JP2015232558A - 被検物質測定fret分子センサー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用して被検物質を測定するFRET分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ蛍光物質および蛍光競合物質が引き起こすFRETを利用する。
【選択図】 図13
Description
(I)被検物質測定FRET分子センサーまたは担体固定化被検物質測定FRET分子センサーと対象とを接触させる工程(対象接触工程)、
(II)励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程(照射測定工程)。
被験物質結合部としてイノシトール1,4,5三リン酸(IP3)受容体のリガンド結合部と、これに結合する蛍光競合物質を作成した。
(1)F−ADAの作成
9−[5−Deoxy−5−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]−(3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranosyl)−2−O−phosphoryl−β−D−ribo−pentofuranosyl]adenine(F−ADA)を下記の手順に従って作成した。
先ず、5’modified adenophostin誘導体合成の前駆体(化合物1、α−disaccharide triflate;T.Mochizuki et al.,Org.Lett.8:1455−1458,2006)を出発物質として、9−[5−Deoxy−5−ethynyl−(3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranosyl)−2−O−phosphoryl−β−D−ribo−pentofuranosyl]adenine(化合物7)を作成した。
m.p.158−159℃;1H−NMR(D2O 400MHz)δ8.47,8.38(each s, each 1H,H−2,H−8),6.33(d,1H,H−1’,J=4.98Hz),5.39(dd,1H,H−2’,J=4.98Hz,4.53Hz),5.24(d,1H,H−1’’,J=3.62Hz),4.70(t,1H,H−4’,J=4.98Hz),4.51(dd,1H,H−3’,J=9.06Hz),4.44(m,1H,H−3’’),4.13(t,1H,H−4’’,J=9.51Hz),3.84−3.73(m,4H,H−6’’a,6’’b,2’’,5’’),2.78(m,2H,H−5’a,5’b),2.41(s,1H,alkyne);13CNMR(D2O 100MHz)δ150.49,148.96,145.02,143.86,119.44,98.33,88.25(J=2.40Hz),88.02,80.24,78.63(J=8.40Hz),75.80(J=3.60Hz),75.36,73.48,72.87,72.00,70.94,60.65,47.25;31P NMR(D2O 162MHz)δ0.81,0.54,0.00;ESI−LRMS m/z 676(M+H)+;ESI−HRMS calcd for C18H25N5O17P3 676.01176,found 676.01126(M+H)+,HPLC purity:RT 7.982,98.11%
次に、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)からN−(3−azidepropyl)−N−(3’,6’−hydroxy−3−oxospiro[isobenzofuran−1(3H),9’−[9H]xanthen]−5−yl)−thiourea(化合物12)を作成した。
m.p.185−186℃;1H−NMR(CD3OD,400MHz)δ7.98(d,1H,H−12,J=1.81Hz),7.69(dd,1H,H−10,J=1.81Hz,6.34Hz),7.19(d,1H,H−9,J=8.16Hz),7.10(d,2H,H−4,5,J=9.06Hz),6.62−6.59(m,H−1,2,7,8,4H),3.71(dd,2H,J=6.34Hz,6.80Hz),3.42(dd,2H,J=6.80Hz,6.34Hz),1.92(m,2H);13C−NMR(CD3OD 125MHz)δ182.26,179.59,173.67,159.58,158.47,141.54,141.19,132.56,131.21,130.83,125.49,125.08,122.96,114.39,104.18,43.02,38.23,29.34,28.00;ESI−LRMS m/z 488(M+H)+;ESI−HRMS calcd for 488.10341 C24H18O5N5S,found 488.10429(M+H)+,HPLC purity:RT 15.127,99.053%
次に、本実施例1(1)[1−1]において作成した化合物7と本実施例1(1)[1−2]において作成した化合物12からF−ADA(化合物13)を作成した。
m.p.294−295℃(dec.);1H−NMR(CDCl3 400MHz)δ7.94,7.89(each s,each 1H,H−2,8),7.48(s,1H,triazole),7.35(s,1H,fluorescein−H−12),7.27(s,1H,fluorescein−H−10),7.12(m,3H,fluorescein−H−9,4,5),6.45(m,4H,fluorescein−H−1,2,7,8),6.19(m,1H,H−1’),5.15(m,2H,H−1’’,2’),4.49(m,1H,H−3’’),4.40(m,1H,H−3’),4.19(m,3H,H−4’’,triazole−CH2),3.93(m,4H,H−4’,6’’a,6’’B,2’’),3.87(m,1H,H−5’’,3.35,2H,H−5’a,H−5’b),3.05(m,CH2NH),1.90(m,CH2CH2CH2);31P−NMR(CDCl3 202MHz)δ5.23,4.67,4.42;ESI−LRMS m/z 1165(M+H)+;ESI−HRMS calcd for C42H45O22N10 165.15652,found 1165.15385(M+H)+,HPLC purity:RT 11.480,92.150%
(2R,3R,4S)−4−O−phosphoryl−2−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]methyl−tetrahydrofuran−3−yl−3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranoside(F−LL)を下記の手順に従って作成した。
先ず、本実施例1(1)[1−1]における反応中間体である化合物2(5−Deoxy−5−ethynyl−3−O−[2,6−di−O−benzyl−3,4−O−(2,3−dimethoxybutan−2,3−diyl)−α−D−glucopyranosyl]−1,2−O−isopropylidene−D−ribo−pentofuranose)を出発物質として、(2R,3R,4S)−4−O−phosphoryl−2−ethynylmethyl−tetrahydrofuran−3−yl−3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranoside(化合物11)を作成した。
m.p.143−144℃;1H−NMR(D20,500MHz)δ5.08(d,1H,H−1’,J=3.43Hz),4.76(m,1H,H−2),4.36(dd,1H,H−3’,J=8.59Hz,9.16Hz),4.21(t,1H,H−3,J=5.73Hz),4.05−3.91(m,4H,H−6’a,6’b,1a,1b),3.71−3.63(m,4H,H−4,4’,5’,2’),2.60−2.46(m,2H,H−5a,5b),2.30(s,1H,alkyne);13C−NMR(D2O,125MHz)δ97.59,80.65,78.49,77.44(J=6.00Hz),73.38,72.59,72.30,71.96,71.93(J=4.80),71.05,70.99(J=2.40),60.63,22.29;31P−NMR(D2O,202MHz)δ0.70,0.48,0.13;ESI−LRM m/z 543(M+H)+;ESI−HRMS calcd for C13H22O17P3 543.00753,found 543.00846(M+H)+
次に、本実施例1(1)本実施例1(2)[2−1]において作成した化合物11と[1−2]において作成した化合物12からF−LL(化合物14)を作成した。
m.p.298−299℃(dec.);1H−NMR(D2O,500MHz)δ7.80(m,1H,fluorescein−H−12),7.52(s,1H,triazole),7.42(m,1H,fluorescein−H−10),7.12(m,3H,fluorescein−H−9,4,5),6,47(m,4H,fluorescein−H−1,2,7,8),5.07(m,1H,H−1’),4.53(m,1H,H−2),4.38(m,3H,H−4,triazole−CH2),4.19(m,1H,H−5’),4.09(m,1H,H−3’),3.92(1H,H−3),3.80(m,3H,H−1a,1b,4’),3.70(m,1H,H−4),3.62(m,1H,H−2’),3.36(m,2H,H−5a,5b),3.25(m,2H,H−6’a,6’b),3.10(m,2H,CH2N),2.01(m,2H,CH2CH2CH2)31P−NMR(D2O,202MHz)δ5.15,4.51,4.32;ESI−LRMS m/z 1032(M+H)+;ESI−HRMS calcd for C37H41O22N5P3 1032.11767,found 1032.11795(M+H)+,HPLC purity:RT 10.680,90.679%
本実施例1(1)で得られたF−ADAおよび同(2)で得られたF−LLがIP3受容体のリガンド結合部と結合する蛍光競合物質になり得るかどうかの確認試験を行うべく、先ずは細胞内Ca2+貯蔵部位(Ca2+ストア)からCa2+が放出されるか否かの確認試験を行った。IP3はCa2+シグナルを誘導する細胞内メッセンジャーであり、IP3がCa2+チャネルであるIP3受容体のリガンド結合部と結合すると、IP3受容体が活性化して小胞体等の細胞内Ca2+貯蔵部位(Ca2+ストア)から細胞質にCa2+が放出される。この原理を利用した確認試験を行った。
容量が約100μLの実験チャンバーの中においてCOS−7細胞(RIKEN gene bank)を培養し、細胞を含む実験チャンバー内において10μMのmag−fura−2を含むHanks−Hepes液を30分間作用させることにより細胞の細胞内小器官内にmag−fura−2を取り込ませ、100μg/mLのサポニンを含む細胞内溶液様緩衝液(ICM;124mM KCl,25mM NaCl,1mM EGTA,330μM CaCl2,pH7.3)に細胞を約3分間暴露することによりチャンバー内の細胞をサポニンで穿孔してサポニン穿孔細胞を得た後、チャンバー内を1mM ATPと1mM MgCl2を含むICMに置換した。
本実施例1(3)[3−1]で得られたサポニン穿孔細胞に対し、様々な濃度のIP3、F−ADAおよびF−LLを作用させ、蛍光イメージング法により小胞体内Ca2+ストア内のCa2+濃度の変化を解析した。蛍光イメージング法は、蛍光倒立顕微鏡TE2000(ニコンインステック社)と、EM−CCDカメラC9100−13、高速波長切り替え装置U7773、W−View光学系および画像解析ソフトウェアAQUACOSMOSから構成されるイメージングシステム(浜松ホトニクス社)を用いて行った。具体的には、様々な濃度のIP3、F−ADAおよびF−LLを作用させたサポニン穿孔細胞を蛍光倒立顕微鏡TE2000(ニコンインステック社)にセットして345nmまたは380nmの光を照射し、蛍光フィルターを用いて535±12.5の蛍光を抽出した。得られた蛍光をEM−CCDカメラで同時記録して、画像解析ソフトウェアを用いて蛍光比を算出し、蛍光比の変化から、細胞内ストア内のCa2+濃度変化を解析することにより、IP3、F−ADAおよびF−LLのIP3受容体を介するCa2+放出の効力を算定した。その結果を図5に示す。
次に、蛍光IP3センサーLIBRAvIIS発現細胞に対するF−ADAの特異性を、次の手順に従って解析した。
既報(Tanimura et al.,J.Biol.Chem.,284:8910−8917,2009)に掲載されているLIBRAvIIS(LvIIS)発現プラスミドを細胞内に導入して、既存の蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)が発現した細胞を作成した。具体的には、容量が約100μLの実験チャンバーの中においてCOS−7細胞(RIKEN gene bank)を培養し、リポフェクトアミン2000(Life Technologies Corporation社)を用いて細胞にLIBRAvIIS(LvIIS)の遺伝子(配列番号19)を導入することにより、蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)が発現した細胞を得た。図6に蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)の構成を示す。図6中、「P」は細胞膜局在シグナルを示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPを示し、「L1」および「L2」はリンカーを示し、「IP3R2(1−604)with R440Q」はラット2型IP3受容体のリガンド結合部に親和性を高めるアミノ酸変異R440Qを入れたペプチド、すなわちラット2型IP3受容体のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の440番のアルギニン(R)をグルタミン(Q)へ変異させたペプチドを示し、「Venus」は黄色蛍光タンパク質EYFPのミュータントであってEYFP配列の46番のフェニルアラニン(F)をロイシン(L)へ、64番のフェニルアラニン(F)をロイシン(L)へ、153番のメチオニン(M)をトレオニン(T)へ、163番のバリン(V)をアラニン(A)へ、175番のセリン(S)をグリシン(G)へ、それぞれ変異させた黄色蛍光タンパク質Venus(T.Nagai et al.,Nat.Biotechnol.,20(1):87−90,2002)を示す。
細胞の細胞内小器官内にmag−fura−2を取り込ませることを除く他は、本実施例1(3)[3−1]と同様の手法に基づいて、同(4)[4−1]で得られた蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)が発現した細胞から蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)発現サポニン穿孔細胞を得た。
得られた蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)発現サポニン穿孔細胞にF−ADAを反応させ、本実施例1(3)[3−2]のイメージングシステム(浜松ホトニクス社)を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を蛍光イメージング法にて解析した。具体的には、蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)発現サポニン穿孔細胞に対しF−ADAを作用させた後、蛍光倒立顕微鏡TE2000(ニコンインステック社)にセットして435nmの光を照射し、試料からの蛍光をW−View光学系485nmのダイクロイックミラーを用いて2光路に分離した後、それぞれの光路に取り付けた蛍光フィルターを用いて480±15nmおよび535±12.5nmの蛍光を抽出した。それぞれの蛍光をEM−CCDカメラで同時記録して、画像解析ソフトウェアを用いて480nmの蛍光と535nmの蛍光の蛍光比を算出した。
従来の蛍光IP3センサーは、蛍光物質としてCFP(ECFP)およびYFP(Venus)の2つの蛍光タンパク質を有しているが、実施例1(4)の結果より、IP3受容体のリガンド結合部、蛍光物質として1つの蛍光タンパク質を備えていれば、F−ADAまたはF−LLといった蛍光競合物質とともに蛍光IP3センサーとして十分機能するのではないかとの知見が得られたことから、これを確認する試験を行った。
実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づいて、既報(Tanimura et al.,J.Biol.Chem.,284:8910−8917,2009)に掲載されている既存の蛍光IP3センサーであるLIBRAvI(LvI)(配列番号20)、LIBRAvII(LvII)(配列番号21)、LIBRAvIII(LvIII)(配列番号22)、LIBRAvN(LvN)(配列番号23)、LIBRAvIIS(LvIIS)(配列番号19)およびMP−LIBRAvIIS(MP−LvIIS)(配列番号24)の各プラスミドをそれぞれの細胞内に導入して、蛍光IP3センサーLIBRAvI(LvI)、LIBRAvII(LvII)、LIBRAvIII(LvIII)、LIBRAvN(LvN)、LIBRAvIIS(LvIIS)およびGeneScript社に依頼して合成したMP−LIBRAvIIS(MP−LvIIS)が発現した細胞をそれぞれ作成した。それぞれの蛍光IP3センサーの構成を図8に示す。図8中、「P」は細胞膜局在シグナルを示し、「MP」は小胞体局在シグナルを示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPを示し、「Cerulean」は青色蛍光タンパク質Ceruleanを示し、「L1」、「L1H1」、「L2」および「L2−6」はいずれもリンカーを示し、「IP3R1(1−604)」はラット1型IP3受容体アミノ酸配列のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「IP3R2(1−604)」はラット2型IP3受容体アミノ酸配列のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「IP3R2(1−604)with R440Q」はラット2型IP3受容体のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の440番のアルギニン(R)をグルタミン(Q)へ変異させたペプチドを示し、「IP3R3(1−604)with K507A」はラット3型IP3受容体アミノ酸配列のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の507番のリシン(K)をアラニン(A)へ変異させたことを示し、「Venus」は黄色蛍光タンパク質Venusを示す。
[2−1]黄色蛍光タンパク質が発光しない蛍光IP3センサーLIBRAvIISVm(LvIISVm)遺伝子の作成
次に、蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)のVenusを蛍光発色させないように変異させた蛍光IP3センサーLIBRAvIISVm(LvIISVm)を下記の手順に従って作成した。
Venus mutFP:GTG ACC ACC CTG GTC AAC CGC CTG CAG TGC TTC(配列番号25)
Venus mutRP:GAA GCA CTG CAG GCG GTT GAC CAG GGT GGT CAC(配列番号26)
次に、実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づいて、LIBRAvIISVm(LvIISVm)発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光IP3センサーLIBRAvIISVm(LvIISVm)が発現した細胞を作成した。蛍光IP3センサーLIBRAvIISVm(LvIISVm)の構成を図10に示す。図10中、「P」は細胞膜局在シグナルを示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPを示し、「L1」および「L2」はリンカーを示し、「IP3R2(1−604)with R440Q」はラット2型IP3受容体のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の440番のアルギニン(R)をグルタミン(Q)へ変異させたペプチドを示し、「Venus mutant」は無発色タンパク質Venus mutantを示す。
続いて、実施例1(4)[4−2]と同様の手法に基づいて、本実施例2(1)および(2)で得られた蛍光IP3センサーLIBRAvI(LvI)、LIBRAvII(LvII)、LIBRAvIII(LvIII)、LIBRAvN(LvN)、LIBRAvIIS(LvIIS)およびMP−LIBRAvIIS(MP−LvIIS)が発現した細胞からそれぞれの蛍光IP3センサー発現サポニン穿孔細胞を得て、終濃度が10nMまたは30nMとなるようにF−ADAを作用させた他は、実施例1(4)[4−3]と同様の手法に基づいて、それぞれの蛍光IP3センサー発現サポニン穿孔細胞における480nmの蛍光と535nmの蛍光の蛍光比を算出した。その結果を図11に示す。
次に、1つの蛍光タンパク質を備えた蛍光IP3センサーについて、次の手順に従って検討した。
蛍光IP3センサーLIBRAvIIS(LvIIS)遺伝子からVenus遺伝子を除去した蛍光IP3センサーLIBRAvIISVd(LvIISVd)発現ベクターを作成した。具体的には、LIBRAvIIS(LvIIS)発現プラスミドおよびECFP−C1発現プラスミド(Clontech社;配列番号28)を制限酵素NheIとEcoRIにより切断し、LIBRAvIIS(LvIIS)発現プラスミドから精製したECFPとラット2型IP3受容体のリガンド結合部遺伝子を含むDNA断片をECFP−C1発現プラスミドのNheI/EcoRI切断サイトに挿入することによりLIBRAvIISVd(LvIISVd)遺伝子(配列番号29)を作成した。LIBRAvIISVd(LvIISVd)遺伝子の作成手順を図12に示す。図12中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「MT」は膜結合遺伝子配列を示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPの遺伝子配列を示し、「LBD」はIP3受容体のリガンド結合部の遺伝子配列を示し、「Venus」は黄色蛍光タンパク質Venusの遺伝子配列を示す。
次に、実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づいて、LIBRAvIISVd(LvIISVd)発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光IP3センサーLIBRAvIISVd(LvIISVd)が発現した細胞を作成した。蛍光IP3センサーLIBRAvIISVd(LvIISVd)の構成を図13に示す。図13中、「P」は細胞膜局在シグナルを示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPを示し、「L1」はリンカーを示し、「IP3R2(1−604)with R440Q」はラット2型IP3受容体のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の440番のアルギニン(R)をグルタミン(Q)へ変異させたペプチドを示す。
続いて、実施例1(4)[4−2]と同様の手法に基づいて、本実施例3(2)で得られた蛍光IP3センサーLIBRAvIISVd(LvIISVd)が発現した細胞から蛍光IP3センサー発現サポニン穿孔細胞を得て、終濃度が30nMまたは100nMとなるように蛍光競合物質F−ADAまたはF−LLを作用させた他は、実施例1(4)[4−3]と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質F−ADAまたはF−LLを作用させた蛍光IP3センサーLIBRAvIISVd(LvIISVd)発現サポニン穿孔細胞における480nmの蛍光および535nmの蛍光の蛍光比を算出した。その結果を図14および図15に示す。
蛍光競合物質が被検物質IP3と競合してIP3受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かを確認する試験を、下記の手順に従って行った。
実施例3において、一種類の蛍光タンパク質およびIP3受容体のリガンド結合部を有する蛍光IP3センサー、ならびに蛍光競合物質を備えた、蛍光タンパク質(ECFP)および蛍光競合物質が引き起こすFRETを利用するIP3測定FRET分子センサーを構築できることが示された。そこで、当該蛍光IP3センサーを担体に固定化し、これと蛍光競合物質との組み合わせにより、担体に固定化したIP3を測定したFRET分子センサーを構築できるか否かを検討した。
[1−1]蛍光IP3センサーcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)遺伝子の作成
先ず、実施例2(1)のMP−LIBRAvIIS(MP−LvIIS)(図8)発現プラスミド(配列番号24)を制限酵素SacIにより切断し、小胞体局在ドメインMPを除去した後に再結合させて、細胞質型蛍光IP3センサーであるcyLIBRAvIIS(cyLvIIS)発現プラスミド(配列番号30)を作成した。続いて、作成したcyLIBRAvIIS(cyLvIIS)発現プラスミドを制限酵素SmaIとHincIIにより切断、再結合させてVenus遺伝子を除去することにより、1つの蛍光タンパク質を備えた細胞質型蛍光IP3センサーであるcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)遺伝子(配列番号31)を作成した。cyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)遺伝子の作成手順を図18に示す。図18中、「ERT」は小胞体結合遺伝子配列を示し、「HisTag」は6個の連続するヒスチジン(His;H)残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示し、「Cerulean」は青色蛍光タンパク質Ceruleanの遺伝子配列を示し、「LBD」はIP3受容体のリガンド結合部の遺伝子配列を示し、「Venus」は黄色蛍光タンパク質Venusの遺伝子配列を示し、「ECFP」は青色蛍光タンパク質ECFPの遺伝子配列を示す。
次に、実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づいて、cyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光IP3センサーcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)が発現した細胞を作成した。蛍光IP3センサーcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)の構成を図19に示す。図19中、「6H」は6個の連続するヒスチジン(His;H)残基からなる精製用のタグペプチドを示し、「Cerulean」は青色蛍光タンパク質Ceruleanを示し、「L1H1」はリンカー(Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Ser−Arg(EAAARSR);配列番号32)を示し、「IP3R2(1−604)with R440Q」はラット2型IP3受容体のリガンド結合部に親和性を高めるアミノ酸変異R440Qを入れたペプチド、すなわちラット2型IP3受容体のN末端から1〜604番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の440番のアルギニン(R)をグルタミン(Q)へ変異させたペプチドを示す。
蛍光競合物質が被検物質IP3と競合して担体固定化蛍光IP3センサーのIP3受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かを確認する試験を、下記の手順に従って行った。
本実施例5(1)で作成した担体固定化蛍光IP3センサーcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)に、終濃度が100nMとなるように蛍光競合物質F−LLを作用させた後に終濃度が0.1μM、1μMないし10μMとなるように段階的にIP3を作用させた他は、実施例1(4)[4−3]と同様の手法に基づいて、F−LLおよびIP3を作用させた担体固定化蛍光IP3センサーcyLIBRAvIISVd(cyLvIISVd)における480nmの蛍光と535nmの蛍光の蛍光比および蛍光変化率を算出した。その結果を図21に示す。
IP3受容体のリガンド結合部のアミノ酸配列に1〜十数個のアミノ酸が付加、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質がIP3受容体のリガンド結合部として機能するか否か、および蛍光IP3センサーにおいて、蛍光タンパク質の代わりに有機蛍光化合物を蛍光物質として用いることができるか否かを同時に検討した。
蛍光タンパク質の代わりにシステイン結合性蛍光有機化合物であるN−[4−メチル−7−(ジメチルアミノ)クマリン−3−イル]マレインイミド(DACM)を用いることを目的として、マウス1型IP3受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸82番と83番との間にLumioTag(LT、CCPGCC、配列番号33)を挿入したOP1−ma(EN)−E、ラット1型IP3受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸140番と141番との間にLumioTagを挿入したOP1−ma(EN)−S、および当該挿入したLumioTagを除去したOP1−ma(EN)−E−Sを、以下の手順に従ってそれぞれ作成した。
先ず、膜結合ドメイン、FLAGタグ、ヒスチジンタグおよびLumioTagを含む12個のアミノ酸からなるペプチド鎖をマウス1型IP3受容体のリガンド結合部に付加または挿入したLhb−ma(配列番号34)を作成した。具体的には、膜結合ドメイン、FLAGタグおよびヒスチジンタグを付加し、かつLumioTagをマウス1型IP3受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸82番と83番との間、およびアミノ酸140番と141番との間に挿入した遺伝子配列を有するLhb−1プラスミド(配列番号35)をGeneScript社に依頼して合成し、得られたLhb−1プラスミドおよび実施例2(1)のLIBRAvIII(LvIII)プラスミド(配列番号22)を制限酵素NheIおよびNotIにより切断した後、Lhb−1遺伝子を含むDNA断片をLIBRAvのベクターに挿入することによりLhb−ma遺伝子を作成した。
本実施例6(1)[1−1]で得られたLhb−ma遺伝子を制限酵素EcoRVおよびNru1により切断した後、再結合することにより、マウス1型IP3受容体のリガンド結合部上流のLumioTagを除去した。これによって、マウス1型IP3受容体のリガンド結合部のアミノ酸82番と83番との間、およびアミノ酸140番と141番との間にLumioTagを含むOP1−ma(EN)遺伝子が得られた。
本実施例6(1)[1−2]で得られたOP1−ma(EN)遺伝子を制限酵素ScaIで切断した後、再結合することにより、マウス1型IP3受容体のリガンド結合部のアミノ酸82番と83番との間のLumioTagを除去した。これによって、マウス1型IP3受容体のリガンド結合部のアミノ酸140番と141番との間にLumioTagを含むOP1−ma(EN)−S遺伝子(配列番号36)が得られた。
続いて、実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づき、OP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−Sのそれぞれの発現プラスミドを細胞内に導入することによりOP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−Sがそれぞれ発現した細胞を作成した後、実施例1(4)[4−2]と同様の手法に基づき、OP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−Sがそれぞれ発現した細胞からそれぞれのサポニン穿孔細胞を得た。得られたそれぞれのサポニン穿孔細胞に対し、システイン結合性蛍光有機化合物であるN−[4−メチル−7−(ジメチルアミノ)クマリン−3−イル]マレインイミド(DACM)2μMにて処理を2分間行い、DACMが結合した蛍光IP3センサーOP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−Sを細胞膜上に発現させた。これら蛍光IP3センサーOP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−S発現サポニン穿孔細胞に対し、終濃度が100nMとなるように蛍光競合物質F−ADAを作用させた他は、実施例1(4)[4−3]と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質F−ADAを作用させた蛍光IP3センサーOP1−ma(EN)−S、OP1−ma(EN)−E、およびOP1−ma(EN)−E−S発現サポニン穿孔細胞における480nmの蛍光および535nmの蛍光の蛍光強度、ならびに480nm/535nm蛍光比を算出した。その結果を図23に示す。
実施例6の結果から、IP3受容体のリガンド結合部の内部にペプチド鎖を挿入しても、IP3受容体のリガンド結合部の機能は損なわれなかったことから、IP3受容体のリガンド結合部の内部に蛍光タンパク質であるECFPの円順列置換体を挿入した蛍光IP3センサーについて検討するとともに、蛍光競合物質との組み合わせにより担体固定化IP3測定FRET分子センサーの構築可能か否かについて検討した。
実施例6(1)[1−3]で作成したOP1−ma(EN)−E−Sのリガンド結合部のアミノ酸82番と83番との間に、ECFPの円順列置換体である蛍光タンパク質cpSECFP157、cpSECFP173、およびcpSECFP229(Nagai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,101:10554−10559,2004)を挿入した。具体的には、cpSECFP157、cpSECFP173、およびcpSECFP229を発現するベクター(配列番号39〜41)を制限酵素EcoRVおよびXca1(SnaI)で切断して各蛍光タンパク質遺伝子を精製した。精製した各蛍光タンパク質遺伝子を、ScaIで切断したOP1−ma(EN)−E−S発現プラスミドに挿入して、蛍光IP3センサーOP1S−cpC157,OP1S−cpC173およびOP1S−cpC229発現プラスミド(配列番号42〜44)を作成した。OP1S−cpC157遺伝子,OP1S−cpC173遺伝子およびOP1S−cpC229遺伝子の作成手順を図24に示す。図24中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「MT」は膜結合遺伝子配列を示し、「FLAG」はFLAGタグの遺伝子配列を示し、「E1」はScaI切断サイトを示し、「E2」はEco47III切断サイトを示し、「1−82−E1−83−140−E2−141−604」はIP3受容体のリガンド結合部の改変タンパク質の遺伝子配列を示し、「Hx6」は6個の連続するヒスチジン(His;H)残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示し、「cpSECFP157」、「cpSECFP173」および「cpSECFP229」はそれぞれECFPの円順列置換体である蛍光タンパク質cpSECFP157、cpSECFP173、およびcpSECFP229の遺伝子配列を示し、「1−82−cpSECFP157−83−140−E2−141−604」、「1−82−cpSECFP173−83−140−E2−141−604」、および「1−82−cpSECFP229−83−140−E2−141−604」はそれぞれECFPの円順列置換体である蛍光タンパク質cpSECFP157、cpSECFP173、およびcpSECFP229をIP3受容体のリガンド結合部の改変タンパク質へ挿入した遺伝子配列を示す。
続いて、実施例1(4)[4−1]と同様の手法に基づき、蛍光IP3センサーOP1S−cpC157、蛍光IP3センサーOP1S−cpC173、および蛍光IP3センサーOP1S−cpC229のそれぞれの発現プラスミドを細胞内に導入することにより蛍光IP3センサーOP1S−cpC157,OP1S−cpC173、およびOP1S−cpC229がそれぞれ発現した細胞を作成した後、実施例1(4)[4−2]と同様の手法に基づき、蛍光IP3センサーOP1S−cpC157,OP1S−cpC173、およびOP1S−cpC229がそれぞれ発現した細胞からそれぞれのサポニン穿孔細胞を得た。終濃度が100nMとなるように蛍光競合物質F−ADAを作用させた他は、実施例1(4)[4−3]と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質F−ADAを作用させた蛍光IP3センサーOP1S−cpC157,OP1S−cpC173、およびOP1S−cpC229発現サポニン穿孔細胞における480nmの蛍光および535nmの蛍光の蛍光強度、ならびに480nm/535nm蛍光比を算出した。その結果を図25に示す。
蛍光物質および抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して対象とする抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質を備えた被検物質測定FRET分子センサーを構築して、競合的蛍光抗原アッセイ(Competitive Fluorescence Antigen Assay:CFAA)の構築を試みた。
ヒトIP3受容体のパラログであるヒト2型IP3受容体(ヒトIP3R2)のC末端、2685〜3001番の18アミノ酸CGFLGSNTPHVNHHMPPHで構成されるペプチドであるCT2−18(配列番号45)をFITCにより蛍光修飾して得られる蛍光ペプチド(F−CT2−18)は、CT2−18と競合し、かつCT2−18を抗原として作成した抗体(ABsII)のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合する蛍光競合物質である。抗体の作成に使用した抗原ペプチドCT2−18およびCT2−18のN末端にFITCによりラベルした蛍光ペプチドF−CT2−18を、United Biosystems Inc.のDr.CabinJohn,MD(USA)に依頼することにより合成した。
既報(Tanimura et al.,J.Biol.Chem.,275:27488−27493,2000)に記載されているCT2−18を抗原として作成した抗体ABsIIに対し、200μMのDACMを30分間作用させることにより、蛍光物質DACMでラベルしたABsIIを有する蛍光ABsII−CT2−18センサーを作成した。具体的には、約10μgのABsIIおよび0.05%のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)1000μLに10μMのDACMを加え、4℃で2時間静置した後、10μLのProtein Gアガロースビーズを加え、さらに4℃で2時間静置することによりアガロースビーズに蛍光ABsII−CT2−18センサーを結合させた後、リン酸緩衝液で洗浄した。蛍光ABsII−CT2−18センサーを結合させたアガロースビーズを100μLのリン酸緩衝液に分散し、AからDのチューブに20μLずつ分注した。Aのチューブにはリン酸緩衝液を、Bのチューブには1μMの蛍光競合物質F−CT2−18を、Cのチューブには1μMの蛍光競合物質F−CT2−18および1μMの被検物質CT2−18を、Dのチューブには1μMの蛍光競合物質F−CT2−18および10μMの被検物質CT2−18を、それぞれ100μL加え、2時間静置した。
これらのアガロースビーズ結合蛍光ABsII−CT2−18センサーおよび蛍光競合物質F−CT2−18の作用による蛍光を、実施例1(3)[3−2]のイメージングシステム(浜松ホトニクス社)を用いて測定して、480nm/535nm蛍光比を算出した。その結果を図26に示す。図26Aはアガロースビーズ結合蛍光ABsII−CT2−18センサーをリン酸緩衝液で洗浄後に蛍光測定を行った結果であり、図26Bはアガロースビーズ結合蛍光ABsII−CT2−18センサーを洗浄せずに蛍光測定を行った結果である。
細胞膜表面のニコチン性アセチルコリン受容体を蛍光物質でラベルし、FITCによりラベルしたニコチン性アセチルコリンである蛍光競合物質を用いることにより、生体内のアセチルコリン濃度を測定することができる。
(1)蛍光被験物質センサーの作製
Protein Gビーズ(SANTA CRUS社製 protein G agalose)溶液100μLに、抗cMycモノクローナル抗体(1mg/mL)25μLを加え、4℃で2時間インキュベートして、ビーズに抗体を結合させた。リン酸緩衝液(PBS)で抗体ビーズを洗浄後、400μLの抗体ビーズ溶液に対して8μLの10mM DACMを加えて4℃で30分間インキュベートした(最終濃度200μM)。その後、50μMのシステインを加えて反応を停止して、DACMでラベルされた抗c−Myc抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーを作製した。
2mMのc−Mycペプチド(アミノ酸配列:EQKLISEEDL、配列番号46)溶液100μL(240μg)にFITCラベル試薬(Dojindo社製 Fluorescein Labeling Kit−NH)5μLを加え、4℃、10分間のインキュベーションによりペプチドをFITCラベルした。その後、10%ウシ血清アルブミン(BSA)を5μL(500μg)加え、20分間のインキュベーションによって、余剰のラベル試薬をBSAと反応させた。その後、限外濾過によって分子量<50Kdの蛍光ペプチド(FITC−cMyc)を回収することで、蛍光競合物質を作製した。
25μgの抗cMycモノクローナル抗体を含むPBS 400μLに対して8μLの10mM DACMを加えて4℃で30分間インキュベートした。その後、50μMのシステインで反応を停止して、限外濾過によって分子量<50Kdの画分を除去し、DACMでラベルされた抗c−Myc抗体である蛍光被験物質センサーを作製した。
0.01%BSAを含むPBSに(1)及び(3)で作製した蛍光被験物質センサーをそれぞれ加え、(2)で作製した蛍光競合物質20μMを、または蛍光競合物質20μMと被験物質(FITCでラベルされていないc−Mycペプチド)400μMとを加え、2時間反応させた。それぞれの反応溶液5μLをカバーガラスに滴下し、×20の対物レンズを装着した蛍光イメージング・システム(実施例1、(4)、[4−3]参照)を用いて、425nmの励起による、480nmと535nmの蛍光イメージを記録し、その蛍光比(480nm/535nm)を測定した。その結果を図27に示す。左のグラフが固相化された蛍光被験物質センサーを用いたときの、右のグラフが固相化されていない蛍光被験物質センサーを用いたときの蛍光比である。
(1)蛍光被験物質センサーの作製
実施例10の(1)と同様にして、DACMでラベルされた抗DYK抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーを作製した。
United Peptide社に依頼して、FITCでラベルされたDYKペプチド(アミノ酸配列:GDYKDDDDKCCPGCCGGGGGGGGGHHHHHH、配列番号47、FT1と表す)を蛍光競合物質として作製した。また被験物質として蛍光ラベルされていないDYKペプチド(FT2)を作製した。
実施例10の(4)と同様にして、DACMでラベルされた抗DYK抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーと蛍光競合物質であるFT1 0.4μM、またはFT1 0.4μMと被験物質4.0μMとを反応させ、蛍光イメージング・システムを用いて蛍光比(480nm/535nm)を測定した。その結果を図28に示す。
(1)蛍光被験物質センサーの作製
Protein Gビーズ(SANTA CRUS社製 protein G agalose)溶液100μLに、抗タイプ2 IP3受容体抗体(ABsII)を加え4℃で2時間インキュベートし、抗体ビーズを作成した。リン酸緩衝液(PBS)で抗体ビーズを洗浄後、400μLの抗体ビーズ溶液に対して8μLの10mM DACMを加えて(最終濃度200μM)4℃で30分間インキュベートした。その後、50μMのシステインで反応を停止させた。さらに、8μLの10mMのIsothiocyanobenzyl−NTA(Dojindo社製)(最終濃度200μM)を加えて4℃で30分間インキュベートした。その後、50μMのシステインで反応を停止させ、さらに10mMのNiCl2を加えて30分間インキュベーションすることで、DACMで標識され、Ni−NTA錯体を有する蛍光被験物質センサーを作製した。
実施例10の(4)と同様にして、0.01%BSAを含むPBSに(1)で作製した蛍光被験物質センサーを加え、実施例11の(2)で作製したFT1 100μM、又はFT1 100μMと被験物質(FT1と競合するペプチド)であるFT2 100μMとを反応させ、蛍光イメージング・システム(対物レンズの倍率は×10)を用いて蛍光比(480nm/535nm)を測定した。その結果を図29に示す。
(1)DACMでラベルされたビーズの作製
Protein Gビーズ(SANTA CRUS社製 protein G agalose)溶液400μLに対して8μLの10mM DACMを加えて(最終濃度200μM)4℃で30分間インキュベートした。その後、50μMのシステインを加えて反応を停止して、DACMでラベルされたProtein Gビーズ(DACM−PG)を蛍光被験物質センサーとして作製した。
100μgの抗タイプ2 IP3受容体抗体(ABsII)を含むPBS溶液にFITCラベル試薬(Dojindo社製 Fluorescein Labeling Kit−NH)5μLを加え、4℃、10分間のインキュベーションによりABsIIをFITCラベルした。その後、限外濾過によって分子量<50Kdの画分を除去し、FITCでラベルされたABsII(FITC−ABsII)を回収することで、蛍光競合物質を作製した。
(3)蛍光イメージング法による解析
0.01%BSAを含むPBSに(1)で作製した蛍光被験物質センサーを加え、(2)で作製した蛍光競合物質0.1μg/mLを、または蛍光競合物質0.1μg/mLと被験物質(FITCでラベルされていないABsII)0.1μg/mLまたは1.0μg/mLとを加え、2時間反応させた。それぞれの反応溶液5μLをカバーガラスに滴下し、×10の対物レンズを装着した蛍光イメージング・システム(実施例1、(4)、[4−3]参照)を用いて、425nmの励起による、480nmと535nmの蛍光イメージを記録し、その蛍光比(480nm/535nm)を測定した。その結果を図30に示す。
Claims (7)
- 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用して被検物質を測定するFRET分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすFRETを利用する前記FRET分子センサー。
- 蛍光物質が蛍光タンパク質またはタンパク質蛍光標識物質である、請求項1に記載のFRET分子センサー。
- 被検物質結合部がイノシトール1,4,5三リン酸(IP3)受容体のリガンド結合部であり、蛍光競合物質が9−[5−Deoxy−5−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]−(3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranosyl)−2−O−phosphoryl−β−D−ribo−pentofuranosyl]adenine(F−ADA)または(2R,3R,4S)−4−O−phosphoryl−2−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]methyl−tetrahydrofuran−3−yl−3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranoside(F−LL)である、請求項1または請求項2に記載のFRET分子センサー。
- 被検物質結合部が抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分であって、蛍光競合物質が前記抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質である、請求項1または請求項2に記載のFRET分子センサー。
- 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用して被検物質を測定するFRET分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有して担体に固定化された蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすFRETを利用する担体固定化被検物質測定FRET分子センサー。
- 請求項1から請求項4のいずれか一項に記載の被検物質測定FRET分子センサーまたは請求項5の担体固定化被検物質測定FRET分子センサーと対象とを接触させる工程と、
励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程と
を有する、蛍光の強度を指標として対象中の被検物質を測定する方法。 - 9−[5−Deoxy−5−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]−(3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranosyl)−2−O−phosphoryl−β−D−ribo−pentofuranosyl]adenine(F−ADA)または(2R,3R,4S)−4−O−phosphoryl−2−[N−[[1−[5−[[3’,6’−dihydroxy−3−oxospiro(isobenzofuran−1,9’−xanthen)−5−yl]amino]thioxomethyl]amino]propyl]−1H−1,2,3−triazol−4−yl]methyl−tetrahydrofuran−3−yl−3,4−di−O−phosphoryl−α−D−glucopyranoside(F−LL)の、請求項1または請求項2に記載のFRET分子センサーにおける蛍光競合物質としての使用。
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JP2020051830A (ja) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 学校法人東日本学園 | Fret法における被検物質蛍光センサーの固定用無機系繊維シート |
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