CN102667480A - 荧光免疫测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种免疫测定方法，其不需要固相化步骤和洗涤步骤，能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量测定，并且能够使抗原可见化。通过如下方式解决该课题：依次进行下述(a)~(c)的步骤来测定受试物质中存在的目标抗原的浓度：(a)在液相中，使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽与受试物质中的抗原接触，或者在液相中，使抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽与受试物质中的抗原接触；(b)测定所述荧光色素的荧光强度；(c)以液相中的抗原浓度与所述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标，计算出受试物质中含有的抗原量。

Description

荧光免疫测定方法
技术领域
本发明涉及不需要固相化步骤和洗涤步骤的新的抗原浓度测定方法和用于实施该抗原浓度测定方法的试剂盒等。
背景技术
测定抗原或抗体的浓度的方法中，在临床诊断、基础研究和环境调查等中使用最广泛的测定方法是使用识别同一抗原的不同表位的2种单克隆抗体或者使用单克隆抗体与多克隆抗体的、称为夹心ELISA法(或夹心RIA法)的免疫测定方法。夹心法的详情如下所述。作为第一阶段，将称为一次抗体的单克隆/多克隆抗体固定在测定用板上，向其中注入含有抗原的样本，反应一定时间而使抗体与抗原结合。接着，作为第二阶段，使用洗涤液将与抗体结合的杂质和非特异性结合在板上的抗原洗涤除去。作为第三阶段，注入预先结合有酶、荧光色素或放射性同位素等报告分子的标记二次抗体溶液，反应一定时间，使被一次抗体填补的抗原上进一步结合标记二次抗体。反应后，使用洗涤液除去多余的标记抗体，利用酶活性、荧光或放射性同位素等对结合在测定用板上的报告分子的量进行测定，由此测定样本中的抗原量。
如上所述，通常的夹心ELISA法中，需要使用表位不同的2种抗体，但在例如以低分子化合物等作为抗原的情况下，难以制作识别不同表位的多种抗体。因此，上田等人建立了使用1种抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)、称为开放式夹心法的高精度的低分子化合物的免疫测定方法(专利文献1和2、非专利文献1和2)。该方法为如下的抗原浓度测定方法：制备对抗原进行特异性识别的抗体的VH区多肽和VL区多肽，利用报告分子标记一种多肽而制成标记化多肽，将另一种多肽固定在固相上而制成固定化多肽，使含有抗原的试样和标记化多肽与固定化多肽接触，测定结合在固定化多肽上的标记化多肽的报告分子的量。此外，作为用于测定低分子化合物的测定方法，除了免疫测定方法之外，还有液相色谱法等，但该方法需要高精度的测定仪器，并且受试体的需要量也多，测定还耗费时间，而且通用性低。
此外，作为使用荧光色素标记后的抗体来测定抗原的浓度的免疫测定方法，已知如下方法：利用不同的荧光色素分别对抗体和抗原进行标记，以荧光色素间发生的荧光共振能量转移(FRET)的效率的变化作为指标的免疫测定方法(非专利文献3和4)；以利用通过预先在荧光标记后的抗体中混合消光物质而消光的抗体的荧光因目标检测物质的导入而增强的现象的淬灭效率的变化为指标的免疫测定方法；使用由荧光色素标记后的抗体来测定由标记抗体与测定对象物凝集而引起的荧光强度的减小的荧光免疫测定方法(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-78436号公报
专利文献2：日本专利第3784111号公报
专利文献3：日本特开平10-282098号公报
非专利文献
非专利文献1：上田宏，薬学雑誌，27：71-80(2007)
非专利文献2：Lim SL,et al.,Anal Chem.,79(16):6193-200(2007)
非专利文献3：Iijima I.and Hohsaka T.,Chembiochem.,17;10(6)：999-1006(2009)
非专利文献4：Kajihara D,et al.,Nat Methods.,3(11):923(2006)
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，到现在为止已知的免疫测定方法均需要使抗体或抗原固相化的步骤和用于除去非特异性的标记化合物的吸附的洗涤步骤。这些步骤操作繁琐而耗费时间，而且会导致结果产生偏差，因此，要求开发不需要固相化步骤和洗涤步骤的液相体系免疫测定方法。本申请发明的课题在于提供一种免疫测定方法，其不需要固相化步骤和洗涤步骤，能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量测定，并且能够使抗原可见化。
用于解决问题的方法
首先，本发明人使用由不同荧光色素标记的抗体VH和VL，尝试建立了以荧光共振能量转移(FRET)效率为指标的抗体/抗原结合活性评价体系。FRET测定使用由荧光色素CR110标记的抗BGP抗体轻链区(CR110-VL)和由荧光色素TAMRA标记的抗BGP抗体重链区(TAMRA-VH)，在不存在抗原的情况下，不发生由CR110向TAMRA的FRET，与此相对，在存在抗原的情况下，VH和VL通过抗原而形成三者的复合物，从而预测会会发生由CR110向TAMRA的FRET，将CR110-VL和TAMRA-VH或未标记的VH与不同浓度的BGP抗原肽一同孵育，利用荧光强度分布分析法(FIDA)分析CR110的荧光强度的变化。结果，在使CR110-VL与TAMRA-VH反应的情况下，CR110的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而降低，因此可以确认，CR110-VL和TAMRA-VH通过抗原肽进行结合而形成复合物，从而发生所预测的由CR110向TAMRA的FRET。
另一方面，令人意外的是，在使CR110-VL与未标记的VH反应的情况下，CR110的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。为了确认在使用标记后的VH的情况下是否也能观察到同样的现象，本发明人将TAMRA-VH和CR110-VL或未标记的VL与不同浓度的BGP抗原肽一同孵育，并对TAMRA的荧光强度的变化进行了分析。结果可知，在使TAMRA-VH与未标记的VL反应的情况下，TAMRA-VH的荧光强度也依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。上述结果完全是预料之外的结果，从而建立了如下假说：也许VL和VH作为淬灭剂对荧光色素(CR110、TAMRA)发挥作用，仅在VH和VL通过抗原肽而形成复合物时，该淬灭才会解除，从而使荧光强度增加。
基于上述假说，本发明人尝试建立了利用淬灭现象的新的测定方法(以下有时也称为“均相荧光免疫测定方法(homogenous fluorescentbased immunoassay)”)，使TAMRA-VH和不同浓度的BGP肽在存在或不存在未标记的VL的条件下反应并测定荧光强度。结果发现，在VL存在下，TAMRA-VH的荧光强度依赖于BGP肽的浓度而增加，根据存在/不存在VL时的TAMRA-VH的荧光强度之比(+VL/-VL)的分析结果，能够构建高灵敏度的均相荧光免疫测定方法。此外，本发明人确认，通过使用ATTO655作为荧光色素、并且借助间隔区将荧光色素标记到VH上，使上述“均相荧光免疫测定方法”的灵敏度增加。
此外，本发明人使用将存在于VH上的4个色氨酸(以下有时也记为Trp或W)分别突变成苯丙氨酸(以下有时也记为Phe或F)而得到的突变VH进行了确认淬灭效果的实验，发现VH的氨基酸序列中的第36位、第47位、第106位(对应于Kabat编号体系中的第103位)的色氨酸作为荧光色素的淬灭剂起作用。这些色氨酸在小鼠抗体VH中高度保守，因此可知，通过应用本发明的“均相荧光免疫测定方法”，能够使用各种抗体进行抗原的测定。
本发明基于以上发现而完成。
发明效果
根据本发明，可以提供能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量测定的免疫测定方法和用于实施利用该测定方法的抗原测定的试剂盒。本发明的测定方法是以标记在抗体VL或VH上的荧光色素的荧光强度为指标来检测/测定抗原与上述抗体VL和VH的结合的方法，该方法基于下述新发现：上述抗体VL与VH未结合时，上述荧光色素处于淬灭的状态，当上述抗体VL和VH通过抗原而结合时，上述荧光色素的淬灭被解除，并且该方法不需要现有免疫测定方法中必不可少的固相化步骤和洗涤步骤，因此，能够在短时间内得到偏差小、精度高的测定结果。
即，本发明涉及：(1)一种抗原浓度测定和检测用试剂盒，具备抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽，且上述抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽中的任意一者由荧光色素标记，其特征在于，能够以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而进行抗原浓度的测定或抗原的可见化；(2)如上述(1)所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合成单链抗体。
此外，本发明涉及：(3)如上述(1)或(2)所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，荧光色素为罗丹明类荧光色素或嗪类荧光色素；(4)如上述(3)所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，荧光色素为CR110、TAMRA或ATTO655；(5)如上述(1)~(4)中任一项所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽；(6)如上述(1)~(4)中任一项所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号7表示的氨基酸序列构成的多肽。
进而，本发明涉及：(7)一种抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，依次包括下述步骤(a)~(c)：(a)使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽(a1)在液相中与受试物质中的抗原接触，或(a2)与施用了抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽的受试非人动物对象中的抗原接触，或(a3)在体外与受试对象中的抗原接触；(b)在上述(a1)的情况下，测定荧光色素的荧光强度，在上述(a2)和(a3)的情况下，检测上述荧光色素的荧光；(c)以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标，在上述(a1)的情况下，计算出受试物质中含有的抗原量，在上述(a2)和(a3)的情况下，使受试对象中含有的抗原可见化。
另外，本发明涉及：(8)如上述(7)所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合成单链抗体；(9)如上述(7)或(8)所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，荧光色素为罗丹明类荧光色素或
Figure BDA00001770993300061
嗪类荧光色素；(10)如上述(9)所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，荧光色素为CR110、TAMRA或ATTO655；(11)如上述(7)~(10)中任一项所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽；(12)如上述(7)~(10)中任一项所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号7表示的氨基酸序列构成的多肽。
附图说明
图1是示意性地表示本发明的CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽(CR110-VL)、TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽(TAMRA-VH)和它们的复合物(CR110-VL/TAMRA-VH)的图。
图2是表示在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、并使用490nm的激发光测定荧光光谱而得到的结果的图。
图3是表示在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、并测定525nm(F525)和575nm(F575)的荧光强度的变化而得到的结果的图。
图4是表示在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、测定525nm和575nm的荧光强度并分析荧光强度之比(F575/F525)的变化而得到的结果的图。
图5是表示使本发明的CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽与TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应、并使用488nm的激光和510~560nm的荧光滤光片通过荧光强度分布分析法(FIDA)进行分析而得到的结果的图。图中，CR110-VL表示CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽，TAMRA-VH表示TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽，w.t.-VH表示未标记的抗BGP抗体重链可变区多肽。
图6是表示使本发明的CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽与TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应、并使用543nm的激光和560~620nm的荧光滤光片通过荧光强度分布分析法(FIDA)进行分析而得到的结果的图。图中，CR110-VL表示CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽，TAMRA-VH表示TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽，w.t.-VL表示未标记的抗BGP抗体轻链可变区多肽。
图7是表示使本发明的TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽与不同浓度的BGP肽在存在或不存在未标记的抗BGP抗体轻链可变区多肽的条件下进行反应、并使用543nm的He-Ne激光测定荧光强度而得到的结果的图。图中，+VL表示在存在未标记的抗BGP抗体轻链可变区多肽的条件下进行反应的结果，-VL表示在不存在未标记的抗BGP抗体轻链可变区多肽的条件下进行反应并测定荧光强度而得到的结果。
图8是表示使本发明的TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽与不同浓度的BGP肽在存在或不存在未标记的抗BGP抗体轻链可变区多肽的条件下进行反应、并对荧光强度之比(+VL/-VL)进行分析而得到的结果的图。
图9是表示本发明的抗BGP抗体重链可变区多肽中存在的色氨酸残基的图。该图是表示抗BGP抗体重链可变区多肽与抗BGP抗体轻链可变区多肽的复合物(VH/VL复合物)以及单独的抗BGP抗体重链可变区多肽(VH)的三维结构预测模型中的色氨酸残基(W33、W36、W47、W106)的位置的图。需要说明的是，这些色氨酸残基的位置在Kabat数据库的编号体系中分别对应于VH的第33位、第36位、第47位、第103位的氨基酸。
图10是表示使野生型抗BGP抗体重链可变区多肽(WT)或突变型抗BGP抗体重链可变区多肽(W33F、W36F、W47F、W106F)与抗BGP抗体轻链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应、并使用543nm的He-Ne激光测定荧光强度而得到的结果的图。
图11是表示使野生型抗BGP抗体重链可变区多肽(WT)或突变型抗BGP抗体重链可变区多肽(W33F、W36F、W47F、W106F)与抗BGP抗体轻链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应、并利用荧光相关光谱法(Fluorescence Correlation Spectroscopy；FCS)分析扩散时间(diffusion time)的变化而得到的结果的图。
图12是表示附加有间隔区的荧光标记抗BGP抗体重链可变区多肽(Fluorescent labeled BGP-VH)与抗BGP抗体轻链可变区多肽(BGP-VL)的复合物(Fluorescent labeled BGP-VH/VL)的三维结构预测模型的图。
图13是表示使包含或不含间隔区(GGGSGGGS；序列号4)的ATTO655标记抗BGP抗体重链可变区多肽与抗BGP抗体轻链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应、并测定荧光强度而得到的结果的图。
图14是表示使包含或不含间隔区(GGGSGGGS；序列号4)的ATTO655标记抗BGP抗体重链可变区多肽与抗BGP抗体轻链可变区多肽在不同浓度的BGP肽存在下进行反应而测定的荧光强度之比的图。
图15是表示使本发明的荧光标记抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合而成的荧光标记单链抗体的三维结构预测模型的图。
图16是表示使本发明的荧光标记抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合而成的荧光标记单链抗体的一维结构的示意图的图。
图17是表示使包含或不含间隔区的ATTO655标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并测定荧光强度而得到的结果的图。
图18是表示使包含或不含间隔区的ATTO655标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应而测定的荧光强度之比的图。
图19是表示使本发明的ATTO655标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并使用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)对荧光进行检测而得到的结果的图。图中，FL92表示由序列号3表示的氨基酸序列构成的间隔序列，2TAG表示由MX(X为荧光标记氨基酸)构成的间隔序列。
图20是表示使包含或不含间隔区的荧光标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并使用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)对荧光进行定量而得到的结果的图。图中，FL92表示由序列号3表示的氨基酸序列构成的间隔序列，2TAG表示由MX(X为荧光标记氨基酸)构成的间隔序列。
图21是表示使包含或不含间隔区的荧光标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并使用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)对荧光进行检测而得到的结果的图。图中，FL92表示由序列号3表示的氨基酸序列构成的间隔序列，2TAG表示由MX(X为荧光标记氨基酸)构成的间隔序列。
图22是表示使包含FL92间隔区(序列号3)的荧光标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并使用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)和MF20/FluoroPoint-Light(奥林巴斯公司制造)进行测定而得到的荧光强度之比的图。
图23是表示使包含或不含间隔区的TAMRA标记抗BGP单链抗体与不同浓度的BGP肽反应、并对荧光进行检测而得到的结果的图。G3S(1)表示包含GGGS的间隔区(接头)的序列，G3S(2)表示包含GGGSGGGS(序列号4)的间隔区(接头)的序列，G3S(3)表示包含GGGSGGGSGGGS(序列号10)的间隔区(接头)的序列。
图24是表示使TAMRA标记抗BGP单链抗体蛋白质与不同浓度的BGP在PBST缓冲液和终浓度为50%的人血浆存在下进行反应、并测定荧光强度而得到的结果的图。
图25是表示使本发明的ATTO655标记抗双酚A(BPA)抗体重链可变区多肽与不同浓度的BPA在存在或不存在未标记的抗BPA抗体轻链可变区多肽的条件下反应、并测定荧光强度而得到的结果的图。
图26是表示使ATTO655标记抗BPA抗体重链可变区多肽与不同浓度的BPA在存在或不存在未标记的抗BPA抗体轻链可变区多肽的条件下反应而测定的荧光强度之比的图。
图27是表示使包含或不含间隔区的TAMRA标记抗BPA单链抗体与不同浓度的BPA肽反应、并对荧光进行检测而得到的结果的图。G3S(2)表示包含GGGSGGGS(序列号4)的间隔区(接头)的序列，G3S(3)表示包含GGGSGGGSGGGS(序列号10)的间隔区(接头)的序列，G3S(5)表示包含GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(序列号11)的间隔区(接头)的序列。
图28是表示使TAMRA标记抗HEL单链抗体与不同浓度的HEL蛋白反应、并对荧光进行检测而得到的结果的图。
图29是表示使TAMRA标记抗雌二醇单链抗体与不同浓度的雌二醇反应、并对荧光进行检测而得到的结果的图。
图30是表示使TAMRA标记抗SA单链抗体与不同浓度的BSA或HSA反应、并对荧光进行检测而得到的结果的图。
图31是表示Kabat数据库的编号体系中的第36位、第47位或第103位的色氨酸在小鼠抗体重链可变区的氨基酸序列中保守的图。该图是表示A)抗BGP小鼠抗体重链可变区的三维结构预测模型、以及该抗BGP小鼠抗体重链可变区中含有的色氨酸残基中W36、W47、W106与淬灭特别相关的可能性的图。
图32是表示W33在很多种类的小鼠抗体重链可变区中高度保守的图。
图33是表示W36在很多种类的小鼠抗体重链可变区中高度保守的图。
图34是表示W47在很多种类的小鼠抗体重链可变区中高度保守的图。
图35是表示W106在很多种类的小鼠抗体重链可变区中高度保守的图。需要说明的是，上述VH的氨基酸序列中的Trp106对应于Kabat数据库的编号体系中第103位的位置。
具体实施方式
作为本发明的抗原浓度测定和检测用试剂盒，只要是如下所述的试剂盒则没有特别限制：具备抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽，且上述抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽中的任意一者由荧光色素标记，其特征在于，能够以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而进行抗原浓度的测定或抗原的可见化。即，只要是下述(1)~(4)所示的试剂盒则没有特别限制：(1)一种抗原浓度测定用试剂盒，具备抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽，其中，所述试剂盒能够以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而测定抗原浓度；(2)一种抗原检测用试剂盒，具备抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽，其中，所述试剂盒能够以受试对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使抗原可见化；(3)一种抗原浓度测定用试剂盒，具备抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽，其中，所述试剂盒能够以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而测定抗原浓度；(4)一种抗原检测用试剂盒，具备抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽，其中，所述试剂盒能够以受试对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使抗原可见化。上述抗体轻链可变区多肽与上述抗体重链可变区多肽只要能够通过同一抗原分子形成复合物，则既可以以各自独立的两个多肽片段的形式来制备，也可以以通过接头等融合而成的单链抗体的形式来制备。此外，作为上述抗原，只要是被上述抗体重链可变区多肽和上述抗体轻链可变区多肽特异性识别的抗原则没有特别限制，可以列举例如：蛋白质、肽、糖质、脂质、糖脂质、低分子化合物等。
作为本发明的抗原浓度测定和检测方法，只要是特征在于依次包括下述(a)~(c)的步骤的抗原浓度测定和检测方法则没有特别限制，所述步骤为：(a)使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽(a1)在液相中与受试物质中的抗原接触，或(a2)与施用了抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽的受试非人动物对象中的抗原接触，或(a3)在体外与受试对象中的抗原接触；(b)在上述(a1)的情况下，测定荧光色素的荧光强度，在上述(a2)和(a3)的情况下，检测上述荧光色素的荧光；(c)以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标，在上述(a1)的情况下，计算出受试物质中含有的抗原量，在上述(a2)和(a3)的情况下，使受试对象中含有的抗原可见化。即，只要是如下所述的方法则没有特别限制，所述方法为：一种抗原浓度测定方法(以下有时称为“测定方法[I]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：在液相中使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽与受试物质中的抗原接触的步骤(a1-1)，测定上述荧光色素的荧光强度的步骤(b)，计算出受试物质中含有的抗原量的步骤，即以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而计算出受试物质中含有的抗原量的步骤(c)；一种抗原浓度测定方法(以下有时称为“测定方法[II]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：在液相中使抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽与受试物质中的抗原接触的步骤(a1-2)，测定上述荧光色素的荧光强度的步骤(b)，计算出受试物质中含有的抗原量的步骤，即以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而计算出受试物质中含有的抗原量的步骤(c)；一种抗原检测方法(以下有时称为“非人动物检测方法[I]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：与施用了抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽的受试非人动物对象中的抗原接触的步骤(a2-1)，(b)检测上述荧光色素的荧光的步骤，(c)以受试非人动物对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使受试对象中含有的抗原可见化的步骤；一种抗原检测方法(以下有时称为“非人动物检测方法[II]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：与施用了抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽的受试非人动物对象中的抗原接触的步骤(a2-2)，检测上述荧光色素的荧光的步骤(b)，以受试非人动物对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使受试对象中含有的抗原可见化的步骤(c)；一种抗原检测方法(以下有时称为“体外检测方法[I]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：在体外使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽与受试对象中的抗原接触的步骤(a3-1)，检测上述荧光色素的荧光的步骤(b)，以受试对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使受试对象中含有的抗原可见化的步骤(c)；一种抗原检测方法(以下有时称为“体外检测方法[II]”)，其特征在于，依次包括下述步骤：在体外使抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽与受试对象中的抗原接触的步骤(a3-2)，检测上述荧光色素的荧光的步骤(b)，以受试对象中的抗原量与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而使受试对象中含有的抗原可见化的步骤(c)。上述抗体轻链可变区多肽与上述抗体重链可变区多肽只要能够通过同一抗原分子形成复合物，则既可以以各自独立的两个多肽片段的形式来制备，也可以以通过接头等融合而成的单链抗体的形式来制备。此外，作为上述抗原，只要是被上述抗体重链可变区多肽和上述抗体轻链可变区多肽特异性识别的抗原则没有特别限制，可以列举例如：蛋白质、肽、糖质、脂质、糖脂质、低分子化合物等。
作为上述抗体重链可变区多肽，只要包含由抗体重链基因的V区、D区和J区的外显子编码的抗体重链可变区中特异性的氨基酸序列则没有特别限制，在上述抗体重链可变区中特异性的氨基酸序列的N末端和/或C末端侧可以进一步附加有任意的氨基酸序列。此外，作为上述抗体重链可变区中特异性的氨基酸序列，优选为Kabat数据库的编号体系中第36位、第47位或第103位的氨基酸为色氨酸的氨基酸序列，具体而言，可以优选例示序列号1表示的氨基酸序列、序列号6表示的氨基酸序列。
作为上述抗体轻链可变区多肽，只要包含由抗体轻链基因的V区和J区的外显子编码的抗体轻链可变区中特异性的氨基酸序列则没有特别限制，在上述抗体轻链可变区中特异性的氨基酸序列的N末端和/或C末端侧可以进一步附加有任意的氨基酸序列。此外，作为上述抗体轻链可变区中特异性的氨基酸序列，优选为Kabat数据库的编号体系中第35位的氨基酸为色氨酸的氨基酸序列，具体而言，可以优选例示序列号2表示的氨基酸序列、序列号7表示的氨基酸序列。
抗体轻链可变区多肽、抗体重链可变区多肽以及含有抗体轻链可变区和抗体轻链可变区两者的单链抗体多肽可以通过公知的化学合成法、基因重组技术、利用蛋白分解酶使抗体分子分解的方法等来制备，其中，优选利用比较容易操作且能够进行大量制备的基因重组技术来制备。在利用基因重组技术制备上述多肽的情况下，可以将含有编码抗体轻链可变区或抗体轻链可变区中特异性的氨基酸序列的碱基序列的DNA导入到适当的载体中来制作表达载体，利用使用细菌、酵母、昆虫、动植物细胞等作为宿主的表达系统或无细胞翻译系统来表达目的多肽。在无细胞翻译系统中进行多肽的表达时，例如，可以使多肽在向大肠杆菌、小麦胚芽、兔网织红细胞等的无细胞提取液中添加三磷酸核苷和各种氨基酸而得到的反应液中进行表达。
作为上述荧光色素，只要是在标记到抗体重链可变区多肽或抗体轻链可变区多肽上的状态下被淬灭(消光)的荧光色素则没有特别限制，可以例示具有罗丹明、香豆素、Cy、EvoBlue、
Figure BDA00001770993300141
嗪、卡波派洛宁(Carbopyronin)、萘、联苯、蒽、菲、芘、咔唑等作为基本骨架的荧光色素或该荧光色素的衍生物，具体而言，可以列举：CR110：羧基罗丹明110，RhodamineGreen(商标名)；TAMRA：羧基四甲基罗丹明，TMR；ATTO655(商标名)；BODIPY FL(商标名)：4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；BODIPY 493/503(商标名)：4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-8-丙酸；BODIPYR6G(商标名)：4,4-二氟-5-(4-苯基-1,3-丁二烯基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；BODIPY 558/568(商标名)：4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；BODIPY 564/570(商标名)：4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；BODIPY576/589(商标名)：4,4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；BODIPY 581/591(商标名)：4,4-二氟-5-(4-苯基-1,3-丁二烯基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸；Cy3(商标名)；Cy3B(商标名)；Cy3.5(商标名)；Cy5(商标名)；Cy5.5(商标名)；EvoBlue10(商标名)；EvoBlue30(商标名)；MR121；ATTO 390(商标名)；ATTO 425(商标名)；ATTO 465(商标名)；ATTO 488(商标名)；ATTO 495(商标名)；ATTO520(商标名)；ATTO 532(商标名)；ATTO Rho6G(商标名)；ATTO 550(商标名)；ATTO 565(商标名)；ATTO Rho3B(商标名)；ATTO Rho11(商标名)；ATTO Rho12(商标名)；ATTO Thio12(商标名)；ATTO 610(商标名)；ATTO 611X(商标名)；ATTO 620(商标名)；ATTO Rho14(商标名)；ATTO633(商标名)；ATTO 647(商标名)；ATTO 647N(商标名)；ATTO 655(商标名)；ATTO Oxa12(商标名)；ATTO 700(商标名)；ATTO 725(商标名)；ATTO 740(商标名)；Alexa Fluor 350(商标名)；Alexa Fluor 405(商标名)；Alexa Fluor 430(商标名)；Alexa Fluor 488(商标名)；Alexa Fluor 532(商标名)；Alexa Fluor 546(商标名)；Alexa Fluor 555(商标名)；Alexa Fluor568(商标名)；Alexa Fluor 594(商标名)；Alexa Fluor 633(商标名)；AlexaFluor 647(商标名)；Alexa Fluor 680(商标名)；Alexa Fluor 700(商标名)；Alexa Fluor 750(商标名)；Alexa Fluor 790(商标名)；Rhodamine Red-X(商标名)；Texas Red-X(商标名)；5(6)-TAMRA-X(商标名)；5TAMRA(商标名)；SFX(商标名)，其中，可以特别优选列举作为罗丹明类荧光色素的CR110、TAMRA以及作为
Figure BDA00001770993300151
嗪类荧光色素的ATTO655。
作为利用荧光色素对抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽进行标记的方法，没有特别限制，可以使用下述方法：利用多肽的两端或侧链的官能团，直接进行标记或者借助交联剂间接进行标记的方法；在利用体外转录-翻译系统合成多肽的同时位点特异性地进行标记的方法等。作为利用体外转录-翻译系统进行标记的方法，已知有：琥珀抑制法(Ellman J et al.(1991)Methods Enzymol.202:301-36)、C末端标记法(日本特开2000-139468号公报)、N末端标记法(美国专利第5643722号公报、Olejnik et al.(2005)Methods 36:252-260)等，在琥珀抑制法中，制作将编码标记的靶位点的氨基酸的密码子替换成作为终止密码子之一的琥珀密码子的DNA或mRNA，利用体外转录-翻译系统由该DNA或mRNA合成蛋白质。此时，通过向蛋白质合成反应液中添加结合有被标记的非天然氨基酸的抑制型tRNA，能够合成在替换成琥珀密码子的位点上导入有标记氨基酸的蛋白质。此外，在C末端标记法中，通过在以最佳浓度添加有标记的嘌呤霉素的体外转录-翻译系统中进行由DNA或mRNA向蛋白质的翻译，能够合成在C末端特异性地导入有标记的蛋白质。
上述本发明的抗原浓度测定和检测用试剂盒可以包括缓冲液、测定用的管或板、能够作为标准物质使用的抗原等此种免疫测定试剂盒中通常使用的试剂和器具。该本发明的抗原浓度测定和检测用试剂盒能够适合用于本发明的抗原浓度测定和检测方法。
上述本发明的测定方法[I]的步骤(a1-1)中，向缓冲液、生理盐水等溶液中分别添加抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽，然后，添加受试物质并进行孵育，从而在溶液中形成由抗体轻链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。此外，上述测定方法[II]的步骤(a1-2)中，向缓冲液、生理盐水等溶液中分别添加抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽，然后，添加受试物质并进行孵育，从而在溶液中形成由抗体重链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。作为上述受试物质，可以列举：可能含有作为测定对象的靶抗原的血清、血浆、唾液、尿液等体液、培养上清、细胞提取液、菌体提取液、工业废水。此外，作为上述孵育条件，只要是一般能够用于抗体抗原反应的条件则没有特别限制，温度条件可以设定为例如1~30℃，优选设定为18~25℃，反应时间可以设定为例如5~180分钟，优选设定为60~120分钟。孵育结束后的溶液可以不经过洗涤等步骤而直接供于以下的步骤(b)。这是本发明的抗原浓度测定和检测方法的一大特征。
上述本发明的测定方法[I]或测定方法[II]的步骤(b)中，可以通过对由上述步骤(a1-1)或(a1-2)制备的溶液照射激发光来测定溶液中的荧光色素的荧光强度。用于测定的荧光测定装置没有特别限制，可以优选列举例如：MF20/FluoroPoint-Light(奥林巴斯公司制造)、FMBIO-III(日立软件工程公司制造)等。此外，测定时，作为由上述步骤(a1-1)制备的溶液的阴性对照，优选对下述溶液进行测定：1)不含抗体轻链可变区多肽而仅含有由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽的溶液；2)不含抗体轻链可变区多肽而仅含有由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽和受试物质的溶液；3)含有抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、但不含受试物质的溶液；4)含有抗体轻链可变区多肽、未标记的抗体重链可变区多肽和受试物质的溶液；等，作为由上述步骤(a1-2)制备的溶液的阴性对照，优选对下述溶液进行测定：1)不含抗体重链可变区多肽而仅含有由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽的溶液；2)不含抗体重链可变区多肽而仅含有由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽和受试物质的溶液；3)含有抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽、但不含受试物质的溶液；4)含有抗体重链可变区多肽、未标记的抗体轻链可变区多肽和受试物质的溶液；等。
上述本发明的测定方法[I]或测定方法[II]的步骤(c)中，可以由上述步骤(b)所得到的荧光强度的测定值计算出受试物质中含有的抗原量。即，由于由上述步骤(a1-1)或(a1-2)制备的溶液中的抗原浓度与由步骤(b)测定的荧光强度存在正相关关系，因此，通过测定使用含有已知浓度的抗原的受试物质时的荧光强度来制作显示抗原浓度与荧光强度的关系的标准曲线，由该标准曲线计算出使用含有未知浓度的抗原的受试物质时的荧光强度的测定值所对应的抗原浓度，由此可以求出受试物质中含有的抗原量。此外，步骤(c)中的“计算出抗原量”也包括利用基于标准曲线而预先设定的换算式等自动地计算出抗原量的情况。
上述本发明的非人动物检测方法[I]的步骤(a2-1)中，对受试非人动物对象施用抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽，在受试非人动物对象中形成由抗体轻链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。此外，上述非人动物检测方法[II]的步骤(a2-2)中，对受试非人动物对象的全身或局部施用抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽，在受试非人动物对象中形成由抗体重链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。作为上述受试非人动物对象，只要是人以外的动物则没有特别限制，可以优选列举例如：小鼠、大鼠、仓鼠、猴、猪等。此外，作为上述“施用”方法，可以从肌肉内注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射、埋植、涂布等非经口的局部施用方法或经口的施用方法中适当选择。
上述本发明的非人动物检测方法[I]或非人动物检测方法[II]的步骤(b)中，在保持个体的状态下以非侵袭的方式对在上述步骤(a2-1)或(a2-2)中施用了其中任意一者由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽的受试非人动物对象中的荧光色素的荧光进行检测，或者对从上述受试非人动物对象中采集的组织或细胞中的荧光色素的荧光进行检测。作为上述“检测”方法，只要是能够对受试非人动物对象的个体、组织或细胞照射激发光而对荧光色素的荧光进行二维或三维检测的方法则没有特别限制。此外，检测时，优选同时制作使用内窥镜、X射线、CT、MRI、超声波、显微镜等来显示受试非人动物对象的个体、组织或细胞的结构的图像。
上述本发明的非人动物检测方法[I]或非人动物检测方法[II]的步骤(c)中，根据由上述步骤(b)得到的荧光色素的荧光的检测结果，使受试非人动物对象中的抗原可见化。即，由于受试非人动物对象中的抗原量与由步骤(b)检测到的荧光的荧光强度存在正相关关系，因此，通过将显示受试非人动物对象的个体、组织或细胞的结构的图像数据与由步骤(b)检测到的荧光的二维或三维图像进行比较，能够获知抗原的定位(位置)。例如，在使用内窥镜进行检测的情况下，对受试非人动物对象的组织照射可见光从而制作能够观察的可见光图像，并且，通过涂布等使其中任意一者进行了标记的抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽与该组织接触，然后，照射针对所标记的荧光色素的激发光来制作荧光图像，将上述可见光图像与荧光图像进行比较，由此能够获知组织中的抗原的定位。
上述本发明的体外检测方法[I]的步骤(a3-1)中，在体外将抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽与受试对象中的抗原进行孵育，从而形成由抗体轻链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。此外，上述体外检测方法[II]的步骤(a3-2)中，在体外将抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽与受试对象中的抗原进行孵育，从而形成由抗体重链可变区多肽/由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽/被抗体特异性识别的抗原构成的三者的复合物。作为上述受试对象，可以列举：可能含有作为测定对象的靶抗原的培养细胞、组织切片、从生物体采集的组织或细胞等以及印迹在硝酸纤维素膜、PVDF膜等上的细胞提取液等。此外，作为上述孵育条件，只要是一般能够用于抗体抗原反应的条件则没有特别限制，温度条件可以设定为例如1~30℃，优选设定为18~25℃，反应时间可以设定为例如5~180分钟，优选设定为60~120分钟。孵育结束后的溶液可以不经过洗涤等步骤而直接供于以下的步骤(b)。这是本发明的抗原浓度测定和检测方法的一大特征。
上述体外检测方法[I]或体外检测方法[II]的步骤(b)中，对在上述步骤(a3-1)或(a3-2)中与其中任意一者由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽孵育后的受试对象中的荧光色素的荧光进行二维或三维检测。作为上述“检测”方法，可以列举：荧光显微镜、荧光影像分析仪等。
上述体外检测方法[I]或体外检测方法[II]的步骤(c)中，根据由上述步骤(b)得到的荧光色素的荧光的检测结果，能够使受试对象中的抗原可见化。即，由于受试对象中的抗原量与由步骤(b)检测到的荧光的荧光强度存在正相关关系，因此，基于由步骤(b)检测到的荧光的二维或三维图像，能够获知抗原的定位(位置)。
在以下所示的实施例中，具体且更详细地对本发明进行说明。下述实施例是用于说明本发明的例子，本发明的技术范围不受这些实施例的限定。
实施例1
1.使用抗BGP抗体来源的VH和VL的均相荧光免疫测定方法的建立
(抗BGP抗体V区基因表达载体的构建)
在编码抗人骨钙素(人谷氨酸蛋白，human Bone Gla Protein；BGP)的抗体的重链可变区(VH；序列号1)或轻链可变区(VL：序列号2)的DNA序列的N末端上附加包含琥珀密码子的ProXTM标签(MSKQIEVNXSNET(X为荧光标记氨基酸)；序列号3)的DNA序列，将所得的基因重组到pIVEX2.3d载体(罗氏诊断公司制造)的NcoI与HindIII位点中。该构建的表达载体以在插入的VH或VL的N末端附加有ProXTM标签(MSKQIEVNXSNET(X为荧光标记氨基酸)；序列号3)、在C末端附加有His-标签的方式来设计。图1中示意性地示出CR110标记抗BGP抗体轻链可变区多肽(CR110-VL)、TAMRA标记抗BGP抗体重链可变区多肽(TAMRA-VH)以及它们的复合物(CR110-VL/TAMRA-VH)。以同样的方式将TAG密码子替换成TTT密码子，制作将荧光标记氨基酸残基替换成苯丙氨酸残基的野生型VH和VL表达载体。
进而，也一并制作如下载体：将上述VH基因中所含的4个色氨酸密码子(TGG；Trp33，Trp36，Trp47，Trp106)分别替换成苯丙氨酸密码子(TTT)而得到的突变VL(W33F、W36F、W47F、W106F)表达载体，在ProX标签与VH基因的N末端之间附加有间隔区(GGGSGGGS；序列号4)的附加间隔区VH表达载体，利用接头(LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS  ，序列号5；或GGGGSGGGGSGGGGS，序列号9)使VH基因与VL基因结合而得到的单链抗体(scFv)表达载体，在ProXTM标签与scFv的N末端之间具有间隔区(GGGS、GGGSGGGS，序列号4；或GGGSGGGSGGGS，序列号10)序列的单链抗体(scFv)表达载体，在N末端具有MX(X为荧光标记氨基酸)的scFv的表达载体。
(标记抗BGP抗体V区蛋白的制作)
使用RTS100大肠杆菌二硫键蛋白表达试剂盒(E.coli DisulfideKit)(罗氏诊断公司制造)，利用无细胞翻译系统向V区蛋白N末端区域引入荧光标记氨基酸。反应液(50μL)中添加有7μL的氨基酸混合物、1μL的蛋氨酸、7μL的反应混合物、25μL的活化大肠杆菌裂解物、5μL的质粒DNA(500ng)、5μL的荧光标记琥珀抑制氨酰tRNA(0.8nmol)。用于制作荧光标记蛋白的荧光标记氨酰tRNA(TAMRA-X-AF-琥珀抑制tRNA、CR110-X-AF-琥珀抑制tRNA和ATTO655-X-AF-琥珀抑制tRNA)使用定点引入非天然氨基酸的蛋白质功能化的CloverDirectTM tRNA试剂(プロテインエクスプレス公司制造)。使反应液在20℃、600rpm的条件下反应2小时后，进一步在4℃下进行16小时的反应。反应结束后，使用1μL反应液进行SDS-PAGE(15%)，利用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)观察蛋白表达。进而，使用His-标签抗体进行蛋白免疫印迹，确认合成了目的蛋白。
合成的V区蛋白利用His-Spin Trap柱(GEヘルスケア公司制造)进行纯化。向上述反应液(50μL)中添加洗涤液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/60mM咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)使其达到400μL，并加到His-Spin Trap柱上。在室温下孵育15分钟后，用洗涤液洗涤三次。接着，用200μL的洗脱液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/0.5M咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)洗脱两次。进而，使用UltraFree-0.5离心管(ミリポア公司制造)，用PBS(+0.05%吐温20)对洗脱液进行缓冲液交换和浓缩。纯化后的样品的浓度使用SDS-PAGE和FCS(MF20；奥林巴斯公司制造)来测定。
实施例2
(荧光光谱测定)
使用PBS(+0.05%吐温20)将实施例1中制作的TAMRA标记抗BGP抗体VH蛋白和CR110标记抗BGP抗体VL蛋白(分别为1μg/mL、30μL)与作为抗原的7个残基的BGP的C末端肽(RRFYGPV；序列号8)制备成总计200μL。在25℃下放置90分钟后，使用荧光分光光度计(FluoroMax-4；ホリバ·ジヨバンイボン公司制造)进行荧光光谱测定。对于CR110-VL与TAMRA-VH的混合物而言，激发波长设置为490nm，对于TAMRA-VH而言，激发波长设置为550nm。计算出CR110-VL与TAMRA-VH的混合物的荧光强度比IA/ID。IA和ID分别为575nm和525nm下的荧光强度。通过荧光强度比(IA/ID)或最大荧光波长的荧光强度的曲线拟合计算出离解常数(Kd)值。此时，使用GraphpadPrism(Graphpad公司制造)的S型量效模型作为统计分析软件。将在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、并使用490nm的激发光测定荧光光谱而得到的结果示于图2中，将在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、并测定525nm和575nm的荧光强度的变化所得到的结果示于图3中，将在不同浓度的BGP肽存在下使CR110-VL与TAMRA-VH反应、并分析525nm和575nm的荧光强度之比(F575/F525)的变化所得到的结果示于图4中。使用PBS(+0.05%吐温20、0.2%BSA)将包含或不含间隔区的TAMRA标记抗BGP抗体scFv蛋白(2μg/mL、25μL)和作为抗原的BGP肽制备成总计200μL的样品。然后，将样品在25℃下放置70分钟后，使用荧光分光光度计(FluoroMax-4；ホリバ·ジヨバンイボン公司制造)进行荧光光谱测定，通过曲线拟合计算出荧光强度。此时，使用ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)的S型量效模型作为统计分析软件。在激发波长为550nm、测定波长为580nm的条件下进行测定。
(荧光强度分布分析法)
使用PBS(+0.05%吐温20)将实施例1中制作的荧光标记VH蛋白和荧光标记VL蛋白(分别为1μg/mL、7.5μL)或者荧光标记scFv(1μg/mL、7.5μL)连同BGP肽一起制备成50μL，加入到384孔的玻璃底微孔板(奥林巴斯公司制造)中，在25℃下孵育90分钟。利用荧光强度分布分析法(Fluorescence Intensity Multiple DistributionAnalysis；FIDA)的测定中，使用MF20/FluoroPoint-Light(奥林巴斯公司制造)在25℃下进行测定。TAMRA和ATTO655分别用543nm和633nm的激光进行激发。每次测定中获取10秒钟的数据，对每个样品进行10次测定。由该测定值计算出平均值和标准差。
实施例3
(TAMRA-VH和CR110-VL与BGP肽的结合活性评价)
首先，尝试建立利用荧光共振能量转移法(FRET)的抗体/抗原结合活性评价体系。FRET测定中分别使用CR110和TAMRA作为供体和受体。供体(CR110)的荧光与受体(TAMRA)的吸收有充分的重叠，因而可以作为FRET对使用。使取向因子(κ2)为2/3时，计算出福斯特(フエルスタ-)距离(R0)为
Figure BDA00001770993300231
该值适于检测蛋白质的分子间相互作用。在不存在抗原的情况下，VL与VH间的相互作用弱，因此，不发生由CR110向TAMRA的FRET，与此相对，在存在抗原的情况下，VH、VL和抗原形成三者的复合物，结果，预测会发生由CR110向TAMRA的FRET。
为了确认通过抗原使CR110-VL与TAMRA-VH结合时是否会检测到由CR110向TAMRA的FRET，进行了以下的实验。将CR110-VL与TAMRA-VH或未标记的VH连同不同浓度的BGP抗原肽(110000ng)一起进行孵育，利用荧光强度分布分析法(FIDA)分析CR110的荧光强度的变化。测定中，使用488nm的激光作为激发光，使用510~560nm的荧光滤光片进行检测。结果示于图5中。在使CR110-VL与TAMRA-VH进行反应的情况下，CR110的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而降低。由该结果确认，CR110-VL和TAMRA-VH通过抗原肽进行结合而形成复合物，由此引起了所预测的由CR110向TAMRA的FRET。另一方面，令人意外的是，在使CR110-VL与未标记的VH反应的情况下，CR110的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。由该结果推测出以下的可能性：VL作为淬灭剂对CR110起作用，在CR110-VL单独存在的情况下，CR110的荧光被VL淬灭，但在CR110-VL、VH和抗原肽形成三者的复合物的情况下，该淬灭效果解除。
为了确认对于VH而言是否也能观察到这种VL所带来的淬灭效果，进行了以下的实验。使TAMRA-VH与CR110-VL或未标记的VL连同不同浓度的BGP抗原肽(1~10000ng)一起进行孵育，利用荧光强度分布分析法(FIDA)分析TAMRA的荧光强度的变化。测定中，使用543nm的激光作为激发光，使用560~620nm的荧光滤光片进行检测。结果示于图6中。在使TAMRA-VH与CR110-VL进行反应的情况下，TAMRA的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。此外，同样地，在使TAMRA-VH与未标记的VL进行反应的情况下，TAMRA-VH的荧光强度也依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。由上述结果推测出以下的可能性：与VL同样，VH也作为淬灭剂对TAMRA起作用，在TAMRA-VH单独存在的情况下，TAMRA的荧光被淬灭，但在TAMRA-VH、VL和抗原肽形成三者的复合物的情况下，该淬灭效果解除。由以上的结果暗示出，VH和VL对荧光色素具有淬灭效果，并且，该效果随着VH/VL/抗原的三者复合物的形成而解除(图9)。
实施例4
(利用淬灭现象的抗原浓度的均相荧光免疫测定方法的建立)
本发明人考虑，是否可以利用实施例3中明确的淬灭现象来建立新的免疫测定方法，从而进行了以下的实验。使TAMRA-VH与不同浓度的BGP肽在存在或不存在未标记的VL的条件下进行反应，使用543nm的He-Ne激光测定荧光强度而得到的结果示于图7中。在VL存在下，TAMRA-VH的荧光强度依赖于BGP肽的浓度而增加。另一方面，在不存在VL的条件下，TAMRA-VH的荧光强度无论在与何种浓度的BGP肽反应的情况下均保持较低。此外，对TAMRA-VH在存在/不存在VL的条件下的荧光强度之比(+VL/-VL)进行分析的结果是，离解常数Kd为1.2×10-7[M](图8)。由以上的结果表明，能够建立利用VH和VL蛋白所带来的淬灭现象的、全新的均相荧光免疫测定方法。
实施例5
(VH中的Trp所带来的淬灭效果的研究)
由实施例3的结果表明，对于抗原的滴定而言，TAMRA的荧光增加量高于CR110的荧光减少量。TAMRA为罗丹明(Rhodamine)类色素，迄今为止的研究报道了罗丹明类色素被色氨酸(Trp)等氨基酸淬灭(消光)。因此，本发明人推测存在于VH中的Trp残基参与TAMRA的淬灭，从而建立了如下假说：在TAMRA-VH单独存在的情况下，TAMRA的荧光被存在于其附近的Trp残基淬灭，但通过TAMRA-VH与VL和抗原形成复合物，使TAMRA/Trp间的相互位置发生变化，从而解除了淬灭。如图9所示，VH具有4个Trp残基(Trp33、Trp36、Trp47、Trp106)。在利用预测分子模型而进行的分析中，预测Trp33、Trp36和Trp106参与了与VL的疏水相互作用，Trp33参与了与BGP肽的相互作用。为了研究这些Trp残基是否对淬灭产生影响，使用将Trp替换成Phe的4种突变型VH，进行了以下的实验。
使野生型或突变型抗BGP抗体重链可变区多肽(W33F、W36F、W47F、W106F)与VL在不同浓度的BGP肽存在下进行反应，使用543nm的He-Ne激光测定荧光强度。结果示于图10和表1中。对突变体的荧光标记VH单独的荧光强度进行测定的结果是，与野生型(WT)相比，W106F和W36F分别显示出31%和29%的荧光增加。W47F显示出11%的荧光增加。另一方面，W33F显示出9%的荧光减少。由上述结果表明，主要是Trp36、Trp47和Trp106参与TAMRA的荧光淬灭。此外，W33F、W36F、W106F通过与VL和BGP肽一同反应，分别显示出1.5倍、1.3倍、1.5倍的依赖于抗原浓度的荧光增加。因Trp向Phe的突变而使依赖于抗原的淬灭的解除减少，上述结果暗示，Trp33、Trp36和Trp106部分地参与淬灭。另一方面，在使W47F与BGP肽和VL反应的情况下，也完全未观察到荧光的增加。利用FCS测定而得到的扩散时间(diffusion time)的分析结果(图11)表明，因Trp47的突变而使抗体的结合活性消失，因此可知，VH的Trp47对于抗体与抗原的结合是必需的。
根据以上的结果，由荧光标记VH单独的荧光增加和依赖于抗原浓度的荧光增加量的减少的这两点可以确认，Trp33和Trp106是对于淬灭重要的Trp。此外，Trp47与依赖于抗原浓度的淬灭的关联尚不清楚，但可知其对于抗原介导的VH和VL的复合物形成是非常重要的位点。需要说明的是，上述VH的氨基酸序列中的Trp106在Kabat数据库的编号体系中对应于第103位的位置(Kabat,E.et al.，“Sequences ofproteins of immunological interest,5th edn.”,U.S.Department of Healthand Human Service,Public Service,National Institute of Health,Washington,DC,1991.)。
[表1]
表1.TAMRA标记VH蛋白的相对荧光淬灭
Figure BDA00001770993300271
*1(IO)=未添加VL和BGP肽时的荧光强度(荧光标记VH单独的荧光强度)
*2(IH)=添加VL、但未添加BGP肽时的荧光强度
*3(IHP)=添加VL和BGP肽时的荧光强度(此时，BGP肽的浓度为10000ng/mL)
*4荧光增加量=各IO的荧光强度相对于WT的IO的荧光强度(表示为IWT)的比例
*5荧光变化量=依赖于抗原浓度的荧光的增加量
*6离解常数
实施例6
(
Figure BDA00001770993300272
嗪类荧光色素和间隔区的附加所带来的淬灭效果的研究)
对于荧光色素和间隔区对均相荧光免疫测定方法的灵敏度产生的影响进行了研究。淬灭的效率依赖于荧光色素的种类而有较大变化，据报道与罗丹明类色素相比，
Figure BDA00001770993300273
嗪(Oxazin)类色素能够更有效地淬灭。因此，本发明人制作了使用
Figure BDA00001770993300274
嗪类荧光色素ATTO655作为标记物质的ATTO655-VH，并进行了与实施例4同样的实验。进而，制作了在ATTO655与VH之间附加有GGGSGGGS(序列号4)作为间隔区的ATTO655-VH(+间隔区)，对间隔区的有无给淬灭效果带来的影响进行了研究。图12中示出附加有间隔区的荧光标记抗BGP抗体重链可变区多肽(Fluorescent labeled BGP-VH)与抗BGP抗体轻链可变区多肽(BGP-VL)的复合物(Fluorescent labeled BGP-VH/VL)的三维结构预测模型。
使用附加或未附加间隔区的ATTO655-VH进行与实施例4同样的实验的结果(图13)是，在任何一种情况下，ATTO655-VH的荧光强度均依赖于BGP肽的浓度而增加。此外，由未附加间隔区的ATTO655-VH得到的荧光强度与使用TAMRA-VH时相比为3倍。进而明确，通过附加间隔区，与未附加间隔区时相比，荧光强度增加约2倍。认为通过附加GGGS间隔区，使作为淬灭剂的Trp与荧光色素之间的距离靠近，从而对这种荧光强度的增加产生影响。
此外，对ATTO655-VH在存在/不存在VL的条件下的荧光强度之比(+VL/-VL)进行分析的结果(图14)是，在未附加间隔区的情况下，离解常数Kd为8.4×10-8[M]，在附加有间隔区的情况下，离解常数Kd为1.8×10-7[M]。认为离解常数越高则测定体系的灵敏度越高，因此，以上的结果意味着，通过在荧光色素与VH之间设置间隔区，能够建立灵敏度更高的测定体系。
实施例7
(使用单链抗体的均相荧光免疫测定方法的建立)
为了建立使用利用由序列号5或序列号9表示的氨基酸序列构成的接头使VH与VL结合而成的单链抗体(scFv)的均相荧光免疫测定方法，进行了以下的实验。将使本发明的荧光标记抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合而成的荧光标记单链抗体的三维结构预测模型示于图15中，将上述荧光标记单链抗体的一维结构示于图16中。与分别使用VH和VL的肽片段时同样，在使用荧光标记scFv的情况下，也观察到依赖于BGP肽浓度的荧光强度的增加。将利用序列号5的接头结合而成的ATTO655标记抗BGP抗体scFv的结果示于图17~22中，将利用序列号9的接头结合而成的TAMRA标记抗BGP抗体scFv的结果示于图23中。
实施例8
(人血浆中的荧光免疫测定)
使用PBS(+0.05%吐温20、0.2%BSA)将TAMRA标记抗BGP抗体scFv蛋白(2μg/mL、6.25μL)与作为抗原的BGP肽制备成总计50μL，以形成含有50%人血浆的样品。然后，在25℃下放置90分钟后，利用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)进行观察。在激发波长为532nm、测定波长为580nm的条件下进行测定。结果示于图24中。在含有50%的人血浆的样品中，也观察到依赖于BGP肽浓度的荧光强度的增加。
实施例9
2.使用抗BPA抗体来源的VH和VL的均相荧光免疫测定方法的建立
(抗BPA抗体来源的V区基因表达载体的构建)
在编码抗双酚A(BPA)抗体的VH(序列号6)的基因的N末端附加包含琥珀密码子的ProXTM标签(MSKQIEVNXSNET(X为荧光标记氨基酸)；序列号3)的DNA序列，将所得的基因重组到pIVEX2.3d载体(罗氏诊断公司制造)的NcoI与HindIII位点中。该构建的表达载体以在插入的VH或VL的N末端附加有包含琥珀密码子的ProXTM标签(MSKQIEVNXSNET(X为荧光标记氨基酸)；序列号3)、在C末端附加有His-标签的方式来设计。此外，以同样的方式在编码抗BPA抗体的VL(序列号7)的基因的N末端附加ProXTM标签的氨基酸X被替换成F而得到的DNA序列，并重组到pIVEX2.3d载体(罗氏诊断公司制造)的NcoI与HindIII位点中。该构建的表达载体以在插入的VL的N末端附加有ProXTM标签的氨基酸X被替换成F而得到的序列、在C末端附加有His-标签的方式来设计。进而，也一并制作如下载体：利用接头(GGGGSGGGGSGGGGS；序列号9)使VH基因与VL基因结合而成的单链抗体(scFv)表达载体，在ProXTM标签与scFv的N末端之间具有间隔区(GGGSGGGS，序列号4；GGGSGGGSGGGS，序列号10；或GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS，序列号11)的3种单链抗体(scFv)表达载体。
(利用无细胞翻译系统的荧光标记蛋白的制作)
使用RTS 100大肠杆菌二硫键蛋白表达试剂盒(罗氏诊断公司制造)，利用无细胞翻译系统向V区蛋白的N末端区域引入荧光标记氨基酸。反应液(50μL)中添加有7μL的氨基酸混合物、1μL的蛋氨酸、7μL的反应混合物、25μL的活化大肠杆菌裂解物、5μL的质粒DNA(500ng)、5μL的ATTO655-X-AF-琥珀抑制tRNA(0.8nmol)。用于制作荧光标记蛋白的ATTO655-X-AF-琥珀抑制tRNA使用定点引入非天然氨基酸的蛋白质功能化的CloverDirectTM tRNA试剂(プロテインエクスプレス公司制造)。使反应液在20℃、600rpm的条件下反应2小时，然后在4℃下进行16小时的反应。反应结束后，使用1μL反应液进行SDS-PAGE(15%)，利用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)观察蛋白表达。进而，使用His-标签抗体进行蛋白免疫印迹，确认合成了目的蛋白。
接着，使用His Spin Trap柱(GEヘルスケア公司制造)，对合成的V区蛋白进行纯化。向上述反应液(50μL)中添加洗涤液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/60mM咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)使其达到400μL，并加到His-Spin Trap柱上。在室温下孵育15分钟后，用洗涤液洗涤三次。接着，用200μL的洗脱液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/0.5M咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)洗脱两次。进而，使用UltraFree-0.5离心管(ミリポア公司制造)，将洗脱液的缓冲液交换为PBS(+0.05%吐温20)，同时进行浓缩。使用SDS-PAGE和FCS(MF20；奥林巴斯公司制造)对样品浓度进行测定。
实施例10
(荧光光谱测定)
将实施例9中制作的ATTO655标记抗BPA抗体VH蛋白和未标记的抗BPA抗体VL蛋白(分别为1μg/mL、7.5μL)与作为抗原的BPA制备成总计50μL的10%MeOH的PBS(+0.05%吐温20)溶液，在25℃下放置90分钟后，利用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)进行观察。在激发波长为635nm、测定波长为670nm的条件下进行测定。通过荧光测定值的曲线拟合计算出离解常数(Kd)值。此时，使用Graphpad Prism(Graphpad公司制造)的S型量效模型作为统计分析软件。
用PBS(+0.05%吐温20、0.2%BSA、1%MeOH)将包含或不含间隔区的TAMRA标记抗BPA抗体scFv蛋白(2μg/mL、25μL)与作为抗原的BPA制备成总计200μL的样品。然后，将样品在25℃下放置10分钟后，使用荧光分光光度计(FluoroMax-4；ホリバ·ジヨバンイボン公司制造)进行荧光光谱测定，通过曲线拟合计算出荧光强度。此时，使用ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)的S型量效模型作为统计分析软件。在激发波长为550nm、测定波长为580nm的条件下进行测定。
实施例11
(使用标记抗BPA抗体来源的V区蛋白的均相荧光免疫测定方法的建立)
为了建立使用ATTO655-VH和未进行荧光标记的VL的均相荧光免疫测定方法，进行了以下的实验。使ATTO655-VH与不同浓度的BPA在存在或不存在未标记的VL的条件下进行反应，并测定荧光强度(图25)。在VL存在下，ATTO655-VH的荧光强度依赖于BPA的浓度而增加。另一方面，在不存在VL的条件下，ATTO655-VH的荧光强度无论在与何种浓度的BPA反应的情况下均保持较低。此外，对ATTO655-VH在存在/不存在VL的条件下的荧光强度之比(+VL/-VL)进行分析的结果是，离解常数(Kd)为2.4×10-8[M](图26)。此外，与实施例7同样，为了建立使用单链抗体(scFv)的荧光免疫测定方法，进行了以下的实验。在使用TAMRA标记抗BPA抗体scFv的情况下，与分别使用VH和VL的肽片段时同样，也观察到依赖于BPA浓度的荧光强度的增加(图27)。
实施例12
3.使用各种抗体来源的单链抗体的均相荧光免疫测定方法的建立
(抗HEL抗体来源、抗雌二醇抗体来源、抗SA抗体来源的V区基因表达载体的构建)
将在单链抗体(scFv)的DNA序列的N末端具有包含琥珀密码子的ProXTM标签(MSKQIEVNXSNET(X为荧光标记氨基酸)；序列号3)、在C末端具有His-标签、在ProXTM标签与scFv的N末端之间具有间隔区(GGGSGGGS，序列号4)的DNA序列重组到pIVEX2.3d载体(罗氏诊断公司制造)的NcoI与HindIII位点中，从而构建表达载体。各单链抗体(scFv)的DNA序列如下所示：抗鸡卵清溶菌酶(HEL)抗体scFv的DNA序列是利用接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS，序列号9)使抗HEL抗体的VH(序列号12)与VL(序列号13)依次结合而成的序列；抗雌二醇(estradiol)抗体scFv  的DNA序列是利用接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS；序列号9)使抗雌二醇抗体的VH(序列号14)与VL(序列号15)依次结合而成的序列；抗SA(血清白蛋白，SerumAlbumin)抗体scFv的DNA序列是利用接头序列(GGGGSGGGGSGGGGS，序列号9)使抗SA抗体的VH(序列号16)与VL(序列号17)依次结合而成的序列。
(荧光标记抗HEL抗体、抗雌二醇抗体、抗SA抗体V区蛋白的制作)
使用RTS100大肠杆菌二硫键蛋白表达试剂盒(罗氏诊断公司制造)，利用无细胞翻译系统向V区蛋白N末端区域引入荧光标记氨基酸。反应液(50μL)中添加有7μL的氨基酸混合物、1μL的蛋氨酸、7μL的反应混合物、25μL的活化大肠杆菌裂解物、5μL的质粒DNA(500ng)、5μL的荧光标记琥珀抑制氨酰tRNA(0.8nmol)。用于制作荧光标记蛋白的荧光标记氨酰tRNA(TAMRA-X-AF-琥珀抑制tRNA)使用定点引入非天然氨基酸的蛋白质功能化的CloverDirectTM tRNA试剂(プロテインエクスプレス公司制造)。使反应液在20℃、600rpm的条件下反应2小时后，进一步在4℃下进行16小时的反应。反应结束后，使用1μL反应液进行SDS-PAGE(15%)，利用荧光影像分析仪(FMBIO-III；日立软件工程公司制造)观察蛋白表达。进而，使用His-标签抗体进行蛋白免疫印迹，确认合成了目的蛋白。
合成的V区蛋白利用His-Spin Trap柱(GEヘルスケア公司制造)进行纯化。向上述反应液(50μL)中添加洗涤液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/60mM咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)使其达到400μL，并加到His-Spin Trap柱上。在室温下孵育15分钟后，用洗涤液洗涤三次。接着，用200μL的洗脱液(20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)/0.5M NaCl/0.5M咪唑/0.1%聚氧乙烯(23)月桂醚)洗脱两次。进而，使用UltraFree-0.5离心管(ミリポア公司制造)，用PBS(+0.05%吐温20)对洗脱液进行缓冲液交换和浓缩。纯化后的样品的浓度使用SDS-PAGE和FCS(MF20；奥林巴斯公司制造)进行测定。
实施例13
(荧光光谱测定)
使用PBS(+0.05%吐温20、1%BSA)将TAMRA标记抗HEL抗体scFv蛋白(2μg/mL、25μL)与作为抗原的HEL蛋白制备成总计200μL的样品。使用PBS(+0.05%吐温20、1%BSA)将TAMRA标记抗雌二醇抗体scFv蛋白(2μg/mL、25μL)与作为抗原的雌二醇制备成总计200μL的样品。使用PBS(+0.05%吐温20、0.2%明胶)将TAMRA标记抗SA抗体scFv蛋白(2μg/mL、25μL)与作为抗原的BSA(牛血清白蛋白)或HSA(人血清白蛋白)制备成总计200μL的样品。然后，将样品在25℃下放置5分钟后，使用荧光分光光度计(FluoroMax-4；ホリバ·ジヨバンイボン公司制造)进行荧光光谱测定，通过曲线拟合计算出荧光强度。此时，使用ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)的S型量效模型作为统计分析软件。在激发波长为550nm、测定波长为580nm的条件下进行测定，结果观察到依赖于抗原浓度的荧光强度的增加(图28~30)。如上所述，可知能够使用各个种类的抗体的荧光标记单链抗体(scFv)来实施荧光免疫测定方法。
实施例14
4.小鼠抗体VH中的Trp残基的保守性
如实施例4、图9和表1所示，可知：Kabat数据库的编号体系中，VH的氨基酸序列中的第33位、第36位和第106位的Trp对标记抗BGP抗体的荧光色素的淬灭发挥重要的作用，此外，第47位的Trp对抗体(VH和VL)与抗原的结合是必需的(需要说明的是，上述VH的氨基酸序列中的Trp106对应于Kabat数据库的编号体系中第103位的位置)。因此，对这些色氨酸残基在抗BGP抗体以外的小鼠抗体VH区是否也具有保守性进行了确认。小鼠抗体的氨基酸残基分布的分析使用Abysis  数据库(Andrew  C.R.Martin  博士的团队；http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)。此外，关于上述数据库中的、依照Kabat序列表示法而得到的各抗体残基的残基编号，可以通过AbCheck(Andrew C.R.Martin博士的团队；Martin,A.C.R.Accessing theKabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS:Structure,Function and Genetics,25(1996),130-133;http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html)来调查。结果如图31~35中所示，对于小鼠抗体的VH区中4个Trp残基的保守率而言，Trp33为40%，Trp36为98%，Trp47为94%，Trp103为95%。上述结果表明，实施均相荧光免疫测定方法时重要的VH的4个Trp残基在多数小鼠抗体VH中是保守的。
将依照Kabat序列表示法对上述实施例中使用的抗BGP抗体的VH(序列号1)和VL(序列号2)、抗BPA抗体的VH(序列号6)和VL(序列号7)中含有的色氨酸残基的位置进行编号而得到的结果示于表2中，将依照Kabat序列表示法对抗BGP抗体scFv、抗BPA抗体scFv、抗HEL抗体scFv、抗SA抗体scFv、抗雌二醇抗体scFv中含有的色氨酸残基的位置进行编号而得到的结果示于表3中。
[表2]
Figure BDA00001770993300351
[表3]
Figure BDA00001770993300352
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供使用由荧光色素标记的抗体(片段)并且以该荧光色素的淬灭的解除为指标的均相荧光免疫测定方法。本发明的均相荧光免疫测定方法不需要进行抗体或抗原的固定化或洗涤，能够通过对混合有抗体和受试物质的混合液的荧光强度进行直接监测来测定目标物质的浓度，因此，预测能够实现更简易且快速的低分子化合物的检测。此外，由于对淬灭产生影响的抗体VH区的Trp残基在很多种类的抗体中是保守的，因此，本发明的均相荧光免疫测定方法能够用于各种抗原浓度的测定。
Figure IDA00001770994100021
Figure IDA00001770994100031
Figure IDA00001770994100051
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Figure IDA00001770994100091
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Figure IDA00001770994100121
Figure IDA00001770994100131

Claims (12)

1.一种抗原浓度测定和检测用试剂盒，具备抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽，且所述抗体轻链可变区多肽和抗体重链可变区多肽中的任意一者由荧光色素标记，其特征在于，能够以液相中的抗原浓度与上述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标而进行抗原浓度的测定或抗原的可见化。
2.如权利要求1所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合成单链抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，荧光色素为罗丹明类荧光色素或
Figure FDA00001770993200011
嗪类荧光色素。
4.如权利要求3所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，荧光色素为CR110、TAMRA或ATTO655。
5.如权利要求1~4中任一项所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽。
6.如权利要求1~4中任一项所述的抗原浓度测定和检测用试剂盒，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号7表示的氨基酸序列构成的多肽。
7.一种抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，依次包括下述步骤(a)~(c)：
(a)使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽
(a1)在液相中与受试物质中的抗原接触，或
(a2)与施用了抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽、或者抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽的受试非人动物对象中的抗原接触，或
(a3)在体外与受试对象中的抗原接触；
(b)在所述(a1)的情况下，测定荧光色素的荧光强度，
在所述(a2)和(a3)的情况下，检测所述荧光色素的荧光；
(c)以液相中的抗原浓度与所述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标，在所述(a1)的情况下，计算出受试物质中含有的抗原量，在所述(a2)和(a3)的情况下，使受试对象中含有的抗原可见化。
8.如权利要求7所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽与抗体轻链可变区多肽结合成单链抗体。
9.如权利要求7或8所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，荧光色素为罗丹明类荧光色素或
Figure FDA00001770993200021
嗪类荧光色素。
10.如权利要求9所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，荧光色素为CR110、TAMRA或ATTO655。
11.如权利要求7~10中任一项所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号1表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽。
12.如权利要求7~10中任一项所述的抗原浓度测定和检测方法，其特征在于，抗体重链可变区多肽包括由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽，抗体轻链可变区多肽包括由序列号7表示的氨基酸序列构成的多肽。
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