KR20240072300A - 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 센서 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 센서 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오센서의 FRET 현상에 기반한 형광 발광 강도의 비율 변화를 통해, 리간드의 결합에 따른 G 단백질 수용체의 활성 여부 및 세포내 하위경로의 활성을 실시간으로 확인할 수 있다.
Description
본 발명은 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 센서 및 이의 용도에 관한 것이다.
G-단백질 결합 수용체 (protein-coupled receptor, GPCR)는 800개 이상의 구성원을 갖는 진핵생물에서 가장 큰 막 수용체 패밀리를 구성하고 다양한 생리학적 과정에 관여하는 수용체이다. 이들은 7개의 막관통 도메인으로 구성되며 G-단백질 결합을 유발하고 두 번째 메신저 캐스케이드에 영향을 미치는 구조적 변화를 통해 세포외 신호(즉, 빛, 호르몬, 신경전달물질, 펩티드, 소분자 리간드 등)를 세포내 신호전달에 전달하는 역할을 한다.
최근 GPCR을 표적으로 하는 약물을 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 특히 GPCR-약물 상호작용은 주로 GPCR의 특정 부위에 삽입된 공여자와 수용자를 이용한 FRET(Forster Resonance Energy Transfer) 또는 BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer)에 대한 연구가 주로 이루어지고 있다.
다만, 기존 GPCR를 이용한 바이오센서는 GPCR이 활성화되었는지 여부만을 실시간으로 확인할 수 있으며, G-proteins(Gαq 및 Gβγ) 재배열 등의 일반적인 GPCR 활성 이후 연달아 발생하는 세포내 하위경로의 활성을 직접적으로 확인하기 어려우며, “G-protein과의 결합”과 “결합된 G-protein의 활성”이라는 구체적인 세부 과정을 구분지어서 확인이 어렵다는 문제점이 있다.
따라서 GPCR에 대한 G 단백질 결합 및 이에 따른 GPCR의 구조적 변화를 실시간으로 분석하기 위한 기술의 개발이 요구되며, 본 발명자들은 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 센서를 발명하였다.
본 발명의 일 양상은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR, G protein-coupled receptor);
형광수용체 (fluorescence acceptor); 및
형광공여체 (fluorescence donor)를 포함하는, 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer; FRET) 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 발현하기 위한 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 포함하는, G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 포함하는, G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용을 확인하는 정보제공방법을 제공한다.
본 연구원들은 FRET 현상에 기반한 형광 발광 강도의 비율 변화를 통해, 리간드의 결합에 따른 G 단백질 수용체의 활성 여부 및 세포내 하위경로의 활성을 실시간으로 확인할 수 있는 바이오센서를 제작하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR, G protein-coupled receptor);
형광수용체 (fluorescence acceptor); 및
형광공여체 (fluorescence donor)를 포함하는, 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer; FRET) 바이오센서를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "G-단백질 연결 수용체(GPCR)"은 세포막에 존재하는 수용체로 총 800 여개의 종류가 있으며, 세포 밖 다양한 물질을 감지하여 그 신호를 세포 내부로 전달하는 역할을 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "형광공명에너지전달(FRET)"은 거리가 가까운 두 발색단 사이의 에너지 전달에 관련된 메커니즘으로, 보다 구체적으로는 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성(non-radiative) 에너지 전이현상을 말한다. 여기(excitation)된 상태의 형광공여체의 여기 준위 에너지가 형광수용체로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상이다.
상기 형광수용체는 FRET 현상에서 수용체로 작용하는 형광물질을 의미하고, 형광공여체는 FRET 현상에서 공여체로 작용하는 형광물질을 의미한다. 보다 구체적으로 형광공여체는 형광단백질(fluorescent protein), 형광 안료(fluorescent dye), 생체발광 단백질(bioluminescent protein) 및 양자점(quantum dot)으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 상기 형광수용체는 형광단백질, 소광체(quencher) 및 금나노입자(Au-nano particle)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 형광수용체는 GPCR 단백질의 세포내 루프 3 (intracellular loop 3, ICL3)에 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 형광수용체는 야생형 GPCR 단백질의 ICL3의 아미노산 일부와 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 아미노산 치환은 상기 야생형 GPCR 단백질의 271번 내지 484번 아미노산이 SacII-EYFP-AgeI (서열번호 4)로 치환된 것일 수 있다.
기존 GPCR 단백질의 ICL3에 형광수용체 또는 형광공여체가 포함되는 경우, 아미노산 서열의 길이 차이 또는 필수적인 아미노산 서열의 삭제 등으로 인해 리간드와 상호작용이 이루어지지 않거나, 상호작용 효율이 감소하는 문제점이 있었다. 반면, 본 발명의 바이오센서는 GPCR 단백질의 ICL3의 길이를 야생형과 유사하게 유지하면서도 G 단백질 상호작용 핵심서열들도 온전하게 유지하여, G 단백질 수용체의 활성 여부 및 세포내 하위경로의 활성을 실시간으로 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 상기와 같은 야생형 GPCR과의 구조적, 기능적 유사성으로 인해, 광 안전성 (photo stability)이 향상되어 오랜 시간 광원에 노출되어도 광표백(photobleaching)이 적으며, 신호 대 잡음 비(signal to noise ratio)가 우수하여 정밀한 규모에서의 FRET 데이터 분석이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 형광공여체는 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein; CFP)이며, 형광수용체는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein; YFP)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 시안형광단백질은 Cerulean, Turquoise2-GL, mTurquoise, mTFP, ECFP, CyPet 및 ECGFP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예에서 상기 시안형광단백질은 ECGFP일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 황색형광단백질은 LanYFP, mNeonGreen, YPet, mEYFP, SEYFP, phiYFP, Citrine, mCitrine, Venus, mVenus, iq-mVenus, cp50Venus, cp157Venus, cp172Venus, cp195Venus, 및 cp229Venus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 시안형광단백질은 YPet일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오센서는 G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용을 실시간으로 측정하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 리간드는 G 단백질 또는 이의 유사체 일 수 있으며, 상기 유사체는 G 단백질과 구조적으로 유사하여 G 단백질 수용체의 활성 또는 비활성을 야기할 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오센서는 G 단백질 수용체에 리간드가 결합하는 경우, 구조적 변화 및 활성에 의해 두 형광단백질의 거리가 증가함에 따라 FRET 비율(FRETr) 신호가 감소할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오센서는 G 단백질 수용체에 리간드 결합시에 일어나는 2 단계 반응을 확인하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 2 단계 반응은 리간드에 의한 GPCR의 활성화에 의해 외부 신호를 세포 내부로 전달하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 2 단계 반응은 G 단백질의 빠른 반응 (단계 1) 및 GPCR 단백질 활성화된 후 G 단백질 소단위체 (Gαq 및 Gβγ)의 느린 해리 반응 (단계 2)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오센서는 서열번호 1로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 바이오센서 단백질을 암호화하는 염기서열은 서열번호 2로 표현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 발현하기 위한 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 재조합 벡터로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 서열번호 3로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 포함하는, G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 G 단백질 수용체의 활성은 리간드가 G 단백질 수용체에 결합시에 일어나는 2 단계 반응에 의해 일어나는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 상호 작용은 G 단백질 수용체의 활성은 리간드가 G 단백질 수용체에 결합하는 것일 수 있으며, 또는 리간드가 G 단백질 수용체에 결합 후 세포 내에서 일어나는 모든 작용을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 상호작용은 agonist 결합에 의해 활성화된 G 단백질 수용체에 G 단백질이 결합하게 되고(1단계 활성반응, 1ON) 결합한 G 단백질은 다시 2개의 소단위체(Gα와 Gβγ)로 나뉘는 활성상태로 전환(2단계 활성반응, 2ON)하면서도 계속해서 수용체와의 결합상태를 유지할 수 있으며, 특히, 수용체, Gα, 그리고 Gα에 의해 활성화되는 PLC(phospholipase C) 세 가지는 수용체 활성화 동안 이종삼량체를 형성할 수 있다. agonist가 제거되면 Gβγ는 G 단백질 수용체로부터 즉시 떨어지고(1단계 비활성반응, 1OFF) 아직까지 G 단백질 수용체와의 결합을 유지하고 있던 Gα도 Gα와 결합돼 있는 GTP가 GDP로 분해되면 수용체로부터 떨어질 수 있다 (2단계 비활성반응, 2OFF).
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 포함하는, G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 스크리닝 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용을 확인하는 정보제공방법을 제공한다.
(a) 상기 청구항 9의 벡터를 세포에 형질도입하는 단계;
(b) 상기 형질도입된 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험 물질이 처리된 세포에서 형광수용체의 발광 강도(emission intensity) 대비 형광공여체의 발광 강도의 비율을 측정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (b) 단계에서 시험 물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer) 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (c) 단계는 하기 수학식 1에 의해 발광 강도 비율을 계산하는 것일 수 있다.
[수학식 1]
FRETr = (YFPc - cFactor Х CFPc)/CFPc
본 명세서에서 용어 "느린 용액 흐름 (slow bath flow)"은 한쪽에서 지속적으로 신선한 (fresh) 링거용액이 공급되고 반대쪽에서 기존의 링거용액이 회수되는 환경(신선한 링거액이 계속해서 공급되는 환경)에 세포를 위치시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 바이오센서는 FRET 현상에 기반한 형광 발광 강도의 비율 변화를 통해, 리간드의 결합에 따른 G 단백질 수용체의 활성 여부 및 세포내 하위경로의 활성을 실시간으로 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는 개체가 살아있는 상태에서 확인이 가능하여 생물 물질의 변형 가능성을 배제할 수 있고, 실시간 이미징 데이터를 바탕으로 하므로 소요되는 비용, 시간 및 노동력을 감소시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 hM3R-YFP-CFP FRET 센서의 2단계 활성화를 나타낸 도이다. 도 1a는 원형질막에서 이중 표지된 hM3R 구성 hM3R-YFP-CFP의 개략도이다. 도 1b 및 1c는 mM1R-YFP-CFP 또는 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 HEK293T 세포에서 10 μM의 Oxo-M에 대한 평균 ΔFRETr 신호 (1b) 및 상대 ΔFRETr 진폭 (1c)를 나타낸다. 여기서, mM1R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물로부터의 6개 세포; 및 n=hM3R-YFP-CFP에 대한 4개의 배양물로부터의 10개 세포를 이용하였고, 샘플링 주파수는 1Hz이다. 도 1d는 Oxo-M에 대한 반응으로 mM1R-YFP-CFP 또는 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 세포의 신호 대 잡음비(SNR)를 나타낸 도이다. 도 1e는 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 온전한 HEK293T 세포에서 정규화된 FRETr 신호의 시간 경과를 나타낸 도이다. Oxo-M(10μM)을 세타 유리 튜브에서 뽑아낸 관류 피펫으로 구성된 빠른 용액 교환 시스템(< 20ms)을 사용하여 세포에 적용하였다. Oxo-M 응용 프로그램의 FRETr 변경 사항은 온전한 세포에서 2단계 활성화 붕괴(1단계 및 2단계)를 나타낸다. 각 단계는 단일 지수 함수로 나타내었다. 샘플링 주파수: 10Hz. 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 1f는 온전한 세포에서 각 활성화 단계의 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 1g는 온전한 세포에서 총 FRETr 반응에서 각 단계의 백분율 분포(단계 1ON 및 단계 2ON의 %)를 나타낸 도이다. 도 1h는 0.1mM의 GTP 또는 1mM의 GDPβS를 포함하는 내부 피펫 용액이 있는 HEK293T 세포의 전체 세포 구성을 나타낸 도이다. Oxo-M은 빠른 세포외 용액 교환 시스템을 통해 적용하였다. 도 1i는 0.1mM의 GTP(왼쪽) 또는 1mM의 GDPβS(오른쪽)로 세포 내 관류된 세포에서 Oxo-M 적용에 의한 FRET의 2단계 활성화 붕괴(1단계 및 2단계)를 나타낸 도이다. 각 단계는 단일 지수 함수로 나타내었다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = GTP에 대한 3개의 배양물로부터의 6개 세포 및 n = GDPβS에 대한 2개의 배양물로부터의 6개 세포를 이용하였다. 도 1j는 패치된 조건에서 FRETr 응답에서 각 단계의 백분율 분포(1ON 단계 및 2ON 단계의 %)를 나타낸 도이다. 도 1k는 패치된 조건에서 각 활성화 단계의 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 1l은 10μM Oxo-M 적용(+ Oxo-M) 전 (대조군) 및 적용 중 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 단일 세포의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸다. 5개 이상의 배양에 대해 독립적으로 반복된 실험은 유사한 결과를 나타낸다. 스케일 바는 10μm이며, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05; 657 **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001;이며, ns은 중요하지 않음을 나타낸다.
도 2는 hM3R-YFP-CFP 및 FRET 신호의 구성을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는 mM1R-YFP-CFP(도 2a) 및 hM3R-YFP-CFP(도 2b)의 개략적인 막횡단 토폴로지를 나타낸다. 빨간색으로 강조 표시된 아미노산은 Gq/11-단백질에 대한 각 하위 유형의 선택적 인식 사이트로 예측된다(Wess, 1996에 의해 검토됨). 도 2c는 야생형 hM3R ICL3 및 hM3R-YFP-CFP ICL3(YFP-ICL3) 간의 제3 세포내 루프(ICL3) 아미노산 서열을 비교한 도이다. ICL3의 214개 아미노산 잔기는 SacII-EYFP-AgeI 서열의 243개 잔기로 대체되었다. 녹색으로 강조 표시된 아미노산은 도 2b에서 녹색으로 강조 표시된 서열에 해당한다. YFP-ICL3에서 파란색 사각형으로 강조 표시된 것은 EYFP를 삽입하기 위한 제한 효소 부위이다. EYFP 시퀀스는 노란색 사각형 상자로 강조 표시하였다. 도 2d 및 2e는 mM1R-YFP-CFP(도 2d) 또는 hM3R-YFP-CFP(도 2e)로 형질감염된 세포에서 CFPc, YFPc 및 FRETr 신호의 시간 경과 추적 결과이다. 상단 패널은 보정된 CFP(CFPC) 형광(파란색 트레이스, 왼쪽 축) 및 보정된 YFP(YFPC) 형광(노란색 트레이스, 오른쪽 축)을 보여주고 하단 패널은 80초 기준선에 대한 FRET 비율, YFCC/CFPC(검정색)를 나타낸다. 샘플링 주파수는 2Hz이다. 도 2f는 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 온전한 세포에서 고주파수(100Hz)에서 측정된 ΔFRETr의 시간 경과를 나타낸 도이다. 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Oxo-M(10μM)은 빠른 용액 교환 시스템(< 20ms)을 사용하여 세포에 처리하였다. Oxo-M 적용에 의한 FRETr 변화는 2단계 활성화 감쇠(1단계 및 2단계)를 보여준다. 단계 1은 시간 상수(τ1)를 계산하기 위해 단일 지수 함수로 적용하였다. n = 2개의 배양에서 12개 세포를 이용하였다. 블러 런다운 그래프는 Oxo-M으로 처리되지 않은 세포의 데이터를 나타낸다(n = 2개의 배양에서 11개 세포). 왼쪽 그래프의 박스 영역(단계 1)을 확대한 모습을 오른쪽에 나타내었다.
도 3은 hM3R-YFP-CFP의 활성화는 야생형 hM3R과 유사한 역학으로 다운스트림 신호 전달 경로를 촉발함을 확인한 도이다. 도 3a 내지 3c 상단은 야생형 수용체(mM1R 또는 hM3R)를 포함하거나 없는(none) PLCδ1(RFP-PH)의 적색 형광 단백질 표지된 플렉스트린 상동성 도메인을 발현하는 세포를 10μM Oxo-M 적용 전(대조군)과 적용 동안 촬영한 공초점 이미지이다. 스케일 바는 10μm이다. 도 3a 내지 3c 하단은 원형질막(FPM, 검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(FCytosol, 빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 시간 경과를 3개의 독립적인 실험에서 5 내지 8개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 3d 및 3e 상단은 RFP-PH 및 mM1R-YFP-CFP(도 3d) 또는 hM3R-YFP-CFP(도 3e)를 발현하는 세포의 대표적인 공초점 이미지를 Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 촬영한 도이다. 스케일 바는 5μm이다. 도 3d 및 3e 하단은 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 시간 경과를 3개의 독립적인 실험에서 5 내지 7개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 3f는 각 수용체 조건에서 Oxo-M 적용 전후의 원형질막(FPM) 및 세포질(FCytosol)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 편차(Δ)를 나타낸 도이다. 도 3g는 각 수용체 조건에서 Oxo-M 적용 동안 원형질막 및 세포질(n = 3개의 배양에서 5 내지 9개 세포)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 곡선의 반 활성화 시간(T50)을 나타낸 도이다. n = 3개의 배양물에서 5 내지 9개 세포이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05; ***P<0.001; ****P<0.0001;이며, ns은 중요하지 않음을 의미한다.
도 4는 hM3R-YFP-CFP FRET의 2단계 활성화 역학은 각각 hM3R-Gq 단백질 상호작용 및 Gαq 및 Gβγ 해리에 해당함을 확인한 도이다. 도 4a는 원형질막에서 hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 소단위의 개략도이다. 도 4b는 전체 세포 구성을 통해 0.1mM의 GTP(왼쪽) 또는 1mM의 GDPβS(오른쪽)로 세포 내 관류된 세포에서 10μM의 Oxo-M에 대한 반응으로 정규화된 FRETr의 시간 경과를 확인한 도이다. 각 데이터는 단일 지수 함수로 적용하였다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = GTP에 대한 3개의 배양물로부터의 8개 세포, n = GDPβS에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4c는 총 FRETr 응답에서 각 단계의 백분율 분포(단계 1 및 단계 2의 %ON)를 나타낸 도이다. 도 4d는 GTP 또는 GDPβS를 사용한 전체 셀 구성에서 FRETr 변화의 시작 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 4e는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 SNR를 나타낸 도이다. 1mM의 GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM의 GTP로 세포내 관류하였다. n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물로부터의 7개 세포(1단계 + 2단계); n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물에서 7개 세포(단계 1); n = hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GTP)에 대한 4개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 n = hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS)에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4f는 원형질막에서 야생형 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP 및 Gγ2의 개략도이다. GRK2는 함께 표현되었지만 도면에서는 나타내지 않았다. 도 4g는 전체 세포 구성을 통해 0.1mM의 GTP(왼쪽) 또는 1mM의 GDPβS(오른쪽)로 세포 내 관류된 세포에서 Oxo-M에 대한 응답으로 정규화된 FRETr의 시간 경과를 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = GTP에 대한 2개의 배양물로부터의 6개 세포; 및 n = GDPβS에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4h는 총 FRETr 응답에서 각 단일 단계(% 단계 1ON 및 단계 2ON)의 백분율 분포를 나타낸 도이다. 도 4i는 GTP 또는 GDPβS가 있는 전체 셀 구성에서 FRETr 변화의 시작 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 4j는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 SNR를 나타낸 도이다. 1mM의 GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM의 GTP로 세포내 관류하였다. n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물로부터의 7개 세포(단계 1 + 단계 2), n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양에서 7개 세포(단계 2)를 이용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. **P<0.01; ***P<0.001이며, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 5는 피크 응답(신호) 및 기준선의 표준 오차(잡음)을 나타낸 도이다. 도 5a는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 피크 반응을 나타낸다. 1mM GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM GTP로 세포내 관류하였다. hM3R-YFP-CFP(단계 1 + 단계 2) 및 hM3R-YFP-CFP(단계 1), n = 3개의 배양액에서 7개 세포; hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GTP), n = 4개의 배양물에서 8개 세포; 및 hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS), n = 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 5b는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 도 5c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 피크 반응을 확인한 도이다. 1mM GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM GTP로 세포내 관류하였다. hM3R-YFP-CFP(1단계 + 2단계) 및 hM3R-YFP-CFP(2단계만), n = 3개의 배양액에서 7개 세포; Gαq-CFP + Gβ1-YFP(GTP), n = 2개의 배양에서 6개 세포; 및 Gαq-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS), n = 3개의 배양에서 9개 세포를 이용하였다. 도 5d는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ***P<0.001; ****P<0.0001;이고, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 6은 FRET 프로브를 발현하는 세포는 활성 GPCR 신호를 나타낸 도이다. 도 6a는 10 μM Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 RFP-PH, hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 서브유닛을 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 6b 상단은 원형질막에서 hM3R-CFP(청록색 트레이스) 및 Gβ1-YFP(노란색 트레이스)의 상대 형광 강도의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 5개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 6b 하단은 Oxo-M에 대한 반응으로 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 15개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 6c는 Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 RFP-PH, hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 6d 상단은 원형질막에서 Gαq-CFP(청록색 트레이스) 및 Gβ1-YFP(노란색 트레이스)의 상대 형광 강도의 시간 경과를 나타낸 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 7개의 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 6d 하단은 원형질막(검정색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(적색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 17개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.33Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다.
도 7은 hM3R-YFP-CFP FRET 신호의 2단계 비활성화를 확인한 도이다. 도 7a 내지 7c는 hM3R-YFP-CFP (도 7a), hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 소단위(도 7b) 또는 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2(도 7c)를 발현하는 세포에서 10 μM Oxo-M 유도 활성화로부터 정규화된 FRETr 복구의 시간 과정을 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 모든 검은색 및 파란색 선은 표시된 τ 값을 가진 단일 지수 맞춤이다. 도 7d는 hM3R-YFP-CFP(단계 1)(4개의 배양에서 n = 6개의 세포)와 hM3R-CFP + Gβ1-YFP(n = 2개의 배양에서 5개의 세포) 사이의 τOFF 비교 결과이다. 도 7e는 hM3R-YFP-CFP(단계 2)(4개의 배양물에서 n = 6개 세포)와 Gαq -CFP + Gβ1-YFP(2개 배양물에서 n = 11개 세포) 간의 τOFF 비교 결과이다. 도 7f는 hM3R-YFP-CFP(단계 1) 및 hM3R-CFP + Gβ1-YFP 간의 FRETr 회복(% OFF)을 확인한 도이다. 도 7g는 hM3R-YFP-CFP(단계 2)와 Gαq-CFP + Gβ1-YFP 간의 FRETr 회복(% OFF)을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 8은 GRK2는 동역학의 변화 없이 hM3R 매개 G-단백질 FRETr 신호의 진폭을 증가시킴을 확인한 도이다. 도 8a는 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포를 나타낸 도이다. 도 8b는 GRK2가 없거나(검은색 흔적, n=5) 또는 있는(빨간색 흔적, n=10) 세포에서 Oxo-M에 대한 상대적 FRETr의 시간 경과를 나타낸 도이다. 노란색 선은 시점의 SEM을 나타낸다. 도 8c는 GRK2가 있거나 없는 세포의 FRETr 변화의 피크 진폭을 나타낸 도이다. -GRK2, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 +GRK2, n = 2개의 배양에서 10개 세포를 이용하였다. 도 8d는 GRK2가 없거나 존재할 때 ΔFRETr의 신호 대 잡음비(SNR)를 확인한 도이다. 도 8e는 GRK2의 부재 또는 존재 하에서 Oxo-M-유도 FRETr 활성화의 시간 상수(τON)를 확인한 도이다. 도 8f는 GRK2의 부재 또는 존재 하에서 Oxo-M 유도 활성화로부터 FRETr 회복의 시간 상수(τOFF)를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 9는 hM3R-YFP-CFP는 구성적으로 활성인 Gαq 단백질이 있는 경우에 단계 1ON 및 단계 1OFF를 나타낸 도이다. 도 9a는 원형질막에서 Gαq, Gαq(Q209L) 또는 Gαq(R183C)의 구성적으로 활성 돌연변이 형태를 갖는 야생형 hM3R의 개략도이다. 도 9b는 hM3R-YFP-CFP 및 야생형 Gq 단백질 서브유닛(Gαq, Gβ1 및 Gγ2)을 모두 발현하는 세포에서 10μM의 Oxo-M에 대한 정규화된 FRETr 신호의 시간 경과를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 빨간색 선은 단계 1ON, 단계 2ON, 단계 1OFF 및 단계 2OFF에 대한 단일 지수 피팅이다. 도 9c는 hM3R-YFP-CFP, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 동족 G 단백질 서브유닛을 발현하는 세포에서 정규화된 FRETr을 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9d는 단계 1ON 및 단계 1OFF에 대한 시간 상수(τ)이다. τON의 경우, 야생형, n = 3개의 배양물에서 7개 세포; Q209L, n = 2개의 배양에서 10개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포이다. τOFF의 경우, 야생형, n = 3개의 배양물에서 세포 7개; Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9e는 1단계의 FRETr 복구(% OFF)를 나타낸다. 도 9f는 hM3R-CFP, Gβ1-YFP, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 Gγ2를 발현하는 세포에서 정규화된 FRETr 신호를 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9g는 FRETr의 시작 및 오프셋의 시간 상수(τ)는 Oxo-M 처리에 의해 변경됨을 나타낸 도이다. τON의 경우, 야생형, n = 2개의 배양에서 8개 세포; Q209L, n = 2개의 배양물로부터의 9개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 6개 세포를 이용하였다. τOFF의 경우, 야생형, n = 2개의 배양에서 5개 세포; Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9h는 FRETr 회복(% OFF)을 나타낸다. 도 9i는 야생형 hM3R, 돌연변이 Gαq-CFP(Q209L 또는 R183C), Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 신호를 나타낸다. 샘플링 주파수는 1Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포를 이용하였다. 도 9j는 야생형 hM3R, 야생형 Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 신호를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 1Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = 2개의 배양물에서 얻은 8개의 세포를 이용하였다.
도 10은 야생형 Gq 단백질 소단위의 동시발현은 hM3R-YFP-CFP의 FRETr 반응에 영향을 미치지 않음을 확인한 도이다. 도 10a 내지 10d는 단계 1ON(도 10a), 단계 2ON(도 10b), 단계 1OFF(도 10c) 및 단계 2OFF(도 10d)의 시간 상수(τ)를 hM3R-YFP-CFP 단독(none) 또는 hM3R-YFP-CFP + 야생형 Gq 단백질(+ Gαq, β1 및 γ2)로 형질감염된 세포에서 측정한 결과이다. none, n = 3개의 배양에서 5개 세포; +G 단백질, n = 3개의 배양물로부터의 7개 세포를 이용하였다. 도 10e 및 10f는 총 회수율에서 단계 1(도 10e)와 단계 2(도 10f)의 퍼센트 분포(%)를 두 그룹에서 측정한 결과이다. 도 10g는 hM3R-YFP-CFP 단독(none) 또는 hM3R-YFP-CFP와 야생형 Gq 단백질(+ Gαq, β1 및 γ2)이 있는 세포에서 ΔFRETr의 피크 반응 진폭을 확인한 도이다. 도 10h는 두 셀 그룹에서 ΔFRETr의 신호 대 잡음비를 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 11은 YM-254890은 hM3R-YFP-CFP 활성화의 2단계 단계를 차단함을 확인한 도이다. 도 11a 내지 11e에서 세포는 hM3R-YFP-CFP, Gαq(야생형 또는 Q209L) 및 동족 G 단백질 소단위로 형질감염하였다. 도 11a는 연속(왼쪽 검은색 추적, 2개의 배양에서 n = 6개 세포) 또는 임시(오른쪽 빨간색 추적, n = 3개에서 17개 세포) YM의 약물 동안의 야생형 Gαq를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 대한 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 과정 배양)을 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 각 시점의 SEM을 나타낸다. 도 11b는 도 11a와 같이 hM3R-YFP-CFP의 활성화(ON) 또는 비활성화(OFF) 동안 각 단계의 백분율 분포를 나타낸다. 도 11c는 연속(왼쪽 검은색 추적, n = 2개의 배양에서 n = 6개 세포) 또는 일시적(오른쪽 빨간색 추적, n = 6개 세포) YM의 약물 동안 돌연변이 Gαq(Q209L)를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 대한 반응으로 정규화된 FRETr 변화의 평균 시간 과정 두 배양)을 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 각 시점의 SEM을 나타낸다. 도 11d는 도 11c에서 hM3R YFP-CFP 활성화(ON) 또는 비활성화(OFF) 동안 각 단계의 백분율 분포를 나타낸다. 도 11e는 도 11a 및 11c에 표시된 단계 1ON 및 단계 1OFF의 시간 상수(τ)를 나타낸다. 단계 2의 값은 비교하지 않았다. 도 11f는 YM의 동작 단계를 보여주는 개략도이다. 도 11g는 YM의 임시 약물 처리 중 hM3R-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 야생형 Gαq(왼쪽, 2개의 배양에서 n = 5개 세포) 또는 돌연변이 Gαq(Q209L)를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 반응하여 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 경과 (오른쪽, n = 3개의 배양에서 11개 세포)를 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. 도 11h는 도 11g의 표시된 각 기간(a: 0.0-9.9초, b: 10-20초, c: 70-80초)에서 ΔFRETr의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 11i는 YM의 임시 약물 처리 중 hM3R, Gβ1-YFP, Gγ2 및 야생형 Gαq-CFP를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 반응하여 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 경과(왼쪽, 2개의 배양에서 n = 7개 세포) 또는 돌연변이 Gαq(Q209L) -CFP(오른쪽, n = 2개의 배양에서 7개의 세포)를 나타낸다. 도 11j는 도 11i에서 표시된 각 기간(a: 0.0 내지 9.9초, b: 10 내지 20초, c: 70 내지 80초)에서 ΔFRETr의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; 733 ****P<0.0001; ns는 중요하지 않음을 나타낸다. 도 11k는 도 11i 및 11j에서 Oxo-M 적용 중 평균 ΔFRETr를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. **P<0.01;이고, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 12는 돌연변이 Gαq(Q209)는 구성적으로 다운스트림 신호를 활성화함을 확인한 도이다. 도 12a 및 12b는 Oxo-M(10μM) 적용 전(대조군) 및 Oxo-M 적용 동안 (+ Oxo-M) RFP-PH, hM3R, 각 유형의 Gαq-CFP(야생형 또는 Q209L), Gβ1-YFP 및 Gγ2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 12c 및 12d는 원형질막(상단) 및 세포질(하단)에서 Gαq-CFP(야생형 또는 Q209L) 및 Gβ1-YFP의 상대 형광 강도의 시간 경과를 2개의 독립적인 실험에서 6개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 12e는 Gαq-CFP의 유형에 따른 원형질막에서의 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP의 절대 형광 강도(WT, 2개의 배양물에서 n = 6개 세포, Q209L, n = 2개 배양물에서 6개 세포)를 확인한 도이다. 도 12f는 Gαq-CFP의 유형에 따른 세포질에서의 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP의 절대 형광 강도를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. **P<0.01;이고, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 13은 hM3R, Gαq 및 PLC는 수용체 활성화 동안 이종삼량체를 형성할 수 있음을 확인한 도이다. 도 13a 및 13b는 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 소단위를 발현하는 세포(도 13a) 및 야생형 hM3R, Gαq-CFP, YFP를 발현하는 세포에서 Oxo-M의 30-60초에 대한 ΔFRETr의 평균 시간 경과 PLCβ1 및 동족 G 단백질 소단위(도 13b)를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 세로선은 SEM을 나타낸다. hM3R-YFP + Gαq-CFP(R-G), n = 2개의 배양에서 11개 세포; 및 Gαq-CFP + YFP PLCβ1(G-PLC), n = 2개의 배양에서 24개 세포를 이용하였다. 도 13c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr의 진폭을 나타낸다. 도 13d는 총 FRETr 응답에서 각 단계의 백분율 분포(단계 1ON 및 단계 2ON의 %)를 나타낸다. 도 13e는 스텝 1ON의 시정수(τON)를 나타낸다. 도 13f는 단계 1ON과 대조되는 각 감소 단계의 백분율(단계 1OFF 및 단계 2OFF의 %)을 나타낸다. 도 13g는 각 비활성화 단계의 시간 상수(τOFF)를 나타낸다. 도 13h는 ΔFRETr의 SNR를 나타낸다. 데이터는 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 ± SEM으로 표시된다. ****P<0.0001; 및 ns은 중요하지 않음을 나타낸다. 도 13i는 hM3R의 Gq 단백질 주기 매개 형태 변화의 개략도이다. 도면은 hM3R 형태의 2단계 활성화 및 2단계 비활성화에 대한 Gq 단백질 주기의 효과를 나타낸다. 상자 안에는 ON 및 OFF 반응 동안 발생하는 각 단계의 기본 프로세스의 요약을 나타내었다. 괄호 안의 반응은 관찰되지 않았다. 점선(-)은 부분적인 상호작용 또는 사전조립의 상태를 의미하며, agonist 결합에 의한 구조적 재배열은 보다 단단한 결합을 유도한다. 비활성 Gq 단백질과 작용제가 결합된 hM3R의 결합은 Gαq와 Gβγ 소단위체 사이의 커플링 형태에 약간의 변화를 일으킨다. 활성화된 Gαq-GTP 서브유닛은 리간드 활성화된 hM3R에서 해리되지 않으며, 동시에 헤테로머 복합체를 형성하여 PLCβ를 자극한다.
도 14는 YM-254890은 Gαq 사이의 상호작용을 억제함을 확인한 도이다. 도 14a 및 14b는 YM-254890(YM)의 존재 하에 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 서브유닛(R-G)을 발현하는 세포 (도 14a) 또는 hM3R, YFP-PLCβ1, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 서브유닛(G-PLC)을 발현하는 세포(도 14 b)에서 30초 또는 60초 Oxo-M에 대한 ΔFRETr의 평균 시간 경과를 나타낸 도이다. n = RG에 대한 2개의 배양물로부터의 8개 세포; n = G-PLC에 대한 2개의 배양에서 얻은 8개 세포를 이용하였다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 선은 SEM이다. 도 14c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr의 진폭을 확인한 도이다. 도 14d는 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 도 14e는 FRETr의 신호 대 잡음비(SNR)를 확인한 도이다. 도 14f는 단계 1ON 및 단계 1OFF의 시정수(τON 및 τOFF)를 확인한 도이다. 데이터는 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 ± SEM으로 표시하였다. **P<0.01; 및 ****P<0.0001이다. Ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 15는 hM3R-YFP 및 Gαq-CFP를 발현하는 세포에서 정상적인 M3R 신호전달을 확인한 도이다. 도 15a는 10μM Oxo-M 적용 전(대조군), 적용 중(+Oxo-M) 및 적용 후(recovery)에 RFP-PH, hM3R-YFP, Gαq-CFP, Gβ1 및 Gγ2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 15b 상단은 Oxo-M에 대한 반응으로 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. 도 15b 하단은 상단 그림에서 표시된 각 기간(a: 19 내지 25초, b: 84 내지 90초, c: 114 내지 120초, d: 300 내지 306초)에서 원형질막(왼쪽 그래프) 및 세포질(오른쪽 그래프)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 평균을 나타낸 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 8개의 세포를 이용하였다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 16은 유전자 클로닝을 통해 제작된 본 발명의 FRET 센서 범주의 플라스미드 벡터 지도를 나타낸 도이다.
도 17은 hM3R-YFP-CFP에서 G 단백질과 결합하는 주요 3아미노산 부위(3X46, 6X37, 7X53)를 alanine으로 치환한 결과, G 단백질 수용체에 G 단백질이 결합하지 못하게 되어 기존의 두 단계 활성반응(단계1, 단계2)이 완전히 사라지는 것을 확인한 도이다.
도 18은 hM3R-YFP-CFP 아미노산 서열 중 G 단백질과 결합하는 부위 (3X46, 6X37, 7X53)를 나타낸 도이다.
도 2는 hM3R-YFP-CFP 및 FRET 신호의 구성을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는 mM1R-YFP-CFP(도 2a) 및 hM3R-YFP-CFP(도 2b)의 개략적인 막횡단 토폴로지를 나타낸다. 빨간색으로 강조 표시된 아미노산은 Gq/11-단백질에 대한 각 하위 유형의 선택적 인식 사이트로 예측된다(Wess, 1996에 의해 검토됨). 도 2c는 야생형 hM3R ICL3 및 hM3R-YFP-CFP ICL3(YFP-ICL3) 간의 제3 세포내 루프(ICL3) 아미노산 서열을 비교한 도이다. ICL3의 214개 아미노산 잔기는 SacII-EYFP-AgeI 서열의 243개 잔기로 대체되었다. 녹색으로 강조 표시된 아미노산은 도 2b에서 녹색으로 강조 표시된 서열에 해당한다. YFP-ICL3에서 파란색 사각형으로 강조 표시된 것은 EYFP를 삽입하기 위한 제한 효소 부위이다. EYFP 시퀀스는 노란색 사각형 상자로 강조 표시하였다. 도 2d 및 2e는 mM1R-YFP-CFP(도 2d) 또는 hM3R-YFP-CFP(도 2e)로 형질감염된 세포에서 CFPc, YFPc 및 FRETr 신호의 시간 경과 추적 결과이다. 상단 패널은 보정된 CFP(CFPC) 형광(파란색 트레이스, 왼쪽 축) 및 보정된 YFP(YFPC) 형광(노란색 트레이스, 오른쪽 축)을 보여주고 하단 패널은 80초 기준선에 대한 FRET 비율, YFCC/CFPC(검정색)를 나타낸다. 샘플링 주파수는 2Hz이다. 도 2f는 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 온전한 세포에서 고주파수(100Hz)에서 측정된 ΔFRETr의 시간 경과를 나타낸 도이다. 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Oxo-M(10μM)은 빠른 용액 교환 시스템(< 20ms)을 사용하여 세포에 처리하였다. Oxo-M 적용에 의한 FRETr 변화는 2단계 활성화 감쇠(1단계 및 2단계)를 보여준다. 단계 1은 시간 상수(τ1)를 계산하기 위해 단일 지수 함수로 적용하였다. n = 2개의 배양에서 12개 세포를 이용하였다. 블러 런다운 그래프는 Oxo-M으로 처리되지 않은 세포의 데이터를 나타낸다(n = 2개의 배양에서 11개 세포). 왼쪽 그래프의 박스 영역(단계 1)을 확대한 모습을 오른쪽에 나타내었다.
도 3은 hM3R-YFP-CFP의 활성화는 야생형 hM3R과 유사한 역학으로 다운스트림 신호 전달 경로를 촉발함을 확인한 도이다. 도 3a 내지 3c 상단은 야생형 수용체(mM1R 또는 hM3R)를 포함하거나 없는(none) PLCδ1(RFP-PH)의 적색 형광 단백질 표지된 플렉스트린 상동성 도메인을 발현하는 세포를 10μM Oxo-M 적용 전(대조군)과 적용 동안 촬영한 공초점 이미지이다. 스케일 바는 10μm이다. 도 3a 내지 3c 하단은 원형질막(FPM, 검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(FCytosol, 빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 시간 경과를 3개의 독립적인 실험에서 5 내지 8개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 3d 및 3e 상단은 RFP-PH 및 mM1R-YFP-CFP(도 3d) 또는 hM3R-YFP-CFP(도 3e)를 발현하는 세포의 대표적인 공초점 이미지를 Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 촬영한 도이다. 스케일 바는 5μm이다. 도 3d 및 3e 하단은 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 시간 경과를 3개의 독립적인 실험에서 5 내지 7개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 3f는 각 수용체 조건에서 Oxo-M 적용 전후의 원형질막(FPM) 및 세포질(FCytosol)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도의 편차(Δ)를 나타낸 도이다. 도 3g는 각 수용체 조건에서 Oxo-M 적용 동안 원형질막 및 세포질(n = 3개의 배양에서 5 내지 9개 세포)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 곡선의 반 활성화 시간(T50)을 나타낸 도이다. n = 3개의 배양물에서 5 내지 9개 세포이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05; ***P<0.001; ****P<0.0001;이며, ns은 중요하지 않음을 의미한다.
도 4는 hM3R-YFP-CFP FRET의 2단계 활성화 역학은 각각 hM3R-Gq 단백질 상호작용 및 Gαq 및 Gβγ 해리에 해당함을 확인한 도이다. 도 4a는 원형질막에서 hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 소단위의 개략도이다. 도 4b는 전체 세포 구성을 통해 0.1mM의 GTP(왼쪽) 또는 1mM의 GDPβS(오른쪽)로 세포 내 관류된 세포에서 10μM의 Oxo-M에 대한 반응으로 정규화된 FRETr의 시간 경과를 확인한 도이다. 각 데이터는 단일 지수 함수로 적용하였다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = GTP에 대한 3개의 배양물로부터의 8개 세포, n = GDPβS에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4c는 총 FRETr 응답에서 각 단계의 백분율 분포(단계 1 및 단계 2의 %ON)를 나타낸 도이다. 도 4d는 GTP 또는 GDPβS를 사용한 전체 셀 구성에서 FRETr 변화의 시작 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 4e는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 SNR를 나타낸 도이다. 1mM의 GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM의 GTP로 세포내 관류하였다. n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물로부터의 7개 세포(1단계 + 2단계); n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물에서 7개 세포(단계 1); n = hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GTP)에 대한 4개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 n = hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS)에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4f는 원형질막에서 야생형 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP 및 Gγ2의 개략도이다. GRK2는 함께 표현되었지만 도면에서는 나타내지 않았다. 도 4g는 전체 세포 구성을 통해 0.1mM의 GTP(왼쪽) 또는 1mM의 GDPβS(오른쪽)로 세포 내 관류된 세포에서 Oxo-M에 대한 응답으로 정규화된 FRETr의 시간 경과를 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = GTP에 대한 2개의 배양물로부터의 6개 세포; 및 n = GDPβS에 대한 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 4h는 총 FRETr 응답에서 각 단일 단계(% 단계 1ON 및 단계 2ON)의 백분율 분포를 나타낸 도이다. 도 4i는 GTP 또는 GDPβS가 있는 전체 셀 구성에서 FRETr 변화의 시작 시간 상수(τON)를 나타낸 도이다. 도 4j는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 SNR를 나타낸 도이다. 1mM의 GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM의 GTP로 세포내 관류하였다. n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양물로부터의 7개 세포(단계 1 + 단계 2), n = hM3R-YFP-CFP에 대한 3개의 배양에서 7개 세포(단계 2)를 이용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. **P<0.01; ***P<0.001이며, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 5는 피크 응답(신호) 및 기준선의 표준 오차(잡음)을 나타낸 도이다. 도 5a는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 피크 반응을 나타낸다. 1mM GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM GTP로 세포내 관류하였다. hM3R-YFP-CFP(단계 1 + 단계 2) 및 hM3R-YFP-CFP(단계 1), n = 3개의 배양액에서 7개 세포; hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GTP), n = 4개의 배양물에서 8개 세포; 및 hM3R-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS), n = 3개의 배양물로부터의 9개 세포를 이용하였다. 도 5b는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 도 5c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용에 대한 ΔFRETr의 피크 반응을 확인한 도이다. 1mM GDPβS로 세포내 관류된 네 번째 컬럼에 속하는 세포를 제외하고, 다른 컬럼에 속하는 모든 세포는 0.1mM GTP로 세포내 관류하였다. hM3R-YFP-CFP(1단계 + 2단계) 및 hM3R-YFP-CFP(2단계만), n = 3개의 배양액에서 7개 세포; Gαq-CFP + Gβ1-YFP(GTP), n = 2개의 배양에서 6개 세포; 및 Gαq-CFP + Gβ1-YFP(GDPβS), n = 3개의 배양에서 9개 세포를 이용하였다. 도 5d는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ***P<0.001; ****P<0.0001;이고, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 6은 FRET 프로브를 발현하는 세포는 활성 GPCR 신호를 나타낸 도이다. 도 6a는 10 μM Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 RFP-PH, hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 서브유닛을 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 6b 상단은 원형질막에서 hM3R-CFP(청록색 트레이스) 및 Gβ1-YFP(노란색 트레이스)의 상대 형광 강도의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 5개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 6b 하단은 Oxo-M에 대한 반응으로 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 15개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.33Hz이다. 도 6c는 Oxo-M 적용 전(대조군) 및 적용 동안 RFP-PH, hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 6d 상단은 원형질막에서 Gαq-CFP(청록색 트레이스) 및 Gβ1-YFP(노란색 트레이스)의 상대 형광 강도의 시간 경과를 나타낸 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 7개의 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 6d 하단은 원형질막(검정색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(적색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 17개 세포를 이용하였으며, 샘플링 주파수는 0.33Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다.
도 7은 hM3R-YFP-CFP FRET 신호의 2단계 비활성화를 확인한 도이다. 도 7a 내지 7c는 hM3R-YFP-CFP (도 7a), hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 소단위(도 7b) 또는 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2(도 7c)를 발현하는 세포에서 10 μM Oxo-M 유도 활성화로부터 정규화된 FRETr 복구의 시간 과정을 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 모든 검은색 및 파란색 선은 표시된 τ 값을 가진 단일 지수 맞춤이다. 도 7d는 hM3R-YFP-CFP(단계 1)(4개의 배양에서 n = 6개의 세포)와 hM3R-CFP + Gβ1-YFP(n = 2개의 배양에서 5개의 세포) 사이의 τOFF 비교 결과이다. 도 7e는 hM3R-YFP-CFP(단계 2)(4개의 배양물에서 n = 6개 세포)와 Gαq -CFP + Gβ1-YFP(2개 배양물에서 n = 11개 세포) 간의 τOFF 비교 결과이다. 도 7f는 hM3R-YFP-CFP(단계 1) 및 hM3R-CFP + Gβ1-YFP 간의 FRETr 회복(% OFF)을 확인한 도이다. 도 7g는 hM3R-YFP-CFP(단계 2)와 Gαq-CFP + Gβ1-YFP 간의 FRETr 회복(% OFF)을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 8은 GRK2는 동역학의 변화 없이 hM3R 매개 G-단백질 FRETr 신호의 진폭을 증가시킴을 확인한 도이다. 도 8a는 hM3R, Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포를 나타낸 도이다. 도 8b는 GRK2가 없거나(검은색 흔적, n=5) 또는 있는(빨간색 흔적, n=10) 세포에서 Oxo-M에 대한 상대적 FRETr의 시간 경과를 나타낸 도이다. 노란색 선은 시점의 SEM을 나타낸다. 도 8c는 GRK2가 있거나 없는 세포의 FRETr 변화의 피크 진폭을 나타낸 도이다. -GRK2, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 +GRK2, n = 2개의 배양에서 10개 세포를 이용하였다. 도 8d는 GRK2가 없거나 존재할 때 ΔFRETr의 신호 대 잡음비(SNR)를 확인한 도이다. 도 8e는 GRK2의 부재 또는 존재 하에서 Oxo-M-유도 FRETr 활성화의 시간 상수(τON)를 확인한 도이다. 도 8f는 GRK2의 부재 또는 존재 하에서 Oxo-M 유도 활성화로부터 FRETr 회복의 시간 상수(τOFF)를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 9는 hM3R-YFP-CFP는 구성적으로 활성인 Gαq 단백질이 있는 경우에 단계 1ON 및 단계 1OFF를 나타낸 도이다. 도 9a는 원형질막에서 Gαq, Gαq(Q209L) 또는 Gαq(R183C)의 구성적으로 활성 돌연변이 형태를 갖는 야생형 hM3R의 개략도이다. 도 9b는 hM3R-YFP-CFP 및 야생형 Gq 단백질 서브유닛(Gαq, Gβ1 및 Gγ2)을 모두 발현하는 세포에서 10μM의 Oxo-M에 대한 정규화된 FRETr 신호의 시간 경과를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 빨간색 선은 단계 1ON, 단계 2ON, 단계 1OFF 및 단계 2OFF에 대한 단일 지수 피팅이다. 도 9c는 hM3R-YFP-CFP, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 동족 G 단백질 서브유닛을 발현하는 세포에서 정규화된 FRETr을 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9d는 단계 1ON 및 단계 1OFF에 대한 시간 상수(τ)이다. τON의 경우, 야생형, n = 3개의 배양물에서 7개 세포; Q209L, n = 2개의 배양에서 10개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포이다. τOFF의 경우, 야생형, n = 3개의 배양물에서 세포 7개; Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9e는 1단계의 FRETr 복구(% OFF)를 나타낸다. 도 9f는 hM3R-CFP, Gβ1-YFP, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 Gγ2를 발현하는 세포에서 정규화된 FRETr 신호를 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9g는 FRETr의 시작 및 오프셋의 시간 상수(τ)는 Oxo-M 처리에 의해 변경됨을 나타낸 도이다. τON의 경우, 야생형, n = 2개의 배양에서 8개 세포; Q209L, n = 2개의 배양물로부터의 9개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 6개 세포를 이용하였다. τOFF의 경우, 야생형, n = 2개의 배양에서 5개 세포; Q209L, n = 2개의 배양물로부터 6개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양에서 5개 세포를 이용하였다. 도 9h는 FRETr 회복(% OFF)을 나타낸다. 도 9i는 야생형 hM3R, 돌연변이 Gαq-CFP(Q209L 또는 R183C), Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 신호를 나타낸다. 샘플링 주파수는 1Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. Q209L, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포; 및 R183C, n = 2개의 배양물로부터의 8개 세포를 이용하였다. 도 9j는 야생형 hM3R, 야생형 Gαq-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포에서 ΔFRETr 신호를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 1Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. n = 2개의 배양물에서 얻은 8개의 세포를 이용하였다.
도 10은 야생형 Gq 단백질 소단위의 동시발현은 hM3R-YFP-CFP의 FRETr 반응에 영향을 미치지 않음을 확인한 도이다. 도 10a 내지 10d는 단계 1ON(도 10a), 단계 2ON(도 10b), 단계 1OFF(도 10c) 및 단계 2OFF(도 10d)의 시간 상수(τ)를 hM3R-YFP-CFP 단독(none) 또는 hM3R-YFP-CFP + 야생형 Gq 단백질(+ Gαq, β1 및 γ2)로 형질감염된 세포에서 측정한 결과이다. none, n = 3개의 배양에서 5개 세포; +G 단백질, n = 3개의 배양물로부터의 7개 세포를 이용하였다. 도 10e 및 10f는 총 회수율에서 단계 1(도 10e)와 단계 2(도 10f)의 퍼센트 분포(%)를 두 그룹에서 측정한 결과이다. 도 10g는 hM3R-YFP-CFP 단독(none) 또는 hM3R-YFP-CFP와 야생형 Gq 단백질(+ Gαq, β1 및 γ2)이 있는 세포에서 ΔFRETr의 피크 반응 진폭을 확인한 도이다. 도 10h는 두 셀 그룹에서 ΔFRETr의 신호 대 잡음비를 확인한 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 11은 YM-254890은 hM3R-YFP-CFP 활성화의 2단계 단계를 차단함을 확인한 도이다. 도 11a 내지 11e에서 세포는 hM3R-YFP-CFP, Gαq(야생형 또는 Q209L) 및 동족 G 단백질 소단위로 형질감염하였다. 도 11a는 연속(왼쪽 검은색 추적, 2개의 배양에서 n = 6개 세포) 또는 임시(오른쪽 빨간색 추적, n = 3개에서 17개 세포) YM의 약물 동안의 야생형 Gαq를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 대한 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 과정 배양)을 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 각 시점의 SEM을 나타낸다. 도 11b는 도 11a와 같이 hM3R-YFP-CFP의 활성화(ON) 또는 비활성화(OFF) 동안 각 단계의 백분율 분포를 나타낸다. 도 11c는 연속(왼쪽 검은색 추적, n = 2개의 배양에서 n = 6개 세포) 또는 일시적(오른쪽 빨간색 추적, n = 6개 세포) YM의 약물 동안 돌연변이 Gαq(Q209L)를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 대한 반응으로 정규화된 FRETr 변화의 평균 시간 과정 두 배양)을 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 각 시점의 SEM을 나타낸다. 도 11d는 도 11c에서 hM3R YFP-CFP 활성화(ON) 또는 비활성화(OFF) 동안 각 단계의 백분율 분포를 나타낸다. 도 11e는 도 11a 및 11c에 표시된 단계 1ON 및 단계 1OFF의 시간 상수(τ)를 나타낸다. 단계 2의 값은 비교하지 않았다. 도 11f는 YM의 동작 단계를 보여주는 개략도이다. 도 11g는 YM의 임시 약물 처리 중 hM3R-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 야생형 Gαq(왼쪽, 2개의 배양에서 n = 5개 세포) 또는 돌연변이 Gαq(Q209L)를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 반응하여 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 경과 (오른쪽, n = 3개의 배양에서 11개 세포)를 나타낸다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 수직선은 SEM을 나타낸다. 도 11h는 도 11g의 표시된 각 기간(a: 0.0-9.9초, b: 10-20초, c: 70-80초)에서 ΔFRETr의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 11i는 YM의 임시 약물 처리 중 hM3R, Gβ1-YFP, Gγ2 및 야생형 Gαq-CFP를 발현하는 세포에서 Oxo-M에 반응하여 정규화된 FRETr 신호의 평균 시간 경과(왼쪽, 2개의 배양에서 n = 7개 세포) 또는 돌연변이 Gαq(Q209L) -CFP(오른쪽, n = 2개의 배양에서 7개의 세포)를 나타낸다. 도 11j는 도 11i에서 표시된 각 기간(a: 0.0 내지 9.9초, b: 10 내지 20초, c: 70 내지 80초)에서 ΔFRETr의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; 733 ****P<0.0001; ns는 중요하지 않음을 나타낸다. 도 11k는 도 11i 및 11j에서 Oxo-M 적용 중 평균 ΔFRETr를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. **P<0.01;이고, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 12는 돌연변이 Gαq(Q209)는 구성적으로 다운스트림 신호를 활성화함을 확인한 도이다. 도 12a 및 12b는 Oxo-M(10μM) 적용 전(대조군) 및 Oxo-M 적용 동안 (+ Oxo-M) RFP-PH, hM3R, 각 유형의 Gαq-CFP(야생형 또는 Q209L), Gβ1-YFP 및 Gγ2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 12c 및 12d는 원형질막(상단) 및 세포질(하단)에서 Gαq-CFP(야생형 또는 Q209L) 및 Gβ1-YFP의 상대 형광 강도의 시간 경과를 2개의 독립적인 실험에서 6개 세포에서 측정한 결과이다. 샘플링 주파수는 0.2Hz이다. 도 12e는 Gαq-CFP의 유형에 따른 원형질막에서의 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP의 절대 형광 강도(WT, 2개의 배양물에서 n = 6개 세포, Q209L, n = 2개 배양물에서 6개 세포)를 확인한 도이다. 도 12f는 Gαq-CFP의 유형에 따른 세포질에서의 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP의 절대 형광 강도를 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. **P<0.01;이고, ns는 중요하지 않음을 나타낸다.
도 13은 hM3R, Gαq 및 PLC는 수용체 활성화 동안 이종삼량체를 형성할 수 있음을 확인한 도이다. 도 13a 및 13b는 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 소단위를 발현하는 세포(도 13a) 및 야생형 hM3R, Gαq-CFP, YFP를 발현하는 세포에서 Oxo-M의 30-60초에 대한 ΔFRETr의 평균 시간 경과 PLCβ1 및 동족 G 단백질 소단위(도 13b)를 나타낸 도이다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 세로선은 SEM을 나타낸다. hM3R-YFP + Gαq-CFP(R-G), n = 2개의 배양에서 11개 세포; 및 Gαq-CFP + YFP PLCβ1(G-PLC), n = 2개의 배양에서 24개 세포를 이용하였다. 도 13c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr의 진폭을 나타낸다. 도 13d는 총 FRETr 응답에서 각 단계의 백분율 분포(단계 1ON 및 단계 2ON의 %)를 나타낸다. 도 13e는 스텝 1ON의 시정수(τON)를 나타낸다. 도 13f는 단계 1ON과 대조되는 각 감소 단계의 백분율(단계 1OFF 및 단계 2OFF의 %)을 나타낸다. 도 13g는 각 비활성화 단계의 시간 상수(τOFF)를 나타낸다. 도 13h는 ΔFRETr의 SNR를 나타낸다. 데이터는 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 ± SEM으로 표시된다. ****P<0.0001; 및 ns은 중요하지 않음을 나타낸다. 도 13i는 hM3R의 Gq 단백질 주기 매개 형태 변화의 개략도이다. 도면은 hM3R 형태의 2단계 활성화 및 2단계 비활성화에 대한 Gq 단백질 주기의 효과를 나타낸다. 상자 안에는 ON 및 OFF 반응 동안 발생하는 각 단계의 기본 프로세스의 요약을 나타내었다. 괄호 안의 반응은 관찰되지 않았다. 점선(-)은 부분적인 상호작용 또는 사전조립의 상태를 의미하며, agonist 결합에 의한 구조적 재배열은 보다 단단한 결합을 유도한다. 비활성 Gq 단백질과 작용제가 결합된 hM3R의 결합은 Gαq와 Gβγ 소단위체 사이의 커플링 형태에 약간의 변화를 일으킨다. 활성화된 Gαq-GTP 서브유닛은 리간드 활성화된 hM3R에서 해리되지 않으며, 동시에 헤테로머 복합체를 형성하여 PLCβ를 자극한다.
도 14는 YM-254890은 Gαq 사이의 상호작용을 억제함을 확인한 도이다. 도 14a 및 14b는 YM-254890(YM)의 존재 하에 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 서브유닛(R-G)을 발현하는 세포 (도 14a) 또는 hM3R, YFP-PLCβ1, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 서브유닛(G-PLC)을 발현하는 세포(도 14 b)에서 30초 또는 60초 Oxo-M에 대한 ΔFRETr의 평균 시간 경과를 나타낸 도이다. n = RG에 대한 2개의 배양물로부터의 8개 세포; n = G-PLC에 대한 2개의 배양에서 얻은 8개 세포를 이용하였다. 샘플링 주파수는 10Hz이고, 노란색 선은 SEM이다. 도 14c는 각 FRET 센서를 발현하는 세포에서 ΔFRETr의 진폭을 확인한 도이다. 도 14d는 ΔFRETr 기준선의 표준 오차를 확인한 도이다. 도 14e는 FRETr의 신호 대 잡음비(SNR)를 확인한 도이다. 도 14f는 단계 1ON 및 단계 1OFF의 시정수(τON 및 τOFF)를 확인한 도이다. 데이터는 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 ± SEM으로 표시하였다. **P<0.01; 및 ****P<0.0001이다. Ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 15는 hM3R-YFP 및 Gαq-CFP를 발현하는 세포에서 정상적인 M3R 신호전달을 확인한 도이다. 도 15a는 10μM Oxo-M 적용 전(대조군), 적용 중(+Oxo-M) 및 적용 후(recovery)에 RFP-PH, hM3R-YFP, Gαq-CFP, Gβ1 및 Gγ2를 발현하는 세포의 공초점 이미지를 촬영한 도이다. 스케일 바는 10 μm이다. 도 15b 상단은 Oxo-M에 대한 반응으로 원형질막(검은색 트레이스, 왼쪽 축) 및 세포질(빨간색 트레이스, 오른쪽 축)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 변화의 시간 경과를 확인한 도이다. 도 15b 하단은 상단 그림에서 표시된 각 기간(a: 19 내지 25초, b: 84 내지 90초, c: 114 내지 120초, d: 300 내지 306초)에서 원형질막(왼쪽 그래프) 및 세포질(오른쪽 그래프)에서 RFP-PH의 상대 형광 강도 평균을 나타낸 도이다. n = 2개의 독립적인 실험에서 얻은 8개의 세포를 이용하였다. 샘플링 주파수는 0.33Hz이고, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. ns는 중요하지 않음을 의미한다.
도 16은 유전자 클로닝을 통해 제작된 본 발명의 FRET 센서 범주의 플라스미드 벡터 지도를 나타낸 도이다.
도 17은 hM3R-YFP-CFP에서 G 단백질과 결합하는 주요 3아미노산 부위(3X46, 6X37, 7X53)를 alanine으로 치환한 결과, G 단백질 수용체에 G 단백질이 결합하지 못하게 되어 기존의 두 단계 활성반응(단계1, 단계2)이 완전히 사라지는 것을 확인한 도이다.
도 18은 hM3R-YFP-CFP 아미노산 서열 중 G 단백질과 결합하는 부위 (3X46, 6X37, 7X53)를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 실험예
1. 재료 및 방법
1.1. 구성
인간 M3D 수용체를 코딩하는 플라스미드(Addgene 플라스미드 # 45547)에서 2개의 점 돌연변이(C149Y 및 G239A)가 생성되어 야생형 인간 M3R(hM3R)를 생성하였다. 상기 hM3R를 hM3R-Cerulean을 생성하기 위해 ECFP(Enhanced cyan Fluorescent protein)의 변종인 cerulean을 포함하는 pcDNA3에 추가하였다. 제한 효소 EcoRI 인식 부위는 hM3R의 C 말단에 있는 Leu590과 cerulean의 N 말단에 있는 Met1 사이의 이 부속기를 매개한다. 이 hM3R-Cerulean의 cerulean을 EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent protein)로 치환하여 hM3R-EYFP를 생성하였다. 분자내 형광 프로브 hM3R-EYFP-Cerulean을 생성하기 위해 EYFP는 hM3R-Cerulean의 세 번째 세포내 루프에서 Ala270과 Lys485 사이의 세그먼트를 대체하였다. 이 때 제한효소 SacII와 AgeI의 인식부위가 이를 매개한다.
기존 인간 Gαq 및 마우스 Gαq-ECFP의 점 돌연변이를 생성하여 Gαq(Q209L), Gαq(R183C), Gαq(Q209L)-ECFP 및 Gαq(R183C)-ECFP를 생성하였다. 모든 구성은 QuikChange(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 돌연변이 유발 프로토콜 및 제한 효소 키트(Enzynomics, Daejeon, South Korea)의 적응을 사용하여 제작되었으며 자동화된 시퀀싱(Macrogen, Seoul, South Korea)에 의해 검증되었다. 마우스 M1R-YFP-CFP, 마우스 Gαq-ECFP, 소 Gβ1-EYFP30, 쥐 EYFP-PLCβ1 및 인간 플렉스트린 상동성(PH) 도메인 프로브 RFP-PH(PLCδ1)는 B. Hille(University of Washington School of Medicine, Seattle, WA)에서 입수하였다. PH(PLCδ1)-ECFP 및 PH(PLCδ1)-EYFP는 K. Jalink(네덜란드 암 연구소, 암스테르담, 네덜란드)에서 입수하였다. 표지되지 않은 마우스 M1R, 인간 Gαq, Gβ1, Gγ2 및 소 GPCR 키나제 2(GRK2)를 함유하는 플라스미드를 B. Hille로부터 얻었다. 여기에서 우리는 일반 형광 단백질 (regular fluorescent proteins) 또는 강화 형광 단백질 (enhanced fluorescent proteins)이 사용되었는지 여부에 관계없이 형광단 (fluorophores)을 단순히 CFP 또는 YFP로 지칭한다.
1.2. 세포 배양
모든 실험은 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에서 수행하였다. 2ml 형질감염 배지는 10μl의 Lipofectamine-2000과 0.2-0.8μg의 각 플라스미드를 함유하였다. G 단백질 연구에서 G 단백질 소단위 프로브의 더 나은 막 발현을 위해 세포는 항상 3개의 G 단백질 소단위(α, β 및 γ)로 함께 형질감염시켰다. 다음날, 세포를 폴리-L-리신 코팅된 #0 유리 커버슬립 칩에 플레이팅하고 형질감염 후 36 내지 48시간 후에 형광 세포를 연구하였다.
1.3. Fφrster resonance energy transfer (FRET)
홈메이드 LED 기반 모노크로메이터 (homemade LED-based monochromator)에서 나오는 남색광(438 ± 12 nm)의 규칙적인 펄스는 형광 단백질을 여기시켰다. 40x, NA 0.95 건식 침지 대물 렌즈(Olympus)를 통과한 방출을 적절한 필터에 의해 단파장(460 내지 500 nm)과 장파장(520 내지 550 nm)으로 분리된 다음 두 개의 광전자 증배관에 의해 획득하였다. 측광법(TILL Photonics)으로 얻은 공여체 및 수용체의 신호를 데이터 수집 보드(PCI-6221, National Instruments, 또는 EPC-10, HEKA Elektronik)로 전송하였다. 신호 수집 및 FRET 비율(FRETr)의 실시간 계산을 수제 프로그램 또는 PatchMaster(HEKA Elektronik)로 수행하였다. YFP 검출기로의 CFP 방출의 블리드스루를 수정하기 위해, CFP만을 발현하는 세포를 사용하여 단파장 및 장파장 방출 채널에서 검출된 신호의 비율을 얻었다. 계산된 비율(cFactor = CFP/YFP = 0.45)은 원시 YFP 방출 신호를 수정하는 데 사용하였다. CFP 검출기로의 YFP 광의 블리드스루는 0.02에 불과하여 무시하였다. 따라서 FRETr은 다음과 같이 계산되었습니다.
[수학식 1]
FRETr = (YFPc - cFactor Х CFPc)/CFPc
여기서 YFPC는 FRET(CFP 여기에 의한 YFP 방출)의 결과로 여기된 YFP의 신호이고, CFPC는 단파장 광전자 증배관에 의해 감지된 CFP 방출이며, YFPC는 장파장 광전자 증배관에 의해 감지된 YFP 방출이다.
측정된 FRETr 트레이스는 다음과 같이 정규화하였다. Oxo-M 처리 전 5초 지점의 평균을 초기값 1로 설정하였고, Oxo-M 또는 YM-254890 세척 전 5초 지점의 평균을 반응 방향에 따라 최소 0 또는 최대 2 값으로 설정하였다. 시계열에서 ΔFRETr을 계산하기 위해 Oxo-M 처리 5초 전 지점의 평균을 초기 값으로 설정하였다. 원시 데이터는 Excel 2016(Microsoft)으로 처리하였다.
1.4. 공초점 이미징 (Confocal imaging)
HEK293T 세포를 실온에서 LSM 700 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 폴리-L-리신 코팅 칩에 형질감염시킨 후 2일째 영상화하였다. 외부 용액으로 채워진 덮개 유리 바닥 접시에서 디지털 줌을 사용하여 1024 × 1024 또는 512 × 512 픽셀의 40 × 대물 렌즈로 이미지를 스캔하였다. Zeiss ZEN 2.3 SP1 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 및 형광 강도 측정을 수행하였다. 상대 형광 강도를 분석하기 위해, 각 시점에서의 관심 영역(ROI)의 형광 강도를 Oxo-M 처리 30초 전 포인트의 평균으로 나누었다. 모든 이미지는 LSM4에서 JPG 형식으로 전송하였다. 원시 데이터는 Excel 2016(Microsoft)으로 처리하였다.
1.5. 용액 및 재료 (Solutions and materials)
약물 처리를 위한 외부 Ringer의 용액 교환은 Warner Instruments(매사추세츠주 홀리스턴)의 스텝 구동 모터에 의해 측면으로 이동된 세타 튜브를 이용하여 수행하였으며 20ms 이내에 완료하였다. 세포는 동시에 링거 용액의 지속적인 느린 용액 흐름 (slow bath flow)을 수행하였다. FRET 및 공초점 이미징에 사용된 외부 링거 용액에는 160 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES 및 8 포도당이 포함되어 있으며 NaOH로 pH 7.4로 조정하였다. 정상 GTP 농도(0.1mM) 조건에서 FRET용 피펫 용액은 175 KCl, 5 MgCl2, 5 HEPES, 0.1 BAPTA, 3 Na2ATP 및 0.1 Na3GTP(KOH로 pH 7.4로 조정)를 포함한다(mM 단위). GTP 고갈 조건의 경우, 0.1mM Na3GTP를 1mM GDPβ로 대체하였다. Oxotremorine-M(Oxo-M) 및 poly-l-lysine은 Sigma-Aldrich(St. Louis, Missouri)에서 구입하였다. DMEM, Lipofectamine-2000 및 페니실린/스트렙토마이신은 Invitrogen(Waltham, Massachusetts)에서 구입하였다. 태아 소 혈청은 Gemini Bio-Products(West Sacramento, California)에서 구입하였다. YM-254890은 Cayman Chemical(Ann Arbor, Michigan)의 제품이다.
1.6. 데이터 분석
모든 데이터는 Excel 2016(Microsoft), Igor Pro-6.0(WaveMetrics) 또는 GraphPad Prism 8(GraphPad Software)을 사용하여 분석하였다. 활성화 곡선의 반감기(T50)는 S자 곡선 피팅에서 계산하였다. 피팅을 수행하고 "hM3R-YFP-CFP" 실험에서 활성화의 시상수(τ) 및 ΔFRETr 진폭을 결정하기 위해 Oxo-M 처리의 시작점을 0 시점으로 간주할 때 시간 지속 시간은 0부터 Oxo-M 첨가 후 1.2초까지를 "단계 1ON"으로 지정하고 Oxo-M 처리 중 1.3 내지 15초의 기간을 "단계 2ON"으로 지정하였다. 피팅을 수행하고 "hM3R-YFP + Gαq-CFP" 실험에서 비활성화의 시간 상수(τ)를 결정하기 위해 0 내지 3.6초를 "단계 1OFF"로 지정하고 3.7 내지 30초를 "단계 2OFF"로 지정하였다. 이전에 설명한 경우를 제외하고 활성화 및 비활성화의 시간 상수(τ) 및 최대 ΔFRETr 진폭을 결정하기 위해 최소 제곱 기준으로 피팅을 수행하였다. 신호 대 잡음비(SNR)는 최대 ΔFRETr 진폭을 기준선 ΔFRETr의 표준 오차로 나눈 값으로 계산하였다. hM3R-YFP-CFP의 FRETr의 백분율(%) ON은 100x(각 활성화 단계(단계 1 또는 단계 2)의 ΔFRETr 진폭/최대 ΔFRETr 진폭)로 계산하였다. 단일 단계 활성화가 있는 다른 구성의 FRETr의 백분율(%) ON은 각 정규화된 FRETr에서 Oxo-M 세척 전 2.5초 지점의 100x(진폭의 평균(초기 값 1과 대조)/정규화된 평균 FRETr에서 Oxo-M 세척 전 2.5초 지점의 진폭(초기 값 1과 대조)의 평균)으로 계산하였다. hM3R-YFP-CFP의 FRETr의 퍼센트(%) OFF는 100X(각 비활성화 단계(단계 1 또는 단계 2)의 ΔFRETr 진폭/활성화의 최대 ΔFRETr 진폭)로 계산하였다. 단일 단계 비활성화가 있는 다른 구성의 FRETr의 백분율(%) OFF는 100x(비활성화의 ΔFRETr 진폭/활성화의 최대 ΔFRETr 진폭)로 계산하였다. 텍스트 및 도면의 통계는 평균 ± SEM을 나타낸다. 두 그룹의 평균 간의 통계적 비교는 변화에 따라 Student's t-test와 Welch's t-test를 사용하여 분석하였다. 일원 ANOVA를 사용하여 3개 이상의 독립 그룹의 평균 간의 통계적 비교를 분석하였다. 차이는 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001 및 ****P<0.0001 수준에서 유의한 것으로 간주하였다.
2. 결과
2.1. 단일 hM3R-YFP-CFP FRET 센서의 2 단계 hM3R 활성화 신호 확인
hM3R FRET 구조인 M3R의 신호전달 특성을 조사하기 위해, hM3R-YFP-CFP는 야생형 hM3R의 세 번째 세포내 루프(ICL3)를 YFP로 교체하고 Gq/11-단백질의 선택적 인식 부위 손상 없이 C-말단에 CFP를 태깅하여 구성하였다 (도 1a 및 도 2a 내지 2c). 수용체는 무스카린 수용체 작용제 oxotremorine-M(Oxo-M)을 적용하여 활성화하였다. 이전에 보고된 마우스 M1 무스카린성 FRET 프로브(mM1R-YFP-CFP)와 대조적으로, 이 hM3R-YFP-CFP에 대한 Oxo-M의 결합은 FRET 비율(FRETr) 신호를 감소시켰으며, 이는 Oxo-M이 YFP와 CFP 사이의 거리가 증가하는 수용체의 3차원 구조를 변경했음을 나타낸다 (도 1b). 또한, hM3R-YFP-CFP는 mM1R-YFP-CFP에 비해 약 3배 더 큰 FRETr 반응과 약 5배 더 높은 신호 대 잡음비(SNR)를 나타낸다 (도 1b 내지 1d). 광안정성도 개선되어 FRETr 신호가 mM1R-YFP-CFP에 비해 유의한 감소 없이 더 오래 유지됨을 확인하였다 (도 2d 및 2e). hM3R-YFP-CFP 구성체의 FRETr이 더 높은 주파수(f = 10Hz)로 더 빠른 관류 시스템 하에서 온전한 HEK293T 세포에서 측정하였을 때, Oxo-M 처리에 의해 더 빠른 단계 (단계 1) 후 더 느린 단계 (단계 1)의 FRETr 신호의 2 단계 감소를 확인하였다 (도 1e). 단계 1 이전에 짧은 지연(0.08 ± 0.05초, n = 5)이 있었다. 단계 1과 단계 2의 시상수 τ 값은 각각 0.22 ± 0.02초 및 1.92 ± 0.30초(n = 5)였다 (도 1f). 그러나 두 단계의 상대적 응답성은 약 50%로 거의 동일하였 (도 1g). 샘플링 주파수를 100Hz로 높이면 광안정성이 감소했지만 단계 1과 단계 2를 더 나누지 않았다 (도 2f). hM3R-YFP-CFP FRETr 반응의 두 단계를 특성화하기 위해 세포의 전체 세포 구성에서 세포 내 GTP 농도를 조작하였다 (도 1h). GTP의 생리학적 수준(0.1mM)으로 세포 내 관류된 세포에서 Oxo-M 적용은 손상되지 않은 세포의 경우와 거의 동일한 hM3R-YFP-CFP의 FRETr 신호 감소를 2 단계로 유도하였다 (도 1i 왼쪽). GTP가 없는 1mM의 GDPβS를 포함하는 피펫 용액으로 패치된 세포도 전체 반응에서 단계 1과 단계 2의 유사한 비율로 2단계 FRETr 감소를 나타냈다 (도 1i 오른쪽 및 1j). 단계 1 반응의 시간 상수는 변하지 않았지만, 단계 2의 반응은 0.1mM의 GTP를 가진 세포보다 거의 5배 더 느렸다 (도 1k). 이러한 결과는 단계 1이 작용제 결합에 의한 hM3R-YFP-CFP의 활성화에 따른 구조적 변화와 관련이 있을 가능성이 있는 반면, 단계 2는 G 단백질 활성화에 따른 수용체의 추가적인 구조적 변화를 나타냄을 나타낸다. 수용체의 내재화가 FRETr 변화에 영향을 미치는지 확인하기 위해 HEK293T 세포막에서 hM3R-YFP-CFP 발현을 공초점 현미경으로 가시화하였다. 우리는 수용체 활성화 전후에 원형질막에서 hM3R-YFP-CFP의 형광 분포에 감지 가능한 변화가 없음을 확인하였다 (도 1l).
hM3R-YFP-CFP에 대한 Oxo-M 결합이 결합된 Gq 단백질의 활성화를 통해 다운스트림 세포내 신호전달을 정상적으로 유발하는지 여부를 확인하기 위해 PLC-매개 PIP2 가수분해를 PLCδ1의 PIP2 프로브 RFP-표지된 플렉스트린 상동성 도메인으로 공동 형질감염된 세포에서 측정하였다 (RFP-PH). 야생형 mM1R 또는 hM3R 플라스미드로 형질감염된 세포는 Oxo-M 처리에 의해 원형질막에서 세포질로 RFP-PH의 강한 전위를 나타냈다 (도 3a 내지 3c).
하기 표 1은 primer 서열을 나타낸다.
| Name of Plasmid | Mutagenesis & Cloning experiments | Forward primer (5'→3') | Reverse primer (5'→3') |
| wild type hM3R from hM3D |
C149Y mutation | GCTGGCTACGTAGTCAATGGCAAGCCAGAG (서열번호 5) | CTCTGGCTTGCCATTGACTACGTAGCCAGC (서열번호 6) |
| G239A mutation | GACAGGCATATAAAAAGCAGCGATGGCTGTGCC (서열번호 7) | GGCACAGCCATCGCTGCTTTTTATATGCCTGTC (서열번호 8) | |
| hM3R-Cerulean | (restriction enzyme sites for Cerulean tagging) BamHI-hM3R-EcoRI |
GATTACGCTGGATCCATGACCTTGCA (서열번호 9) | GATCCAACTAGAATTCCAAGGCCTGC (서열번호 10) |
| hM3R-EYFP | (restriction enzyme sites for EYFP tagging) EcoRI-EYFP-NotI |
GAGCAGGCCTTGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA (서열번호 11) | ATGCATGCTCGAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA (서열번호 12) |
| hM3R-EYFP-Cerulean | (restriction enzyme sites for EYFP insertion) hM3R-SacII-AgeI-Cerulean |
(SacII) CCGCGGTCTGGGACAGAGGCAGAGAC (서열번호 13) |
(SacII) GGCTTGCAGGCCAGCAAGCTCTTTGG (서열번호 14) |
| (AgeI) GCCCAGACCCTCAGTGCGATCTTGCTTGCCTTCATC (서열번호 15) |
(AgeI) CGCTTTCTTCTCCTTACCGGTGACCAGGGACATCC (서열번호 16) |
||
| (restriction enzyme sites for EYFP insertion) SacII-EYFP-AgeI |
CCGCGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA (서열번호 17) | ACCGGTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA (서열번호 18) | |
| Gαq(Q209L) | Q209L mutation | GATGTAGGGGGCCTAAGGTCAGAGAG (서열번호 19) | CTCTCTGACCTTAGGCCCCCTACATC (서열번호 20) |
| Gαq(Q209L)-ECFP | ATGTAGGGGGCCTAAGGTCAGAGAG (서열번호 21) | CGACCATTCTGAAAATGACACTTTG (서열번호 22) | |
| Gαq(R183C) | R183C mutation | CAACAAGATGTGCTTAGAGTTTGTGTCCCCACCACAGGGATCATC (서열번호 23) | GATGATCCCTGTGGTGGGGACACAAACTCTAAGCACATCTTGTTG (서열번호 24) |
| Gαq(R183C)-ECFP | GTGCTTAGAGTTTGTGTCCCCACTACA (서열번호 25) | GTCTTGCTCTGTCGGCATGTACTCA (서열번호 26) |
mM1R-YFP-CFP를 발현하는 세포에서 RFP-PH의 유의한 움직임은 없었으며, 이는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 mM1R-YFP-CFP가 다운스트림 신호 전달 경로를 유발할 수 없음을 의미한다 (도 3d). 그러나 Oxo-M은 hM3R-YFP-CFP를 발현하는 세포에서 RFP-PH의 강력한 전위를 유도하여 Oxo-M에 의한 hM3R-YFP-CFP의 활성화가 Gq 단백질 활성화를 통해 다운스트림 신호 전달 경로를 자극할 수 있음을 나타낸다 (도 3e). 원형질막과 세포질에서 상대적인 RFP-PH 변화에는 약간의 차이가 있었지만, 활성화 반감기(T50)는 야생형 hM3R과 매우 유사한 역학을 나타냈다 (도 3f 및 3g).
따라서, 상기 결과는 hM3R-YFP-CFP가 야생형 hM3R과 유사한 역학으로 Gq 단백질의 활성화를 통해 외부 신호를 다운스트림 경로로 전달할 수 있음을 의미한다.
2.2. hM3R-YFP-CFP의 2 단계 활성화 (Gq 단백질 활성화)
PIP2 고갈의 동역학 측면에서 hM3R-YFP-CFP와 야생형 hM3R 간의 유사성을 기반으로 두 단계의 분자 기반을 추가로 확인하였다. 첫째, hM3R-YFP-CFP의 빠른 단계 1에 해당하는 경로가 수용체에 대한 Oxo-M 결합 및 활성화된 수용체와 이종삼량체 Gq 단백질의 후속 상호작용에 따른 구조적 변화와 관련이 있다고 가정하였다. 따라서 hM3R-CFP, Gβ1-YFP 및 동족 G 단백질 소단위로 형질감염된 세포에서 FRET 실험을 수행하였다 (도 4a). 그 결과, Oxo-M 처리 시 빠른 신호로 구성된 단일 단계 FRETr 응답을 확인하였다 (도 4b 왼쪽 및 4c 회색). 단계(0.23 ± 0.04 s)의 τ(도 4d 회색)는 hM3R-YFP-CFP의 단계 1 τ(도 1k 왼쪽, 회색)와 매우 유사했으며, 이는 단계 1 반응이 Oxo-M이 수용체에 결합한 후 hM3R 및 Gq 단백질의 빠른 반응을 포함하는 것을 의미한다.
피펫 용액에서 0.1mM의 GTP를 1mM의 GDPβS로 대체하여 동일한 실험을 수행하여 반응 간의 유사성을 교차 확인하였다 (도 4b 오른쪽). 그 결과, 0.1mM GTP 또는 hM3R-YFP-CFP의 단계 1 반응(도 4c 및 4d 녹색)과 거의 동일한 시간 상수로 단일 FRETr 신호 반응이 있음을 확인하였으며, 이는 세포내 GTP 농도가 단계 1 반응에 영향을 주는 것을 의미한다.
또한 hM3R-YFP-CFP와 hM3R-CFP + Gβ1-YFP 간의 단계 1 SNR 차이를 측정하였다(도 4e). hM3R-YFP-CFP의 단계 1 반응의 SNR 값(169 ± 23)은 0.1mM의 GTP(90 ± 14) 또는 1mM의 GDPβS(69 ± 8)의 hM3R-CFP + Gβ1-YFP에 비해 약 2배로 측정되었다 (도 4e 및 도 5a 및 5b). 마지막으로, GTP 또는 GDPβS로 세포내 관류된 세포 사이의 SNR에는 유의한 차이가 없었다.
또한, 야생형 hM3R, Gγ2 및 GRK2를 사용하여 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 Gαq 및 Gβγ 소단위 사이의 FRET 실험을 수행하였다 (도 4f). 그 결과, Oxo-M 처리 시 0.25 ± 0.08초 지연(n = 6)으로 FRETr의 단일 단계 감소를 확인하였다 (도 4g 왼쪽 및 4h 회색). 이 단계의 평균 τ 값은 1.45 ± 0.19초(도 4i 회색)로 hM3R-YFP-CFP의 단계 2 반응과 유사하였다 (도 1k 오른쪽, 회색). 또한, GTP 대신 1mM의 GDPβS가 있는 상태에서 동일한 실험을 수행하였다 (도 4g 오른쪽). 그 결과, GDPβS의 경우 반응이 GTP (도 4i 회색)가 있는 세포의 응답과 비교하여 훨씬 느렸지만(10.38 ± 1.46초)(도 4i 녹색), GDPβS가 있는 hM3R-YFP-CFP의 단계 2 반응과 유사함을 확인하였다 (도 1k 오른쪽, 녹색).
GTP 또는 GDPβS 조건(도 4j, 도 5c 및 5d)에서 hM3R-YFP-CFP(단계 2)와 Gαq-CFP + Gβ1-YFP 간의 SNR에 유의미한 차이가 없음을 확인하였다. 이는 hM3R-YFP-CFP의 단계 2 FRET 반응이 수용체에서 활성화된 후 Gαq 및 Gβγ 소단위체의 느린 해리에 해당함을 의미한다. 공초점 현미경을 사용하여 hM3R-CFP + Gβ1-YFP 또는 Gαq-CFP + Gβ1-YFP를 발현하는 세포가 Gq 단백질 활성화를 통해 정상적인 PIP2 가수분해를 나타냄을 확인하였다 (도 6a, 6c 및 6b, 6d 하단). 또한, hM3R 활성화는 원형질막에서 세포질로 Gαq 및 Gβγ 서브유닛을 방출하지 않았으며(도 6b 및 6d 상단), 이는 두 서브유닛이 분리 후 원형질막에 독립적으로 묶여 있음을 나타낸다.
2.3. Oxo-M 해리에 의한 hM3R-YFP-CFP에서 2 단계 비활성화 역학을 유발
Oxo-M 세척 후 hM3R-YFP-CFP의 비활성화 동역학을 측정하였다. hM3R-YFP-CFP 비활성화는 더 빠른 단계 1 반응과 느린 단계 2 반응으로 2 단계 FRETr 회복을 나타내었다 (도 7a). 이 두 단계의 특성을 결정하기 위해 FRETr은 hM3R-CFP + Gβ1-YFP 또는 Gαq-CFP + Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 수용체 비활성화 중에 측정하였다 (도 7b 및 7c). 그 결과, 두 실험 모두에서 비활성화가 단일 단계로 나타났다. hM3R-CFP와 Gβ1-YFP의 비활성화 τ(0.53 ± 0.04s)는 hM3R-YFP-CFP 비활성화의 단계 1(0.47 ± 0.08s)의 값과 매우 유사한 값을 나타냈지만 (도 7d), Gαq-CFP + Gβ1-YFP(21.37 ± 1.34초)의 시간은 hM3R-YFP-CFP 비활성화의 단계 2(20.02 ± 2.29초)와 유사했다(도 7e). 총 회수율에서 각 단계의 퍼센트 분포 측면에서, hM3R-CFP + Gβ1-YFP 및 Gαq 182 CFP + Gβ1-YFP는 모두 약 88%의 유사한 분포 값을 나타내었다 (도 7f 및 7g). 또한, GRK2의 동시발현이 FRETr 반응의 신호 진폭과 SNR을 유의하게 증가시켰지만 수용체 활성화 또는 비활성화의 동역학을 변화시키지 않았다는 것을 확인하였다 (도 8).
2.4. hM3R-YFP-CFP 및 분리된 Gβγ 소단위체의 복합체 형성
hM3R이 외부 신호를 다운스트림 경로로 전달하기 위해 Gq 단백질과 통신하는 방법을 추가로 설명하기 위해 우리는 두 가지 Gαq 돌연변이 형태인 Gαq(Q209L) 및 Gαq(R183C)를 구성하였다 (도 9a). 이전 연구에서는 포도막 흑색종과 같은 질병이 Gαq 돌연변이(Q209L 또는 R183C)를 통한 지속적인 GPCR 활성과 subunit의 GTPase 활성 손실로 인해 발생하는 것으로 보았다.
먼저, 야생형 Gq 단백질의 추가 발현이 hM3R-YFP-CFP의 Oxo-M 유도 FRETr 신호에 영향을 미치는지 확인하였다. 야생형 Gq 단백질의 과발현은 활성화 및 비활성화, 회수율 또는 hM3R-YFP-CFP의 SNR에 대한 단계 2의 동역학을 변경하지 않았다 (도 9b 및 도 10). 그러나 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 동족 G 단백질 서브유닛으로 공동 형질감염된 세포에서 FRETr 실험(도 9c)에서 활성화 및 복구의 단일 단계만 확인되었으며, 이는 단계 1 (ON 또는 OFF)의 야생형 Gq 단백질과 유사한 시간 상수를 나타낸다 (도 9d). 단계 2가 없기 때문에 FRETr은 단일 단계 내에서 거의 완전히 복구되었다 (도 9e).
다음으로, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C)와 Gγ2를 공동 발현하는 세포에서 hM3R-CFP와 Gβ1-YFP 사이의 FRETr 실험을 수행하였다. 그 결과, Oxo-M이 야생형 Gαq의 단계 1과 비교하여 유사한 시간 상수 및 회수율로 단일 단계 FRETr 변화를 유도함을 확인하였다 (도 9g 및 9h). 상기 결과는 Oxo-M이 수용체에 결합할 때 hM3R이 분리된 Gβγ 서브유닛과 독립적으로 상호작용할 수 있음을 나타낸다. 또한, hM3R과 Gβγ 소단위 사이의 상호작용이 작용제의 적용 동안 지속되었고 Oxo-M 세척 직후 회복되었다.
마지막으로, FRETr 실험을 hM3R, 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C)-CFP, Gβ1-YFP, Gγ2 및 GRK2를 발현하는 세포에서 수행하였다. 그 결과, 야생형 Gαq (도 9i 내지 9k)를 제외하고 Oxo-M 적용에 의한 FRETr의 변화를 보여주지 않았으며, 이는 돌연변이 Gαq(Q209L 또는 R183C) 및 Gβγ 서브유닛이 휴지 조건에서 해리되며, 수용체 활성화는 별도로 반응하는 것을 나타낸다.
2.5. Gαq로부터의 GDP 방출 억제에 의한 hM3R-YFP-CFP의 2 단계 반응의 선택적 차단
YM-254890(YM)은 혈전증, 천식, 흑색종 등 다양한 질병의 후보약물로 연구되어 왔다. 전임상 연구에 따르면 YM의 주요 작용 메커니즘은 Gαq 단백질에서 GDP 방출을 억제하는 것이다.
hM3R 및 Gq 단백질의 FRETr 반응에 대한 YM의 효과를 확인하였다. YM의 존재하에 hM3R-YFP-CFP 및 야생형 Gq 단백질을 발현하는 세포에서 Oxo-M 적용시 단계 1(ON 및 OFF) FRETr 반응만이 검출되었다 (도 11a 좌측). Oxo-M을 사용한 hM3R-YFP-CFP 활성화 중간에 YM이 제거되었을 때, 세포는 총 FRETr 활성화(단계 1ON + 단계 2ON) 및 단계 2OFF의 약 31%까지 느린 단계 2ON FRETr 반응을 나타냈다. 전체 비활성화(단계 1OFF + 단계 2OFF)의 약 30%까지 반응하였다 (도 11a 및 11b 빨간색). 그러나 돌연변이 Gαq(Q209L)에 대한 실험 결과 Oxo-M에 의한 단계 1의 FRETr 반응은 정상이었지만, YM을 씻어낸 후에도 hM3R-YFP-CFP에서는 단계 2의 반응이 검출되지 않았다 (도 11c 및 11d). 이는 Oxo-M 처리 전에 구성적으로 활성인 돌연변이 Gαq 및 βγ 서브유닛의 사전 분리 때문일 수 있다. 야생형 Gq와 Gq(Q209L) 간에 단계 1(ON 및 OFF)의 τ 값에는 큰 차이가 없었다 (도 11e). 이러한 결과는 YM이 Gq 단백질과 Oxo-M에 의해 활성화된 hM3R의 상호작용에 영향을 미치지 않고, Gαq 단백질로부터 GDP 방출과 GTP 결합 및 이종삼량체 Gq 단백질의 Gαq 및 βγ 서브유닛으로의 분리 반응을 차단함으로써 단계 2의 반응을 선택적으로 억제함을 나타낸다 (도 11f).
YM 처리 하의 단일 단계 FRET 반응의 분자 메커니즘은 hM3R-CFP + Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 추가로 연구되었다. YM은 Oxo-M에 의한 hM3R-CFP와 Gβ1-YFP 간의 상호 작용에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 11g 및 11h). 또한, 돌연변이 Gq(Q209L)를 발현하는 세포에서 hM3R-CFP와 Gβ1-YFP 사이의 상호작용은 정상이었다.
또한, Gαq-CFP와 Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 YM의 효과를 확인하였다. 상기 세포에서 YM은 Gq 단백질의 활성화를 억제하여 Gαq-CFP와 Gβ1-YFP의 분리를 차단하였다 (도 11i 왼쪽). 그런 다음, YM을 제거한 후 Gαq 및 βγ 서브유닛의 분리에 의해 느린 FRETr 감소를 확인하였다. 실험 결과에서 YM이 있는 경우에도 Oxo-M 적용 후 FRETr의 미미하지만 상당한 감소가 감지되었으며, 이는 이종삼량체 Gq 단백질과 리간드 활성화 hM3R의 결합이 여전히 서로 밀접하게 연결되어 있음을 의미한다. 돌연변이 Gαq(Q209L)-CFP + Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서, YM 세척 후 FRETr에 변화가 없었으며, 이는 Gαq(Q209L)-CFP와 Gβ1-YFP가 이미 분리되어 있고 YM 또는 수용체 활성화에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다 (도 11i 및 11j).
Gβγ와 상호작용이 없는 Gαq(Q209L)-CFP가 정상적으로 원형질막에 고정되어 있는지 여부를 추가로 확인하였다. 공초점 현미경 영상을 통해 Gαq가 휴지 상태에서 돌연변이되었는지 여부에 따라 원형질막 또는 세포질에서 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP의 형광 발현 수준에 차이가 없음을 확인하였다 (도 12a 내지 12f). 또한, 두 조건 모두에서 수용체 활성화는 해당 신호 수준을 변경하지 않았다 (도 12a 내지 12d). 그러나 PIP2 수준의 조절에는 차이가 있었다. Oxo-M은 PIP2를 가수분해하고 야생형 Gαq-CFP 및 Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 RFP-PH의 세포내 수준을 증가시켰다 (도 12a). 대조적으로, 돌연변이 Gαq(Q209L)-CFP 및 Gβ1-YFP를 발현하는 세포에서 RFP-PH의 세포질 수준은 수용체 활성화와 관계없이 이미 상승하여 Gαq(Q209L)-CFP가 수용체 자극 없이도 PLC를 활성화할 수 있음을 확인하였다 (도 12b).
2.6. 수용체 활성화 동안 hM3R, Gαq 및 PLCβ1 간의 지속적인 조립
hM3R 형태의 가역적 조절에서 Gαq의 작동 역할을 결정하기 위해 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 소단위로 형질감염된 세포에서 FRETr 실험을 수행하였다. Oxo-M 적용 시 수용체 활성화는 단일 단계 FRETr 증가를 보여 hM3R-YFP 및 Gαq-CFP가 상호 작용함을 확인하였다 (도 13a 및 13d). 증가된 FRETr 신호는 Oxo-M 처리 동안 유지되었다. Oxo-M 제거 후 FRETr 신호는 거의 동일한 비율로 단계 2의 동역학을 통해 기준선으로 복구되었다 (도 13a 및 13f).
상기 단계 2의 복구를 확인하기 위해 먼저 YM이 있는 상태에서 동일한 FRETr 실험을 수행하였다 (도 14a). YM이 없는 것과 같이 FRETr의 단일 단계 증가가 있었으며 τ는 약 0.2초였다 (도 13e 및 14f). 이것은 hM3R-YFP-CFP의 단계 1의 τ(~0.21초)와 매우 유사하여 hM3R 266 YFP-CFP의 빠른 단계 1ON 반응이 hM3R과 이종삼량체 비활성 Gq 단백질의 커플링에 의해 매개됨을 나타낸다. 또한, YM이 있는 경우, hM3R-YFP + Gαq-CFP의 단계 1OFF(도 13g) 및 hM3R-YFP-CFP의 단계 1OFF (도 7a 및 7d)의 유사한 시간 상수의 단일 단계 FRETr 복구만이 있음을 확인하였다 (도 14a).
상기 결과는 hM3R-YFP 및 Gαq-CFP가 있는 세포에서 FRETr의 2 단계 회복이 hM3R-YFP-CFP에서 단계 1OFF 및 단계 2OFF 반응으로 이루어짐을 나타낸다. 이는 단계 1OFF는 hM3R에서 Oxo-M가 분리 (uncoupling)된 후에 hM3R에서 Gβγ 서브유닛이 방출되는 것을 의미하고, 단계 2OFF는 Gαq의 GTPase 활성에 의해 GTP가 GDP로 가수분해된 후 hM3R-YFP에서 Gαq-CFP가 해리된 것을 의미한다 (도 13i).
공초점 현미경 이미징을 통해 hM3R-YFP, Gαq-CFP 및 동족 G 단백질 서브유닛으로 형질감염된 세포가 수용체 활성화에 의한 PLCβ 활성화 및 PIP2 가수분해에 대한 정상적인 신호 전달 캐스케이드를 보유함을 추가로 확인하였다 (도 15a). 또한, PLCβ 활성화에 대한 hM3R 신호전달은 작용제가 세척될 때까지 지속되었다 (도 15b).
활성화된 Gαq-GTP와 이펙터 PLCβ의 상호 작용을 조사하기 위해 hM3R, Gαq-CFP, YFP-PLCβ1 및 동족 G 단백질 소단위로 형질감염된 세포에서 FRETr 실험을 수행하였다. Oxo-M 적용 시 수용체 활성화는 hM3R-YFP 및 Gαq-CFP보다 강하지만 느린 단일 단계 FRETr 증가를 보여 hM3R과 Gαq 간의 결합이 Gαq 및 PLCβ1의 복합 형성보다 빠르게 완료됨을 확인하였다. (도 13b 내지 13e). Gαq-CFP와 YFP-PLCβ1 사이의 증가된 FRETr 신호는 수용체가 활성화되는 동안에도 유지되었다 (도 13b). 이러한 결과는, 활성 hM3R과 Gαq-GTP 사이의 안정적인 상호작용을 고려하면, hM3R, Gαq 및 PLCβ1이 수용체 활성화 동안 안정적인 이종삼량체 복합체를 형성함을 의미한다 (도 13a). 두 FRETr 반응 사이의 SNR에는 차이가 없었다 (도 13h).
다음으로, Gαq-CFP + YFP-PLCβ1에서 비활성화 과정을 확인할 때 단일 단계 감소를 확인하였다 (도 13b 및 13f). 이 단일 단계 비활성화의 동역학은 hM3R-YFP + Gαq-CFP (도 13g) 또는 hM3R-YFP-CFP(도 7a 및 7d)의 단계 1OFF 반응보다 느리지만, hM3R-YFP + Gαq-CFP (도 13g) 또는 hM3R-YFP-CFP (도 7a 및 7e)의 단계 2OFF 반응보다는 빠른 것으로 확인되었다. 또한, PLCβ1이 단계 1OFF 반응보다 Gαq-GTP에서 더 천천히 방출되고 이 방출이 단계 2OFF 반응이 완료되기 전에 종료된다는 것을 확인하였다 (도 13i).
마지막으로 YM의 기능을 확인하기 위해 YM이 있는 상태에서 Gαq-CFP와 YFP-PLCβ1을 사용하여 동일한 FRETr 실험을 수행하였다 (도 14b 내지 14f). 그 결과, 수용체 활성화에 의한 FRETr 변화는 없었으며, 이는 YM이 Gαq에서 GDP 방출을 차단함으로써 Gq 활성화를 성공적으로 억제함을 나타낸다. 따라서 상기 결과는 불활성 Gq 단백질이 PLCβ1과 상호작용할 수 없음을 의미하는 것이다.
2.7. hM3R-YFP-CFP에서 G 단백질과 결합하는 주요 아미노산 치환시 2 단계 활성 반응 여부 관찰
hM3R-YFP-CFP에서 G 단백질과 결합하는 주요 3군데 아미노산 부위(3X46, 6X37, 7X53)를 alanine으로 치환한 결과, G 단백질 수용체에 G 단백질이 결합하지 못하게 되어 기존의 두 단계 활성반응(단계1, 단계2)이 완전히 사라지는 것을 확인하였다 (도 17 참조).
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (15)
- G 단백질 결합 수용체 (GPCR, G protein-coupled receptor);
형광수용체 (fluorescence acceptor); 및
형광공여체 (fluorescence donor)를 포함하는, 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer; FRET) 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서,
상기 형광수용체는 GPCR 단백질의 세포내 루프 3 (intracellular loop 3, ICL3)에 포함되는 것인, 바이오센서.
- 청구항 2에 있어서,
상기 형광수용체는 야생형 GPCR 단백질의 ICL3의 아미노산 일부와 치환된 것인, 바이오센서.
- 청구항 3에 있어서,
상기 아미노산 치환은 상기 야생형 GPCR 단백질의 271번 내지 484번 아미노산이 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 SacII-EYFP-AgeI로 치환된 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서,
상기 형광공여체는 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein; CFP)이며, 형광수용체는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein; YFP)인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서,
상기 시안 형광 단백질은 Cerulean, Turquoise2-GL, mTurquoise, mTFP, ECFP, CyPet 및 ECGFP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서,
상기 황색 형광 단백질은 LanYFP, mNeonGreen, YPet, mEYFP, SEYFP, phiYFP, Citrine, mCitrine, Venus, mVenus, iq-mVenus, cp50Venus, cp157Venus, cp172Venus, cp195Venus, 및 cp229Venus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서,
상기 바이오센서는 G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호작용을 실시간으로 측정하기 위한 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서,
상기 바이오센서는 서열번호 1로 표현되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표현되는 염기 서열을 포함하는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1의 바이오센서를 발현하기 위한, 벡터.
- 청구항 10에 있어서,
상기 벡터는 서열번호 3로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 벡터.
- 청구항 1의 바이오센서를 포함하는,
G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 조성물.
- 청구항 1의 바이오센서를 포함하는,
G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용 진단용 키트.
- 하기의 단계를 포함하는, G 단백질 수용체의 활성 및 리간드와의 상호 작용을 확인하는 정보제공방법:
(a) 상기 청구항 9의 벡터를 세포에 형질도입하는 단계;
(b) 상기 형질도입된 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험 물질이 처리된 세포에서 형광수용체의 발광 강도(emission intensity) 대비 형광공여체의 발광 강도의 비율을 측정하는 단계.
- 청구항 14에 있어서,
상기 (c) 단계는 하기 수학식 1에 의해 발광 강도 비율을 계산하는 것인, 정보제공방법.
[수학식 1]
FRETr = (YFPC - cFactor Х CFPC)/CFPC
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| KR1020220147739A KR20240072300A (ko) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | 실시간 Gq 단백질 주기 감응형 형광공명에너지전달 센서 및 이의 용도 |
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| KR20210101960A (ko) | 2020-02-11 | 2021-08-19 | 한국원자력연구원 | 현장 베타선 측정 장치 및 이를 이용한 현장 베타선 측정 방법 |
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