KR101600177B1 - 살아있는 세포내 막 단백질 결합 양상을 분석하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살아있는 단일 세포내 막 단백질 결합 양상을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 결합 양상을 분석하는 방법은 리간드에 표지하지 않고 표적 막 단백질과 이에 특이적으로 결합할 수 있는 후보물질과의 결합 양상을 정확, 민감, 신속하면서 쉬운 방법으로 분석할 수 있고, 이에 따라 막 단백질과 후보물질의 결합에 대한 위치, 정량적인 정보를 직접적이고 정확하게 측정할 수 있다. 이러한 효과로 인해 해리상수(dissociation constant), 돌연변이 연구(mutant study), 복합체 형성(complex formation), 신호전달(signal transduction)등 다양한 활용에 적용할 수 있으며, 나아가 아직 밝혀지지 않은 많은 막 단백질과 후보물질에 대해서도 탐구할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

살아있는 세포내 막 단백질 결합 양상을 분석하는 방법{METHOD OF ANALYZING BINDING ASPECT OF MEMBRANE PROTEIN IN A LIVING CELL}

본 발명은 살아있는 세포에서 막 단백질과 후보물질의 결합 양상을 분석하는 방법에 관한 것이다.

세포 막은 세포를 유지하는데 있어서 필수적인 요소이고, 세포 막에 존재하는 막 단백질은 리간드와의 역동적인 결합을 통해 세포 안과 밖의 의사소통에 중요한 역할을 한다. 실제로 세포에 존재하는 단백질의 절반 정도가 세포막에서 리간드와 결합을 한다고 알려져 있지만, 여전히 많은 부분에 대해서 잘 알려져 있지 않다. 이러한 결합을 밝히기 위해 수많은 기술들과 시도들이 지난 세월 동안 행해졌고, 연구자들은 여전히 노력을 기울이고 있다.

세포밖의 환경은 세포막 내부에 비해 점성이 상대적으로 매우 작기 때문에 리간드가 결합하는 막 단백질의 세포밖 부분이 표적 단백질의 확산에 미칠 수 있는 영향은 간과되어 왔으며, 막 단백질의 확산 이론인 Saffman-Delbruck 모델을 포함한 많은 연구들이 이러한 막 단백질의 확산을 결정하는 데 있어서 막통과 부분에 집중하여 그 중요성에 대해서 설명하고 있다. 따라서 표적 막 단백질의 세포밖 부분과 리간드의 결합을 확산을 기반으로 측정하는 것은 근본적으로 어렵다고 여겨져 왔다. 그러나 이러한 기존의 연구에서 사용하는 시스템은 분리 정제된 막 단백질을 이용하여 세포밖의 환경에서 측정하거나, 표적 막 단백질을 인위적으로 제작한 지질막에 넣음으로써 인공적이고 통제된 환경 하에서 표적 막 단백질과 리간드의 결합을 분석하는데 집중해 왔기 때문에 실제 세포막의 복잡한 구성을 반영할 수 없어 세포밖에 결합하는 리간드에 대한 결합 분석에는 한계가 있었다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명은 살아있는 단일 세포에서 표적 막 단백질과 이에 특이적으로 결합할 수 있는 후보물질 간의 결합 양상을 민감하게 분석하는 방법을 제공하고자 한다.

또 다른 본 발명의 목적은 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위한 수단으로, 본 발명의 일 구현예는 표적 막 단백질을 발현하는 살아있는 세포에서 후보물질의 처리 전후의 표적 막 단백질의 확산계수를 구하고, 이를 통해 얻어진 하나 이상의 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 분석하는 단계를 포함하는 상기 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 방법을 제공한다.

또한, 다른 일 구현예는 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 단계; 및 상기 결합양상을 이용하여 상기 후보물질 중에서 상기 표적 막 단백질에 특이적으로 작용하는 약물을 결정하는 단계를 포함하는, 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표적 막 단백질을 발현하는 살아있는 세포에서 후보물질의 처리 전후의 표적 막 단백질의 확산계수를 구하고, 이를 통해 얻어진 하나 이상의 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 분석하는 단계를 포함하는 상기 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 방법을 제공한다.

다양하고 역동적인 막 단백질과 리간드와의 결합은 여러 환경 변화에 대처하는 세포들의 반응 중의 하나이다. 다양한 리간드와 결합한 막 단백질의 복합체는 세포의 여러 가지 역할에 참여하고 있다. 하지만 이러한 막 단백질 복합체를 확인하는 것에는 기술적인 제한점이 존재하고 있기 때문에 많은 부분에 대해 여전히 잘 알지 못한다. 본 발명자들은 이러한 한계를 뛰어넘고자 단일 입자 추적(single particle tracking, SPT) 방법과 초 고해상도(super-resolution) 현미경 기술을 결합한 smDIMSA(single molecule diffusional mobility shift assay) 방법을 완성하였으며, 상기 방법은 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 방법으로 활용이 될 수 있다. smDIMSA 방법은 살아있는 세포에서의 확산계수의 변화를 측정하기 때문에, 인위적으로 형성된 환경이 아닌 실제 세포가 살아있고 기능을 하는 환경에서의 생물학적인 반응에 대해 연구를 할 수 있다.

본 발명의 분석 방법은 표적 막 단백질에 연결된 형광단백질 또는 형광물질이 결합되어 있고, 표적 막 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 프로브의 형광을 탐지함으로써 하기 (1) 내지 (3)의 특성을 가진다:

(1) 리간드 무표지적 측정 (Non-labeling of ligand and direct binding measurement),

(2) 리간드와 수용체 특이성 (Ligand-Receptor Specificity),

(3) 크기 민감성 (Size sensitivity).

상기 (1)과 관련하여, 종래 유세포 분석, FRET, 또는 다른 형광 기반의 측정법을 이용할 때에는 막 단백질뿐만 아니라 결합하는 후보물질에 대해서도 동시에 형광물질의 표지가 필요했기 때문에 후보물질이 다양해지는 경우 여러 가지 표지가 필요하였다. 그러나, 본 발명의 방법은 후보물질의 표지를 요하지 않기 때문에 추가적인 형광이 필요하지 않고 단지 확산계수의 변화만을 통해 결합 여부를 판단할 수 있는 장점을 가진다.

상기 (2)와 관련하여, 상기 방법을 이용하기 위해서 측정하고자 하는 표적 막 단백질에 형광단백질을 연결시키거나 형광물질이 결합되어 있고, 표적 막 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 표적 막 단백질을 특이적으로 탐지하게 됨으로써, 주위의 다른 막 단백질이 관찰할 때 영향을 끼치지 못하게 하는 장점을 가진다.

상기 (3)과 관련하여, 확산계수의 변화를 관찰함으로써 크기를 모르는 물질에 대해서도 확산계수의 변화를 통해 크기를 유추할 수 있는 장점을 가진다.

상기 (1) 내지 (3) 특성으로 인해, 상기 방법은 (a) 해리상수(dissociation constant), (b) 돌연변이 연구(mutant study), (c) 복합체 형성(complex formation), (d) 신호전달(signal transduction) 등 다양한 막 단백질 연구 분야에 적용될 수 있다.

(a)와 관련하여, 해리상수(dissociation constant)는 생화학이나 약학분야에서의 막 단백질과 리간드의 결합 정도를 가늠할 수 있는 중요한 기준이다. 실제 해리상수는 관심 있는 단백질을 정제한 후, SPR(surface plasmon resonance)나 filter binding assay 등을 통해 일반적으로 측정된다. 하지만 막 단백질의 특성상 정제가 어렵다는 점 때문에 해리상수의 측정 역시 어려움을 겪어왔다. 만약 두 개의 다른 군집이 동시에 존재한다면, 상기 방법을 통해 두 군집의 비율을 유추할 수 있다. 상기 방법을 이용하면 리간드가 결합 또는 결합하지 않은 군집은 크기가 같지 않기 때문에 확산계수에 차이를 구분할 수 있고, 이 비율을 이용해 단세포 수준에서 해리상수를 정량적으로 측정이 가능하다.

(b)와 관련하여, 돌연변이 단백질은 질병 진단의 중요한 마커로 사용된다. 만약 세포에서 돌연변이 단백질과 리간드와의 결합을 이해한다면, 혼합된 세포의 시그널에서 돌연변이의 시그널을 구분해 낼 수 있게 되고, 질병 연구에 있어서 큰 도움이 될 수 있다. 상기 방법을 이용하게 되면 정상적인 단백질과 혼재되어 있는 상태의 돌연변이 단백질에 대하여 돌연변이 단백질로부터 유래된 특이적인 결합만을 관찰할 수 있으므로 이로부터 돌연변이 단백질 특이적인 특성을 분석할 수 있다.

(c)와 관련하여, 단백질은 일반적으로 거대한 분자복합체를 이루어 특정 역할을 수행하게 된다. 하지만 막 단백질은 정제하여 분리하기 힘들기 때문에 분자복합체의 형성에 대한 연구에 어려움이 많다. 하지만 상기 방법을 이용하게 되면, 이러한 복합체를 이루는 과정 속에서 분자의 크기가 커지고, 이는 확산계수와 직접적으로 연결되어 있기 때문에 복합체를 이루는 과정을 알 수 있게 된다.

하기 실시예에서는 EGFR 항체와 EGFR과 EGFR 항체의 결합 유무를 확산계수의 변화를 통해 확인한 실시예(도 5 및 도 13 참조), GPCR과 G 단백질과의 결합 유무를 화학적 저해제 를 처리함으로써 측정이 가능함을 보인 실시예(도 7 참조)를 통해 표적 막 단백질과 후보물질의 결합 유무를 확산계수의 변화 분석을 통해 확인할 수 있음을 보여준다. 또한, 도 19는 확산계수의 변화값과 후보물질의 분자량에 상관관계를 통해 확산계수를 측정하는 것만으로 분자량을 알 수 있음을 보여준다. 또한, 도 21은 세툭시맙(후보물질)의 처리 농도를 조금씩 증가시켜가면서 확산계수의 변화를 측정한 결과를 통해 세툭시맙과 결합되어 있는 EGFR의 비율을 분석할 수 있음을 보여준다. 이를 통해 도 22와 같은 플롯(plot)을, 그리고 이로부터 해리상수 Kd와 결합 협동성(cooperativity)를 구할 수 있게 된다. 복합체 형성과정에 대한 예시는 도 27과 도 28에서 찾아볼 수 있다. 표적 막 단백질에 직접 결합하는 1차 항체에 대한 2차 항체, 2차 항체에 대한 3차 항체를 이용하여 항체 복합체 형성을 측정한 것을 확인할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 막 단백질은 세포나 세포소기관의 막(membrane)에 결합된 단백질을 의미하며, 표적 막 단백질이란 막에 존재하는 수많은 막 단백질 중 관찰하고자 하는 목적의 막 단백질을 의미한다. 막 단백질은 내재성 막 단백질(integral membrane protein), 표재성 막 단백질(peripheral membrane protein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 막 당단백질(membrane glycoprotein), 지질 공정 막 단백질(lipid anchored membrane protein) 등을 포함한다.

예를 들어, 상기 막 단백질로는 내재성 막 단백질에 속하는 RTK(Receptor Tyrosine Kinase), GPCR(G protein coupled receptor), Ion-channel, PRR(Pattern recognition receptor) 등을 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 RTK로는 RTK class I, RTK class II, RTK class III, RTK class IV, RTK class V, RTK class VI, RTK class VII, RTK class VIII, RTK class IX, RTK class X, RTK class XI, RTK class XII, RTK class XIII, RTK class XIV, RTK class XV, RTK class XVI, RTK class XVII 등이 있다. RTK class I은 EGF receptor family 또는 ErbB family로 ErbB-1(EGFR), ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4 등을 포함하며, RTK class II는 Insulin receptor family 로 Insulin receptor-A, Insulin receptor-B 등을 포함하며, RTK class III 는 PDGF receptor family로 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D 등을 포함하며, RTK class IV는 FGF receptor family로 FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR6 등을 포함하며, RTK class V는 VEGF receptors family로 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 등을 포함하며, RTK class VI는 HGF receptor family 로 HGFR 등을 포함하며, RTK class VII는 Trk receptor family 로 TrkA, TrkB, TrkC 등을 포함하며, RTK class VIII는 Eph receptor family로 EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6 등을 포함하며, RTK class IX는 AXL receptor family로 AXL 등을 포함하며, RTK class X는 LTK receptor family로 LTK 등을 포함하며, RTK class XI는 TIE receptor family로 TIE1, TIE2 등을 포함하며, RTK class XII는 ROR receptor family 로 ROR1, ROR2 등을 포함하며, RTK class XIII는 DDR receptor family로 DDR1 등을 포함하며, RTK class XIV는 RET receptor family로 RET 등을 포함하며, RTK class XV는 KLG receptor family로 PTK7 등을 포함하며, RTK class XVI는 RYK receptor family로 RYK 등을 포함하며, RTK class XVII는 MuSK receptor family로 MuSK 등을 포함한다.

상기 GPCR로는 Class A (Rhodopsin-like), Class B (Secretin receptor family), Class C (Metabotropic glutamate/pheromone), Class D (Fungal mating pheromone receptors), Class E (Cyclic AMP receptors), Class F (Frizzled/Smoothened) 등이 있다. Class A에는 Subfamily A1 내지 A19가 있으며, Subfamily A1로는 Chemokine (C-C motif) receptor 1, Chemokine (C-C motif) receptor 2, Chemokine (C-C motif) receptor 3, Chemokine (C-C motif) receptor 4, Chemokine (C-C motif) receptor 5, Chemokine (C-C motif) receptor 8, Chemokine (C-C motif) receptor-like 2, chemokine (C motif) receptor 1, chemokine (C-X3-C motif) receptor 1, GPR137B 등을 포함하며, Subfamily A2로는 Chemokine (C-C motif) receptor-like 1, Chemokine (C-C motif) receptor 6, Chemokine (C-C motif) receptor 7, Chemokine (C-C motif) receptor 9, Chemokine (C-C motif) receptor 10, Chemokine (C-X-C motif) receptor 3, Chemokine (C-X-C motif) receptor 4, Chemokine (C-X-C motif) receptor 5, Chemokine (C-X-C motif) receptor 6, Chemokine (C-X-C motif) receptor 7, IL8R-α, IL8R-β, Adrenomedullin receptor, Duffy blood group, chemokine receptor, G Protein-coupled Receptor 30 등을 포함하며, Subfamily A3로는 Angiotensin II receptor, Apelin receptor, Bradykinin receptor B1, Bradykinin receptor B2, GPR15, GPR25 등을 포함하며, Subfamily A4로는 delta Opioid receptor, kappa Opioid receptor, mu Opioid receptor, Nociceptin receptor, Somatostatin receptor 1, Somatostatin receptor 2, Somatostatin receptor 3, Somatostatin receptor 4, Somatostatin receptor 5, GPCR Neuropeptides B/W receptor 1, Neuropeptides B/W receptor 2, GPR1 orphan receptor 등을 포함하며, Subfamily A5로는 Galanin receptor 1, Galanin receptor 2, Galanin receptor 3, Cysteinyl leukotriene receptor 1, Cysteinyl leukotriene receptor 2, Leukotriene B4 receptor, Leukotriene B4 receptor 2, Relaxin/insulin-like family peptide receptor 1, Relaxin/insulin-like family peptide receptor 2, Relaxin/insulin-like family peptide receptor 3, Relaxin/insulin-like family peptide receptor 4, KiSS1-derived peptide receptor (GPR54), Melanin-concentrating hormone receptor 1, Urotensin-II receptor 등을 포함하며, Subfamily A6로는 Cholecystokinin A receptor, Cholecystokinin B receptor, Neuropeptide FF receptor 1, Neuropeptide FF receptor 2, Hypocretin (orexin) receptor 1, Hypocretin (orexin) receptor 2, Arginine vasopressin receptor 1A, Arginine vasopressin receptor 1B, Arginine vasopressin receptor 2, Gonadotrophin releasing hormone receptor, Pyroglutamylated RFamide peptide receptor, GPR22, GPR176 등을 포함하며, Subfamily A7로는 Bombesin-like receptor 3, Neuromedin B receptor, Gastrin-releasing peptide receptor, Endothelin receptor type A, Endothelin receptor type B, GPR37, Neuromedin U receptor 1, Neuromedin U receptor 2, Neurotensin receptor 1, Neurotensin receptor 2, Thyrotropin-releasing hormone receptor, Growth hormone secretagogue receptor, GPR39, Motilin receptor 등을 포함하며, Subfamily A8로는 C3a receptor, C5a receptor, Chemokine-like receptor 1, Formyl peptide receptor 1, Formyl peptide receptor-like 1, Formyl peptide receptor-like 2, MAS1, MAS1L, GPR1, GPR32, GPR44, GPR77 등을 포함하며, Subfamily A9로는 Melatonin receptor 1A, Melatonin receptor 1B, Tachykinin receptor 1, Tachykinin receptor 2, Tachykinin receptor 3, Neuropeptide Y receptor Y1, Neuropeptide Y receptor Y2, Pancreatic polypeptide receptor 1, Neuropeptide Y receptor Y5, Prolactin-releasing peptide receptor, Prokineticin receptor 1, Prokineticin receptor 2, GPR19, GPR50, GPR75, GPR83 등을 포함하며, Subfamily A10로는 FSH-receptor, Luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor, Thyrotropin receptor, Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 4, Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5, Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 6 등을 포함하며, Subfamily A11로는 Free fatty acid receptor 1, Free fatty acid receptor 2, Free fatty acid receptor 3, GPR42, Purinergic receptor P2Y1, Purinergic receptor P2Y2, Purinergic receptor P2Y4, Purinergic receptor P2Y6, Purinergic receptor P2Y8, Purinergic receptor P2Y11, Hydroxycarboxylic acid receptor 1, Hydroxycarboxylic acid receptor 2, Niacin receptor 1, Hydroxycarboxylic acid receptor 3, Niacin receptor 2, GPR31, GPR82, Oxoglutarate (alpha-ketoglutarate) receptor 1, Succinate receptor 1 등을 포함하며, Subfamily A12로는 Purinergic receptor P2Y12, Purinergic receptor P2Y13, Purinergic receptor P2Y14, GPR34, GPR87, GPR171, Platelet-activating factor receptor 등을 포함하며, Subfamily A13로는 Cannabinoid receptor 1 (brain), Cannabinoid receptor 2 (macrophage), Lysophosphatidic acid receptor 1, Lysophosphatidic acid receptor 2, Lysophosphatidic acid receptor 3, Sphingosine 1-phosphate receptor 1, Sphingosine 1-phosphate receptor 2, Sphingosine 1-phosphate receptor 3, Sphingosine 1-phosphate receptor 4, Sphingosine 1-phosphate receptor 5, Melanocortin 1 receptor, Melanocortin 3 receptor, Melanocortin 4 receptor, Melanocortin 5 receptor, ACTH receptor, GPR3, GPR6, GPR12 등을 포함하며, Subfamily A14로는 Prostaglandin D2 receptor, Prostaglandin E1 receptor, Prostaglandin E2 receptor, Prostaglandin E3 receptor, Prostaglandin E4 receptor, Prostaglandin F receptor, Prostaglandin I2 (prostacyclin) receptor, Thromboxane A2 receptor를 포함하며, Subfamily A15로는 Lysophosphatidic acid receptor 4, Lysophosphatidic acid receptor 5, Lysophosphatidic acid receptor 6, Purinergic receptor P2Y10, Coagulation factor II (thrombin) receptor-like 1, Coagulation factor II (thrombin) receptor-like 2, Coagulation factor II (thrombin) receptor-like 3, lymphocyte-specific G protein-coupled receptor, GPR4, GPR65, GPR68, GPR132, GPR17, GPR18, GPR20, GPR35, GPR55, Coagulation factor II receptor 등을 포함하며, Subfamily A16로는 Rhodopsin, Opsin 1 (cone pigments), Opsin 3, Panopsin, Opsin 4, Melanopsin, Opsin 5, Retinal G protein coupled receptor, Retinal pigment epithelium-derived rhodopsin homolog 등을 포함하며, Subfamily A17로는 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT6, Alpha1A, Alpha1B, Alpha1D, Alpha2A, Alpha2B, Alpha2C, Beta1, Beta2, Beta3, D1, D2, D3, D4, D5, TAAR1, TAAR2, TAAR3, TAAR5, TAAR6, TAAR8, TAAR9, Histamine H2 receptor 등을 포함하며, Subfamily A18로는 Histamine H1 receptor, Histamine H3 receptor, Histamine H4 receptor, Adenosine receptor (A1, A2a, A2b, A3), Muscarinic acetylcholine receptor (M1, M2, M3, M4, M5), GPR21, GPR27, GPR45, GPR52, GPR61, GPR62, GPR63, GPR78, GPR84, GPR85, GPR88, GPR101, GPR161, GPR173 등을 포함하며, Subfamily A19로는 5-Hydroxytryptamine (5-HT) receptor (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F, 5-HT4, 5-HT5A, 5-HT7) 등을 포함하며, 추가로 분류되지 않는 Olfactory receptor, Vomeronasal receptor (VN1R1, VN1R2, VN1R3, VN1R4, VN1R5) 등도 포함한다. Class B에는 Subfamily B1 내지 B3가 있으며, Subfamily B1로는 Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type 1 receptor (PACAPR), Calcitonin receptor (CALCR), Corticotropin-releasing hormone receptor (CRHR1, CRHR2), Glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor/Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR), Glucagon receptor-related (GLP1R, GLP2R), Growth hormone releasing hormone receptor (GHRHR), Parathyroid hormone receptor (PTHR1, PTHR2), Secretin receptor (SCTR), Vasoactive intestinal peptide receptor (VIPR1, VIPR2) 등을 포함하며, Subfamily B2로는 Brain-specific angiogenesis inhibitor (BAI1, BAI2, BAI3), CD97 antigen (CD7), EMR hormone receptor (CELSR1, CELSR2, CELSR3, EMR1, EMR2, EMR3, EMR4), GPR56 orphan receptor IPR003910 (GPR56, GPR64, GPR97, GPR110, GPR111, GPR112, GPR113, GPR114, GPR115, GPR123, GPR125, GPR126, GPR128, GPR133, GPR144, GPR157), Latrophilin receptor IPR003924 (ELTD1, LPHN1, LPHN2, LPHN3) 등을 포함하며, Subfamily B3로는 Diuretic hormone receptor, Unclassified subfamilies, Ig-hepta receptor (GPR116) 등을 포함하며, 추가로 분류되지 않는 Ig-hepta receptor (GPR116)도 포함한다. Class C 는 Metabotropic glutamate/pheromone로 Group I (mGluR1, mGluR5), Group II (mGluR2, mGluR3), Group III (mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8) 등을 포함하며, Class D 는 Fungal mating pheromone receptors로 STE2, STE3 등을 포함하며, Class E는 Cyclic AMP receptors이며, Class F는 Frizzled/Smoothened로 Frizzled-1, Frizzled-2, Frizzled-3, Frizzled-4, Frizzled-5, Frizzled-6, Frizzled-7, Frizzled-8, Frizzled-9, Frizzled-10 등을 포함한다.

상기 Ion-channel는 Voltage-gated ion channel (Voltage-gated sodium channel, Voltage-gated calcium channel, Voltage-gated potassium channel, transient receptor potential channel, cyclic nucleotide-gated channel, Voltage-gated proton channel), Ligand-gated ion channel, Vertebrate Anionic Cys-loop Receptors (GABAA, GlyR), Vertebrate Cationic Cys-loop Receptors (Serotonin, Nicotinic acetylcholine, Zinc-activated ion channel), Ionotropic glutamate receptors (AMPA, Kainate, NMDA, orphan), ATP-gated channel (P2X) 등을 포함한다.

상기 PRR로는 Receptor kinases, Toll-like receptors (TLR) (TLRs in Drosophila immunity, TLR3, TLR11), C-type lectin receptor (CLR), Group I CLRs: The mannose receptors, Group II CLRs: asialoglycoprotein receptor family, The classic asialoglycoprotein receptor macrophage galactose-type lectin (MGL), DC-SIGN (CLEC4L), Langerin (CLEC4K), Myeloid DAP12-associating lectin (MDL)-1 (CLEC5A), DC-associated C-type lectin 1 (Dectin1) subfamily (dectin 1/CLEC7A, DNGR1/CLEC9A, Myeloid C-type lectin-like receptor (MICL) (CLEC12A), CLEC2, CLEC12B), DC immunoreceptor (DCIR) subfamily which includes (DCIR/CLEC4A, Dectin 2/CLEC6A, Blood DC antigen 2 (BDCA2) (CLEC4C), Mincle i.e. macrophage-inducible C-type lectin (CLEC4E)) 등을 포함한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 표적 막 단백질과 결합하여 표적 막 단백질을 활성화시키는 물질로, 예컨대 화합물, 핵산, 당, 탄수화물, 지질, 펩티드, 단백질 등의 물질일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어 항체일 수 있으며, 여기에서 항체는 전체 또는 일부, 이를테면 팹(Fab) 부분 또는 힌지 (hinge) 부위만을 선택적으로 잘라낸 부분 (half-immunoglobulin fragment) 모두를 포함하는 개념이다. 한 구체예에서, 상기 후보물질은 핵산일 수 있으며, 여기에서 핵산은 2-200개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 혹은 c-DNA 모두를 포함하는 개념이다. 상기 후보물질은 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하기 위해 적절한 양으로 상기 세포에 처리될 수 있으며, 처리는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, 후보물질 0.01 내지 100 ug/ml를 상기 세포의 배지에 직접 처리할 수 있다.

한 구체예에서, 표적 막 단백질의 확산계수는 단일 입자 추적(single particle tracking, SPT)을 통해 막 단백질의 세포막 내 이동을 탐지함으로써 얻을 수 있다. 단일 입자 추적이란 어떠한 medium 안에서 단일 입자의 움직임을 관찰하는 것으로 시간에 따른 움직임의 좌표를 궤도(trajectory)로 표현하며, 이로부터 움직임 양식, 불균질성 등에 대해서 분석하는 기술이다(Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 1997;26(373-399).

막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 당해 기술분야에서 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예컨대, TIRF(total internal reflection fluorescence)를 이용하여 형광을 탐지할 수 있다. TIRF 현미경은 전반사 현미경으로서 빛의 전반사 현상을 이용하여 다른 빛에 의한 간섭을 배제하고 특정 200nm 이하 영역의 형광만을 관찰할 수 있기 때문에 세포막과 그 주변의 현상을 연구하는데 적합하다. 이러한 TIRF 현미경을 이용하여 표적 막 단백질의 시간에 따른 위치에서의 이미지를 얻고, 이를 궤도로 표현하여 확산계수를 구하게 된다.

본 발명에 따른 확산계수는 하기 수학식 1 및 수학식 2를 이용하여 얻을 수 있다. 예컨대, 표적 막 단백질에 연결된 형광단백질의 형광을 탐지하여 시간에 따른 표적 막 단백질의 위치, 즉 좌표를 소정의 시간 동안 여러 개의 이미지로 얻고,이러한 좌표의 움직임을 하나의 표적 막 단백질의 궤적으로 표현할 수 있다. 그런 다음, 하기 수학식 1 및 2에 측정된 시간에 따른 궤적의 좌표들을 대입하여 하나의 궤적에 대한 확산계수를 구할 수 있다. 위와 같은 계산에서 하나의 표적 막 단백질 입자의 위치를 결정하기 위해 형광을 탐지하는 시간(한 좌표에서의 막 단백질 입자를 이미징하는데 걸리는 시간)은 분석 조건에 따라 적절히 변경할 수 있는데, 예를 들어, 약 30 내지 70 ms, 예컨대, 50 ms일 수 있다. 또한 하나의 표적 막 단백질 입자가 하나의 궤적을 만들 때 필요한 좌표는 이에 제한되는 것은 아니나 5개 이상인 것이 바람직하다.

[수학식 1]

(△: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기(Step size), △는 자연수다, MSD(△): 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기에 대한 표적 막 단백질 입자의 이동한 거리 제곱의 평균 (Mean Square Displacement), N: 하나의 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표의 총 수, (x_n, y_n): 하나의 궤적 내의 표적 막 단백질 입자의 n번째 위치 좌표, (x₁, y₁): 하나의 궤적의 시작점에서의 표적 막 단백질 입자의 위치 좌표, (x_N,y_N): 하나의 궤적의 종료점에서의 표적 막 단백질 입자의 위치 좌표. (x_{n +Δ}, y_{n +Δ}): 하나의 궤적 내의 표적 막 단백질 입자의 n+Δ 번째 위치 좌표, 단, n+Δ는 N보다 같거나 작다.)

[수학식 2]

MSD(△) = 4D△

(D: 확산계수, △: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기)

위와 같은 계산에서 MSD는 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기에 따른 함수로 나타나며 해당 궤적을 브라운 운동에 의한 것으로 가정하였을 때 MSD는 선형함수로 나타난다. 따라서 수학식 2에 의해 각 막단백질의 궤적의 MSD를 선형함수 (f(X)=aX)에 fit 하였을 때의 기울기로부터 그 궤적의 확산계수 (a/4)를 얻을 수 있다. MSD는 평균값을 나타내기 때문에 해당 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표가 많을수록 (즉, 추적하는 궤적이 길어지거나 좌표 밀도가 높아질수록) 더 정확한 확산계수를 얻을 수 있다. 따라서 확산계수의 계산은 일정한 길이 이상의 궤적을 사용하며 선형함수의 fit은 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기를 두 프레임 이상으로 하여 (선형함수의 fit은 두 점이 있으면 가능하기 때문에) 확산계수의 측정의 정확도를 높인다. 이러한 확산계수를 전체 궤적에 대해 평균하여 각 세포 내의 막단백질의 평균 확산계수를 계산할 수 있다.

또한, 확산계수의 변화는 하기 수학식 3을 이용하여 얻을 수 있다:

[수학식 3]

확산계수의 변화(%)= 100*|1-(D_c2/D_c1)|

상기 식에서, D_c1은 세포 주변환경의 후보물질 농도 c1 에서의 표적 막 단백질의 단일 세포 수준에서의 확산계수, D_c2는 세포 주변환경의 후보물질 농도 c2에서의 표적 막 단백질의 단일 세포 수준에서의 확산계수이다.

본 발명에서 살아있는 세포막 위의 단일 막 단백질들은 같은 종류의 막단백질일지라도 서로 이질성이 매우 높기 때문에 단일 세포수준의 확산계수의 변화는 하나 이상의 표적 단일 막 단백질의 궤적을 추적하여 확산계수를 구하고 이의 변화를 분석하는 것이 바람직하다. 추적되는 표적 막 단백질의 개수가 많을수록 분석의 정확성이 높아질 수 있다. 추적되는 표적 막 단백질의 개수 및 표적 막 단백질의 궤적을 얻기 위한 시간은 표적 막 단백질의 종류 및 특성, 세포의 종류 등에 따라 변화할 수 있으며, 당업자가 분석의 조건에 따라 적절히 조절할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 단일 세포 수준에서의 확산계수의 변화를 정확하게 측정하기 위해서는 1,000개 이상, 예를 들어, 5000개 이상, 바람직하게는 10,000개 이상, 보다 바람직하게는 12,000개 이상, 보다 더 바람직하게는 15,000개 이상, 보다 더 바람직하게는 20,000개 이상의 표적 막 단백질을 추적할 수 있다. 그런 다음, 각각의 표적 막 단백질들로부터 얻어진 궤적을 통해 각각의 확산계수를 구하고, 이들 값을 평균함으로써 보다 정확한 확산계수를 얻게 된다. 예를 들어, 측정하는 시간 동안 한 개의 세포에서 평형 상태(steady state)를 유지하면서 연속된 이미지 5장 이상의 길이를 갖는 (수학식 1에서 N이 5 이상인 MSD를 구하기 위해) 표적 막 단백질의 궤적을 추적하면, 2분 이내 (약 24,000 장의 이미지의 측정) 약 12,000개 이상의 그 궤적들에 대한 확산계수 값들을 얻을 수 있고, 이를 평균하여 얻음으로써 2% 이내의 단일 세포 수준에서 확산계수 오차를 보장하는 것이 바람직하다.

후보물질을 처리하기 전후와 비교하여 표적 막 단백질과 후보물질의 결합으로 인하여 크기가 증가하고 표적 막 단백질의 확산계수가 감소하므로, 이를 이용하여 표적 막 단백질과 후보물질과의 결합 유무, 전체 표적 막 단백질 중 후보물질에 결합한 표적 막 단백질의 비율, 표적 막 단백질과 결합한 후보물질의 분자량 등을 분석할 수 있다. 따라서 확산계수의 변화가 있는 경우 후보물질을 표적 막 단백질과 결합하는 리간드로 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 수학식 3에서 얻어진 확산계수의 변화(%)가 유의수준(significance level)인 경우, 예를 들어 2%, 내지 5% 이상인 경우 상기 후보물질을 표적 막 단백질과 결합하는 리간드로 결정할 수 있다.

막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 막 단백질에 형광과 같은 광학 프로브를 레이블링함으로써 수행되며, 앞서 설명한 바와 같이 후보물질 또는 막 단백질과 후보물질의 결합에는 레이블링의 과정을 요하지 않는다.

본 발명의 한 구체예에서, 막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 표적 막 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 세포에서 상기 형광 단백질의 형광을 탐지함으로써 수행될 수 있다. 상기 형광단백질은 표적 막 단백질을 관찰하기 위하여 표지 역할을 하는 것으로 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 형광단백질로는 GFP(Green Fluorescent Protein) 계열, BFP(Blue fluorescent protein) 계열, Cyan 계열, YFP(Yellow Fluorescent Protein)계열, RFP(Red Fluorescent Protein)계열, Orange 계열, Far-red 계열, Near-IR, 광활성 단백질(Photoactivatable protein), 광전환 단백질(Photoconvertible protein), 광스위치 단백질(Photoswitchable protein) 등을 포함할 수 있다. 여기에서, 광활성 단백질은 보통 상황에서는 형광을 띠고 있지 않다가 어떠한 자극(예를 들어, 레이저 조사)에 의해 형광을 띠게 되는 단백질을 의미한다. 또한, 광전환 단백질과 광스위치 단백질은 보통 상황에서 특정 색의 형광을 띠고 있다가 광활성 단백질과 마찬가지로 어떠한 자극에 의해서 다른 색의 형광을 띠게 되는 단백질로서 광전환 단백질은 이 변환이 비가역적이나 광스위치 단백질은 가역적이라는 차이가 있다.

상기 GFP 계열로는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder GFP, Azami green mWasabi, TagGFP, AcGFP, T-sapphire, mUKG, Clover, mNeonGreen 등을 포함하며, 상기 BFP(Blue fluorescent protein) 계열로는 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite, mTagBFP, mKalama1, Sirius 등을 포함하며, 상기 Cyan 계열로는 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP(monomeric ECFP), Cerulean, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, TagCFP, mTFP1(Teal), SCFP3A, monomeric Midoriishi Cyan 등을 포함하며, 상기 YFP 계열로는 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Benus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, mBanana, SYFP2 등을 포함하며, 상기 RFP 계열로는 mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, mRFP1, mCherry, mRaspberry, dKeima-Tandem(monomeric version), HcRed-Tandem(monomeric version), mPlum 등을 포함하며, 상기 Far-red 계열로는 mKate2, mNeptune 등을 포함하며, 상기 Near-IR로는 TagRFP657, IFP1.4 등을 포함하며, 상기 광활성 단백질로는 PA-GFP, PAmCherry1, PaTagRFP 등을 포함하며, 상기 광전환 단백질로는 PS-CFP2, mEos2, mEos3.2, PSmOrange 등을 포함하며, 상기 광스위치 단백질로는 Dronpa 등을 포함한다.

예컨대, 상기 형광 단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder GFP, Azami green mWasabi, TagGFP, AcGFP, T-sapphire, mUKG, Clover, mNeonGreen, EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite, mTagBFP, mKalama1, Sirius, ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP(monomeric ECFP), Cerulean, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, TagCFP, mTFP1(Teal), SCFP3A, monomeric Midoriishi Cyan, EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Benus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, mBanana, SYFP2, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, mRFP1, mCherry, mRaspberry, dKeima-Tandem(monomeric version), HcRed-Tandem(monomeric version), mPlum, mKate2, mNeptune, mKate2, mNeptune, TagRFP657, IFP1.4, PA-GFP, PAmCherry1, PaTagRFP, PS-CFP2, mEos2, mEos3.2, PSmOrange 및 Dronpa로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것일 수 있다.

상기 융합단백질은 표적 막 단백질과 형광단백질의 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 상기 “유전적 융합”이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 융합단백질의 제조는 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예컨대, 유전자 재조합 기술을 이용하여 융합단백질을 제조할 수 있다.

상기 융합단백질을 발현하는 세포는 발현벡터를 형질전환시켜 준비할 수 있다. 융합단백질의 발현을 위해 개발된 공지의 발현벡터를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 또는 코스미드 벡터일 수 있다. 융합단백질을 발현하는 숙주세포는 문헌(Sambrook, J., et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자총(gene gun)을 이용하는 방법 및 바이러스 트랜스펙션(virus transfection) 등의 형질전환 방법을 이용하여 준비될 수 있다. 예컨대, 표적 막 단백질과 형광단백질의 융합단백질이 포함된 발현벡터를 리포펙타민(lipofectamine), 퓨진 (fugene), 또는 메타팩틴(metafectin)을 이용하여 숙주세포에 형질전환시켜 융합단백질을 발현하는 세포를 준비할 수 있다.

표적 막 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 세포는 동물, 식물, 효모 및 박테리아의 세포일 수 있다. 예컨대, 상기 세포는 HEK(human embryonic kidney) 세포, HEK 293 세포 (ATCC CRL 1573), 3T3-L1 세포 (ATCC CL 173), C6 세포 (ATCC CCL 107), CHO (Chinese hamster ovary) 세포 (ATCC CCL61), CHO?1 세포 (ATCC CCL 61), 세포 NIH/3T3(NIH Swiss mouse embryo) (ATCC CRL 1658), BHK 세포(baby hamster kidney), COS1 세포 (ATCC CRL 1650), COS7 세포 (ATCC CRL 1651), HaCaT 세포, HeLa 세포 (ATCC CCL 2), HeLa S3 세포 (ATCC CCL 2.2), HepG2 세포 (ATCC HB 8065), HL-60 세포 (ATCC CCL 240), HUV-EC-C 세포 (ATCC CRL 1730), Jurkat 세포 (ATCC TIB 152), K-562 세포 (ATCC CCL 243), L6 세포 (ATCC CRL 1458), MCF7 세포 (ATCC HTP 22), MDCK 세포 (ATCC CCL 34), NIH/3T3 세포 (ATCC CRL 1658), RAW 264.7 세포 (ATCC TIB 71), RBL-1 세포 (ATCC CRL 1378), SH-SY5Y 세포 (ATCC CRL 2266), U-937 세포 (ATCC CRL 1593.2) 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 형광물질이 결합되어 있고, 표적 막 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 프로브에 의해 수행되는 것일 수 있다. 막 단백질과 형광단백질의 융합 단백질을 이용하여 확산계수의 변화를 탐지하는 방식에서는 숙주세포 내에서 융합 단백질을 발현시켜 확산계수를 측정할 세포를 제조하여야 하고, 표적 막 단백질의 종류에 따라 이의 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포의 종류가 제한적이라는 단점을 가지나, 형광물질이 결합되어 있는 프로브를 이용하는 방식은 이러한 제한이 없고 표적 막 단백질을 발현하는 세포이기만 하면 활용가능하므로 유용하게 활용될 수 있다.

형광물질이 결합되어 있고, 표적 막 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있다면 프로브는 어떠한 형태든지 사용가능하다. 다만, 표적 막 단백질에 특이적으로 결합하는 프로브는 표적 막 단백질의 활성에 영향을 미치지 않는 것을 선택하는 것이 바람직할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 항 구체예에서, 상기 프로브는 항체, 압타머, 비항체 단백질 골격(non-antibody protein scaffold)일 수 있다. 상기 항체는 전체 서열을 갖는 항체뿐만 아니라 팹(Fab) 항체, 단일 체인 가변 단편(Single chain variable fragment), single-domain antibody 등도 모두 포함한다. 전체 서열을 갖는 항체에 형광물질을 결합시킨 후 타겟 막 단백질과의 결합을 통해 경로를 추적해도 무방하지만, Full antibody의 크기로 인해 다른 결합 가능한 파트너와의 결합 시 확산계수의 변화 정도가 줄어들기 때문에 항체의 특이성은 유지하면서 최대한 크기가 작은 표지자가 유리할 수 있다. 또한, 항체뿐만 아니라 압타머, 비항체 단백질 골격 등도 형광 프로브와 결합하여 본 방법에서 유용하게 활용할 수 있다. 비항체 단백질 골격은 항체를 기반으로 하지 않고 무작위의 단백질 골격 중에서 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 골격을 발굴하여 최적화시킨 것으로서 예컨대 affibody와 같은 물질이 있다.

상기 프로브에 결합되어 있는 형광물질은 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 형광물질은 유기형광염료일 수 있으며, 본 발명에서 사용가능한 유기형광염료는 Atto 488, Alexa Flour 488, Dy505, Rhodamine 123, Atto 520, Dy 530, ATTO 532, Alexa Fluor 532, Fluorescein, FITC, Cy2, Cy3B, Alexa Flour 568, TAMRA, Cy3, Cy3.5, SNAP-Cell TMR-Star, Atto 565, Atto 590, Alexa Fluor 647, Cy5, Atto 647, Atto 647N, Dyomics 654, Atto 655, TMP-ATTO 655, Atto 680, Cy5.5, Atto 680, Alexa Fluor 680, Atto 700, Alexa Fluor 700, DyLight 750, Cy7, Alexa Flour 750, Atto 740, Alexa Flour 790 또는 IRDye 800 CW로부터 선택될 수 있다. 그 외에도 광스위치 형광염료에 해당하는 모든 유기형광염료가 사용될 수 있다.

한편, 본 방법은 또한 후보물질 처리 후의 표적 막 단백질의 확산계수를 여러 시점에서 구하고, 이를 통해 얻어진 하나 이상의 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 경시적으로 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 유동적인 막 상태에서 이동하는 표적 막 단백질의 형광을 경시적으로 탐지하여 표적 막 단백질과 후보물질간의 해리상수 등을 분석할 수 있다.

또한 본 분석 방법은 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 경시적으로 분석함으로써 막 단백질 특이적 세포내섭취(endocytosis)의 유무를 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표적 막단백질의 세포내섭취 여부는 추적된 궤적으로부터 확산계수를 기반으로 하여 판단할 수 있다. 세포내섭취시 막 단백질 입자의 궤적은 자유롭게 확산하다가 일정 위치에서 세포내 섭취 기관의 일종인 클라트린피복 소공(CCPs)의 크기인 120nm 이내의 한정된 공간 안에서 움직이는 confined motion을 가지게 된다. 따라서 입자의 궤적이 확산(diffusing)에서 confined motion으로 변하는 유형을 세포내 섭취로 판단할 수 있다. 세포내섭취는 표적 특이적 약물의 효과를 판단하는 중요한 척도로 활용될 수 있으므로, 표적 막 단백질에 대한 후보물질의 처리로 인해 막 단백질 특이적 세포내섭취가 발견될 경우 후보물질이 표적 특이적 약물로서 효과를 발휘함을 예측할 수 있게 된다.

본 분석 방법은 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 경시적으로 분석함으로써 표적 막 단백질과 후보물질간의 복합체 형성과정을 분석할 수 있다. 예컨대, 같거나 다른 후보물질을 반복 처리하여 융합단백질의 확산계수의 변화를 분석함으로써 표적 막 단백질과 여러 후보물질간의 복합체 형상과정을 경시적으로 분석할 수 있다.

상기 방법은 단일세포에서 결합양상을 분석할 수 있다. 종래 기술인 생화학적 방법, 보다 구체적으로는 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용할 경우 약 천만 개정도의 세포를 이용하여야 하는 것과 달리, 상기 방법은 단일세포 수준에서도 이용이 가능하므로 매우 적은 양의 후보물질만으로도 표적 막 단백질과의 결합양상을 분석할 수 있다.

다른 일 구현예는 상기 방법에 따라 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 단계; 및 상기 결합양상을 이용하여 상기 후보물질 중에서 상기 표적 막 단백질에 특이적으로 작용하는 약물을 결정하는 단계를 포함하는, 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 하는 방법에 있어서, 막 단백질, 후보물질, 확산계수, 막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지 등은 앞서 설명한 바와 같다.

막 단백질은 약물 개발의 주요 표적이며, 현재 개발된 모든 약물들 중 50% 이상이 막 단백질을 표적으로 하고 있다(Overington, J. P., How many drug targets are there?, Nature reviews. Drug discovery. 5, 993-996, 2006). 예컨대, 심차단(heart block) 또는 서맥(bradycardia)의 치료제인 이소프레날린(isoprenaline)은 b-adrenergic receptor를 표적으로 하는 약물이며, 당뇨치료제인 인슐린은 insulin receptor를 표적으로 하는 약물로 공지되어 있다(Peter Imming. et al. Drugs, their targets and the nature and number of drug target. Nature reviews. Drug discovery, 2006). 또한 개발된 많은 항암제들은 막 단백질을 표적으로 하고 있다. 예컨대, ErbB family는 암에서 중요한 역할을 하며, 이를 표적으로 하는 항암제의 개발에 대한 중요성은 이미 공지된 상태이며(Eric K. Rowinsky. THE ERBB FAMILY: Targets for Therapeutic Development Against Cancer and Therapeutic Strategies Using Monoclonal Antibodies and Tyrosine Kinase Inhibitors. Annu. Rev. Med. 55, 433-57, 2004), 일례로 대장암 치료제인 세툭시맙(cetuximab)은 ErbB family를 표적으로 하는 약물이다. 따라서, 막 단백질과 리간드와 결합 등에 대한 연구는 표적 막 단백질에 특이적으로 작용하는 약물 개발에 응용될 수 있으며, 구체적으로 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝 하는 방법으로 사용될 수 있다. 예컨대, 표적 막 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리한 후 상기 수학식 3에 따라 확산계수의 변화(%)가 오차범위 이상인 경우, 예컨대 2% 내지 5% 이상인 경우 표적 막 단백질에 특이적으로 작용하는 약물로 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 양상을 분석하는 방법은 리간드에 표지하지 않고 표적 막 단백질과 이에 특이적으로 결합할 수 있는 후보물질과의 결합 양상을 정확, 민감, 신속하면서 쉬운 방법으로 분석할 수 있고, 이에 따라 막 단백질과 후보물질의 결합에 대한 위치, 정량적인 정보를 직접적이고 정확하게 측정할 수 있다. 이러한 효과로 인해 해리상수(dissociation constant), 돌연변이 연구(mutant study), 복합체 형성(complex formation), 신호전달(signal transduction)등 다양한 활용에 적용할 수 있으며, 나아가 아직 밝혀지지 않은 많은 막 단백질과 후보물질에 대해서도 탐구할 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 형광단백질을 표적 막 단백질에 표지함으로써 세포막에 존재하는 많은 막 단백질 중에서 표적 단백질만을 특이적으로 관찰할 수 있는 시스템을 그린 모식도이며, 이러한 환경 하에서 리간드가 결합하게 되면 표적 단백질의 확산이 느려지게 된다.
도 2는 TIRF에서 원형 커버슬립에 붙은 하나의 세포의 표적 막 단백질의 움직임을 추적하고 이를 시공간적으로 평균화하여 단일 세포에서 표적 막 단백질의 확산계수를 분석하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 PMT-mEos3.2를 발현하는 숙주세포와 EGFR-mEos3.2를 발현하는 숙주세포에 세툭시맙 처리 전후의 경로를 무작위로 뽑은 그림으로, PMT의 경우는 세툭시맙 처리 전후로 경로의 길이의 변화가 거의 없고, 이에 반해 EGFR의 경우는 세툭시맙 처리 후 경로의 길이가 확연히 짧아졌음을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1.5에 따른 세툭시맙 처리 전후 10사이클 동안에 PMT와 EGFR의 확산계수의 평균과 표준편차 값을 나타낸 그림이다.
도 5는 도 3의 결과를 정량적으로 정리한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 β2-AR은 기본적으로 Gi-단백질과 결합은 없어서 Pertussis toxin(PTX)를 처리하여도 차이가 없지만, FZD1은 Gi-단백질과 결합이 있으며, PTX를 처리해주면 Gi-단백질의 ADP가 리보실레이티드 되어 FZD1과의 결합이 저해되는 그림이다.
도 7은 실시예 2.4에 따른 PMT, FZD1, β2-AR의 PTX 처리 전후의 PMT, FZD1, β2-AR의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2.4에 따른 PMT, β2-AR, EGFR의 평균적 확산계수의 절대값을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 3에 따른 다른 환경에서 측정한 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸 것으로, 배치#1, 배치#2 및 배치#3는 각 3개의 다른 배치에서 준비한 COS7 세포에서의 EGFR의 확산계수의 변화를 나타내며, 배치#3-1과 배치#3-2는 배치는 같지만 다른 글라스에서 측정한 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸다.
도 10은 실시예 4 내지 6에 따른 HEK293, HELA, CHO-K1 세포에서의 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 EGFR에 각각 다른 부위와 결합할 수 있는 항체인 세툭시맙, mAb 199.12, mAb 528 및 mAb R-1의 그림이다.
도 12는 비교에 1에 따른 웨스턴블롯의 결과로서 NT는 항체를 처리하지 않은 상태를 나타내며, EGF의 +/-는 EGF 처리 유/무를 나타낸다.
도 13은 실시예 7에 따른 PMT와 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 EGFR과 특이적 결합을 하는 세툭시맙, ErbB2와 특이적 결합을 하는 트라스주맙(trastuzumab)의 그림이다.
도 15는 비교예 2에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것으로, 구체적으로 x축은 형광신호의 세기를 나타내며 y축은 특정 수준의 형광신호 세기를 가지는 세포의 상대적 비율을 나타낸다.
도 16은 실시예 8에 따른 PMT와 EGFR에 세툭시맙, 트라스주맙, 항-액틴 항체 처리 전후의 확산계수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 결합 위치가 동일하지만 분자량이 다른 4개의 리간드와 EGFR의 결합을 나타낸 그림이다.
도 18은 실시예 9에 따른 PMT와 EGFR에 대해서 세툭시맙, 세툭시맙 팹(Fab), 세툭시맙 팹2(F(ab')2), EGFR 특이적 결합 압타머의 처리 전후로 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 실시예 9에 따른 리간드의 분자량과 확산계수 변화의 관계가 선형적임을 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 10.1에 따른 세툭시맙의 농도가 높아짐에 따라 EGFR과 결합하는 세툭시맙이 많아짐을 나타낸 그림이다.
도 21은 하나의 세포에서 세툭시맙의 농도를 0.02부터 1.28 ug/ml까지 증가시킴에 따른 EGFR의 확산계수의 감소를 나타낸 것이다.
도 22는 세툭시맙의 농도를 높여줌에 따라 EGFR과 결합된 세툭시맙의 비율을 나타냄으로써 해리상수 및 협동도(cooperativity)를 구한 그래프이다.
도 23은 EGFR wild-type(WT, 야생형)은 세툭시맙과 mAb R-1 항체와 모두 결합할 수 있지만, 돌연변이 형태인 EGFRvIII의 경우에는 mAb R-1 항체는 결합하지 않고, 세툭시맙만이 결합하는 것을 나타낸 것이다.
도 24는 PMT의 경우에는 세툭시맙과 mAb R-1 두 항체에 의한 결합이 없기 때문에 PMT의 확산계수의 감소가 나타나지 않지만, EGFRvIII의 경우에는 세툭시맙과는 결합을 하고 mAb R-1와는 결합을 하지 않기 때문에 이에 따른 확산계수의 변화가 달리 측정되는 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 10.1과 같은 방법을 이용하여 EGFRvIII과 결합된 세툭시맙의 비율을 나타냄으로써 해리상수 및 협동도(cooperativity)를 구한 그래프이다.
도 26은 EGFR에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체가 차례대로 결합 하는 것을 나타낸 것이다.
도 27은 EGFR에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체를 차례대로 처리하였을 때 EGFR의 확산계수가 점차 감소하는 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 EGFR에 세툭시맙, 3차 항체, 2차 항체의 순서대로 처리하여, EGFR의 확산계수의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 내재성 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 팹(Fab) 단편에 광스위치 형광 유기 염료인 Alexa Fluor 647을 결합시켜 내재성 EGFR을 탐지하는 과정을 보여준다.
도 30은 내재성 EGFR에 대하여 mAb 199.12의 결합이 세툭시맙의 결합에 의해 방해 받지 않음을 확인한 결과이다.
도 31은 내재성 EGFR과 세툭시맙의 특이적 결합 양상을 관찰한 결과이다.
도 32는 서로 다른 5개의 세포주에 대하여 이뮤노글로불린 항체 및 세툭시맙에 의해 변화된 확산계수의 평균값 및 표준편차를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 33은 폐 세포 조직 내의 세포 종류에 대한 마커와 자발형광(Autofluorescence) 수준으로 분류한 mouse primary 세포에 대한 각각의 이미지들을 나타낸다.
도 34은 도 33에서 선별된 4가지 세포 BASC, 내피세포, AT2 세포 및 Clara 세포에 존재하는 내재성 EGFR에 대하여 세툭시맙 결합 양상에 따른 확산계수의 변화를 관찰한 결과를 보여준다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 표적 막 단백질 측정: EGFR

1.1 EGFR - mEos3 .2 융합 단백질 제조용 플라스미드

실험에서 사용한 EGFR WT(Addgene plasmid #11011)는 Matthew Meyerson 박사로부터 제공받았고, mEos3.2 형광단백질은 Tao xu 박사로부터 제공 받았다. 제공된 형광단백질의 경우에는 막 단백질과의 용이한 연결을 위해 pEGFP-N1/mEos3.2에서 pcDNA3.1/mEos3.2-his를 만드는 서브클로닝을 수행하였다. 막 단백질 EGFR WT(서열번호 1)와 형광단백질 mEos3.2(서열번호 2)의 연결된 형태의 단백질을 만들기 위해 제한효소 Xbal(서열번호 3, TCTAGA)과 NotI(서열번호 4, GCGGCCGC)을 이용하여 pcDNA3.1/EGFR WT-mEos3.2-His를 제조하였다.

1.2 PMT - mEos3 .2 융합 단백질 제조용 플라스미드

상기 실시예 1.1에 대한 대조군으로 사용하기 위해 PMT와 형광단백질이 연결된 형태인 플라스미드를 제조하였다. 상기 서브클로닝된 pcDNA3.1/mEos3.2-his에 PMT에 해당하는 DNA(서열번호 5)를 제한효소 Xbal(서열번호 3)과 NotI(서열번호 4)을 사용해 pcDNA3.1/PMT-mEos3.2-His를 제조하였다.

1.3 융합 단백질 발현용 숙주세포 제조

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Lonza)에서 37℃, 5% CO_{2 ,} 95% humidity with 10% FBS(Gibco) 조건에서 ATCC로부터 제공받은 COS7 세포를 배양하였으며, Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용해 제조사 설명에 따라 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 제조된 플라스미드를 COS7 세포로 각각 형질전환 하였다. 단백질의 과발현으로 인한 효과를 줄이기 위해 형질전환 후 24시간 배양된 세포 중 특히 낮은 발현량을 보이는 세포를 유세포 분석을 통해 분리하였다. 구체적으로 형질전환된 세포를 PBS를 이용해 불순물을 제거하였고, detaching 버퍼를 이용하여 바닥에서 떼어낸 후 cell strainer(40μm, BD Bioscience)를 이용해 모아서 걸러내었다. 그 후 MoFlo™ XDP cell sorter (Beckman Coulter)를 통해 낮은 발현량을 보이는 세포만을 특이적으로 선택하였다.

선택된 세포는 25mm 지름의 커버슬립(coverslip)에 안착시켰는데, 커버슬립의 자발형광(autofluorescence)을 최소화 하기 위해 아세톤에 담가 42℃에서 30분간 sonication을 하고, 증류수로 3번 씻은 후 다시 1% hydrofluoric acid에 담가 42℃ 에서 10 분간 sonication을 진행한 후 증류수로 15~20번 정도 완전히 hydrofluoric acid가 없어지도록 씻어 주었고, 마지막으로 100% 에탄올에 담가 UV에 30분간 노출시켜 멸균을 시킨 후 보관한 커버슬립을 사용하였다. 결과적으로, EGFR-mEos 융합 단백질을 발현하는 숙주세포와 PMT-mEos 융합 단백질을 발현하는 숙주세포가 안착된 커버슬립을 얻었다.

1.4. 리간드가 결합하지 않은 막 단백질의 확인

상기 실시예 1.3에 따라 안착된 세포가 있는 커버슬립을 생세포 유지 장치(37℃ 온도, 5% CO₂)와 EM-CCD(electron multiplying charge coupled device)가 있는 현미경에 고정시켜 단세포 단위로 관찰하였다. 상기 현미경은 올림푸스사의 IX71모델로서 TIRF(total internal reflection fluorescence)을 기반으로 하기 때문에 원형 커버슬립에 가깝게 붙은(커버슬립에서 약 200nm 정도) 세포의 원형질막 부분에 있는 형광 분자에 대해서만 관찰할 수 있다. 405nm laser를 이용해 mEos3.2 형광단백질의 back-bone을 끊음으로써 여러 형광단백질 중에 무작위로 green form에서 red form으로 변형시켰고, 561nm laser를 이용해 무작위로 변형된 red form의 mEos3.2 형광단백질을 형광 단분자에서 나오는 신호를 감지할 수 있는 andor technology의 EM-CCD(electron multiplying charge coupled device) ixon3 897를 이용하여 이미지를 얻었다.

일정한 시간간격(~150ms)으로 순서대로 형광 이미지를 얻었고, 각각의 이미지에 존재하는 단분자의 신호를 centroid fitting을 통해 중심점을 찾은 후, multiple tracking을 이용해 전후 이미지들과 비교함으로써 단위 시간당 형광단백질이 이동한 거리 및 경로를 확인하였고, 이동한 거리(MSD)는 상기 수학식 1을 이용하여 구하였다.

도 1은 형광단백질을 표적 막 단백질에 표지함으로써 세포막에 존재하는 많은 막 단백질 중에서 표적 단백질만을 특이적으로 관찰할 수 있는 시스템을 그린 모식도이며, 이러한 환경 하에서 리간드가 결합하게 되면 표적 단백질의 확산이 느려지게 된다.

도 2는 TIRF에서 원형 커버슬립에 붙은 하나의 세포의 표적 막 단백질의 움직임을 추적하고 이를 시공간적으로 평균화하여 단일 세포에서 표적 막 단백질의 확산계수를 분석하는 과정을 나타낸 그림이다. 하나의 세포에 리간드 처리를 통해 다른 환경을 만들어 주고, 시간에 따라서 하나의 표적 막 단백질의 경로를 기록한다. 통계적으로 유의미한 값을 가질 수 있도록 여러 번 이 과정을 반복하고 공간과 시간에 대해 평균을 취함으로써 세포 본연의 이질성을 극복할 수 있고 또한 다른 조건 하에서의 표적 막 단백질의 확산을 측정하여 비교할 수 있다.

1.5. 리간드가 결합된 표적 막 단백질의 확인

상기 실시예 1.3에서 얻어진 PMT-mEos3.2를 발현하는 숙주세포와 EGFR-mEos3.2를 발현하는 숙주세포에 20 ug/ml의 세툭시맙을 처리 전후를 상기 실시예 1.4와 같은 방법을 통해 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 PMT-mEos3.2를 발현하는 숙주세포와 EGFR-mEos3.2를 발현하는 숙주세포에 세툭시맙 처리 전후의 경로를 무작위로 뽑은 그림으로, PMT의 경우는 세툭시맙 처리 전후로 경로의 길이의 변화가 거의 없고, 이에 반해 EGFR의 경우는 세툭시맙 처리 후 경로의 길이가 확연히 짧아졌음을 나타내는 그림이다. 도 3에 나타난 NT(Non treatment)는 외부에 아무것도 처리하지 않은 상태를 나타내고, 세툭시맙은 세툭시맙을 처리 한 후 경로를 측정한 것을 나타낸다. 각각의 그림에서 확대된 모양의 그림은 해당 영역에서 무작위로 추출한 수 개의 형광 분자의 경로를 나타낸 것이다. 아무것도 처리하지 않은 NT(왼쪽)의 경우에는 PMT와 EGFR 막 단백질 모두 비교적 자유롭게 확산 운동을 하고 있음을 알 수 있다. 하지만 세툭시맙(오른쪽)의 경우에는 그 양상이 달라짐을 알 수 있다. PMT는 세툭시맙과 결합을 하지 않기 때문에 형광 분자 경로의 길이에 있어서 큰 변화가 없다. 하지만 EGFR의 경우에는 세툭시맙과 직접적인 결합을 하기 때문에 형광 분자 경로의 길이가 확연히 짧아짐을 관찰할 수 있었다.

도 3에 나타난 변화의 결과가 실험 과정에서 생긴 어떠한 요인 때문이 아니라 EGFR과 이에 결합하는 항체로 인한 것임을 증명하기 위해 다른 요소들에 대해 세툭시맙 처리 전후의 변화에 대해 확인하였다. 각각 하나의 실험에서 총 4000장의 이미지를 얻고, 그 이미지를 통해 경로를 구하고, 상기 수학식 1과 수학식 2를 이용하여 PMT와 EGFR의 확산계수를 구하고, 확산계수의 평균값과 표준편차를 도 4에 나타내었다.

도 4는 세툭시맙 처리 전후 10 사이클 동안에 PMT와 EGFR의 확산계수의 평균과 표준편차 값을 나타낸 그림으로, 측정하는 동안에 다른 이미징 요소에 의해 확산계수가 변한 것이 아니라 세툭시맙에 의해 EGFR의 확산계수가 변한 것임을 알 수 있다.

도 5는 도 3의 결과를 정량적으로 정리한 그림으로, PMT와 EGFR에 아무것도 처리를 하지 않았을 때의 PMT와 EGFR의 확산계수를 기준으로 세툭시맙 처리를 하고 난 후 확산계수의 변화(%)를 나타낸 것이다. PMT의 경우는 세툭시맙 처리 전후로 PMT의 확산계수가 거의 변하지 않았지만, EGFR의 경우는 세툭시맙 처리 후 약 40%에 가까운 확산계수의 변화를 보였다. 구체적으로, 상기 수학식 1 및 수학식 2을 이용하여 확산계수를 구할 수 있으며, 각각 다른 조건에서의 확산계수를 D_c1 및 D_c2로 하였을 때, 상기 수학식 3을 이용하여 확산계수의 변화의 비율을 계산하면, PMT는 D_c1 과 D_c2 의 값이 거의 동일하기 때문에 확산계수의 변화 값은 매우 작으나, EGFR은 D_c2과 D_c1의 값은 약 60% 정도 수준으로 이를 계산하면 40% 정도의 확산계수 감소를 보임을 확인할 수 있다.

도 1 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 표적 막 단백질과 리간드의 결합으로 인한 크기의 증가가 표적 막 단백질의 확산계수의 감소로 나타났고, 또한 감소되는 정도를 정량적으로 나타낼 수 있다. 세툭시맙과 결합할 수 없는 PMT의 경우는 세툭시맙 처리 전후로 PMT의 확산계수의 큰 변화가 없었지만, EGFR의 경우에는 세툭시맙 처리 후 EGFR의 확산계수의 감소를 확인할 수 있었고, 감소된 정도는 약 40% 였다.

실시예 2. 표적 막 단백질 측정: GPCR

2.1 β2- AR - mEos3 .2 융합 단백질 제조용 플라스미드

실험에 사용한 β2-AR (Addgene plasmid #14697)는 Robert Lefkowitz 박사로부터 제공받았고, 상기 실시예 1.1에서 서브클로닝된 pcDNA3.1/mEos3.2-his에 β2-AR DNA(서열번호 6)를 BamHI과 Xbal 제한효소를 사용해 pcDNA3.1/β2-AR-mEos3.2-His를 제조하였다.

2.2 FZD1 - mEos3 융합 단백질 제조용 플라스미드

실험에 사용한 FZD1 (Addgene plasmid #16819)는 Randall Moon 박사로부터 제공받았고, 상기 실시예 1.1에서 서브클로닝된 pcDNA3.1/mEos3.2-his에 FZD1 DNA(서열번호 7)를 BamHI과 Xbal 제한효소를 사용해 pcDNA3.1/FZD1-mEos3.2-His를 제조하였다.

2.3 융합 단백질 발현용 숙주세포 제조

GPCR을 비활성 시키는 실험을 위해 β2-AR-mEos3.2, FZD1-mEos3.2, 및 PMT-mEos3.2(상기 실시예 1.2 참조)를 실시예 1.3과 동일하게 COS7 세포에 형질전환 시켰으며, 각각 형질전환된 COS7 세포를 1% serum(최소 조건)이 있는 배지에서 16시간 동안 스타베이션(starvation) 시켰다. 또한, PTX(Pertussis toxin) 실험을 위해 막 단백질를 측정하기 전에 100ng/ml PTX 농도에서 6시간 동안 각각 형질전환된 COS7 세포를 처리하였다.

2.4 리간드가 결합된 표적 막 단백질의 확인

상기 실시예 1.5와 동일한 방법으로 PMT, FZD1, β2-AR의 확산계수를 측정하였으며, 그 결과를 도 7 내지 도 8에 나타내었다.

도 6은 β2-AR은 기본적으로 Gi-단백질과 결합은 없지만, FZD1은 Gi-단백질과 결합이 있으며, PTX를 처리해주면 Gi-단백질의 ADP가 리보실레이티드 되어 FZD1과의 결합이 저해되는 것을 나타낸다. 상기 기작에 따라 PTX 여부에 크게 상관없이 β2-AR는 확산계수의 변화가 없고, FZD 경우에는 PTX 처리 후 확산계수의 증가를 보이게 된다.

도 7은 PMT, FZD1, β2-AR의 PTX 처리 전후의 PMT, FZD1, β2-AR의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.

도 8은 PMT, β2-AR, EGFR의 평균적 확산계수의 절대값을 나타낸 것으로, β2-AR이 EGFR 보다 빠르기 때문에 β2-AR의 결합이 EGFR보다 민감하게 측정된다.

도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 방법은 EGFR에만 국한된 것이 아니라 GPCR에서도 적용 가능하며, 이는 다른 막 단백질에도 적용 가능함을 나타내고, 세포 밖에서 일어나는 결합뿐만 아니라 세포 안쪽에서 일어나는 결합도 측정할 수 있음을 보여준다. 또한 EGFR과 세툭시맙과 결합하는 현상뿐만 아니라, FZD1과 Gi-단백질이 해리되는 현상에 대해서도 측정이 가능함을 보여준다.

실시예 3. 다른 환경에서의 표적 막 단백질의 측정

앞서 실시예 1의 방법의 기술 재현성을 입증하기 위하여, 각각 다른 날에 준비한 3개의 형질전환된 COS7 세포(배치(Batch)#1, 배치#2, 배치#3)와 같은 날에 준비하였지만 독립적으로 준비한 2개의 형질전환된 COS7 세포(배치#3-1, 배치#3-2)로서 각 배치가 안착된 커버슬립을 얻었다. 상기 숙주세포를 이용하여 실시예 1.4에 기재된 방법과 같이 세툭시맙을 처리하여 EGFR의 확산계수의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 상기 방법에 따라 측정된 EGFR의 확산계수의 변화로서, 배치#1, 배치#2 및 배치#3는 각 3개의 다른 배치에서 준비한 COS7 세포에서의 EGFR의 확산계수의 변화를 나타내며, 배치#3-1과 배치#3-2는 배치는 같지만 다른 글라스에서 측정한 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸다.

도 9에 나타난 바와 같이, 다른 날에 준비한 것과 독립적으로 준비한 것 모두 EGFR의 확산계수의 변화에 차이를 보이지 않았으며, ANOVA 분석을 통해 p=0.768로 통계적으로 각 배치간의 차이는 없는 것을 확인하였다.

실시예 4-6. 표적 막 단백질 확인(세포주: HEK293, HELA , CHO - K1 )

COS7 세포 이외에 다른 세포주에서도 표적 막 단백질를 측정할 수 있음을 입증하기 위하여, 상기 실시예 1.3의 COS7 세포 대신 ATCC로부터 제공받은 HEK293, HELA, CHO-K1 세포를 이용하여 실시예 1.4와 같은 방법으로 PMT-mEos3.2를 발현하는 숙주세포와 EGFR-mEos3.2를 발현하는 숙주세포를 준비하였으며, 상기 실시예 1.5와 같이 각 숙주세포에 세툭시맙을 처리하여 EGFR 및 PMT의 확산계수의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 숙주세포로 HEK293, HELA, CHO-K1 세포를 이용한 것은 각각 실시예 4 내지 6으로 하였다.

도 10은 상기 방법에 따른 HEK293, HELA, CHO-K1에서의 EGFR의 확산계수의 변화를 나타낸 것으로, COS7 세포의 결과와 같이 모든 세포주에서도 세툭시맙에 의한 EGFR의 확산계수의 감소를 측정할 수 있었다.

비교예 1. 리간드와의 결합 측정: 웨스턴 블롯( Western blot )

표적 막 단백질과의 리간드와의 결합을 분석하기 위한 비교예로서 웨스턴 블롯을 수행하였다.

리간드의 입수처와 관련하여 mAb 199.12는 invitrogen에서, mAb 528/mAb R-1은 Santa Cruz에서 구매하였고, 항-pEGFR(Y1068) 항체는 Invitrogen에서, 항-total EGFR와 항-pErk1/2 항체는 Signaling에서, 항-액틴 항체는 MP biomedical에서 구매하였다.

RIPA(Radioimmunoprecipitation) buffer를 이용해 COS7 세포를 용해시켰다. 세포 용해물은 6-16% gradient SDS-PAGE 젤에 로딩하였고, 전기장에 의해서 세포 용해물을 내렸다. SDS-PAGE 젤 상에서 분리된 단백질들은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼고, 막에 1차 항체처리 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응을 시킨 후, HRP(horseradish peroxidase) 또는 IRDye800CW(Li-COR)가 달린 2차 항체를 이용해 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 단백질의 존재 여부 및 양은 chemiluminescence (ECL system, Pierce) 또는 infra-red fluorescence(Odyssey system, Li-COR)를 이용해 탐지하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 11은 EGFR에 각각 다른 부위와 결합할 수 있는 세툭시맙, mAb 199.12, mAb 528 및 mAb R-1을 나타낸 것이다.

도 12는 웨스턴블롯의 결과로서 NT는 항체를 처리하지 않은 상태를 나타내며, EGF의 +/-는 EGF 처리 유/무를 나타낸다. 도 12에 나타난 바와 같이 세툭시맙과 mAb 528은 EGFR의 인산화를 막음과 동시에 Erk1/2의 인산화를 다른 경향성으로 막고 있으며, mAb 199.12와 mAb R-1은 EGFR의 인산화를 효과적으로 막지는 못하는 결과를 보이고 있다. 구체적으로 EGFR은 EGF에 의해 활성화되는데, pEGFR은 활성화된 EGFR과 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 감지할 수 있다.

EGF가 없는 환경에서는 EGFR이 활성화되어 있지 않기 때문에 pEGFR 항체를 이용해 감지가 되지 않으나, EGF가 존재하는 환경에서는 EGF에 의해 EGFR이 활성화되고 활성화된 EGFR은 pEGFR 항체에 의해 감지되므로 이와 같은 결과를 보이게 된다. pErk1/2는 신호전달 과정에서 하위 신호전달의 확인에 있어서 중요한 마커로서 EGF가 없는 환경에서는 최소한의 신호전달을 유지하고 있다가, EGF가 존재하는 환경에서는 양이 많아지므로 이를 통해 하위 신호전달이 효과적으로 이루어짐을 알 수 있다.

액틴(actin)은 세포를 구성하는 주요 단백질 중 하나로서 여러 웨스턴 블롯 실험을 수행할 때 비슷한 양의 단백질이 실험에 사용되는 것을 확인해 주는 마커의 역할을 한다.

EGF과 세툭시맙 또는 mAb 528이 동시에 존재할 때, EGF와 EGFR이 결합을 할 수 있는 부분에 세툭시맙과 mAb 528이 방해를 하게 되고 그 결과 EGFR의 활성화가 저해되는 경향이 웨스턴 블롯을 통해 보인다. 하지만 mAb 199.12와 mAb R-1의 경우에는 EGF가 존재하는 환경에서 EGFR의 활성화를 저해하는 경향이 웨스턴 블롯 결과를 통해서 나타나지 않으므로 mAb 199.12와 mAb R-1은 EGF에 의한 EGFR의 활성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

실시예 7. 리간드와의 결합 측정

상기 실시예 1.3에서 얻은 PMT-mEos3.2 숙주세포 및 EGFR-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, mAb 199.12, mAb 528, 및 mAb R-1을 처리하여 상기 실시예 1.5와 같은 방법으로 측정하였는데, 구체적으로 아무것도 처리 하지 않은 상태에서 이미지를 얻고(~10 사이클), 그 이후에 각각 항체를 최종농도 20 ug/ml 세포 배양액에 섞어주어 세포 표면에 존재하는 막 단백질에 항체가 붙도록 유도한 뒤 이미지를 얻었다(~10 사이클). 얻은 PMT-mEos 숙주세포 및 EGFR-mEos 숙주세포에 대해서 각각의 항체를 처리하기 전후의 확산계수 변화를 상기 수학식 3을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13은 확산계수의 변화를 나타낸 것으로, PMT는 세툭시맙, mAb 199.12, mAb 528, mAb R-1과의 특이적 결합을 하지 않기 때문에 처리 전후의 확산계수의 변화는 없지만, EGFR의 경우에는 세툭시맙, mAb 199.12, mAb 528, mAb R-1 모두와 특이적 결합을 하기 때문에 처리 전후 비교에서 약 40% 정도의 변화를 보인다.

도 13에 나타난 바와 같이, PMT의 경우에는 각각의 항체처리 전후의 PMT의 확산계수의 변화가 거의 없음을 보인 반면, EGFR의 경우에는 항체처리 전후에 각각 40% 정도의 EFGR의 확산계수의 변화를 나타내었다. 이는 상기 방법에 의해 측정된 확산계수의 변화가 직접적인 결합에 영향을 받는다는 것과, 또한 결합이 일어나는 부위와 상관없이 측정이 가능하다는 것을 나타낸다. 이러한 특징은 FRET(fluorescene resonance energy transfer)과 PCA(Protein fragment complementation assay)를 이용해서는 얻을 수 없는 장점이다.

비교예 2. 분자특이성 구분 시험: 유세포 분석

표적 막 단백질과 리간드와의 분자특이성 구분 시험을 분석하기 위한 비교예로서 유세포 분석을 수행하였다.

이뮤노글로불린 (anti-Human(A21445)/anti-Mouse(A21235). Invitrogen), 세툭시맙, 트라스주맙 (Roche), 항-액틴 항체 ((691001), MP Biomedicals)에 Alexa Fluor 647 형광 분자를 붙여서 유세포 분석 에 이용하였고, BD bioscience의 Gallios를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 구체적으로 COS7 세포에 상기 Alexa Fluor 647이 연결된 항체를 처리하여 막 단백질과의 결합을 유도하였고, 유세포 분석기를 이용하여 세포 표면에 붙은 형광신호를 관찰하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 14는 EGFR과 특이적 결합을 하는 세툭시맙, ErbB2와 특이적 결합을 하는 트라스주맙의 그림을 나타낸 것이다.

도 15는 유세포 분석 결과를 나타낸 것으로, 구체적으로 x축은 형광신호의 세기를 나타내며 y축은 특정 수준의 형광신호 세기를 가지는 세포의 상대적 비율을 나타낸다. 즉, 그래프가 오른쪽으로 갈수록 형광신호는 강하며, 이는 세포의 표면에 형광염료가 많이 붙어있다는 것으로 해석된다.

도 15에 나타난 바와 같이, 세툭시맙이나 트라스주맙의 경우에는 세포 표면에 비교적 잘 붙음을 알 수 있으나(이뮤노글로불린이나 액틴은 컨트롤로서 세포 표면에 존재하는 막 단백질과 큰 특이적 결합을 보이지 않음), 이러한 접근법 자체는 어떠한 막 단백질에 세툭시맙이 결합하고, 어떠한 막 단백질에 트라스주맙이 결합하였는지에 대해서는 알 수가 없다. 즉, 유세포 분석은 COS7 세포에 내생적으로 존재하는 EGFR과 ErbB2에 대해서 각각 형광 분자로 표지된 항체를 사용해 해당 막 단백질의 유무를 알 수 있지만, 구체적으로 세툭시맙과 트라스주맙이 특이적으로 EGFR과 ErbB2와 결합하는지에 대해서는 알 수 없는 한계를 나타낸다.

실시예 8. 분자특이성 구분 시험

상기 실시예 1.3에서 얻은 PMT-mEos3.2 숙주세포 및 EGFR-mEos 숙주세포에 상기 실시예 1.5와 동일한 방법으로 하여 PMT와 EGFR의 확산계수를 측정하였는데, 구체적으로 각각의 숙주세포에 세툭시맙, 트라스주맙, 항-액틴 항체를 처리하고 처리 전후의 확산계수의 값을 이용해 상기 수학식 3에 따라 확산계수의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16은 상기 방법으로 측정한 PMT-mEos3.2 숙주세포 및 EGFR-mEos 숙주세포에 세툭시맙, 트라스주맙, 항-액틴 항체 처리 전후의 확산계수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.

도 16에 나타난 바와 같이 상기 방법으로 PMT와 EGFR의 확산계수를 측정하였을 때, PMT의 경우에는 세툭시맙, 트라스주맙, 항-액틴 항체에 의해 PMT의 확산계수의 변화가 보이지 않지만, EGFR의 경우에는 세툭시맙에 의해서 EGFR의 확산계수의 변화를 볼 수 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, PMT의 경우 이전 실험의 결과들과 같이 각 항체의 처리 유무에 관계없이 거의 일정한 확산계수를 가지고 있고, PMT의 확산계수의 변화는 매우 적으나, 세툭시맙은 EGFR과 특이적 결합을 하므로 EGFR의 확산계수의 변화를 보이게 되고, EGFR과는 특이적을 결합하지 않는 트라스주맙과 항-액틴 항체의 경우에는 EGFR의 확산계수의 변화를 보이지 않게 된다.

상기 비교예 2의 유세포 분석 결과와 비교했을 때, 유세포 분석는 세툭시맙과 트라스주맙이 세포 표면에 존재하는 막 단백질과 결합한다는 것을 알 수 있지만, 그 결합이 특이적이라는 결론을 내리지 못하는데 반해, 상기 방법을 통해 확산계수를 측정하면 EGFR은 트라스주맙과의 결합이 아니라 세툭시맙과 특이적 결합을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 9. 표적 막 단백질의 측정 방법의 분자량 민감성

세툭시맙과 같이 분자량이 공지된 리간드 뿐만 아니라 분자량에 대해 정확하게 모르는 리간드와 표적 막 단백질의 결합이 있을 경우, 분자량를 모르는 리간드에 대한 분자량 정보를 확산계수의 변화 정도를 통해 유추할 수 있음을 증명하기 위하여, 세툭시맙(150kDa), 세툭시맙 팹(Fab(50kDa)), 세툭시맙 팹2(F(ab')₂(90kDa)) 및 EGFR 특이적 결합 압타머(17kDa)의 총 4개의 다른 분자량(17kDa~150kDa)을 가진 물질과 EGFR과 결합 후 EGFR의 확산계수의 변화를 관찰하는 실험을 진행하였다.

세툭시맙은 Merck Serono에서 구입하였으며, 세툭시맙의 팹(Fab)과 팹2(F(ab`)2) 는 제조 키트(Pierce, 44685 and 44688)를 이용해 준비하였고, EGFR 특이적 결합 압타머는 SELEX를 이용해 만들었다. 상기 실시예 1.5에서와 같이, 각 EGFR-mEos3.2로 형질전환된 COS7 세포에 대해 준비된 4개의 리간드(세툭시맙, 세툭시맙 팹(Fab), 세툭시맙 팹2(F(ab')₂), EGFR 특이적 결합 압타머)를 처리 전후로 상기 실시예 1.5와 동일한 방법을 통해 EGFR의 확산계수의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.

도 17은 결합 위치가 동일하지만 분자량이 다른 4개의 리간드와 EGFR의 결합을 나타낸 그림이다.

도 18은 PMT-mEos3.2 숙주세포 및 EGFR-mEos 숙주세포에 세툭시맙, 세툭시맙 팹(Fab), 세툭시맙 팹2(F(ab')₂), EGFR 특이적 결합 압타머의 처리 전후로 EGFR과 PMT의 확산계수의 변화를 나타낸 것이다.

도 19는 리간드의 분자량과 확산계수 변화의 관계가 선형적임을 나타낸 것이다.

도 17 및 도 19에 나타난 바와 같이, 리간드의 분자량이 17kDa, 50kDa, 90kDa, 150kDa로 커짐에 따라 EGFR의 확산계수의 변화 또한 약 7%, 16%, 27%, 38% 정도로 증가함을 확인하였고, 이러한 관계가 선형적임을 알 수 있다. 구체적으로, 상기 수학식 1 및 2에 따라 확산계수를 계산하면 확산현상을 나타내는 리간드의 분자량이 클수록 확산계수가 느려짐을 이용하여 해당 리간드의 분자량을 유추할 수 있다.

실시예 10. 해리상수의 측정

10.1 EGFR - WT 의 해리상수 측정

세툭시맙을 충분하지 않게 처리하면 세툭시맙이 결합된 EGFR 상태와 결합하지 않은 EGFR 상태로 나누어지는데, 상기 두 개의 다른 상태가 동시에 존재한다면, 실시예 1의 방법을 통해 EGFR의 확산계수를 측정하는 경우 두 군집의 비율을 유추할 수 있다. 상기 실시예 1의 방법을 이용하면 리간드가 결합되거나 또는 결합되지 않은 군집은 크기가 같지 않기 때문에 각 군집이 가지는 EGFR의 확산계수의 차이를 서로 구분할 수 있고, 이 비율을 이용해 살아있는 단세포에서 EGFR과 세툭시맙의 해리상수를 정량적으로 측정하는 것이 가능하다.

이를 증명하기 위해 실시예 1.3의 EGFR-mEos3.2가 발현된 COS7 세포에 세툭시맙의 농도를 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 ug/ml의 포화수준까지 점차 올려 가면서 각 환경에서의 EGFR의 확산계수를 측정하였다. 얻어진 EGFR의 확산계수를 하기 수학식 4 내지 8를 이용하여 EGFR과 세툭시맙의 결합/비결합 비율로 변환하였다.

하기 수학식 4 내지 8에서 U와 B는 리간드가 결합하지 않은 또는 결합된 하나의 표적 막 단백질의 확산계수의 random variables이다. 단순한 모델을 위해 두 상태의 전환은 없다고 가정을 하였으며, 리간드의 농도는 c로 나타내었다.

[수학식 4]

M_(C=c) = α_(C=c)*U + β_(C=c)*B

M_(C=c)는 리간드 농도가 c일 때 표적 막 단백질의 확산계수,

α_(C=c)는 하나의 세포에서 리간드의 농도가 c일 때, 전체 표적 막 단백질 중 리간드가 결합하지 않은 막 단백질의 비율,

β_(C=c)는 하나의 세포에서 리간드의 농도가 c일 때, 전체 표적 막 단백질 중 리간드가 결합된 표적 막 단백질의 비율을 의미하며, α_(C=c) + β_(C=c) = 1이다

U는 리간드가 결합하지 않은 하나의 표적 막 단백질의 확산계수,

B는 리간드가 결합된 하나의 표적 막 단백질의 확산계수를 의미한다.

[수학식 5]

E(M_(C=c)) = α_(C=c)*E(U) + β_(C=c)*E(B)

E(M_(C=c))는 리간드 농도가 c일 때 표적 막 단백질의 예상 확산계수,

E(U)는 리간드가 붙지 않은 표적 막 단백질의 예상 확산계수,

E(B)는 리간드가 붙지 않은 표적 막 단백질의 예상 확산계수를 의미한다.

그러므로 리간드가 결합된 막 단백질의 비율은 하기 수학식 6과 같이 유도된다.

[수학식 6]

β_(C=c)=(E(M_(C=c))-E(M_(C=0)))/(E(M_(C=s))-E(M_(C=0)))=(D_(C=c)-D_(C=0))/(D_(C=s)-D(_C=0))

E(U)= E(M_(C=0)), E(B)=E(M_(C=s))

D_(C=c)는 하나의 세포에서 리간드의 농도가 c일 때, 표적 막 단백질의 확산계수이다. 그러므로 해리상수(K_d)는 수학식 7과 같이 정의된다.

[수학식 7]

K_d = ([L][R])/([RL])=(c*α_(C=c))/β_(C=c)

[L]은 리간드의 농도,

[R]은 표적 막 단백질(receptor)의 농도,

[LR]은 리간드와 표적 막 단백질이 붙은 농도를 의미한다.

수학식 6과 수학식 7을 통해, 수학식 8를 얻을 수 있다.

[수학식 8]

(D(_C=c)-D(_C=0))/(D(_C=s)-D(_C=0))=c/(K_d+c)

EGFR과 세툭시맙의 결합/비결합 비율을 통해 상기 수학식 4 내지 8을 이용하여 EGFR과 세툭시맙의 해리상수뿐만 아니라 EGFR과 세툭시맙의 협동도(cooperativity)를 살아있는 단세포 수준에서 확인하였다. 그리고 이렇게 측정된 해리상수와 Scatchard plot을 통해 얻어진 협동도(cooperativity) 값들을 실제로 in vitro 에서 수행된 실험과도 비교하였을 때 비슷한 값을 나타냄을 확인하였고, 그 자세한 결과들을 도 20 내지 도 22에 나타내었다.

도 20는 세툭시맙의 농도가 높아짐에 따라 EGFR과 결합하는 세툭시맙이 많아짐을 나타낸 그림이다.

도 21은 세툭시맙의 농도를 하나의 세포에서 0.02부터 1.28 ug/ml까지 증가시킴에 따른 EGFR의 확산계수의 감소를 나타낸 것이다. 아무것도 처리하지 않았을 때를 기준으로 줄어든 EGFR의 확산계수의 값을 정규화 하였다.

도 22는 도 22의 결과를 바탕으로 세툭시맙의 농도를 높여줌에 따라 EGFR과 결합된 세툭시맙의 비율을 나타낸 그래프며, 이를 통해서 EGFR과 세툭시맙의 해리상수를 구할 수 있다. 또한 도 22의 안쪽 그래프는 scatchard plot을 통해 결합에 있어서 세툭시맙의 결합에는 협동도(cooperativity)가 없음을 나타낸 것이다.

도 20 내지 도 22에 나타난 바와 같이, 상기 방법을 이용하여 EGFR의 확산계수를 측정하면 리간드가 결합하거나 또는 결합하지 않은 군집은 크기가 같지 않기 때문에 EGFR과 세툭시맙이 결합된 정도에 따라 EGFR의 확산계수의 차이를 구분할 수 있고, 이 비율을 이용해 살아있는 단세포에서 EGFR과 세툭시맙의 해리상수를 정량적으로 측정하는 것이 가능함을 확인할 수 있다.

10.2 돌연변이 형태인 EGFRvIII 의 해리상수 측정

실시예 1의 방법을 이용하게 되면 리간드와 형광 표지한 표적 막 단백질과의 결합만을 관찰할 수 있다. 다시 말해 수많은 막 단백질이 혼합된 환경에서도 형광으로 표지된 표적 막 단백질만을 관찰할 수 있다.

이를 증명하기 위해 EGFR에 비해서 extracellular 도메인의 일부분이 없는 EGFR의 돌연변이 형태인 EGFRvIII(서열번호 8)에 세툭시맙과 mAb R-1 항체를 처리해주는 방법으로 실험하였다. 구체적으로 EGFR-mEos3.2 대신에 EGFRvIII-mEos3.2를 COS7 세포에 발현시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같이 형질전환된 세포를 준비하였고, 같은 방법으로 PMT가 발현된 COS7 세포를 준비하였으며, EFGR과는 결합을 하지만 EGFRvIII와는 결합을 하지 않는 mAb R-1을 추가한 것 이외에는 실시예 10.1과 같이 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다.

도 23은 EGFR WT은 세툭시맙과 mAb R-1 항체와 모두 결합할 수 있지만, 돌연변이 형태인 EGFRvIII의 경우에는 mAb R-1은 결합하지 않고, 세툭시맙만이 결합하는 것을 나타낸 것이다.

도 24는 PMT의 경우에는 세툭시맙과 mAb R-1 두 항체에 의한 결합이 없기 때문에 PMT의 확산계수의 감소가 나타나지 않지만, EGFRvIII의 경우에는 세툭시맙과는 결합을 하고 mAb R-1와는 결합을 하지 않는 결과를 나타낸 것이다.

도 24에 나타난 바와 같이, 세툭시맙에 의한 EGFRvIII의 확산계수의 감소는 확연히 드러나고, mAb R-1에 의한 EGFRvIII의 확산계수의 감소는 미미함을 확인할 수 있다. 이는 EGFR WT에서 mAb R-1의 결합 위치가 제거된 돌연변이인 EGFR vIII과 세툭시맙과는 결합을 하고, mAb R-1과는 결합하지 않는 것을 의미한다.

EGFR vIII와 세툭시맙의 해리상수를 농도 변화 실험을 통해 측정하였는데, 보다 구체적으로 세툭시맙의 농도를 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 ug/ml로 증가시켜 주면서 상기 실시예 1.4와 같은 방법으로 EGFRvIII의 확산계수를 측정하였고, 세툭시맙과 결합한 비율을 통해 상기 실시예 10.1과 같이 EGFRvIII와 세툭시맙의 해리상수를 측정하였으며, 또한 scatchard plot을 그려서 분석하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.

도 25는 실시예 10.1과 같은 방법을 이용하여 EGFRvIII와 세툭시맙의 해리상수 및 협동도(cooperativity)를 나타낸 것이다. 도 25에 나타난 바와 같이, Scatchard plot을 통해 EGFRvIII와 세툭시맙 사이의 결합에 협동도(cooperativity)가 없음을 확인할 수 있었다.

도 20 내지 도 25에 나타난 바와 같이, 상기 방법은 살아있는 세포에서 보고자 하는 표적 막 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드의 해리상수 및 협동도(cooperativity)를 구할 수 있음을 보여준다.

실시예 11. 표적 막 단백질의 복합체 형성과정 분석

실시예 1의 방법으로 EGFR를 포함한 표적 막 단백질의 확산계수를 측정하게 되면 표적 막 단백질이 복합체를 이루는 과정 속에서 분자의 크기가 커지게 되고, 이는 확산계수와 직접적으로 연결되어 있기 때문에 확산계수를 기반으로 복합체를 이루는 과정을 알 수 있게 된다.

실시예 1.3의 EGRF-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, 2차 항체(Goat anti-human 이뮤노글로불린(IgG) 항체(81-7100), invitrogen), 3차 항체(Rabbit anti-goat 이뮤노글로불린 (A10537), invitrogen)를 순서를 정해 처리해 줌으로써, 복합체를 이루는 과정을 알아보기 위해, 도 26과 같이 EGFR에 순차적으로 결합하는 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체를 차례대로 처리하여 상기 실시예 1.5와 같은 방법을 수행하여 EGFR의 확산계수를 측정하였고, 그 결과를 도 27에 나타내었다.

도 26은 EGRF-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체가 차례대로 결합 하는 것을 나타낸 것이며, 도 27은 EGRF-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체를 차례대로 처리하는 순서로 EGFR의 확산계수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 27에 나타난 바와 같이, EGRF-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체를 순서대로 처리해 주면, EGFR의 확산계수 역시 순서대로 감소되는 경향을 나타내었다. 최종적으로 표적 막 단백질에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체가 붙은 복합체(complex)의 크기는 약 600 kDa 이상이었고, 2차 항체까지 결합되어 있는 복합체에서 3차 항체가 붙음으로써 발생한 EGFR의 확산계수의 감소는 ~12% 정도였으며, 이를 통해 600 kDa 이상의 큰 복합체에 대해서도 적용이 가능함을 보여주었다.

대조적으로 EGRF-mEos3.2 숙주세포에 세툭시맙, 3차 항체, 2차 항체의 순서대로 처리하여 상기 실시예 1.5와 동일한 방법을 이용하여 EGFR의 확산계수를 측정하였고, 그 결과를 도 28에 나타내었다.

도 28은 EGFR에 세툭시맙, 2차 항체, 3차 항체의 순서대로 처리하여, EGFR의 확산계수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 28에 나타난 바와 같이, EGFR에 세툭시맙, 3차 항체, 2차 항체를 순서대로 처리해 주면, 2차 항체가 처리되는 순간 한번에 복합체를 만들기 때문에 이 시점에서 약 30% 정도의 EGFR의 확산계수의 급격한 변화를 나타내었다.

도 27과 도 28을 비교해보면, EGFR에 세툭시맙을 처리하고 3차 항체를 처리하였을 때에는 EGFR의 확산계수가 변하지 않았지만, 2차 항체를 처리하였을 때는 3차 항체와 2차 항체가 결합을 한 후 세툭시맙에 붙기 때문에 훨씬 더 큰 EGFR의 확산계수의 감소를 보인다. 이러한 특이성은 상기 방법이 표적 막 단백질의 복합체를 이루는 과정에 대해 연구할 수 있는 좋은 수단이 될 수 있음을 나타낸다.

실시예 12. 표적 내재성 막단백질 관찰: COS7 세포에서 발현된 내재성 EGFR

EGFR을 타겟으로 하는 여러 종류의 항체들 중 Mouse (monoclonal) Anti-Human Epidermal Growth Factor Receptor(mAb 199.12(Invitrogen))를 이용하여 EGFR 특이적 결합 및 관찰하였다. 항체가 결합함으로써 표적 단백질의 활성을 조절하는 경우가 있는데, mAb 199.12의 경우는 EGFR의 활성에 거의 영향을 미치지 않는 항체로 알려져 있다.

12.1 팹( Fab ) 항체 제작

팹(Fab) 제조 키트(Pierce, 44685)를 이용하여 팹(Fab) 항체를 제작하였다. 먼저, 단백질 분해효소인 파파인(papain)이 결합된 수지(resin)를 효소 반응이 일어나기에 효과적인 완충 용액 내에서 면역 글로불린 항체와 섞어준 후 37도 온도 조건에서 5-6시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되어 2개의 팹(Fab) 단편과 Fc 단편으로 분리된 항체와 파파인 수지를 원심분리하여 상층액만을 분리해냈다. Protein A가 결합된 수지와 상층액을 섞어준 다음 원심분리하여 정제된 팹(Fab) 단편을 얻었다.

12.2 항체와 유기형광염료의 결합

Alexa Fluor® 647 Antibody Labeling 키트(Invitrogen)를 이용하여 항체를 유기형광염료 Alexa Fluor 647과 결합시켰다. 항체를 0.1M 탄산수소나트륨 용액에 섞어준 다음 succinimidyl ester 혹은 tetrafluorophenyl ester 반응기가 달려있는 형광 염료와 섞어 1시간 동안 반응시킴으로써 형광 염료가 항체 내의 1차 아민 그룹과 안정적인 결합체를 형성하도록 하였다. 결합하지 않고 남아있는 형광 염료를 정제 수지에 올려서 결합시킨 후 원심분리를 통해 통과액을 얻음으로써 형광 염료와 결합되어 있는 항체만을 분리하여 얻었다.

12.3 커버슬립 준비 및 세포 안착

다른 어떠한 처리도 거치지 않은 천연 그대로의 세포를 이용하여 25mm 또는 18mm 지름의 커버슬립(coverslip)에 안착시켰는데, 커버슬립의 자발형광(autofluorescence)을 최소화 하기 위해 아세톤에 담가 42℃에서 30분간 sonication을 하고, 증류수로 3번 씻은 후 다시 1% hydrofluoric acid에 담가 42℃에서 10 분간 sonication을 진행한 후 증류수로 15~20번 정도 완전히 hydrofluoric acid가 없어지도록 씻어 주었고, 마지막으로 100% 에탄올에 담가 UV에 30분간 노출시켜 멸균을 시킨 후 보관한 커버슬립을 사용하였다.

세포안착은 세포가 커버슬립 근처에 붙을 수 있도록, 표면 코팅 물질(surface coating material)을 처리한다. 이 때 사용할 수 있는 표면 코팅 물질로는 콜라겐, 파이브로넥틴, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함한다.

12.4 세포가 안착된 커버슬립의 현미경에의 고정

상기 실시예 12.3에 따라 안착된 세포가 있는 커버슬립을 생세포 유지 장치(37℃ 온도, 5% CO₂)와 EM-CCD(electron multiplying charge coupled device)가 있는 현미경에 고정시켜 단세포 단위로 관찰하였다. 상기 현미경은 올림푸스사의 IX71모델로서 TIRF(total internal reflection fluorescence)을 기반으로 하기 때문에 원형 커버슬립에 가깝게 붙은(커버슬립에서 약 200nm 정도) 세포의 원형질막 부분에 있는 형광 분자에 대해서만 관찰할 수 있다.

12.5 유기 형광염료가 결합된 항체의 처리

상기 실시예 12.4에 따라 안착된 세포가 가지고 있는 내재성 막 단백질을 실시예 12.1 및 12.2에서 제작된 형광 염료가 결합된 팹(Fab)을 이용하여 특이적으로 표지한다. 표적 단백질을 표지하는 정도는 형광 염료가 결합된 팹(Fab)의 농도와 시간을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.

내재성 단백질에 충분한 표지가 되고 나면 용액 속에 존재하는 결합하지 않은 형광 염료가 결합된 팹(Fab)은 성장배지로 2~3회 씻어줌으로써 제거하였다.

살아있는 세포가 유지되는 조건에서 유기 형광 염료의 광스위치를 유도하고 광표백을 억제하기 위해서 세포의 배지에 1mM MEA(β-Mercaptoethylamine), 0.2U/ml PCA(protocatechuic acid) 및 2.5 mM PCD(Protocatechuate-3,4-dioxygenase)을 넣어주었다.

12.6 리간드 및 상호작용 파트너가 결합되지 않은 내재성 막단백질 관찰

상기 실시예 12.5에서 형광으로 표지된 내재성 EGFR에 642nm laser를 이용하여 단분자(single molecule)가 관찰 가능한 정도로 Alexa Fluor 647이 가지고 있는 형광을 일시적으로 꺼지게 만든 다음 405nm laser를 이용해 형광의 전자 상태를 변화시킴으로써 여러 형광 염료 중에 무작위로 다시 형광이 켜지도록 조절하였고, 642nm laser를 이용해 형광 단분자에서 나오는 신호를 감지할 수 있는 andor technology의 EM-CCD(electron multiplying charge coupled device) ixon3 897를 이용하여 일정한 시간간격(~50ms)으로 순서대로 형광 이미지를 얻었다. 각각의 이미지에 존재하는 단분자의 신호를 찾은 후 전후 이미지들과 비교함으로써 단위 시간당 형광 단백질이 이동한 거리 및 경로를 추적하였고, 이동한 거리(MSD)는 상기 수학식 1을 이용하여 구하였다.

도 29는 내재성 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 팹(Fab) 단편에 광스위치 형광 유기 염료인 Alexa Fluor 647을 결합시켜 내재성 EGFR을 탐지하는 과정을 보여준다(좌측). 실제 세포의 EGFR에 붙어서 광활성된 Alexa Fluor 647은 중간 그림처럼 형광 신호를 내게 되므로 관찰이 가능하다. 각각의 단분자에서 나오는 형광 신호가 광표백 될 때까지 위치정보와 경로를 추적함으로써, 확산계수를 구할 수 있다. 오른쪽 그림은 추적된 10000개의 단분자 경로를 나타낸 것이다.

12.7 리간드 및 상호작용 파트너가 결합된 내재성 막단백질 관찰

상기 실시예 12.5에서 준비된 내재성 EGFR이 형광 염료로 표지된 세포에 20ug/ml의 세툭시맙을 처리하였다. 도 30과 같이 형광 염료가 결합된 mAb 199.12와 세툭시맙은 EGFR에서 특이적으로 결합하는 부위가 다르기 때문에 상호 영향을 주지 않음을 확인하였다. 세툭시맙의 처리 전후를 상기 실시예 12.6과 같은 방법을 통해 관찰하였고, 상기 수학식 1과 수학식 2를 이용하여 처리 전후의 확산계수를 구하고 그 평균값과 표준편차를 도 31에 나타내었다.

도 30은 내재성 EGFR에 대하여 mAb 199.12와 세툭시맙의 결합이 서로 방해받지 않음을 확인한 결과이다. 형광 염료로 표지된 세툭시맙, mAb 199.12 항체 1ug/ml와 형광 염료로 표지되지 않은 세툭시맙(100ug/ml)을 섞어서 COS7 세포에 존재하는 내재성 EGFR에 30분간 결합시킨 후 유세포 분석기를 사용하여 그 결합 정도에 따른 형광 신호를 탐지하였다. mAb 199.12 항체의 결합 정도는 100배 농도의 세툭시맙이 존재하더라도 결합이 방해받지 않은 반면, 세툭시맙 항체는 형광 염료가 결합되지 않은 고농도의 세툭시맙에 의해 그 결합이 저해되어 감소된 형광신호를 보임을 알 수 있다.

도 31은 내재성 EGFR과 세툭시맙의 특이적 결합 양상을 관찰한 데이터이다. EGFR에 특이적 결합을 하는 mAb 199.12 항체의 팹(Fab)을 정제하여 Alexa Fluor 647 형광 염료로 표지한 후, 살아있는 하나의 COS7 세포에 처리함으로써 세포가 가지고 있는 내재성 EGFR에 결합시켰다. 이뮤노글로불린 항체 및 세툭시맙을 처리하기 전의 확산계수를 구하고, 각각 이뮤노글로불린 항체와 세툭시맙을 처리한 후 그 결합에 따라 변화된 확산계수를 계산하였다. 이뮤노글로불린 항체는 EGFR과 특이적 결합을 하지 않기 때문에, 확산계수의 변화가 거의 없는 반면, 세툭시맙의 경우는 EGFR과 특이적 결합을 하기 때문에, 확산계수가 ~40% 정도로 변화하는 것을 관찰할 수 있다.

12.8 다양한 세포주에 존재하는 내재성 EGFR 확인

다양한 세포 라인에 존재하는 내재성 EGFR에 세툭시맙에 의한 확산계수의 변화를 관찰하기 위하여 COS7, A431, MDA-MB-231, BT20, HCC827 세포주들을 상기 실시예 12.4에 따라 준비하고, 세포들에 존재하는 내재성 EGFR에 대하여 상기 실시예 12.5와 같이 팹(Fab)을 이용하여 형광으로 표지를 하였으며, 상기 실시예 12.6과 같은 방법으로 아무것도 처리하지 않은 상태의 확산계수를 측정하였다. 그 후 동일한 세포에 대하여 각각 이뮤노글로불린 항체 혹은 세툭시맙을 처리해 준 다음, 마찬가지로 확산계수를 측정하였다. 상기 수학식 3을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 상태 대비 확산계수의 변화를 계산하여 도 32에 나타내었다.

도 32는 서로 다른 5개의 세포주에 대하여 이뮤노글로불린 항체 및 세툭시맙에 의해 변화된 확산계수의 평균값 및 표준편차를 정량적으로 나타낸 결과이다. 아무것도 처리를 하지 않았을 때의 각 세포에서의 내재성 EGFR의 확산계수를 기준으로 이뮤노글로불린 항체를 처리한 경우 처리 전후로 확산계수가 거의 변하지 않았지만, 세툭시맙의 경우 처리 후 모든 세포에서 약 40%에 가까운 확산계수의 변화를 보였다. 구체적으로, 상기 수학식 1 및 수학식 2을 이용하여 확산계수를 구할 수 있으며, 각각 다른 조건에서의 확산계수를 D_c1 및 D_c2로 하였을 때, 상기 수학식 3을 이용하여 확산계수의 변화의 비율을 계산하면, 이뮤노글로불린 항체를 처리한 경우는 D_c1 과 D_c2 의 값이 거의 동일하기 때문에 확산계수의 변화 값은 매우 작으나, 세툭시맙을 처리한 경우는 D_c2과 D_c1의 값은 약 60% 정도 수준으로 이를 계산하면 40% 정도의 확산계수 감소를 보임을 확인할 수 있다.

실시예 13. 동물 모델에서 유래된 Primary 세포에서 내재성 막 단백질의 관찰: 쥐의 폐로부터 분리된 다양한 Primary 세포에서 내재성 EGFR 의 관찰

13.1 세포 표지에 특이적인 형광 염료가 결합된 항체 준비

조직으로부터 분리된 세포는 세포주와 달리 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있기 때문에, 관찰하는 세포의 종류를 판단하기 위해 다양한 세포막 마커(Sca-1, PECAM)에 대한 항체와 이 항체에 결합하는 형광 염료가 붙어 있는 2차 항체를 이용하여 세포를 표지하였다. 이때, 서로 다른 파장의 레이저로 관찰이 가능하도록 하기 위해 마커에 따라 형광 염료의 종류를 달리하였다(Pacific blue, Alexa Fluor 488, Dylight 549).

13.2 쥐의 폐조직으로부터 Primary 세포의 분리 및 세포 안착

8주령의 C57BL/6 계통의 쥐 모델의 폐조직에 기도를 통해 0.5mg/ml Collagenase type II(Worthington)와 1mg/ml Collagenase type IV(Worthington)의 혼합액을 주입하여 조직을 분해하고 분리한 폐 조직을 collagenase 혼합액에 37℃ 에서 30분간 두었다. PBS로 collagenase를 중화시킨 다음, 원심분리하여 세포만을 얻고 이것을 Cell strainer(BD falcon)으로 걸러서 단일 세포를 분리해내었다. 분리된 세포를 성장배지에 Fibroblast growth inhibitor를 처리하여 24시간 키운 다음 상기 실시예 12.3 및 12.4와 같은 방법으로 18mm 지름의 커버슬립에 안착시켜 현미경에 고정하였다.

13.3 세포 표지에 따른 Primary 세포의 분류

고정되어 있는 마우스의 폐 Primary 세포들에 Pacific blue 형광 염료가 결합되어 있는 Sca-1 단백질에 대한 항체(Invitrogen), Dylight 549가 결합되어 있는 2차 항체와 결합된 Pecam 단백질에 대한 항체(Santa cruz) 및 Alexa Fluor 647 형광염료가 결합되어 있는 EGFR 단백질 항체를 함께 처리하였다. 각 형광염료에 적합한 각기 다른 파장의 레이저(405, 488, 561, 633nm)를 이용하여 상기 실시예 12.6과 같은 방식으로 자발형광 수준, 각 단백질의 발현 정도 및 움직임을 관찰하였다. 그 결과를 바탕으로 기존에 알려져 있는 폐 세포 조직 내의 세포 종류에 대한 마커들과 비교하여(Carla F. Bender Kim, et al., Cell, Vol. 121, 823-835, June 17, 2005) 한 마리의 쥐 모델에서 분리해낸 폐 세포 군집 안에 섞여 있는 서로 다른 4가지 종류의 세포를 분류하였으며 각 세포에서 내재성 EGFR의 확산계수를 측정하고 세툭시맙에 의해 변화된 확산계수를 측정하였다.

도 33은 폐 세포 조직 내의 세포 종류에 대한 마커와 자발형광(Autofluorescence) 수준으로 분류한 mouse primary 세포에 대한 각각의 이미지들을 나타낸다. DIC는 세포가 가진 본래의 모양을 나타내는 이미지이고, Sca-1, Pecam, 자발형광은 모두 형광 이미지를 타나낸다. Sca-1의 발현이 아주 높고 Pecam의 발현이 거의 되지 않은 세포 1번은 BASC(Bronchio-alveolar stem cell)로 분류되었으며, Sca-1과 Pecam이 모두 발현되어 있는 세포 2번은 내피세포로 분류할 수 있었다. 세포 3번은 Sca-1과 Pecam의 발현이 모두 매우 낮으나 488nm 채널에서의 자발형광이 매우 높게 나타났으므로 AT2 세포로 판단되며, Sca-1과 Pecam이 거의 발현되어 있지 않은 동시에 자발형광 수준도 매우 낮게 나타난 세포 4번은 Clara 세포로 보여진다.

도 34은 도 33에서 선별된 4가지 세포 BASC, 내피세포, AT2 세포 및 Clara 세포에 존재하는 내재성 EGFR에 대하여 세툭시맙 결합 양상에 따른 확산계수의 변화를 관찰한 결과를 보여준다. BASC 세포와 Clara 세포에 존재하는 EGFR은 세툭시맙에 의한 확산계수의 변화가 ~40% 정도로 변화의 폭이 큰데 반해, 내피세포와 AT2 세포는 그 변화의 폭이 10% 미만으로 관찰되었음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD OF ANALYZING BINDING ASPECT OF MEMBRANE PROTEIN IN A LIVING CELL <130> P14U10C0517 <150> KR 10-2013-00560008 <151> 2013-05-16 <150> PCT/KR 2013/011002 <151> 2013-11-29 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60 gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120 ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180 gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240 accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300 ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360 gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420 caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480 agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540 cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg 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1440 tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500 gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560 agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620 cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680 gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740 cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800 ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860 catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920 cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980 gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040 aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100 caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160 ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280 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accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180 aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240 agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300 cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360 agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420 actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480 ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540 gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600 gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca 3630 <210> 2 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEos3.2 <400> 2 atgagtgcga ttaagccaga catgaagatc aaactccgta tggaaggcaa cgtaaacggg 60 caccactttg tgatcgacgg agatggtaca ggcaagcctt ttgagggaaa acagagtatg 120 gatcttgaag tcaaagaggg cggacctctg ccttttgcct ttgatatcct gaccactgca 180 ttccattacg gcaacagggt attcgccaaa tatccagaca acatacaaga ctattttaag 240 cagtcgtttc ctaaggggta ttcgtgggaa cgaagcttga ctttcgaaga cgggggcatt 300 tgcaacgcca gaaacgacat aacaatggaa ggggacactt tctataataa agttcgattt 360 tatggtacca actttcccgc caatggtcca gttatgcaga agaagacgct gaaatgggag 420 ccctccactg agaaaatgta tgtgcgtgat ggagtgctga cgggtgatat tgagatggct 480 ttgttgcttg aaggaaatgc ccattaccga tgtgacttca gaactactta caaagctaag 540 gagaagggtg tcaagttacc aggcgcccac tttgtggacc actgcattga gattttaagc 600 catgacaaag attacaacaa ggttaagctg tatgagcatg ctgttgctca ttctggattg 660 cctgacaatg ccagacga 678 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI restriction site <400> 3 tctaga 6 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NotI restriction site <400> 4 gcggccgc 8 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggctgct tcttcagcaa gcggcggaag gccgacaagg agagc 45 <210> 6 <211> 1239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggggcaac ccgggaacgg cagcgccttc ttgctggcac ccaatagaag ccatgcgccg 60 gaccacgacg tcacgcagca aagggacgag gtgtgggtgg tgggcatggg catcgtcatg 120 tctctcatcg tcctggccat cgtgtttggc aatgtgctgg tcatcacagc cattgccaag 180 ttcgagcgtc tgcagacggt caccaactac ttcatcactt cactggcctg tgctgatctg 240 gtcatgggcc tggcagtggt gccctttggg gccgcccata ttcttatgaa aatgtggact 300 tttggcaact tctggtgcga gttttggact tccattgatg tgctgtgcgt cacggccagc 360 attgagaccc tgtgcgtgat cgcagtggat cgctactttg ccattacttc acctttcaag 420 taccagagcc tgctgaccaa gaataaggcc cgggtgatca ttctgatggt gtggattgtg 480 tcaggcctta cctccttctt gcccattcag atgcactggt accgggccac ccaccaggaa 540 gccatcaact gctatgccaa tgagacctgc tgtgacttct tcacgaacca agcctatgcc 600 attgcctctt ccatcgtgtc cttctacgtt cccctggtga tcatggtctt cgtctactcc 660 agggtctttc aggaggccaa aaggcagctc cagaagattg acaaatctga gggccgcttc 720 catgtccaga accttagcca ggtggagcag gatgggcgga cggggcatgg actccgcaga 780 tcttccaagt tctgcttgaa ggagcacaaa gccctcaaga cgttaggcat catcatgggc 840 actttcaccc tctgctggct gcccttcttc atcgttaaca ttgtgcatgt gatccaggat 900 aacctcatcc gtaaggaagt ttacatcctc ctaaattgga taggctatgt caattctggt 960 ttcaatcccc ttatctactg ccggagccca gatttcagga ttgccttcca ggagcttctg 1020 tgcctgcgca ggtcttcttt gaaggcctat gggaatggct actccagcaa cggcaacaca 1080 ggggagcaga gtggatatca cgtggaacag gagaaagaaa ataaactgct gtgtgaagac 1140 ctcccaggca cggaagactt tgtgggccat caaggtactg tgcctagcga taacattgat 1200 tcacaaggga ggaattgtag tacaaatgac tcactgctg 1239 <210> 7 <211> 1926 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 7 atggctgagg aggcggtgcc tagcgagtcc cgggccgccg gccggccgag cttggaactt 60 tgtgccgtag cactccccgg ccggcgggag gaggtggggc accaggacac ggctggccac 120 cgccggcccc gggctgactc ccggtgctgg gctagagggc tactgctgct tctttggctg 180 ctggaggctc ctctgctttt gggggtccga gcgcaggcgg cgggccaggt atccgggccg 240 ggccagcaag ctccgccgcc gccccagcca cagcagggcg ggcagcagta caacggcgaa 300 cggggcatct ccatcccgga ccacggctac tgtcagccca tctccatccc gctgtgcacg 360 gacatcgcgt acaatcagac catcatgccc aacctgctgg gccacacgaa tcaggaggac 420 gccggcctgg aggtgcacca gttctacccg ttggtgaagg tgcagtgctc agccgagctc 480 aagttcttcc tgtgctccat gtacgcgcct gtgtgcaccg tactggagca ggcgctgccg 540 ccctgccgct ccctgtgcga gcgcgcgcgc cagggctgcg aggcactcat gaacaagttc 600 ggcttccagt ggccagacac gctcaagtgc gagaagttcc ctgtgcacgg cgcaggagag 660 ctgtgcgtgg gccagaacac ttccgacaaa ggcaccccga ctccctcctt gctgccggag 720 ttctggacca gcaatccgca gcacggcggc ggtggttacc gcggcggcta cccgggaggt 780 gccggccccg tggagcgggg aaagttctcc tgcccgcgcg ccctcagggt gccttcctac 840 ctcaactatc actttctggg ggagaaggac tgcggcgcgc cctgcgaacc cactaaagta 900 tacgggctca tgtacttcgg gcctgaggag ttgcgctttt cgcgcacctg gataggcatc 960 tggtcggtgc tgtgctgcgc ctccacgctc ttcacggtgc tcacgtacct agtagacatg 1020 cggcgcttca gctacccgga gcggcccatt attttcctgt ccggctgtta cacagcggtg 1080 gcggtggcct atatcgccgg ctttctgttg gaggaccggg tggtgtgcaa cgacaagttt 1140 gcagaggacg gggcgcgcac ggtggcgcag ggcactaaga aggaggggtg caccatcctc 1200 tttatgatgc tctacttctt cagcatggcc agctccatct ggtgggtaat cctgtccctc 1260 acctggttcc tggcagccgg catgaagtgg ggccacgaag ccatcgaggc caactcacaa 1320 tattttcacc tagccgcctg ggctgtacca gccattaaaa ctataaccat cctggcgctg 1380 ggccaagtgg atggcgacgt actgagtgga gtgtgttttg tggggctcaa taacgtggat 1440 gctctgcggg gctttgtgct ggcgccgctc ttcgtctatc tgttcatcgg cacctctttc 1500 ctgctggctg gtttcgtgtc gctcttccgc atccgcacca tcatgaagca tgacggcacc 1560 aagacagaga aactggaaaa gctcatggtg cgcatcggag tcttcagtgt gctctacacc 1620 gtgccggcca ccatcgtcat cgcctgctac ttctatgagc aggcctttcg ggaccagtgg 1680 gagcgcagct gggtggccca gagctgcaag agttatgcca tcccttgccc tcacctccaa 1740 ggaggtggag gcgtcccacc acacccaccc atgagccccg actttacagt cttcatgatc 1800 aagtatctca tgacgctaat tgtgggcatc acatcaggct tctggatctg gtccggcaag 1860 acactgaatt cctggaggaa gttctacacg aggcttacca acagcaaaca gggggagact 1920 accgtc 1926 <210> 8 <211> 2829 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60 gcgagtcggg ctctggagga aaagaaaggt aattatgtgg tgacagatca cggctcgtgc 120 gtccgagcct gtggggccga cagctatgag atggaggaag acggcgtccg caagtgtaag 180 aagtgcgaag ggccttgccg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 240 tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 300 gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 360 gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 420 caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 480 ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 540 ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 600 aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 660 accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 720 gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 780 aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 840 gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 900 aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 960 ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 1020 tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 1080 tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 1140 actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 1200 atgcgaaggc gccacatcgt tcggaagcgc acgctgcgga ggctgctgca ggagagggag 1260 cttgtggagc ctcttacacc cagtggagaa gctcccaacc aagctctctt gaggatcttg 1320 aaggaaactg aattcaaaaa gatcaaagtg ctgggctccg gtgcgttcgg cacggtgtat 1380 aagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat caaggaatta 1440 agagaagcaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgaagccta cgtgatggcc 1500 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcaa 1560 ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 1620 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggg catgaactac 1680 ttggaggacc gtcgcttggt gcaccgcgac ctggcagcca ggaacgtact ggtgaaaaca 1740 ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 1800 gaataccatg cagaaggagg caaagtgcct atcaagtgga tggcattgga atcaatttta 1860 cacagaatct atacccacca gagtgatgtc tggagctacg gggtgaccgt ttgggagttg 1920 atgacctttg gatccaagcc atatgacgga atccctgcca gcgagatctc ctccatcctg 1980 gagaaaggag aacgcctccc tcagccaccc atatgtacca tcgatgtcta catgatcatg 2040 gtcaagtgct ggatgataga cgcagatagt cgcccaaagt tccgtgagtt gatcatcgaa 2100 ttctccaaaa tggcccgaga cccccagcgc taccttgtca ttcaggggga tgaaagaatg 2160 catttgccaa gtcctacaga ctccaacttc taccgtgccc tgatggatga agaagacatg 2220 gacgacgtgg tggatgccga cgagtacctc atcccacagc agggcttctt cagcagcccc 2280 tccacgtcac ggactcccct cctgagctct ctgagtgcaa ccagcaacaa ttccaccgtg 2340 gcttgcattg atagaaatgg gctgcaaagc tgtcccatca aggaagacag cttcttgcag 2400 cgatacagct cagaccccac aggcgccttg actgaggaca gcatagacga caccttcctc 2460 ccagtgcctg aatacataaa ccagtccgtt cccaaaaggc ccgctggctc tgtgcagaat 2520 cctgtctatc acaatcagcc tctgaacccc gcgcccagca gagacccaca ctaccaggac 2580 ccccacagca ctgcagtggg caaccccgag tatctcaaca ctgtccagcc cacctgtgtc 2640 aacagcacat tcgacagccc tgcccactgg gcccagaaag gcagccacca aattagcctg 2700 gacaaccctg actaccagca ggacttcttt cccaaggaag ccaagccaaa tggcatcttt 2760 aagggctcca cagctgaaaa tgcagaatac ctaagggtcg cgccacaaag cagtgaattt 2820 attggagca 2829

Claims (19)

1. 표적 막 단백질을 발현하는 살아있는 세포에서 후보물질의 처리 전후의 표적 막 단백질의 확산계수를 구하고, 이를 통해 얻어진 하나 이상의 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 분석하는 단계를 포함하는 상기 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 표적 막 단백질과 후보물질의 결합양상의 분석은 표적 막 단백질과 후보물질의 결합 유무, 전체 표적 막 단백질 중 후보물질에 결합한 표적 막 단백질의 비율, 표적 막 단백질과 결합한 후보물질의 분자량, 표적 막 단백질과 후보물질간의 해리상수, 또는 표적 막 단백질과 후보물질간의 복합체 형성과정의 분석인 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 표적 막 단백질은 내재성 막 단백질(integral membrane protein), 표재성 막 단백질(peripheral membrane protein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 막 당단백질(membrane glycoprotein) 및 지질 공정 막 단백질(lipid anchored membrane protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 후보물질은 화합물, 핵산, 당, 탄수화물, 지질, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서,
   표적 막 단백질의 확산계수는 단일 입자 추적(single particle tracking, SPT)을 통해 막 단백질의 세포막 내 이동을 탐지함으로써 얻는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 확산계수는 하기 수학식 1 및 수학식 2를 이용하여 얻는 것인 방법:
   [수학식 1]
   

   

   
   (△: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기(Step size), △는 자연수다, MSD(△): 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기에 대한 표적 막 단백질 입자의 이동한 거리 제곱의 평균 (Mean Square Displacement), N: 하나의 궤적을 이루는 표적 막 단백질 입자의 좌표의 총 수, (x_n, y_n): 하나의 궤적 내의 표적 막 단백질 입자의 n번째 위치 좌표, (x₁, y₁): 하나의 궤적의 시작점에서의 표적 막 단백질 입자의 위치 좌표, (x_N,y_N): 하나의 궤적의 종료점에서의 표적 막 단백질 입자의 위치 좌표. (x_{n +Δ}, y_{n +Δ}): 하나의 궤적 내의 표적 막 단백질 입자의 n+Δ 번째 위치 좌표, 단, n+Δ는 N보다 같거나 작다.)
   [수학식 2]
   MSD(△) = 4D△
   (D: 확산계수, △: 표적 막 단백질 입자의 좌표 간 스텝 크기)
7. 제1항에 있어서,
   상기 확산계수의 변화는 하기 수학식 3을 이용하여 얻어지는 것인 방법:
   [수학식 3]
   확산계수의 변화(%)= 100*|1-(D_c2/D_c1)|
   상기 식에서, D_c1은 세포 주변환경의 후보물질 농도 c1 에서의 표적 막 단백질의 단일 세포 수준에서의 확산계수, D_c2는 세포 주변환경의 후보물질 농도 c2에서의 표적 막 단백질의 단일 세포 수준에서의 확산계수이다.
8. 제7항에 있어서,
   상기 수학식 3에서 얻어진 확산계수의 변화(%)가 2% 이상인 경우 상기 후보물질을 표적 막 단백질과 결합하는 리간드로 결정하는 것인 방법.
9. 제5항에 있어서,
   막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 표적 막 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 세포에서 상기 형광 단백질의 형광을 탐지함으로써 수행되는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 GFP(Green Fluorescent Protein) 계열, BFP(Blue fluorescent protein) 계열, Cyan 계열, YFP(Yellow Fluorescent Protein) 계열, RFP(Red Fluorescent Protein) 계열, Orange 계열, Far-red 계열, Near-IR, 광활성 단백질(Photoactivatable protein), 광전환 단백질(Photoconvertible protein), 및 광스위치 단백질(Photoswitchable protein)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 형광 단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder GFP, Azami green mWasabi, TagGFP, AcGFP, T-sapphire, mUKG, Clover, mNeonGreen, EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite, mTagBFP, mKalama1, Sirius, ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP(monomeric ECFP), Cerulean, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, TagCFP, mTFP1(Teal), SCFP3A, monomeric Midoriishi Cyan, EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Benus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, mBanana, SYFP2, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, mRFP1, mCherry, mRaspberry, dKeima-Tandem(monomeric version), HcRed-Tandem(monomeric version), mPlum, mKate2, mNeptune, mKate2, mNeptune, TagRFP657, IFP1.4, PA-GFP, PAmCherry1, PaTagRFP, PS-CFP2, mEos2, mEos3.2, PSmOrange 및 Dronpa로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인, 방법.
12. 제1항에 있어서,
    표적 막 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 세포는 HEK(human embryonic kidney) 세포, HEK 293 세포, 3T3-L1 세포, C6 세포, CHO (Chinese hamster ovary) 세포, CHO?1 세포, NIH/3T3 세포, BHK(baby hamster kidney) 세포, COS1 세포, COS7 세포, HaCaT 세포, HeLa 세포, HeLa S3 세포, HepG2 세포, HL-60 세포, HUV-EC-C 세포, Jurkat 세포, K-562 세포, L6 세포, MCF7 세포, MDCK 세포, NIH/3T3 세포, RAW 264.7 세포, RBL-1 세포, SH-SY5Y 세포 및 U-937 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
13. 제5항에 있어서,
    막 단백질의 세포막 내 이동의 탐지는 형광물질이 결합되어 있고, 표적 막 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 프로브에 의해 수행되는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 프로브는 항체 압타머, 또는 비항체 단백질 골격(non-antibody protein scaffold)인 방법.
15. 제13항에 있어서,
    상기 형광물질은 유기형광염료인 방법.
16. 제15항에 있어서,
    상기 유기형광염료는 Atto 488, Alexa Flour 488, Dy505, Rhodamine 123, Atto 520, Dy 530, ATTO 532, Alexa Fluor 532, Fluorescein, FITC, Cy2, Cy3B, Alexa Flour 568, TAMRA, Cy3, Cy3.5, SNAP-Cell TMR-Star, Atto 565, Atto 590, Alexa Fluor 647, Cy5, Atto 647, Atto 647N, Dyomics 654, Atto 655, TMP-ATTO 655, Atto 680, Cy5.5, Atto 680, Alexa Fluor 680, Atto 700, Alexa Fluor 700, DyLight 750, Cy7, Alexa Flour 750, Atto 740, Alexa Flour 790 또는 IRDye 800 CW로부터 선택되는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서,
    후보물질 처리 후의 표적 막 단백질의 확산계수를 여러 시점에서 구하고, 이를 통해 얻어진 하나 이상의 표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 경시적으로 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서,
    표적 막 단백질의 확산계수의 변화를 경시적으로 분석함으로써 막 단백질 특이적 세포내섭취(endocytosis)의 유무를 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 후보물질과 표적 막 단백질의 결합양상을 분석하는 단계; 및
    상기 결합양상을 이용하여 상기 후보물질 중에서 상기 표적 막 단백질에 특이적으로 작용하는 약물을 결정하는 단계를 포함하는, 표적 막 단백질에 대한 약물을 스크리닝 하는 방법.
    

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