CN1168679A - 具免疫抑制活性的单克隆抗体片段 - Google Patents

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Abstract

本发明包括mAb的单价mAb片段(Fab)，其具有下调HLA-DR在抗原呈递细胞上表达的能力。Fab片段可以下调这种HLA-DR表达而无亲代mAb或mAb二价片段[F(ab)′2]的细胞毒性。因此本发明的Fab片段是无细胞毒性副作用的有效Ⅱ类MHC特异性免疫抑制化合物。

Description

具免疫抑制活性的单克隆抗体片段
II类主要组织相容性复合物(MHC)分子可结合抗原肽片段，并将它们呈递给辅助(CD4+)T细胞(“Th”细胞)(参考文献1)。对II类MHC分子具特异性的单克隆抗体(mAb)已被证实是在体外Th细胞反应中效力极高的选择性抑制剂(参考文献2)。自从发现它们之后，它们已被视为用于自身免疫疾病(如类风湿性关节炎)的选择性免疫抑制治疗的有效药物。最初的活体研究表明，这些mAb对Th细胞的有益作用介导了异源-和自身免疫的反应(参考文献3-6)。然而在某些情况下，把II类MHC特异性mAb的活体实验应用与导致实验室灵长类动物死亡的未预料到的并发症联系起来了(参考文献7、8)。后一观察结果阻碍了人们对MHC特异性mAb免疫调节作用进一步研究的兴趣。据最近的出版文献所描述，II类MHC在转基因小鼠体内表达降低10倍造成了因无效的抗原呈递而引起的Th细胞的无反应性(参考文献19)。这表明了II类MHC表达的降低与活体模型中的免疫抑制有关系。
依据本发明，已令人惊奇地发现，具有下调HLA-DR表达能力的mAb的单价mAb片段(Fab)可以自身下调这种HLA-DR表达而不引起mAb本身或mAb二价片段[F(ab)′2]的细胞毒性。因此本发明的Fab片段是无细胞毒性副作用的有效II类MHC特异性免疫抑制化合物。
在更详细描述本发明之前，先简要描述下列附图：
图1DR结合性竞争肽和DR特异性mAb对EBV转化的B细胞系Priess的作用。
图2mAb L243对LG2的调控和细胞毒性作用时间过程。
图3在除去mAb之后L243对LG2的调控和细胞毒性作用的持续时间。
图4在与DR特异性mAb L243及其片段共培养之后，HLA-DR表达对不同APC群体的下调作用。
图5DR特异性Fab片段浓度的不断增加对EBV转化的B细胞系LG2的作用。
图6L243及其片段的延长性共培养对LG2细胞的作用。
图7EBV-LCL细胞毒性对DR-交联的依赖性。
图8DR下调作用对静止B细胞和单核细胞/巨噬细胞的选择性。
图9DR下调作用对B细胞胚细胞的选择性。
图10DR下调作用对LG2细胞的选择性。
图11由mAb引起的DR下调作用的同种异型非选择性。
图12由1-1C4 Fab引起的对TS-10细胞的泛II类下调作用。
图13LG2和Priess细胞与L243及其片段的共培养引起TNFα分泌增加不足。
图14Th细胞抑制和DR下调所需要的抗体浓度。
图15抗DR mAb和Fab片段对固定性APC引起的抗原呈递的作用。
图16抗原负载对mAb、Fab和肽颉颃物的作用。
图17Fab和肽对抗原剂量-反应曲线的相对作用。
图18II类颉颃物对正在进行的Th细胞反应的作用。
对HLA-DR[类型“DR”的人的白细胞抗原；II类主要组织相容性复合物(MHC)分子]具特异性的某些单克隆抗体(mAb)可以下调白细胞[其是约90％的抗原呈递细胞(“APC”)]表面HLA-DR分子的表达。同样的mAb还可以抑制人的Th细胞克隆的活化，后者需要由HLA-DR分子引起的抗原呈递。与目前所使用的肽颉颃物相比，这些mAb的抑制效力要高出几百至几千倍(参见下列表1)。这种HLA-DR表达的下调和Th细胞活化的抑制是一种可引起免疫抑制的药物活性。这种免疫抑制可用于治疗自身免疫疾病，特别是类风湿性关节炎。
依据本发明，已令人惊奇地发现，具有下调HLA-DR表达能力的mAb的单价、抗原结合性mAb片段(Fab)可以自身下调这种HLA-DR表达而不引起mAb本身或mAb二价片段[F(ab)′2]的细胞毒性。因此本发明的Fab片段是无细胞毒性副作用的有效II类MHC特异性免疫抑制化合物。这样，本发明含有抗HLA-DR mAb的Fab片段，其中所述完整的mAb对抗原呈递细胞具细胞毒性并可下调剩余抗原呈递细胞上的HLA-DR的表达。这样的mAb可抑制Th细胞的活化。从其中衍生出本发明Fab片段的mAb都结合在HLA-DR的第一区域中。
依据本发明可使用的三种下调性mAbs的实例是：
LB3.1(小鼠IgG2b，泛-DRα1-特异性；参考文献9-10)；
L243(小鼠IgG2a，泛-DRα1-特异性；参考文献10-11；ATCC登记号HB55)；
SFR3-DR5(大鼠IgG2b，DRB1*110X-特异性；参考文献13；ATCC登记号HB-151)。
此外，可通过如实施例22中所述的常规方法来产生能另外下调HLA-DQ和-DP的HLA-DR下调性mAb，1-1C4(小鼠IgG2a，β链特异性；参考文献14)。这样，本发明也包括上述mAb的Fab片段。
与下调性mAbs抑制Th细胞活化的能力相一致，5种非下调性mAbs，CCCL20[小鼠IgG2b，对三种DRB1(β链)等位形式(DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*0404)具特异性；参考文献12]和8D1、9F1、9F2、10F12(所有四种小鼠IgG1)只能极弱地或完全不能抑制Th细胞的活化。
活性的mAb对B淋巴母细胞样细胞和小部分正常活化的B细胞具有细胞毒性。同这些mAb一样，这些mAb的二价F(ab)′2片段可介导下调作用但也具有细胞毒性。不过，依据本发明，这些mAb的Fab单价片段可释放细胞毒性，但令人惊奇地保留了亲代mAb的下调特性。
可通过任何常规方法来生产出获得本发明Fab片段所用的抗HLA-DRmAb，例如一般由Kohler和Milstein首先描述的程序。把这种抗原注射进大鼠或小鼠、兔子、绵羊等(优选为小鼠)体内，可以通过从这种免疫动物中回收抗体产生细胞和使以常规方法获得的所述细胞不断增殖来制备出单克隆抗体，常规方法如与骨髓瘤细胞，如小鼠骨髓瘤细胞，SP2/0-SP2/0-Ag 14-细胞[ATCC No.CRL 1581；ATCC No.CRL 8287]融合[产生抗体的一般性指导参见如“抗体-实验室手册”，Harlow和Lee编著，冷泉港实验室出版社(1988)]。随后可通过常规程序(如放射免疫、酶免疫或斑点免疫结合或免疫荧光测定)来筛选这种杂交瘤培养物的上清液中的单克隆抗体(mAb)。通过常规层析程序可从杂交瘤上清液中提纯mAb，例如可通过离子交换层析、结合在固体支持物上的蛋白质A、抗免疫球蛋白抗体或抗原或其部分的亲和层析、HPLC等方法。依据本发明所使用的mAb的生产如实施例22所述。
为了能依据本领域熟悉的方法大量生产mAb，可将分泌所需抗体的杂交瘤注射进小鼠的腹腔内，该鼠在注射前曾进行过如用姥鲛烷的预处理。可通过在一只小鼠体内生成的腹水肿瘤来生产约100mg的mAb。可通过上述方法来提纯由这种肿瘤所产生的腹水液中的mAb。
可通过已知方法(如Ouchterlony免疫扩散方法)依据其亚类对mAb进行表征。本领域的人们还知道，mAb可通过修饰用于多种用途，或生产出其仍具结合抗原能力的片段。如可通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶解mAb来产生出这些片段。
生产本发明中mAb所用的免疫原优选为HLA-DRβ-链[如参见WO92/10589；生物化学杂志262，8748-8758(1987)；序列信息也可得自序列数据库，例如Genback(Intelligenetics，加利福尼亚，美国)，欧洲生物信息科学研究所(Hinxton Hall，剑桥，英国)，NBRF(乔治汤大学，医学中心，华盛顿DC，美国)和Vecbase(威斯康星大学，生物技术中心，麦迪逊，威斯康星，美国)；可通过本领域目前已知的方法来使用这些序列以生产用于本发明单克隆抗体的制备所需的抗原]，可通过常规方法，如SDS-PAGE进行纯化。
对于上述对APC具细胞毒性且能下调HLA-DR表达的抗HLA-DR mAb，可通过常规方法进行鉴定。优选的是可依据实施例3对抗HLA-DR mAb进行鉴定，其中把EB病毒转化的人B淋巴母细胞系(EBV-LCL)用作APC(特别是活化的B细胞)的模型。优选使用每毫升含约105EBV-LCL细胞的至少1ml培养物。用20nM抗HLA-DR mAb来温育培养物16小时，通过常规方法来确定死细胞的数目以及剩余存活细胞对HLA-DR的表达。为了达到本发明的目的，特对细胞毒性和下调作用做如下定义：1)如果在上述条件下，mAb对抗原呈递细胞具细胞毒性，完整mAb至少杀死25％EBV-LCL的抗原呈递细胞，优选为至少40％；2)如果在上述条件下，mAb下调抗原呈递细胞上HLA-DR的表达，其减少EBV-LCL抗原呈递细胞表面HLA-DR分子的数量，存活至少仍为平均50％。
通过常规免疫荧光法来标记EBV-LCL抗原呈递细胞以检测死细胞和测定剩余存活细胞的HLA-DR的表达。使用流式细胞仪(如FACScan，Becton-Dickinson，圣何赛，加利福尼亚)来分析这些细胞，并通过常规方法来计算死细胞的百分比和HLA-DR在剩余细胞上表达的降低，优选使用通常应用流式细胞仪的软件(如装备有FACS can细胞计数器的LYSIS II软件)。
用于筛选具有所需特性的单克隆抗体的EBV-LCL并不关键。依据本发明可使用任何常规性EBV-LCL。依据本发明所使用的EBV-LCL的实例有Priess[ECACC(索尔兹伯里，英国)登记号86052111]，LG2[IstitutoNazionale Per La Ricerca Sul Cancro(热那亚，意大利)登记号G20112301]和TS-10[ECACC(索尔兹伯里，英国)登记号85102911]。
可通过任何常规方法来生产上述mAb的Fab片段。可通过胃蛋白酶对亲代mAb的消化和通过本领域熟悉的方法分离Fab片段来生产出Fab片段，如见Andrew和Titus，“免疫球蛋白G的断裂”，免疫学的现行方案，Goligan等人编著(Greene和Wiley，1994)。因此，这样的方法和用该方法制备Fab片段也是本发明的目的。优选的是通过能表达编码所需Fab片段的基因的重组性细胞系来生产出本发明的Fab片段。可通过任何常规方法来生产这样的重组性细胞系。例如，可通过常规方法从分泌Fab片段亲代mAb的杂交瘤中克隆出编码Fab片段的基因部分。随后可通过常规方法把Fab片段eDNA掺入一表达载体中，其而后用来转染适当的细胞系。
本发明的优选Fab片段是“人源化的”，即与直接产生于动物(优选为小鼠)的Fab片段mAb相比，当施用于人体时它们具较少的抗原性。生产本发明的人源化Fab片段的方法并不关键。可使用本领域所熟悉的任何常规方法。这些方法依据的是这样的事实，即任何免疫球蛋白(Ig，如单克隆抗体)都由恒定区和能发生抗原结合的可变区所组成。可变区又由包埋在构架区(每个Ig的轻链和重链上的3个CDR′s)中的6个互补决定区(“CDR′s”)组成(参考文献42)。正是CDR′s对mAb的特异性负责。由于mAb是小鼠或其它动物种类来源的，mAb的人源化基本上可通过用具有所需特异性的动物mAb的相应CDR′s置换至少1个但优选为全部6个人免疫球蛋白的CDR′s来进行。这样，人的Ig就起到了动物CDR′s构架的作用。在这样的程序中，动物mAb(通常为小鼠)被描述为“供体”，而人Ig则被描述为“受体”。
也可对所述人源化mAb的氨基酸序列进行进一步的“微调”而使人源化mAb的抗原特异性达到最佳化。例如，据国际专利申请公开号WO 90/7861披露应筛选出一组10-20个人的Ig，而可变区同小鼠供体mAb的可变区有最大程度同源性(一般为65-70％或更高的同源性)的人Ig应该用作受体。可依据WO 90/7861(第12-15页)所披露的4条标准在CDR′s之外进行进一步的供体氨基酸对受体氨基酸的置换(一般为约3次置换)。
在本领域所熟悉的人源化的另一个实例中，欧洲专利0 620 276披露了特殊置换的等级，这些置换可发生在为增加人源化mAb特异性的移入性供体CDR′s之外的受体Ig上。据披露，这样的置换排除了选择可变区同供体mAb可变区具高度同源性的人受体Ig的需要。人源化的具体方案由欧洲专利0 620 276(第8-9页)所提供。
产生用于在人源化完整mAb(用于得到本发明的Fab片段)的宿主细胞中表达的或用于本发明的人源化Fab片段表达的DNA序列的方法都是本领域中所熟悉的且并不是关键的。这些方法包括：如位点针对性诱变，利用重叠寡核苷酸(其在人的构架上掺入动物的CDR′s)和PCR移植来构建整个可变区(WO 90/7861，欧洲专利0 620 276，参考文献43)。
这样，本发明可进一步描述为含有免疫球蛋白Fab片段和6个互补决定区(包含在所述免疫球蛋白Fab片段之中)的Fab片段，其中1-6个所述互补决定区是具有下列特性的单克隆抗体的互补决定区：
1)该单克隆抗体结合在HLA-DR的第一个区域中，
2)该单克隆抗体对表达HLA-DR的抗原呈递细胞具有细胞毒性，
3)该单克隆抗体在抗原呈递细胞上下调HLA-DR的表达。
本发明的优选实施方案是人源化Fab片段，其中如上述，免疫球蛋白Fab片段是人的，而具特性1-3的单克隆抗体是动物的(优选为小鼠)。这种人源化Fab片段可以是人的免疫球蛋白Fab片段，其中内含的1-6个CDR′s被相应的动物mAb的CDR′s所置换。这样，本发明的优选Fab片段是含有人免疫球蛋白Fab片段和6个互补决定区(包含在所述免疫球蛋白Fab片段之中)的Fab片段，其中1-6个所述互补决定区是具有上述特性1-3的单克隆抗体的互补决定区。
这种本发明的人源化Fab片段优选含有所有6个动物mAb的CDR′s。
在免疫球蛋白Fab片段为动物来源的情况下，预计本发明的Fab片段可以是具有上述特性1-3的单克隆抗体的Fab片段本身。这样的Fab片段可用作获得动物CDR′s的中间体，而动物CDR′s将包含在本发明的优选人源化Fab片段中。
本发明的优选Fab片段具有同得自上述单克隆抗体LB3.1、L243、SFR3-DR5和1-1C4的Fab片段相似的特性。由于本发明的Fab片段可抑制Th细胞的活化，它们可用于治疗活化的Th细胞为疾病或症状来源的各种疾病。这类疾病的一种是类风湿性关节炎(参考文献33)。下调类风湿性关节炎患者APC上的HLA-DR并因而抑制这类患者体内Th细胞活化，会减缓或终止该疾病的发展。通过减少或终止作为这些症状原因的介体的释放，抑制类风湿性关节炎患者体内的Th细胞活化也可以缓解症状(如疼痛和炎症)。
这样，本发明还包括所述的Fab片段及其作为治疗活性剂的应用，特别是作为免疫抑制剂和更具体地说用于治疗类风湿性关节炎，以及包括抑制患者免疫反应的方法，包括把本发明一定疗效量的Fab片段施用到需要这种治疗的患者体内。本发明进而包括通过将本发明一定疗效量的Fab片段施用到需要这种治疗的患者体内来治疗患者类风湿性关节炎的方法。可通过任何常规方法来确定所施用的Fab片段量。另外，可通过任何常规方法来进行本发明Fab片段的施用。
本发明Fab片段的施用优选利用本发明的药物组合物来完成(如下述)。施用优选通过肠胃外(皮下、肌内或静脉内)进行，特别是静脉内施用。可通过任何常规方法，如通过剂量限制性临床试验来确定抑制患者Th细胞活化及借此治疗类风湿性关节炎所需要的剂量。不过，优选剂量为约1-10mg/天(静脉内)，特别是约3-7mg/天，尤其是约5mg/天(参考文献34、35)，优选以大丸药形式给药。治疗优选为每天一次，治疗一星期或不足一星期，而如必要的话，每日治疗可持续长达3个星期。
本发明的Fab片段可配制成如用于肠胃外施用的液体药用组合物，其含有溶解于常规药用性液态载体材料中的本发明的Fab片段。该组合物进而可含有其它药用活性物质。该组合物优选含有约0.5-5mg/ml本发明的Fab片段，特别是约1-2mg/ml。优选的液态载体为无菌的生理盐水。
在下述实施例1-7中所述的结果表明，HLA-DR特异性mAb对Th细胞活化的抑制可通过多重作用奏效：(a)通过直接细胞毒性作用来排除可利用的APC，(b)通过下调细胞表面表达来减少剩余存活APC上的可用性HLA-DR分子，(c)对II类MHC-TcR相互作用的阻碍。还可通过mAb阻碍DR分子上肽结合沟、使得其对抗原隐蔽而发生Th细胞的抑制(30)。因此可以理解为什么mAb是优于目前的肽颉颃物的Th细胞抑制剂，而后者的作用完全是依据对HLA-DR分子的抗原结合位点的阻断。
构成细胞毒性和由抗体引起的II类下调作用的基础的机制尚有待研究。不过，细胞毒性显然需要交联，而下调作用还可通过本发明的单价Fab片段来实现且不会造成亲代mAb的细胞毒性。这种差异使得这两种特性通过抗体断裂而区分。假设前面观察到的抗II类Ab的副作用(参考文献7、8)至少部分与直接细胞毒性相关，本发明的Fab片段提供了这些抗体作为免疫抑制剂的治疗应用而未带来副作用。
                     实施例
                     实施例1
               抗DR的mAb的同种型特异性
通过mAb染色用人HLA II类基因转染的小鼠细胞系的能力确定了其准确的特异性。
方法：利用DR特异性mAb和FITC缀合山羊-抗小鼠Ig(南方生物技术联合公司，伯明翰，亚拉巴马)分别作为初级和次级试剂，通过标准间接性免疫荧光法来染色用指示人II类基因转染的小鼠成纤维细胞系(15)和未转染的宿主细胞(Lmtk)。在FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson，圣何赛，加利福尼亚)上对样品进行分析。结果如表1所示。“+”和“-”分别为有和无抗体结合；“NT”为未测试。
结论：抗体8D1、9F1、9F2和10F12是泛DR特异性的，而1-1C4可以识别所有3种人II类同种型(DR、DP和DQ)。
表1.泛-DR特异性mAb的染色模式
鼠成纤维细胞系     所表达的HLAII类                                   mAb
    1-IC4     8D1     9F1     9F2     10F12
Lmtk-     -     -     -     -     -     -
L57.23     DRA*0101/DRB1*0101     +     NT     +     +     +
L243.6     DRA*0101/DRB1*0401     +     +     +     +     +
L164.11     DRA*0101/DRB1*0402     +     NT     NT     NT     NT
L259.1     DRA*0101/DRB1*0403     +     NT     NT     NT     NT
L300.7     DRA*0101/DRB1*0404     +     NT     +     NT     NT
L241.2     DRA*0101/DRB1*0701     +     NT     +     NT     NT
L91.7     DRA*0101/DRB1*1101     +     NT     +     +     +
L167.2     DRA*0101/DRB1*1401     +     NT     NT     NT     NT
L182.1     DRA*0101/DRB1*1402     +     NT     NT     NT     NT
L105.1     DRA*0101/DRB3*0202     +     NT     NT     NT     +
L168.2     DRA*0101/DRB3*0101     +     NT     NT     NT     NT
L257.6     DRA*0101/DRB4*0101     +     NT     NT     NT     NT
 L256.12     DPA1*0202X/DPB1*0201     +     NT     NT     NT     NT
 L25.4     DPA1*0103/DPB1*040X     +     -     -     -     -
 L21.3     DQA1*0201/DQB1*0602     +     NT     NT     NT     NT
                实施例2
        抗HLA-DR mAbs的链和区域特异性
方法：使用标准基因克隆、重组和转染技术(10)，产生出表达嵌合性人/小鼠II级分子的两种小鼠B细胞系。从小鼠II类阴性宿主系M12.C3(15)中衍生出转染子M12.C3.25，其表达由衍生自人HLA-DRA*0101/DRB1*0401分子中的α1和β1区域以及小鼠I-Ed蛋白质的α2和β2区域(DR特异性试剂不与其结合)所组成的MHC产物。从小鼠II类阳性宿主系CH27(16)中衍生出转染子CH27.105，其表达与上述嵌合性人/小鼠α链相联系的小鼠最初的Eβk链。利用指示IgG1和IgG2抗体并分别配合蛋白质A-FITC(Boehringer，曼海姆，德国)和山羊抗小鼠IgG1-FITC(南方生物技术联合公司，伯明翰，亚拉巴马)来进行标准间接性免疫荧光染色。在FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson，圣何赛，加利福尼亚)上对样品进分析。结果如表2所示(同表1中所表述)。
结论：结果进一步证实了以前所报道过的LB3.1和L243的DRα1的特异性(10)。抗体8D1和1-1C4是β1特异性的，而由CCCL20所识别的抗原决定基似乎是β2区域依赖性的。剩余的试剂(9F1、9F2、10F12)似乎结合了由HLA-DR第二区域所表达的决定子。利用这些转染子并不能做出抗DRB1*110X mAb对应的抗原决定基的图谱，因为SFR3-DR5并不能识别DRB1*0401同种异型。表2.用嵌合性人-小鼠重组II类基因转染的B小鼠细胞系与抗-DR mAb的结合。
小鼠细胞系     M12.C3     M12.C3.25     CH27     CH27.105
人II类衍生蛋白质的表达： - DRα1-Eα2/DRβ1-Eβ2 - DRα1-Eα2/Eβ1-Eβ2
mAb：LB3.1     -     +     -     +
L243     -     +     -     +
1-1C4     -     +     -     -
8D1     -     +     -     -
9F1     -     -     -     -
9F2     -     -     -     -
10F12     -     -     -     -
CCCL20     -     -     NT     NT
抗-DR mAbs及其片段对HLA-DR表达和细胞存活力的作用
对用DR结合性竞争肽aXA(17)或DR特异性mAb进行预温育的抗原呈递细胞(APC)的DR表达和存活力对于aXA和两种mAb(LB3.1、1-1C4)来说，在阻碍抗原呈递给Th细胞的不同浓度下进行了检测。作为APC，使用了EB病毒转化的人B淋巴母细胞系(EBV-LCL)。
                 实施例3
    DR结合性竞争肽和DR特异性mAb对EBV-LCL的作用
方法：在DR特异性mAb(LB3.1，1-1C4，CCCL20)或肽aXA(aXAAAKTAAAAa-NH2；参考文献17)存在下(浓度如图1所示)，对EBV-LCL[Priess，ECACC(索尔兹伯里，英国)登记号86052111](105细胞/ml)进行培养16小时。随后冲洗细胞并利用DR特异性mAb[LB3.1(a)，CCCL20(b)，1-1C4(c)]和FITC缀合山羊-抗小鼠Ig(南方生物技术联合公司，伯明翰，亚拉巴马)分别作为初级和次级试剂，通过标准间接性免疫荧光法来进行染色。在FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson，圣何赛，加利福尼亚)上对样品进行分析。结果如图1所示。X轴代表HLA-DR的表达，Y轴代表用碘化丙锭染色的死细胞的荧光，均为任意荧光单位。“本底”代表在正常培养基中培养16小时，而后分别在无初级试剂的条件下进行标记的对照细胞群。
结论：用肽aXA(图1a)进行共培养并没有显著影响到细胞存活力或DR表达，而DR特异性mAb LB3.1(图1a)和1-1C4(图1c)却诱导了高水平的细胞毒性作用并降低了DR在剩余存活细胞上的表达。不过，这些特性并不是所有抗DR mAbs共有的，因为CCCL20甚至在浓度增加的条件下也未能影响到存活力或DR表达(图1b)。
可以通过另外两种DR特异性mAb(L243和SFR-DR5)来诱发EBV-LCL上的DR下调作用和细胞毒性作用，而4种其它抗DR mAb(8D1，9F1，9F2和10F12)既无细胞毒性作用也未能降低DR表达(未出示数据)。
                    实施例4
    mAb L243对LG2的调节和细胞毒性作用的时间过程
方法：在DR特异性mAb L243(Becton-Dickinson)存在下(浓度为10nM)，对EBV-LCL LG2[Istituto Nazionale Per La Ricerca Sul Cancro(热那亚，意大利)登记号G20112301](105细胞/ml)进行培养，时间如所指定的。随后冲洗细胞并利用DR特异性mAb L243和FITC缀合山羊-抗小鼠Ig(南方生物技术联合公司，伯明翰，亚拉巴马)分别作为初级和次级试剂，通过标准间接性免疫荧光法来进行染色。用碘化丙锭染色死细胞，在FACScan流式细胞仪上对样品进行分析。结果如图2所示。直方图代表死细胞(亮处)和表达数量降低的HLA-DR的活细胞(暗处)的相对数量。
结论：动态性活体研究表明了2小时之后mAb的可检测出的细胞毒性以及8小时之后的平稳期毒性。4小时之后DR的下调作用变得能够检测到，而8小时之后到达了其高峰。
                   实施例5
除去mAb之后L243对LG2的调节和细胞毒性作用的持续时间
方法：在DR特异性mAb L243(Becton-Dickinson)存在下(浓度为10nM)，对EBV-LCL LG2(105细胞/ml)进行培养，时间如所指定的。如所示，通过3x冲洗除去抗体，并在等体积的新鲜培养基中恢复细胞培养。随后冲洗细胞并利用DR特异性mAb L243和FITC缀合山羊-抗小鼠Ig(南方生物技术联合公司，伯明翰，亚拉巴马)分别作为初级和次级试剂，通过标准间接性免疫荧光法来进行染色。用碘化丙锭染色死细胞，在FACScan流式细胞仪上对样品进行分析。结果如图3所示。直方图代表死细胞(亮处)和表达数量降低的HLA-DR的活细胞(暗处)的相对数量。
结论：在除去mAb之后，抗体诱发的DR下调作用持续16小时。
                实施例6
   在用DR特异性mAb L243及其片段共培养之后
        HLA-DR表达对不同APC群的下调作用
抗DRmAb对不同、未转化的MHC II类阳性细胞亚群的作用：对静止和活化的B细胞、单核细胞/巨噬细胞和活化的Th细胞做进一步的检验。
方法：利用以对CD3(SK7)和CD14(MΦP9)或CD19(4G7)分别具特异性的mAb预涂敷的磁珠(Dynal)(Becton-Dickinson)，通过在培养之前除去T细胞加单核细胞或B细胞(适用时)来进行从新鲜外周血中分离B细胞和单核细胞/巨噬细胞。通过分别用植物凝血素(1μg/ml；Sigma)和美洲商陆促细胞分裂素(2.5μg/ml；Sigma)对外周血单核细胞进行3-5天的体外刺激来生产出Th和B细胞胚细胞。用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶来消化L243以分离出F(ab)′2和Fab片段，分别如参考文献18所示。通过亲和层析从蛋白质G柱上去除未消化的抗体及其Fc片段。在等浓度的L243完全抗体(10nM)或其F(ab)′2(10nM)和Fab(20nM)片段存在下培养APC(105细胞/ml)16小时，如图4所示。随后如实施例3所示冲洗细胞并进行染色。结果如图4所示。X轴代表HLA-DR的表达，Y轴代表用碘化丙锭染色的死细胞的荧光，均为任意荧光单位。数目指对应扇形体中的细胞的百分比。“DR-FITC染色”和“本底FITC染色”代表在正常培养基中培养16小时，而后分别在无初级试剂的条件下进行标记的对照细胞群。
结论：在分别存在完全mAb及其二价及三价片段F(ab)′2和Fab的条件下，DR分子的细胞表面表达在所有群体中均减少。DR降低程度在B细胞中高(80-90％)，在单核细胞APC中为中等(50-65％)，而在Th细胞胚细胞中低(少于50％)。用二价抗-DR试剂[完全mAb和F(ab)′2]共培养EBV-LCL和预活化的B细胞胚细胞分别引起了高水平(60-70％)和边缘(5-15％)的细胞毒性，而单价片段(Fab)仅能在无显著细胞死亡的情况下诱发下调作用。在用这些试验中所用的任意形式的DR特异性mAb预温育的静止B细胞、活化的Th淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞的亚群内，细胞毒性是完全没有的。
利用完全mAb1-1C4和LB3.1及其Fab片段获得了相似的情况(部分如以下章节所述)。[不可能产生LB3.1抗体的F(ab)′2片段，因为其同种型不容许木瓜蛋白酶消化]。
                  实施例7
不断增加DR特异性Fab片段浓度对EBV转化的B细胞系LG2的作用
研究单价和二价mAb试剂之间的细胞毒性差异以确定其是否只是定量的，或是因为定量差异的作用机制。
方法：同实施例3和6。结果如图5所示。表述同图1。
结论：增加L243-Fab的浓度未能诱发APC存活力的任何显著减少。
                   实施例8
      延长L243及其片段的共培养对LG2细胞的作用
方法：在等浓度的完全L243抗体(10nM)或其Fab片段(20nM)存在下来培养APC(105/ml)，培养时间为指定时间。而后如实施例6冲洗细胞并进行染色。结果如图6所示。表述同图2。
结论：延长共培养时间未能诱发APC存活力的任何显著减少。
                 实施例9
         EBV-LCL的细胞毒性取决于DR交联
方法：如所示，在L243 Fab(20nM)片段和山羊抗小鼠IgG预涂敷磁珠(“抗Ig”，Dynal)存在下，对EBV-LCL(Priess)(105细胞/ml)培养16小时，以便把细胞膜结合性Fab片段交联起来。而后如实施例6冲洗细胞并进行染色。结果如图7所示。表述同图1。
结论：HLA-DR结合性Fab的交联产生了对EBV-LCL的细胞毒性作用。
从上述结果中可以总结出：
(a)在任何单核血细胞类型上表达的HLA-DR当用特异性mAb连接时被下调；
(b)出乎意料，由单价试剂(Fab)所引起的DR连接也可导致DR的下调作用；
(c)由于细胞毒性仅仅在EBV、活化的B细胞模型和促细胞分裂素预活化的B细胞上是明显的，其或许取决于B细胞的活化期；和
(d)细胞毒性是由二价配体[完全mAb和F(ab)′2，交联性Fab]引起的DR交联的结果，而且并不需要抗体的Fc部分。
以前的研究表明，II类分子同整体mAb或T细胞受体的连接标志着APC中的一系列变化，如细胞因子的分泌(参考文献19-20)、细胞生长和免疫球蛋白分泌的调节(参考文献21-28)、共刺激和细胞粘连分子的上调作用(参考文献15和参考文献20、29)以及CD23的下调作用(参考文献25)。因此重要的是确定与mAb预培养后DR表达的减少是局限于由抗体连接的II类分子，还是全面诱发的多种细胞表面蛋白质下调作用的一部分。在同L243的F(ab)′2或Fab片段共培养之后，在不同的APC亚群上对HLA II类同种型DP和DQ、HLA I类分子以及与MHC无关的粘连蛋白质CD18的表达进行分析。
                  实施例10
DR下调作用对静止B细胞和单核细胞/巨噬细胞的选择性
方法：同实施例6。分别配合山羊抗小鼠-IgG1-FITC和FITC标记的蛋白质A(Boehringer)来实施对HLA-DP(克隆B7/21)、-DQ、(SK10)、CD18(L130)(所有IgG1亚类，Becton-Dickinson)和抗HLAI类(W6-32IgG2a，Accurate，Westbury，纽约)试剂具特异性的mAb的标准间接性免疫荧光染色。这个程序不包括残余膜结合性DR特异性抗体片段的附加间接FITC标记。结果如图8所示。表述同图4。“对照”代表着在正常培养基中培养16小时并随后用蛋白质A和FITC缀合山羊抗小鼠IgG1一起标记的细胞群。
结论：尽管DR分子表现出表达减少，但DP、DQ、I类和CD18分子在用F(ab)′2片段预培养的静止B细胞和单核细胞/巨噬细胞中仍未受影响。
                 实施例11
       DR下调作用对B细胞胚细胞的选择性
方法：同实施例10。结果如图9所示。表述同图4。
结论：尽管DR分子被下调，但DP、DQ、I类和CD18分子的表达在用F(ab)′2片段预培养的B细胞胚细胞中仍未受影响。
               实施例12
           DR下调作用对LG2细胞的选择性
方法：同实施例10。结果如图10所示。表述同图4。
结论：尽管DR分子的表达似乎因Fab的连接而被选择地降低了，但二价F(ab)′2片段诱导了其它II类同种型、I类分子和CD18的显著下调作用。由于非选择性调节的水平仅为2倍以及DR减少为10倍，因此有理由做出假设：其它细胞表面分子表达的减少与EBV-LCL上的二价试剂的一般毒性是有关系的。
                   实施例13
       由mAb引起的DR下调作用的同种异型非选择性
调控性mAb LB3.1、L243和1-1C4是泛-DR特异性的，即它们不能区别不同的等位形式HLA-DR。因此，它们不适宜用来测试DR下调作用的同种异型特异性。然而，这个问题可利用下调性mAb SFR3-DR5来解决，SFR3-DR5对DRB1*110X(原来的DR5；参考文献13)绝对是特异性的。
方法：在DRB1*110X特异性mAb SFR3-DR5(20％的杂交瘤上清液；参考文献14)存在下对B细胞(分离自实施例6中杂种DRB1*0101/1101受体的新鲜外周血)进行培养。随后冲洗细胞，利用DRB1*110X特异性mAbSFR3-DR5或DRB1*1101特异性mAb CCCL20(12)并配合山羊抗小鼠及大鼠Ig(南方生物技术联合公司)，通过标准间接免疫荧光法进行染色。结果如图11所示。表述同图4。
结论：DRB18*110X特异性试剂SFR3-DR5诱发了由杂种静止B细胞所表达的DR同质异晶的下调作用，也影响不被mAb所识别的DR同种异型。这样，DR下调作用似乎并不是同种异型特异性。
                 实施例14
       1-1C4 Fab对TS-10细胞的泛-II类下调作用
由于mAb1-1C4可以识别所有三种HLA II类同种型(DR、DP、DQ)的β链，因此测定其是否具有减少它们表达的能力是很重要的。
方法：在1-1C4 Fab(20nM)、抗DP mAb(10nM)或抗DQ mAb(10nM)存在下，对EBV-LCL TS-10[ECACC(索尔兹伯里，英国)登记号85102911]培养16小时。随后如实施例6和10冲洗细胞并进行染色。结果如图12所示。活的门控细胞(live gated cells)的直方图染色情况如示。X轴代表任意单位的荧光密度，Y轴代表相对的细胞数量。开放式直方图代表用相应次级试剂标记的对照细胞群。
结论：强度降低的所有三种II类同种型(DR、DP、DQ)的1-1C41Fab下调性表达与由同种型特异性mAb(抗DP、抗DQ)获得的结果类似。这种由1-1C4 Fab所引起的泛-II类下调作用是选择性的，因为HLA I类和CD18分子仍未受到影响。因此，除了可用于治疗HLA-DR相关联的症状(如类风湿性关节炎)，来自泛-II类mAb(如1-1C4)的本发明Fab片段也可用于治疗与HLA-DP和-DQ表达相关联的疾病，如多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、红斑症、器官移植排斥症和移植物抗宿主症(参考文献36-41)。
                     实施例15
LG2和Priess细胞与L243及其片段共培养而引起的TNFα分泌增加的缺乏
以前的研究表明，L243与DR分子在EBV转化的B细胞系JY上的交联增加了TNFα的分泌(20)。由于这可能是细胞毒性的一种机制，对用同样mAb L243及其片段共培养的Priess和LG2细胞所释放的TNFα进行测定。
方法：在等浓度的完全L243抗体(10nM)或其F(ab)′2(10nM)和Fab(20nM)片段存在下，对APC(105细胞/ml)培养16小时。使用内控式标准ELISA药盒(T细胞诊断，剑桥，麻萨诸塞州)对培养物上清液中的TNFα浓度进行测定。通过如实施例4所示的免疫荧光法(未显示数据)进一步证实了单克隆试剂的细胞毒性和DR调节作用。结果如图13所示。
结论：在这些培养物中未检测到任何显著的TNFα增加。因此，细胞毒性以及选择性DR下调作用的机制尚有待研究。
      利用抗DR mAb及其片段来抑制Th细胞的反应
                    实施例16
利用抗DR mAb、其片段和DR结合性肽来抑制Th细胞的反应
方法：如参考文献32所制备的CD4阳性Th细胞克隆NBHAC25、KMHA25和DSHABB10分别对由DRA/DRB1*0101、DRA/DRB1*0401和DRA/DRB1*0401呈递的流感病毒血细胞凝集素(HA)肽HA307-319(PKYVKQNTLKLAT)反应。用丝裂霉素C处理过的APC、抗原(134nM)和抑制剂来温育细胞。通过标准3H-胸苷掺入测定法来检测抗原特异性Th细胞增殖情况。结果如表3所示。
结论：诱发DR分子下调作用的那些mAb LB3.1、L243和1-1C4也是Th辅助细胞活化的有效抑制剂。与之相反，未下调DR的mAb(CCCL20、8D1、9F1、9F2、10F12)或者未影响Th细胞反应，或者诱发边缘抑制效应(表3)。这样，DR下调作用的能力就同抑制活性相关联。此外，这些结果表明，下调性mAb有助于识别位于II类分子肽结合(α1和β1)区域上的抗原决定基。表3用抗DR mAb、其片段和DR结合性肽抑制T细胞反应eir fragnents，and DR-binding peptides.
  Th克隆   APC：DRB1*a   抗原 抑制剂                     抑制剂的生物活性
DR区域行异性 DR下调作用   最大％抑制b     IC50 c(或范围；nM)   IC94 d(或范围；nM)
  NBHHAC25   LG2：0101   HA307-319   LB3.1 mAb     α1     +     100     3-8     6-60
  LB3.1 Fab     α1     +     100     2-8     20-1 20
  PBMC：0101   HA307-319   LB3.1 mAb     α1     +     100     0.9     30
  LB3.1 Fab     α1     +     100     70     500
  天然HA   LB3.1 mAb     α1     +     100     ＜0.1     0.6
  LB3.1 Fab     α1     +     100     0.8     60
  LG2：0101   HA307-319   1.243 mAb     α1     +     100     3-8     6-20
  L243F(ab)′2     α1     +     100     4     30
  L243 Fab     α1     +     100     7-40     40-180
  1-1C4 mAb     β1     +     100     1-4     6-20
  1-1C4 Fab     β1     +     100     4-12     20-60
  CCCL20mAb     β2     -     0-26     N/Ae     N/A
  8D1 mAb     β1     -     0-18     N/A     N/A
  9F1 mAb     2     -     31-38     N/A     N/A
  9F2 mAb     2     -     42-47     N/A     N/A
  10F12 mAb     2     -     42-52     40     N/A
  aXA/aXRA肽  f   α1β1     -     48-78     240-270,000g     N/A
    m/1-8肽h   α1β1     -     74     2,100     N/A
 KMHA25     Priess：0401  HA307-319  LB3.1 mAb     α1     +     100     1.8-3     6-20
    PBMC：0401  天然 HA  LB3.1 mAb     α1     +     100     0.1     0.6
 DSHABB10     Priess：0401  HA307-319  LB3.1 mAb     α1     +     100     4     18
 1-1C4 mAb     β1     +     100     3.8     20
 1-1C4 Fab     β1     +     100     17     80
 L243 Fab     α1     +     100     18     180
a可把抗原呈递给Th克隆的DR分子
b对于mAb及其片段在60nm下实现和对于颉颃物肽在10μM下实现。
c抑制50％抗原特异性增殖Th反应所需要的浓度。上限值和下值限来自3-4次实验。
d抑制94％抗原特异性增殖Th反应所需要的浓度。上限值和下限值来自3-4次实验。
e不适用：由于所测定的抑制水平分别低于50％和94％，因而未能建立IC50和IC94值。
f与T细胞抑制能力相当的aXA(肽CY760.50，aXAAAKTAAAAa-NH2；参考文献17)和aXRA(aXRAMKTLAAAa-NH2)。
g取决于抗原负载(13.4pM-134nM的HA307-319)。
h  Ac-YRAMATLA-NH2。
                      实施例17
     Th细胞抑制和DR下调作用所需的抗体浓度
为了进一步研究，实施例16中证实的关联性，测定了下调和抑制作用所需的抗体浓度。
用丝裂霉素C处理过的Priess细胞(作为APC)、HA307-319肽(330nM，作为抗原)和指定浓度的mAb LB3.1来温育Th细胞克隆KMHA25和DSHABB10(见表3)。3天后，通过3H-胸苷掺入来测定抗原特异性Th细胞的增殖(上面)。如实施例3进行具mAb LB3.1的Priess细胞的流式细胞计量测定(下面)。结果如图14所示。
结论：当mAb浓度能诱导约2/3的APC中的90％DR下调作用(并非杀死)，该浓度就可实现Th反应的近乎完全抑制，这意味着这些现象需要相似的浓度。
               实施例18
     抗DR mAb和Fab片段对固定性APC引起的抗原呈递的作用
本实施例研究了DR下调作用是否是Th细胞反应抑制中涉及的唯一机制。
方法：用戊二醛(Fluka Chemie，Buchs，瑞士)来固定APC(LG-2)。如实施例17对在mAb或Fab存在下Th细胞克隆NBHAC25对丝裂霉素处理(“My”)或固定(“Fix”)的LG-2加HA307-319(134nM)的反应进行测定。结果如图15所示。
结论：抗II类mAb及其Fab片段也可以抑制Th细胞对在固定(即死亡)的APC上呈递的肽抗原的反应，而在APC上II类分子的下调作用是不可能的。这样，至少有另外一种机制在Th细胞抑制中起着作用，其很可能是对II类Th细胞抗原受体(TCR)相互作用的空间阻碍。
                 实施例19
     抗原负载对mAb、Fab和肽颉颃物效力的作用
对Th细胞反应抑制中的抗II类mAb、其片段和肽结合位点颉颃物的相对效率进行了比较。
方法：同实施例15。Th克隆NBHAC25；APC LG-2。上面为HA 307-31913.4nM，下面为330nM。肽同表3。结果如图16所示。
结论：抗体和Fab片段的抑制能力是类似的，只是后者比前者的边缘效应低。然而与肽相比，二者的效力都高出数百倍。需要指出的是增加抗原浓度(在图16中下面比上面高出30倍)使得肽颉颃物效力变低，但还没有影响到mAb的效能。可以用抑制机制的差异来解释这一观察结果：由于肽直接与抗原竞争II类结合位点，抗体可下调II类表达和阻碍MHC-TCR的相互作用。
                    实施例20
         Fab和肽对抗原剂量-反应曲线的相对作用
对Fab片段和肽在宽范围的抗原浓度下抑制Th细胞反应的能力进行了比较。
方法：同实施例17。Th克隆，NBHAC25；APC，LG-2；13.4pM-134nM的HA307-319；Fab，100nM；肽aXA，100μM。结果如图17所示。
结论：从数据中显然可以看出，在同肽相比约高出100倍的抗原浓度下，Fab片段具有抑制Th细胞反应的能力，在整个抗原浓度范围中这个差异保持恒定不变。
               实施例21
        II类颉颃物对正在进行的Th细胞反应的作用
确定不同种类的II类颉颃物是否会干扰正在进行的Th细胞反应是很重要的。虽然这个问题不可能在体外Th细胞反应的短期框架中得到恰当研究，但尝试了在不同时间加入到APC-抗原-Th细胞系统中的Fab片段和肽之间做出比较。
方法：同实施例17。Th克隆，NBHAC25；APC，LG-2；HA307-319，4nM。从-2小时起用HA来温育APC。在0小时处加入克隆。使用LB3.1的Fab。结果如图18所示。
结论：延迟加入肽颉颃物导致了抑制活性的逐渐的、时间依赖性消除，其不能通过增加竞争物的浓度来恢复。相比之下，甚至当在加入Th细胞之后2小时加入时，Fab片段仍然引起了接近完全的抑制作用，而因延迟加入引起的抑制效能的降低可通过增加Fab的浓度得到补偿。这样，同现用的肽竞争物相比，在干扰正在进行的Th细胞反应上Fab片段似乎更有效。
                 实施例22
               mAb1-1C4的生产
利用mAb L243从EBV-LCL Priess中免疫沉淀出HLA-DR，通过SDS-PAGE分离出HLA-DR的α和β链。从凝胶中切下含DR-β链的28k电泳带并用于免疫BALB/c小鼠。而后通过融合骨髓瘤系PAI-0使小鼠免疫B细胞无限增殖[Stocker，W.等人，研究通报，217：155-157(1982)]以获得mAb分泌性杂交瘤。对于这种杂交瘤的培养上清液，针对其在具有抗原HA307-319和Priess(作为APC)的条件下抑制HA/DRB1*0401 Th细胞克隆KMHA25(见表3)活化的能力进行筛选。对能分泌出具抑制能力的mAb的杂交瘤1-1C4进行鉴定。
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Claims (14)

1.一种含免疫球蛋白Fab片段和6个包含在所述Fab片段中的互补决定区的Fab片段，其中1-6个所述互补决定区是具有下列特性的单克隆抗体的互补决定区：
1)单克隆抗体结合在HLA-DR的第一区域中，
2)单克隆抗体对表达HLA-DR的抗原呈递细胞具细胞毒性，
3)单克隆抗体下调HLA-DR在抗原呈递细胞上的表达。
2.权利要求1的Fab片段，其中单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。
3.权利要求2的Fab片段，其中免疫球蛋白是人的免疫球蛋白。
4.权利要求3的Fab片段，其中6个所述Fab片段的互补决定区是所述单克隆抗体的6个互补决定区。
5.一种液体药用组合物，含有：
1)一种药用性液体载体；和
2)如权利要求2-4中任意一项所要求的具一定疗效量的Fab片段。
6.权利要求5的组合物，其中Fab片段量为0.5-5mg/ml液体组合物。
7.权利要求6的组合物，其中Fab片段量为1-2mg/ml液体组合物。
8.制备权利要求1-4中任意一项所定义的Fab片段的方法，其特征在于：用胃蛋白酶切割权利要求1或2中所定义的单克隆抗体，并通过本领域所熟知的方法来分离出Fab片段。
9.通过权利要求8的方法所制备的Fab片段。
10.依据权利要求1-4任意一项的Fab片段作为治疗活性剂，尤其是免疫抑制剂。
11.依据权利要求1-4任意一项的Fab片段用于抑制患者的免疫反应的应用。
12.依据权利要求1-4任意一项的Fab片段用于治疗风湿性关节炎的应用。
13.本文中所述的发明。
14.抑制患者免疫反应的方法，包括施用具一定疗效量的含如权利要求3或4中所定义的Fab片段的Fab片段。
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