztása alapján azonosítjuk.

REFERENCIÁK ·« ··*· w· ·»·· • · · ···

1. Babbitt, B. et al. Natúré, 317, 359-361 (1985).

2. Baxevanis, C.N. et al. Immunogenetics 11, 617-625 (1980).

3. Rosenbaum, J.T. et al. J. Exp. Med., 154, 1694-1702 (1981).

4. Waldor, M.K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2713-2717 (1983).

5. Jonker, M. et al. J. Autoimmun., 1, 399-414 (1988).

6. Stevens, H.P. et al. Transplant. Proc., H, 1783-1784 (1990).

7. Billing, R. & Chatteijee, S. Transplant. Proc. 15, 649-650 (1983).

8. Jonker, M. et al. Transplant. Proc., 23, 264-265 (1991).

9. Gorga, J.C. et al. Cell. Immunoi., 103, 160-173 (1986).

10. Woods, A. et al. J. Exp. Med., 180, 173-181 (1994).

11. Lampson, L.A. & Levy, R. J. Immunoi. 125, 293-299 (1980).

12. Dejelo, C.L. et al. Humman Immunoi., 17, 135-136 (1986).

13. Radka, S.F. et al. J. Immunoi., 130, 1863-1866 (1983).

14. Cammarota, G. et al. Natúré ,356, 799- 801 (1992).

15. Nabavi, N. et al. Natúré ,360, 266-268 (1992).

16. Pennell, C.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3799-3803 (1985).

17. Ishioka, G. Y. et al. J. Immunoi., 152, 4310-4319 (1993).

18. Andrew, S.M. & Titus, J.A. Current Protocols in Immunology (eds. Coligan, J.E. et al.) 1, 2.8.1-2.8.10 (Greene & Wiley, New

York, 1994)

19. Palacios, R. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 82, 6652-6656 (1985).

20. Altomonte, M. et al. J. Immunoi., 151, 5115-5122 (1993).

21. Palacios, R. et al. Proc. natn. Acad. Sci. USA, 80, 3456-3460 (1983).

22. Clement, L.T. et al. J. Immunoi., 136, 2375-2381 (1986).

23. Howard, D.R. et al. Exp. Hematol. , 14, 887-895 (1986).

24. Vaickus, L. et al. Cell. Immunoi., 119, 445-458 (1989).

25. Kabelitz, D. & Janssen. O. Cell. Immunoi., 120, 21-30 (1989).

26. Holté. H. et al. Eur. J. Immunoi. 19, 1221-1225 (1989).

27. Newell, M.K. et al. Proc. natl. Acad. Sci. USA, 90, 10459-10463 (1993^.

28. Tniman, J.-P. et al. Int. Immunoi., 6, 887-896 (1994).

29. Mourad, W. et al. J. Exp. Med., 172, 1513-1516 (1990).

30. Naquet, P. et al. Immunogenetics., 18, 559- 574 (1983).

• * • J ·*» · > -» · V» • · » <t « * w ·· ··« · « · « · **·· ·· ·«· ·♦

31. Gilfillan. S. et al. J. Immunoi., 147, 4074-4081 (1991).

32. Panina-Bordignon, P. et al. Eur. J. Immunoi.. 19, 2237-2242 (1989).

33. Harris, E.D. Jr. N. Engl. J. Med... 322(18):1277 (1990).

34. Cosimi, B. et al. N. Engl. J. Med.,305, 308-314 (1981).

35. Chatenoud, L. et al. Eur. J. Immunoi., 12, 979-982 (1982).

36. Svejgaard, A. et al. Immunoi. Rév. , 70, 193-218 (1983).

37. Todd, J.A. et al. Science, 240 1003-1009 (1988).

38. Nepom, G.T. et al. Immunoi., 9, 493-525 (1991).

1D 39. Sprent, J. et al. J. Exp. Med. 163, 998-1011 (1986).

40. Santos, G.W. Immunoi. Rév. 88, 169-192 (1985).

41. Lehmann, P.V. et al. J. Exp. Med., 171, 1485-1496 (1990).

42. Co, M.S. and Queen, C. Natúré, 351, 501-502 (1991).

43. Lewis, A.P. and Crowe, J.S. Gene, 101, 297-302 (1991).

Claims

1) a monoklonális antitest a HLA-DR első tartományához kötődik;

1. Valamely immunoglobulin Fab fragmenst és ebben a Fab fragmensben 6 komplementeritást meghatározó tartományt tartalmazó Fab fragmens, mimellett a fenti komplementeritás-meghatározó tartományok közül egy-hat az alábbi tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitest komplementeritás-meghatározó tartománya/i/:

2. Az 1. igénypont szerinti Fab fragmens, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest valamely egér vagy patkány monoklonális antitest.

3. A 2. igénypont szerinti Fab fragmens, azzal jellemezve, hogy az immunoglobulin valamely humán immunoglobulin.

4. A 3. igénypont szerint Fab fragmens, azzal jellemezve, hogy a Fab fragmens hat komplementaritás-meghatározó tartománya a monoklonális antitest hat komplementaritás-meghatározó tartománya.

5. Folyékony gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy

A. ) gyógyászatilag alkalmas folyékony hordozóanyagot; és

B. ) gyógyászatilag hatékony mennyiségben a 2-4. igénypontok bármelyike szerinti Fab fragmenst tartalmaz.

··· ···· • »'*· » ”* ·*** «« · * • « · · « · ·« ·««

6. Az 5.igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a Fab fragmens menynyisége a folyékony készítmény 1 ml-ére vonatkoztatva 0,5-5 mg.

7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzaljellemezve, hogy a Fab fragmens menynyisége a folyékony készítmény 1 ml-ére vonatkoztatva 1-2

8. Eljárás az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti Fab fragmens előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. vagy 2. igénypontban meghatározott monoklonális antitestet pepszinnel hasítunk és a Fab fragmenseket az irodalomból ismert módszerekkel izoláljuk.

9. Fab fragmens, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti eljárással állítottuk elő.

10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti Fab fragmens gyógyászati hatóanyagként, különösen immunoszupresszív hatóanyagként.

11. Az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti Fab fragmens felhasználása betegek immunválaszának visszaszorítására .

12. Az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti Fab fragmens felhasználása reumatoid arthritis kezelésére.