KR20230116843A - 세포 표면 단백질을 제시하는 생물학적 소포 및 이와관련된 방법 - Google Patents
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Abstract
세포 표면 단백질을 제시하는 생물학적 소포, 및 이러한 소포를 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 식별하고 특성화하는 방법이 본원에 제공되어 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2020년 12월 1일에 출원된 미국 특허 출원 제 63/120,167; 2021년 6월 17일에 출원된 미국 특허 출원 제 63/212,021; 및 2021년 7월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제 63/227,039에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2021년 11월 29일에 생성된 해당 ASCII 사본은 파일명 50474-231WO4_Sequence_Listing_11_29_21_ST25이고 크기는 4,713바이트이다.
발명의 분야
세포 표면 단백질을 제시하는 생물학적 소포, 및 이러한 소포를 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 식별하고 특성화하는 방법이 본원에 제공되어 있다.
배경
원형질막-발현 단백질 및 이들의 상호작용인자는 세포의 세포질로의 신호 전달 개시에 중요한 역할을 하므로, 대부분의 생물학적 경로의 핵심 조절인자이다. 수용체들이 이들의 생물학적 기능에 직접적으로 영향을 미치는 세포외 환경에서 상호 작용하는 파트너들의 복잡한 환경을 가짐을 보여주는 증거가 증가하고 있다. 결과적으로, 수용체-리간드 누화의 조절 장애는 종종 병리학 및 질병 진행의 기초가 된다. 그러나, 수용체 상호작용 네트워크는 막 단백질들을 이들의 고유 형태 단백질로 유지시키는 것과 관련된 생화학적 문제 및 일반적으로 수용체들 간의 약한 상호작용으로 인해 연구되지 않은 상태로 남아 있다.
따라서, 세포 표면 단백질들 사이의 상호작용을 확인하는 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 이러한 상호작용의 신규한 조절인자 및 이를 사용하는 방법에 대한 충족되지않은 수요가 존재한다.
발명의 요약
한 양상에서, 본 발명은 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 하나 이상의 고체 표면 상에 고정된 표적 폴리펩티드들의 집합체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 집합체를, 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건하에서 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제(a membrane-budding agent)를 포함하는 생물학적 소포(BV)와 접촉시키는 단계(이 때, 이종 막-결합 단백질은 BV 표면에서 임계 수준 이상으로 발현됨); 및 (c) 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 하나 이상의 표적 폴리펩티드는 하나 이상의 고체 표면 상의 별개의 위치에 고정된다.
일부 양상에서, 상호작용을 식별하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준보다 높은 신호를 검출하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다.
일부 양상에서, 막-출아제는 검출가능한 마커를 추가로 포함하고, 상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 검출가능한 마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소이다. 일부 양상에서, 효소는 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase, Rluc)이고, 기질은 Rluc 기질이다.
일부 양상에서, BV가 막 마커를 포함하고, 상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 막 마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 막 마커는 콜레스테롤 마커이다. 일부 양상에서, 콜레스테롤 마커는 AMPLEX™ Red이다.
일부 양상에서, 상호작용은 일시적인 상호작용이다.
일부 양상에서, 상호작용은 저 친화성 상호작용이다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질이다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함한다.
일부 양상에서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 막 표면에 고정(tether)시킨다. 일부 양상에서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, 태그는 직접 또는 간접적으로 시각화될 수 있다.
일부 양상에서, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다. 일부 양상에서, 태그는 당단백질 D(gD) 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질의 발현 수준은 생물층 간섭계(BLI) 분석을 사용하여 결정된다.
일부 양상에서, 태그는 gD 폴리펩티드이고, 이종 막-결합 단백질의 발현은 항-gD 항체를 사용하여 검출되고, 임계 수준은 30℃에서 BLI 분석을 사용하여 측정 시, 1.5 nm의 이동(shift)이다.
일부 양상에서, 태그는 형광 단백질을 포함한다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 막관통 수용체 또는 이의 단편이다. 일부 양상에서, 수용체는 단일 통과(single-pass) 막관통(STM) 수용체이다.
일부 양상에서, 단백질 단편은 세포외 도메인이다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드 집합체의 각 구성원은 Fc-태그가 있는 세포외 도메인이고, 고체 표면은 단백질 A로 코팅된다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질(이 때, 이종 막-결합 단백질은 BV의 외부 표면에 존재함) 및 (b) 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질(이 때, 이종 막-결합 단백질은 BV의 외부 표면에 존재함) 및 (b) 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 하며, 이 때 BV는 (i) 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 모 세포로부터 BV를 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다.
일부 양상에서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 지질 막 표면에 고정(tether)시킨다. 일부 양상에서, 앵커는 GPI 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, 태그는 직접 또는 간접적으로 시각화될 수 있다. 일부 양상에서, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다. 일부 양상에서, 태그는 gD 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, 태그는 형광 단백질을 포함한다.
일부 양상에서, 단백질 단편은 막관통 수용체의 세포외 도메인이다. 일부 양상에서, 막관통 수용체는 STM 수용체이다.
일부 양상에서, BV는 태그에 대한 항체와 접촉할 때 BLI 분석을 사용하여 측정 시 임계 수준 이상인 이동을 생성한다.
일부 양상에서,태그는 gD 폴리펩티드이고, 항체는 항-gD 항체이고, 임계 수준은 30℃에서 BLI 분석을 사용하여 측정 시 1.5nm의 이동이다.
일부 양상에서, 막-출아제는 검출가능한 마커를 포함한다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소이다. 일부 양상에서, 효소는 Rluc이고, 기질은 Rluc 기질이다.
일부 양상에서, BV는 막 마커를 포함한다. 일부 양상에서, 막 마커는 콜레스테롤 마커이다. 일부 양상에서, 콜레스테롤 마커는 AMPLEX™ Red이다.
일부 양상에서, BV는 포유동물 모 세포에 의해 생산된다. 일부 양상에서, BV는 세포외 소포(EV)이다. 일부 양상에서, BV는 엑소좀 또는 미세소포이다. 일부 양상에서, BV는 바이러스 유사 입자(VLP)인이다.
일부 양상에서, 모 세포는 이종 막-결합 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 막-출아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 1의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때, 후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 1의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 1의 단백질에 대한 표 2의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 2의 단백질을 표 1의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 2의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, BLI 분석 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정 시 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제이다. 일부 양상에서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 감소이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 증가이다.
일부 양상에서, 조절인자는 소분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다.
일부 양상에서, 항원-결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인이다.
일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1의 단백질에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2의 단백질에 결합한다.
일부 양상에서, 표 1의 단백질은 LRRC15이다. 일부 양상에서, 표 2의 단백질은 TEM1이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소된다.
일부 양상에서, 조절인자는 LRRC15를 표적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 양상에서, 조절인자는 TEM1을 표적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계; 및 (c) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계; 및 (c) LRRC15의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 후보 조절인자를 LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별시킨다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) LRRC15에 대한 TEM1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 TEM1을 LRRC15와 접촉시키는 단계; 및 (c) TEM1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 후보 조절인자를 TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별시킨다.
일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 종양 성장이다.
일부 양상에서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 변경된 결합 프로파일을 갖는 생물학적 소포(BV)를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 하나 이상의 고체 표면에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계; (b) 관심 BV와 단계 (a) 집합체를 접촉시키는 단계; (c) 관심 BV와 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 상호작용 프로파일을 식별하는 단계; 및 (d) 관심 BV의 상호작용 프로파일을 대조군 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 관심 BV의 상호작용 프로파일과 대조군 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 관심 BV가 변경된 결합 프로파일을 갖는 것으로 식별된다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 관심 BV는 조작된 BV이다.
일부 양상에서, 관심 BV는대상체의 샘플로부터 유래한다. 일부 양상에서, 관심 BV 및 대조군 BV는 상이한 조직 또는 상이한 세포 유형으로부터 유래한다. 일부 양상에서,관심 BV는 질환 조직으로부터 유래하고 대조군 BV는 건강한 조직으로부터 유래한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제를 포함하는 BV 및 (b) 표적 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 특징으로 하며, 이 때 이종 막-결합 단백질 및 표적 폴리펩티드는 서로에 결합된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때, 후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 5의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) 표 5의 단백질에 대한 표 6의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 6의 단백질을 표 5의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 6 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, BLI 분석 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정 시 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제이다.
일부 양상에서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 감소이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 증가이다.
일부 양상에서, 조절인자는 소분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다.
일부 양상에서, 항원-결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인이다.
일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5의 단백질에 결합한다.
일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6의 단백질에 결합한다.
일부 양상에서, 표 5의 단백질은 ADGRB1이다.
일부 양상에서, 표 6의 단백질은 PD-L1이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소된다.
일부 양상에서, 조절인자는 PD-L1을 표적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 양상에서, 표 6의 단백질은 ICOSLG이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 T 세포 활성화이다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 조절인자의 존재 시 증가된다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 적어도 20%만큼 증가된다.
일부 양상에서, 조절인자는 ICOSLG을 표적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 양상에서, 조절인자는 ADGRB1을 표적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 PD-L1와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 PD-L1와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) PD-L1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 후보 조절인자를 PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별시킨다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) PD-L1에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1을 PD-L1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 후보 조절인자를 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별시킨다.
일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG를 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ICOSLG의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ICOSLG에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1을 ICOSLG와 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다.
일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 T 세포 활성화이다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 조절인자의 존재 시 감소된다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 적어도 20%만큼 증가된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 세포주를 변형시키는 단계; 및 (b) 세포주에 의해 생성된 생물학적 소포(BV)의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포주의 상호작용 프로파일 변화를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 세포주를 변형시키는 단계; (b) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (c) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (d) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화가 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 세포주의 상호작용 프로파일 변화를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (b) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (c) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화가 식별된다.
일부 양상에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 양상에서, 포유동물 세포주는 면역 세포주, 신경 세포주, 또는 섬유모세포 세포주이다. 일부 양상에서, 면역 세포주는 T-세포, B-세포, 또는 단핵구 중 하나 이상을 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 제1 시점 이후 제2 시점 이전에 세포주를 자극에 노출시키는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 자극은 신호전달을 유도하는 조건 또는 제제이다. 일부 양상에서, 자극은 질환 관련 상태를 유도하는 조건 또는 제제이다. 일부 양상에서, 세포주는 면역 세포주이고 질환 관련 상태는 면역 고갈이다.
일부 양상에서, 자극은 분화를 유도하는 조건 또는 제제이다.
일부 양상에서, 이 방법은 하나 이상의 추가 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 2개의 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 각각의 세포주를 변형시키는 단계; (b) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (c) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (d) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이가 식별된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 2개의 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (b) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (c) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이가 식별된다.
일부 양상에서, 막-출아제의 발현은 유도성이다.
일부 양상에서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 BV에서 하나 이상의 관심 막-결합 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 BV에서 하나 이상의 관심 수용체의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 하나 이상의 고체 표면 상에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)에서 표적 폴리펩티드의 집합체를 BV와 접촉시키는 단계; 및 (c) BV와 표적 폴리펩티드 집합체의 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출하여 상호작용 프로파일을 식별하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 수행된다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 BV의 세포질 단백질 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 이종 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 하며, 이 때 BV는 (i) 유도성 대조군하에서 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포주를 제공하는 단계; (ii) 막-출아제의 발현을 유도하는 단계, 및 (iii) 모 세포주로부터 BV를 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양상에서, 모 세포주는 포유동물 세포주이다.
일부 양상에서, BV는 세포외 소포(EV)이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 막-결합 단백질의 효소 활성을 평가하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 단백질을 포함하는 BV에서 효소 활성에 대한 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 펩티다제이고 효소 활성에 대한 분석은 펩티다제 활성에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 프로테아제이고 효소 활성에 대한 분석은 프로테아제 활성에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 키나제이고 효소 활성에 대한 분석은 키나제 활성에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 포스파타제이고 효소 활성에 대한 분석은 포스파타제 활성에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 BV가 유래된 모 세포에 내인성이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 BV가 유래된 모 세포에 이종이다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질이다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함한다. 일부 양상에서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 막 표면에 고정(tether)시킨다. 일부 양상에서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 배양 배지 또는 대상체의 샘플로부터 BV를 정제하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 BV를 표 8 또는 표 9의 단백질 중 하나 이상을 포함하는 고체 표면과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질은 Fc 영역을 포함하도록 변형되어 있다.
일부 양상에서, 대상체의 샘플은 소변 샘플, 혈액 샘플 또는 소화된 조직 샘플이다.
일부 양상에서, 고체 표면은 단백질 A-작용기화 비드를 포함하는 컬럼이고, 상기 방법은 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질을 포함하는 조건화 배지를 컬럼 위로 유동시키는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 BV를 포함하는 배양 배지를 컬럼 위로 유동시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 BV를 용출시키는 단계를 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 세포 배양물로부터 수용체-발현 세포외 소포(EV)의 단리를 보여주는 개략도이다. EXPI293FTM 세포는 관심 수용체를 인코딩하는 플라스미드와 레닐라 루시퍼라제(Rluc)에 융합된 HIV gag 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염되었다. 세포 및 파편들은 원심분리 및 여과에 의해 EV 함유 상층액으로부터 분리되었다. 50% 수크로스 쿠션을 사용하여 소형 단백질 응집체들을 제거하고 소형 소포들을 단리했다.
도 1B는 수크로스 쿠션 단계 존재시(오른쪽 패널) 및 부재시(왼쪽 패널) 제조된 EV들을 보여주는 일련의 네거티브 염색 전자 현미경 사진이다. EV 제제는 전자 현미경 검사 전에 동일한 단백질 농도로 희석되었다. 화살표는 샘플의 대표적인 EV를 가리킨다.
도 1C는 나노입자 추적 분석을 사용하여 측정된, 전장(FL) PVR 단백질(왼쪽 패널) 또는 PVR 엑토도메인, 당단백질 D(gD) 태그 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 링커(gD-GPI)(오른쪽 패널)을 포함하는 단백질을 운반하는 EV의 크기 분포(nm 단위)를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 5개의 복제본이 각 그래프에 표시된다. 검은색 선은 평균을 나타내고; 회색 선은 평균의 표준 오차를 나타낸다. EV의 크기는 일관되게 약 120nm이다.
도 2A는 세포의 원형질막 및 EV 막에 포매된 막관통 단백질을 보여주는 다이어그램이다.
도 2B는 EV-발현 수용체에 대한 2가지 실험 설정을 보여주는 다이어그램이다. 왼쪽: 세포막과 EV 막에 포매된 HIV gag 단백질 및 전장 막관통 수용체. 오른쪽: 세포막과 EV 막에 포매된 HIV 개그 단백질 및 gD-GPI 태그를 포함하는 지질-고정된 엑토도메인.
도 2C는 나노입자 추적 분석을 사용하여 측정된, HIV gag 단백질로 형질전환되어 있는 모 세포(Gag 있음) 및 형질전환되지 않은 대조군 세포(Gag 없음)에 의해 생성된 20-500 nm 크기 범위의 EV의 입자 수를 보여주는 그래프이다.
도 2D는 Rluc에 융합된 HIV gag 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 형질전환되었던 모 세포로부터 생산된 EV 제제의 3배 희석 시리즈에서 Rluc의 발광 신호를 보여주는 그래프이다.
도 2E는 PVR 리간드를 발현하는 포유동물 세포의 표면에 결합된 전장 PVR을 발현하는 EV를 보여주는 개략도 및 명시된 전장 PVR 리간드를 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다.
도 2F는 PVR 리간드를 발현하는 포유동물 세포의 표면에 결합된 gD-GPI 태그가 있는 PVR 엑토도메인을 발현하는 EV를 보여주는 개략도 및 명시된 전장 PVR 리간드를 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다. 스케일 바는 20μm이다.
도 2G는 생물층 간섭계(BLI) 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. CD226-Fc 또는 대조군 인간 IgG를 센서에 부착했다. 센서를 전장(FL) PVR 또는 gD-GPI PVR 엑토도메인 또는 단량체 PVR 단백질(PVR 단량체)를 발현하는 EV를 포함하는 용액에 담그고 BLI 신호(nm 단위)를 측정했다. 오른쪽 패널은 0nm 이상의 신호를 확대한 것이다.
도 3A는 RDIMIS(Receptor-Display In Membranes Interaction Screen) 프로토콜의 흐름도를 보여주는 개략도이다. EV는 gag-luc와 함께 관심 수용체를 발현하는 세포들의 조건화된 배지로부터 단리된다. Fc-태그가 있는 엑토도메인(ECD-Fc)으로 표현되는 단일 통과 막관통(STM) 단백질들의 라이브러리가 플레이트에 고정된다. 수용체-EV는 반자동 워크플로우를 사용하여 플레이트-결합된 STM 단백질들의 집합체에 대해 스크리닝된다. 라이브러리에서 상호작용하는 엑토도메인에 대한 EV 결합은 발광을 사용하여 검출된다.
도 3B는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 2회의 독립적인 RDIMIS 스크린(반복 1 및 반복 2) 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다.
도 3C는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트(도 3B의 반복 2) 및 전장(FL) PVR EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다.
도 4A는 태그가 없는 전장 수용체 PD1, PD-L1, EPHA3, CD248, LRRC15, PVR 또는 PVRL1을 발현하고 이들 수용체에 특이적인 항체로 염색된 전 세포 용해물(세포) 또는 EV의 웨스턴 블롯을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 항-튜불린(α-Tub) 및 항-액틴(α-Actin) 염색이 대조군으로 제공된다.
도 4B는 명시된 gD-GPI 태그가 있는 수용체 엑토도메인을 발현하고 gD 태그에 특이적인 항체(α-gD)로 염색된 전 세포 용해물 또는 EV의 웨스턴 블롯을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 항-튜불린(α-Tub) 및 항-액틴(α-Actin) 염색이 대조군으로 제공된다.
도 4C는 gD-GPI 발현 소포들의 선택적 항-gD 면역골드 표지법을 보여주는 일련의 네거티브 염색 전자현미경 사진이다.
도 4D는 생물층 간섭계 실험의 설계 및 결과를 보여주는 그래프이다. 항-gD 항체가 센서에 부착되었다. 센서는 명시된 gD-GPI 엑토도메인을 발현하는 EV와 함께 인큐베이션되었으며 BLI 신호(nm 단위)가 측정되었다.
도 5A는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트 및 PD-L1 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 스크린들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제와 수용체 특이적 히트들(두 축 근처)을 구별하기 위해 서로에 대해 플롯된다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 5B는 CD80 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트 및 CD276 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 수용체 특이적 히트들은 축 근처에 있다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 5C는 본 연구에서 PVR, PD-L1, CD80 및 CD276에 대해 식별된 결합 파트너와 STRING, Bioplex 및 Biogrid 데이터베이스에 나열된 상호작용 사이의 중첩을 나타내는 일련의 다이어그램이다. PD-L1/CD274의 경우, Bioplex 데이터베이스에 STM 라이브러리 구성원과의 상호 작용이 없었다. 어떠한 실험적으로 검증된 상호작용도 CD276/B7-H3에 대한 STRING에 나열되지 않았다.
도 6A는 LRRC15 엑토도메인 5량체와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AVEXIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. LRRC15 5량체 결합은 CD248 엑토도메인(강조 표시됨)을 포함하는 웰에서 배경 이상에서 관찰되지 않았다. 회색 점은 스톡 5량체가 첨가되었지만 세척되지 않은 각 플레이트의 양성 대조군 웰을 나타낸다.
도 6B는 EV에서 LRRC15 전장(FL) 또는 gD-GPI 엑토도메인을 사용하여 본원에서 식별된 히트와 Bioplex 및 Biogrid 데이터베이스에 나타난 히트 사이의 비교를 보여주는 일련의 다이어그램이다. 해당 라이브러리에서 LRRC15와 STM 단백질 사이의 실험적 증거가 있는 어떠한 상호작용도 STRING 데이터베이스에 표시되지 않았다.
도 7A는 LRRC15 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 결과를 도 3C에 도시된 PVR 스크린 결과와 비교한다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 7B는 LRRC15 전장 EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 결과를 도 3C에 도시된 PVR 스크린 결과와 비교한다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 8A는 두경부 편평 세포 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다. 각 포인트는 하나의 환자 샘플을 나타낸다. 스피어먼 순위 상관 계수와 유의성 값은 오른쪽 상단에 제공된다.
도 8B는 유방 침윤성 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다. 각 포인트는 하나의 환자 샘플을 나타낸다. 스피어먼 순위 상관 계수와 유의성 값은 오른쪽 상단에 제공된다.
도 8C는 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 얻은 비종양 세포들을 보여주는 한 쌍의 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 차원 축소 플롯이다. 세포는 명시된 마커 유전자(왼쪽; LRRC15; 오른쪽: CD248)들의 발현 수준 별로 음영 처리된다.
도 9A는 췌관 선암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다(The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터).
도 9B는 요로상피성 방광 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다(The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터).
도 9C는 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 얻은 비종양 세포들을 보여주는 한 쌍의 UMAP 차원 축소 플롯이다. 세포는 명시된 마커 유전자(왼쪽, DCN 암 관련 섬유모세포, 오른쪽: RGS5 암 관련 혈관주위세포 마커)의 발현 수준에 따라 음영 처리된다.
도 10A는 CD248 엑토도메인 5량체와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AVEXIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. CD248 5량체 결합은 LRRC15 엑토도메인(강조 표시됨)을 포함하는 웰에서 배경 이상에서 관찰되지 않았다. 회색 점은 스톡 5량체가 첨가되었지만 세척되지 않은 각 플레이트의 양성 대조군 웰을 나타낸다.
도 10BA는 LRRC15-Fc를 SPR 칩 상의 단백질 A에 캡처시키고 명시된 분석물들을 첨가한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 결과를 보여주는 그래프이다. LRRC15는 5μg/mL(빨간색 및 녹색 선) 또는 50μg/mL 농도로 로드되었다. 분석물은 400nM 농도로 로드되었다.
도 11A는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. CD248은 재조합 단백질로 발현되어 센서에 고정되었다. 센서를 LRRC15-Fc(500nM) 또는 LRRC15 전장 또는 gD-GPI LRRC15(0.25mg/ml)를 포함하는 EV를 포함하는 용액과 접촉시키고, BLI 신호(nm 단위)를 측정하였다.
도 11B는 전장 CD248 또는 gD-GPI CD248을 일시적으로 발현하는 세포에 대한, gag-NeonGreen 및 전장(FL) LRRC15, gD-GPI LRRC15(LRRC15-gD), 또는 빈 벡터 대조군을 포함하는 EV의 결합을 나타내는 개략도 및 현미경 사진 세트이다.
도 11C는 전장 LRRC15 또는 gD-GPI LRRC15를 일시적으로 발현하는 세포에 대한 (사량체화된 재조합 엑토도메인으로서) CD248 또는 빈 벡터 대조군의 결합을 나타내는 개략도 및 일련의 현미경 사진이다. 스케일 바는 20μm를 나타낸다.
도 11D는 NeonGreen 신호 수준(3회의 독립적인 반복실험에 대한 평균 ± 표준 오차)에 기초한 도 11B의 EV 결합의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12A는 gag-Rluc로 형질감염된 EXPI293FTM 세포 또는 형질감염되지 않은 세포로부터 수확된 PD-L1 및 PVR gD-GPI EV의 희석 시리즈에 대한 판독값으로서 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)(콜레스테롤)을 사용하여 검출된 콜레스테롤의 형광 및 레닐라 루시퍼라제 형광의 비교를 보여주는 산점도이다.
도 12B는 나열된 유전자들이 웰에 고정되고 PD-L1 gD-GPI EV를 사용하여 프로브된 소규모 RDIMIS 스크린에서 관찰된 레닐라 루시퍼라제 및 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)로부터 얻은 상대 신호 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 두 판독값에 대한 결과들을 각각의 PDCD1 신호로 정규화한다.
도 12C는 gag-Rluc를 발현하는 EV(x-축) 또는 형질감염되지 않은 세포로부터 수확된 소포(y-축)에 대한 판독값으로서 콜레스테롤을 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 나타내는 산점도이다.
도 13A는 gD 태그에 특이적인 항체(α-gD)로 염색된, 수용체 PVR, PD-L1, CD276, CD80 및 LRRC15의 전장(FL) 또는 gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인을 발현하는 EV들의 웨스턴 블롯을 나타내는 일련의 현미경 사진이다. α-액틴, α-PVR 및 α-LRRC15 염색도 도시되어 있다.
도 13B는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. 비오티닐화 PD-L1은 스트렙타비딘 BLI 바이오 센서와 함께 인큐베이션되었다. 그런 다음 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 발현하는 EV들과 함께 인큐베이션하고 BLI 신호(nm 단위)를 측정했다.
도 13C는 전장 또는 gD-GPI 태그가 있는 PD-L1을 일시적으로 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 포함하였다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다.
도 13D는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. 비오티닐화 PD-L1은 스트렙타비딘 BLI 바이오 센서와 함께 인큐베이션되었다. 이어서 이것은 서로 다른 농도의 Fc 태그가 있는 PD1 엑토도메인 또는 인간 IgG 대조군의 존재 또는 부재하에서 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 발현하는 EV와 함께 인큐베이션되었으며 BLI 신호(nm)가 측정되었다.
도 14A는 PVR gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14B는 PD-L1 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14C는 CD80 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14D는 CD276 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14E는 LRRC15 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14F는 전장 LRRC15를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 15는 높은 신뢰도의 상호작용들의 IgSF 상호작용체(Interactome)의 목록(1)(파란색 가장자리) 및 STRING으로부터 얻은 상호작용의 실험 및 데이터베이스 목록 (2)(빨간색 가장자리)와 함께 통합된 본원에서 식별된 일반 소포 결합제들을 보여주는 네트워크 다이어그램이다. 상자의 높이는 EV 모 세포 그리고 그리하여 EV 자체에서 잠재적인 결합 파트너의 발현을 추정하기 위해 The Cell Atlas(3)의 HEK293 세포에서 정규화된 발현 값을 나타낸다.
도 16A는 수행된 각각의 RDIMIS 스크린에 대한 상관관계 및 상관계수를 나타내는 산점도 세트이다. 스크린들은 여러 배치들(batches)에서 수행되었다. 1) PVR gD-GPI 반복 1, 2) PVR gD-GPI 반복 2 및 PD-L1 gD-GPI, 3) CD80 gD-GPI 및 CD26 gD-GPI, 4) LRRC15 gD-GPI, LRRC15 FL 및 PVR FL, 5) 과발현된 관심 수용체가 없는 EV인 소포 대조군.
도 16B는 CD80 gD-GPI와 PVR-FL 스크린 사이의 상관관계를 보여주는 일련의 산점도이다. 일반 소포 결합제들의 두 집단들이 표시된다. 하단 패널: x축 확대 보기. 오른쪽 패널: 일반 소포 결합제와의 상관 관계가 제거되었다.
도 17A는 막이 콜레스테롤 결합제 Filipin III으로 파괴된 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 LRRC15 gD-GPI EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17B는 막이 콜레스테롤 결합제 Filipin III으로 파괴된 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 전장 LRRC15 EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17C는 항-gD 항체에 대한 도 17A의 EV의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 17D는 막을 메틸-베타 시클로덱스트린(MβCD)으로 파괴한 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 LRRC15 gD-GPI EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17E는 막을 MβCD로 파괴한 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 전장 LRRC15 EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17F는 항-gD 항체에 대한 도 17D의 EV의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 18A는 세포에서 발현된 >500개의 다중 막관통 수용체에 대한 항체 표면 염색 수준(a.u.)을 보여주는 산점도 및 저발현 수용체(DRD2) 및 고발현 수용체(S1PR1)에 대한 대표적인 세포 표면 염색을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. 배경 염색은 선으로 표시된다.
도 18B는 N-말단 FLAG 태그와 C-말단 비너스(Venus)로 조작된 >400 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 비너스 태그의 형광(X축; 총 수용체(a.u.)) 및 항-FLAG 항체를 사용한 표면 염색 수준(a.u.)을 보여주는 산점도이다. 삽입된 이미지는 저발현 수용체(DRD2), 고발현 수용체(S1PR1), 및 매우 높게 발현된 단일 막관통 수용체(EGFR)에 대한 대표적인 세포 표면 염색(자홍색) 및 비너스 형광(녹색)을 보여주는 현미경 사진이다. 배경 염색은 형질감염되지 않은 세포에 대한 신호의 평균에 의해 결정되었고 선으로 표시된다.
도 18C는 다중 막관통(MTMR) 수용체 라이브러리의 1791개 구성원의 특징을 보여주는 원형 차트이다. >500개의 구성원만이 세포외 HIS 태그를 가지고 있으며, 이러한 수용체들의 약 절반만이 배경 위에 염색을 나타낸다.
도 18D는 낮은, 중간 및 높은 FLAG 염색 발현 수준을 갖는 도 18B의 GPCR의 비율을 나타내는 원형 차트이다. “중간” 수용체 발현은 배경 신호의 10배로 정의되었다.
도 19A는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 EGF-647의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. EGF-647은 EGFR에만 결합했으며, 이는 각 플레이트에 형질감염 대조군으로 프린트되었다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19B는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 RSPO3의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. RSPO3은 LGR4 및 LGR5에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19C는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 PVR의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군으로 추가되었던 단일 통과 막관통 수용체인 CD226에 결합했다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19D는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 PD-L1의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. PD-L1은 부착 G 단백질 결합 수용체 B1(ADGRB1)인 PVR, 뿐만 아니라 양성 대조군으로 추가되었던 단일 통과 막관통 수용체 PD1, PDL2, CD80 및 EPHA3에 결합했다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 20A는 태그가 있는 다중 통과 막관통 수용체를 포함하는 세포외 소포(EV)를 보여주는 개략도이다. 수용체의 세포 외 영역은 EV 외부에 있고 세포 내 영역은 EV의 내강에 있다. FLAG 태그와 형광 태그(Luc)의 위치가 표시된다.
도 20B는 EV를 보여주는 네거티브 염색 전자 현미경 이미지이다.
도 20C는 NanoSight 입자 추적을 사용하여 측정된, PVR 및 GAG로 형질감염된; PVR만으로 형질감염된; 또는 형질감염되지 않은(대조군) 세포들로부터의 EV의 크기 분포(nm) 및 농도(mL당 106개 입자)를 보여주는 그래프이다.
도 20D는 도 20C의 EV의 평균 크기(nm)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 20E는 PVR 및 GAG; PVR 단독; 또는 형질감염되지 않은 세포의 EV로 형질감염된 세포로부터 유래된 EV에 대한 항-gD 항체의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20F는 PVR 및 GAG; PVR 단독; 또는 형질감염되지 않은 세포의 EV로 형질감염된 세포로부터 유래된 EV에 대한 PVR 리간드 TIGIT(TIGIT Fc)의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20G는 G 단백질-결합 수용체(GPCR) ADGRB1, LGR4 및 LGR5를 포함하는 EV에 대한 항-FLAG 항체의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. GPCR은 N-말단 FLAG 태그를 포함하였다.
도 21A는 다중 막관통 수용체 라이브러리의 구성원 및 양성 대조군에 대한 PVR을 포함하는 EV의 결합(a.u.)에 대한 스크린의 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 GAG-neonGreen 융합으로부터의 소포 형광을 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 21B는 다중 막관통 수용체 라이브러리의 구성원 및 양성 대조군에 대한 PD-L1을 포함하는 EV의 결합(a.u.)에 대한 스크린의 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군 및 ADGRB1에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 GAG-neonGreen 융합으로부터의 소포 형광을 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 21C는 Fc-융합된 단일 막관통 수용체(STMR)의 세포외 도메인들을 포함하는 라이브러리의 구성원에 대한 ADGRB1의 결합(a.u.)에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. RTN4R 및 PD-L1과의 상호작용이 확인되었고 새로운 상호작용이 밝혀졌다.
도 22A는 ADGRB1 또는 LGR4를 포함하는 EV에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc, ICOSLG-Fc, 및 RTN4R-Fc(각각 단백질 A 플레이트에 접합됨)의 결합의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다.
도 22B는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc, ICOSLG-Fc 및 RTN4R-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다.
도 23은 GPCR 스크리닝 플랫폼의 설계를 보여주는 개략도이다. 포괄적인 라이브러리는 384웰 플레이트 형식으로 수집된다. 포괄적인 과발현 플라스미드들의 집합체가 384웰 이미징 플레이트에 프린트된다. 세포를 역 형질감염시킨 다음, 형광 리간드로 처리하고 고처리량, 고함량 이미저에서 분석한다.
도 24A는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 24B는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 ICOSLG-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 24C는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 RTN4R-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 25A는 HEK 세포에서 β어레스틴 및 SH2 동원에 대한 생물발광 에너지 전달(BRET) 분석 결과를 보여주는 그래프이다. PD-L1에 반응하는 어떠한 ADGRB1 또는 EphA3의 활성화도 관찰되지 않았다.
도 25B는 HEK 세포 처리 후 칼슘 감지(GCaMP6s 형광)를 보여주는 그래프이다. PD-L1에 반응하는 어떠한 반응도 ADGRB1 또는 EphA3의 다운스트림에서 관찰되지 않았다.
도 25C는 HEK 세포 처리 후 cAMP 자극(GLOSENSOR™에 의해 평가됨)을 보여주는 그래프이다. 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 25D는 HEK 세포 처리 후 cAMP 억제를 보여주는 그래프이다. 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 26A는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 ADGRB1을 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다.
도 26B는 Fc에 융합된 단일 막관통 수용체의 세포외 도메인들을 포함하는 라이브러리(STM 라이브러리)의 구성원에 대한 ADGRB1을 포함하는 EV들의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. RTN4R 및 PD-L1에 대한 결합이 확인되었고, 새로운 상호작용이 확인되었다. 새로운 히트들이 표지된다.
도 26B는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 LGR4를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다.
도 26D는 STM 라이브러리의 구성원에 대한 LGR4를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(RSPO3)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다.
도 26E는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 LGR5를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다.
도 26F는 STM 라이브러리의 구성원에 대한 LGR5를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다. 공유된 LGR4 및 LGR5 히트들은 파란색으로 표시된다.
도 27은 카르복시펩티다제 M(CPM) 활성 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다. CPM-FL: 전장 CPM을 포함하는 소포. CPMgD: gD-GPI(gD) CPM을 포함하는 소포. pRK EV: 벡터 대조군; PBS 단독: 완충액 대조군.
도 28은 전장 EPHA3(EPHA3-FL) 및 PDL1-Fc, EPHA3-Fc, EPHA3 리간드 EFNA1-Fc 및 EFNA5-Fc, 및 전장 PDL1을 포함하는 EV에서 검출된 총 EPHA3 및 인산화 EPHA3 종들(pEPHA2/3/4 and pEPHA3/4/5)의 수준을 보여주는 한 쌍의 웨스턴 블롯을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. pRK EV: 벡터 대조군.
도 1A는 세포 배양물로부터 수용체-발현 세포외 소포(EV)의 단리를 보여주는 개략도이다. EXPI293FTM 세포는 관심 수용체를 인코딩하는 플라스미드와 레닐라 루시퍼라제(Rluc)에 융합된 HIV gag 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염되었다. 세포 및 파편들은 원심분리 및 여과에 의해 EV 함유 상층액으로부터 분리되었다. 50% 수크로스 쿠션을 사용하여 소형 단백질 응집체들을 제거하고 소형 소포들을 단리했다.
도 1B는 수크로스 쿠션 단계 존재시(오른쪽 패널) 및 부재시(왼쪽 패널) 제조된 EV들을 보여주는 일련의 네거티브 염색 전자 현미경 사진이다. EV 제제는 전자 현미경 검사 전에 동일한 단백질 농도로 희석되었다. 화살표는 샘플의 대표적인 EV를 가리킨다.
도 1C는 나노입자 추적 분석을 사용하여 측정된, 전장(FL) PVR 단백질(왼쪽 패널) 또는 PVR 엑토도메인, 당단백질 D(gD) 태그 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 링커(gD-GPI)(오른쪽 패널)을 포함하는 단백질을 운반하는 EV의 크기 분포(nm 단위)를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 5개의 복제본이 각 그래프에 표시된다. 검은색 선은 평균을 나타내고; 회색 선은 평균의 표준 오차를 나타낸다. EV의 크기는 일관되게 약 120nm이다.
도 2A는 세포의 원형질막 및 EV 막에 포매된 막관통 단백질을 보여주는 다이어그램이다.
도 2B는 EV-발현 수용체에 대한 2가지 실험 설정을 보여주는 다이어그램이다. 왼쪽: 세포막과 EV 막에 포매된 HIV gag 단백질 및 전장 막관통 수용체. 오른쪽: 세포막과 EV 막에 포매된 HIV 개그 단백질 및 gD-GPI 태그를 포함하는 지질-고정된 엑토도메인.
도 2C는 나노입자 추적 분석을 사용하여 측정된, HIV gag 단백질로 형질전환되어 있는 모 세포(Gag 있음) 및 형질전환되지 않은 대조군 세포(Gag 없음)에 의해 생성된 20-500 nm 크기 범위의 EV의 입자 수를 보여주는 그래프이다.
도 2D는 Rluc에 융합된 HIV gag 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 형질전환되었던 모 세포로부터 생산된 EV 제제의 3배 희석 시리즈에서 Rluc의 발광 신호를 보여주는 그래프이다.
도 2E는 PVR 리간드를 발현하는 포유동물 세포의 표면에 결합된 전장 PVR을 발현하는 EV를 보여주는 개략도 및 명시된 전장 PVR 리간드를 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다.
도 2F는 PVR 리간드를 발현하는 포유동물 세포의 표면에 결합된 gD-GPI 태그가 있는 PVR 엑토도메인을 발현하는 EV를 보여주는 개략도 및 명시된 전장 PVR 리간드를 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다. 스케일 바는 20μm이다.
도 2G는 생물층 간섭계(BLI) 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. CD226-Fc 또는 대조군 인간 IgG를 센서에 부착했다. 센서를 전장(FL) PVR 또는 gD-GPI PVR 엑토도메인 또는 단량체 PVR 단백질(PVR 단량체)를 발현하는 EV를 포함하는 용액에 담그고 BLI 신호(nm 단위)를 측정했다. 오른쪽 패널은 0nm 이상의 신호를 확대한 것이다.
도 3A는 RDIMIS(Receptor-Display In Membranes Interaction Screen) 프로토콜의 흐름도를 보여주는 개략도이다. EV는 gag-luc와 함께 관심 수용체를 발현하는 세포들의 조건화된 배지로부터 단리된다. Fc-태그가 있는 엑토도메인(ECD-Fc)으로 표현되는 단일 통과 막관통(STM) 단백질들의 라이브러리가 플레이트에 고정된다. 수용체-EV는 반자동 워크플로우를 사용하여 플레이트-결합된 STM 단백질들의 집합체에 대해 스크리닝된다. 라이브러리에서 상호작용하는 엑토도메인에 대한 EV 결합은 발광을 사용하여 검출된다.
도 3B는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 2회의 독립적인 RDIMIS 스크린(반복 1 및 반복 2) 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다.
도 3C는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트(도 3B의 반복 2) 및 전장(FL) PVR EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다.
도 4A는 태그가 없는 전장 수용체 PD1, PD-L1, EPHA3, CD248, LRRC15, PVR 또는 PVRL1을 발현하고 이들 수용체에 특이적인 항체로 염색된 전 세포 용해물(세포) 또는 EV의 웨스턴 블롯을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 항-튜불린(α-Tub) 및 항-액틴(α-Actin) 염색이 대조군으로 제공된다.
도 4B는 명시된 gD-GPI 태그가 있는 수용체 엑토도메인을 발현하고 gD 태그에 특이적인 항체(α-gD)로 염색된 전 세포 용해물 또는 EV의 웨스턴 블롯을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 항-튜불린(α-Tub) 및 항-액틴(α-Actin) 염색이 대조군으로 제공된다.
도 4C는 gD-GPI 발현 소포들의 선택적 항-gD 면역골드 표지법을 보여주는 일련의 네거티브 염색 전자현미경 사진이다.
도 4D는 생물층 간섭계 실험의 설계 및 결과를 보여주는 그래프이다. 항-gD 항체가 센서에 부착되었다. 센서는 명시된 gD-GPI 엑토도메인을 발현하는 EV와 함께 인큐베이션되었으며 BLI 신호(nm 단위)가 측정되었다.
도 5A는 PVR gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트 및 PD-L1 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 스크린들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제와 수용체 특이적 히트들(두 축 근처)을 구별하기 위해 서로에 대해 플롯된다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 5B는 CD80 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트 및 CD276 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 수용체 특이적 히트들은 축 근처에 있다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 5C는 본 연구에서 PVR, PD-L1, CD80 및 CD276에 대해 식별된 결합 파트너와 STRING, Bioplex 및 Biogrid 데이터베이스에 나열된 상호작용 사이의 중첩을 나타내는 일련의 다이어그램이다. PD-L1/CD274의 경우, Bioplex 데이터베이스에 STM 라이브러리 구성원과의 상호 작용이 없었다. 어떠한 실험적으로 검증된 상호작용도 CD276/B7-H3에 대한 STRING에 나열되지 않았다.
도 6A는 LRRC15 엑토도메인 5량체와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AVEXIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. LRRC15 5량체 결합은 CD248 엑토도메인(강조 표시됨)을 포함하는 웰에서 배경 이상에서 관찰되지 않았다. 회색 점은 스톡 5량체가 첨가되었지만 세척되지 않은 각 플레이트의 양성 대조군 웰을 나타낸다.
도 6B는 EV에서 LRRC15 전장(FL) 또는 gD-GPI 엑토도메인을 사용하여 본원에서 식별된 히트와 Bioplex 및 Biogrid 데이터베이스에 나타난 히트 사이의 비교를 보여주는 일련의 다이어그램이다. 해당 라이브러리에서 LRRC15와 STM 단백질 사이의 실험적 증거가 있는 어떠한 상호작용도 STRING 데이터베이스에 표시되지 않았다.
도 7A는 LRRC15 gD-GPI EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 결과를 도 3C에 도시된 PVR 스크린 결과와 비교한다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 7B는 LRRC15 전장 EV와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 RDIMIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. 결과를 도 3C에 도시된 PVR 스크린 결과와 비교한다. 신호가 각 개별 스크린에 대해 98% 분위수 이상이고 특정 스크린에서 적어도 4배 강화가 있는 히트들이 표지된다. 다른 히트들은 스크린 간 공통인 일반 소포 결합제로서 식별된다.
도 8A는 두경부 편평 세포 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다. 각 포인트는 하나의 환자 샘플을 나타낸다. 스피어먼 순위 상관 계수와 유의성 값은 오른쪽 상단에 제공된다.
도 8B는 유방 침윤성 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다. 각 포인트는 하나의 환자 샘플을 나타낸다. 스피어먼 순위 상관 계수와 유의성 값은 오른쪽 상단에 제공된다.
도 8C는 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 얻은 비종양 세포들을 보여주는 한 쌍의 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 차원 축소 플롯이다. 세포는 명시된 마커 유전자(왼쪽; LRRC15; 오른쪽: CD248)들의 발현 수준 별로 음영 처리된다.
도 9A는 췌관 선암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다(The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터).
도 9B는 요로상피성 방광 암종에 대한 LRRC15(x축) 및 CD248(y축)의 벌크 RNA-seq 발현 수준(백만분의 일 당 전사체(TPM))을 나타내는 산점도이다(The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터).
도 9C는 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 얻은 비종양 세포들을 보여주는 한 쌍의 UMAP 차원 축소 플롯이다. 세포는 명시된 마커 유전자(왼쪽, DCN 암 관련 섬유모세포, 오른쪽: RGS5 암 관련 혈관주위세포 마커)의 발현 수준에 따라 음영 처리된다.
도 10A는 CD248 엑토도메인 5량체와 STM 단백질 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AVEXIS 스크린 테스트의 결과를 보여주는 산점도이다. CD248 5량체 결합은 LRRC15 엑토도메인(강조 표시됨)을 포함하는 웰에서 배경 이상에서 관찰되지 않았다. 회색 점은 스톡 5량체가 첨가되었지만 세척되지 않은 각 플레이트의 양성 대조군 웰을 나타낸다.
도 10BA는 LRRC15-Fc를 SPR 칩 상의 단백질 A에 캡처시키고 명시된 분석물들을 첨가한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 결과를 보여주는 그래프이다. LRRC15는 5μg/mL(빨간색 및 녹색 선) 또는 50μg/mL 농도로 로드되었다. 분석물은 400nM 농도로 로드되었다.
도 11A는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. CD248은 재조합 단백질로 발현되어 센서에 고정되었다. 센서를 LRRC15-Fc(500nM) 또는 LRRC15 전장 또는 gD-GPI LRRC15(0.25mg/ml)를 포함하는 EV를 포함하는 용액과 접촉시키고, BLI 신호(nm 단위)를 측정하였다.
도 11B는 전장 CD248 또는 gD-GPI CD248을 일시적으로 발현하는 세포에 대한, gag-NeonGreen 및 전장(FL) LRRC15, gD-GPI LRRC15(LRRC15-gD), 또는 빈 벡터 대조군을 포함하는 EV의 결합을 나타내는 개략도 및 현미경 사진 세트이다.
도 11C는 전장 LRRC15 또는 gD-GPI LRRC15를 일시적으로 발현하는 세포에 대한 (사량체화된 재조합 엑토도메인으로서) CD248 또는 빈 벡터 대조군의 결합을 나타내는 개략도 및 일련의 현미경 사진이다. 스케일 바는 20μm를 나타낸다.
도 11D는 NeonGreen 신호 수준(3회의 독립적인 반복실험에 대한 평균 ± 표준 오차)에 기초한 도 11B의 EV 결합의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12A는 gag-Rluc로 형질감염된 EXPI293FTM 세포 또는 형질감염되지 않은 세포로부터 수확된 PD-L1 및 PVR gD-GPI EV의 희석 시리즈에 대한 판독값으로서 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)(콜레스테롤)을 사용하여 검출된 콜레스테롤의 형광 및 레닐라 루시퍼라제 형광의 비교를 보여주는 산점도이다.
도 12B는 나열된 유전자들이 웰에 고정되고 PD-L1 gD-GPI EV를 사용하여 프로브된 소규모 RDIMIS 스크린에서 관찰된 레닐라 루시퍼라제 및 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)로부터 얻은 상대 신호 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 두 판독값에 대한 결과들을 각각의 PDCD1 신호로 정규화한다.
도 12C는 gag-Rluc를 발현하는 EV(x-축) 또는 형질감염되지 않은 세포로부터 수확된 소포(y-축)에 대한 판독값으로서 콜레스테롤을 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 나타내는 산점도이다.
도 13A는 gD 태그에 특이적인 항체(α-gD)로 염색된, 수용체 PVR, PD-L1, CD276, CD80 및 LRRC15의 전장(FL) 또는 gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인을 발현하는 EV들의 웨스턴 블롯을 나타내는 일련의 현미경 사진이다. α-액틴, α-PVR 및 α-LRRC15 염색도 도시되어 있다.
도 13B는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. 비오티닐화 PD-L1은 스트렙타비딘 BLI 바이오 센서와 함께 인큐베이션되었다. 그런 다음 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 발현하는 EV들과 함께 인큐베이션하고 BLI 신호(nm 단위)를 측정했다.
도 13C는 전장 또는 gD-GPI 태그가 있는 PD-L1을 일시적으로 발현하는 세포들의 표면에 결합된 EV를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. EV는 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 포함하였다. EV는 gag-NeonGreen을 포함되며 녹색은 EV의 직접적인 형광을 나타낸다. 포유동물 세포의 DNA는 파란색으로 나타낸다.
도 13D는 BLI 실험의 설계 및 결과를 보여주는 개략도 및 그래프이다. 비오티닐화 PD-L1은 스트렙타비딘 BLI 바이오 센서와 함께 인큐베이션되었다. 이어서 이것은 서로 다른 농도의 Fc 태그가 있는 PD1 엑토도메인 또는 인간 IgG 대조군의 존재 또는 부재하에서 전장 또는 gD-GPI LRTM1 또는 벡터 대조군을 발현하는 EV와 함께 인큐베이션되었으며 BLI 신호(nm)가 측정되었다.
도 14A는 PVR gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14B는 PD-L1 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14C는 CD80 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14D는 CD276 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14E는 LRRC15 gD-GPI를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 14F는 전장 LRRC15를 포함하는 EV(Y축)를 사용하여 수행된 RDIMIS 스크린의 결과를 벡터 대조군으로 형질감염된 세포로부터 유래한 “빈” EV(X축)와 비교하여 보여주는 산점도이다.
도 15는 높은 신뢰도의 상호작용들의 IgSF 상호작용체(Interactome)의 목록(1)(파란색 가장자리) 및 STRING으로부터 얻은 상호작용의 실험 및 데이터베이스 목록 (2)(빨간색 가장자리)와 함께 통합된 본원에서 식별된 일반 소포 결합제들을 보여주는 네트워크 다이어그램이다. 상자의 높이는 EV 모 세포 그리고 그리하여 EV 자체에서 잠재적인 결합 파트너의 발현을 추정하기 위해 The Cell Atlas(3)의 HEK293 세포에서 정규화된 발현 값을 나타낸다.
도 16A는 수행된 각각의 RDIMIS 스크린에 대한 상관관계 및 상관계수를 나타내는 산점도 세트이다. 스크린들은 여러 배치들(batches)에서 수행되었다. 1) PVR gD-GPI 반복 1, 2) PVR gD-GPI 반복 2 및 PD-L1 gD-GPI, 3) CD80 gD-GPI 및 CD26 gD-GPI, 4) LRRC15 gD-GPI, LRRC15 FL 및 PVR FL, 5) 과발현된 관심 수용체가 없는 EV인 소포 대조군.
도 16B는 CD80 gD-GPI와 PVR-FL 스크린 사이의 상관관계를 보여주는 일련의 산점도이다. 일반 소포 결합제들의 두 집단들이 표시된다. 하단 패널: x축 확대 보기. 오른쪽 패널: 일반 소포 결합제와의 상관 관계가 제거되었다.
도 17A는 막이 콜레스테롤 결합제 Filipin III으로 파괴된 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 LRRC15 gD-GPI EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17B는 막이 콜레스테롤 결합제 Filipin III으로 파괴된 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 전장 LRRC15 EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17C는 항-gD 항체에 대한 도 17A의 EV의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 17D는 막을 메틸-베타 시클로덱스트린(MβCD)으로 파괴한 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 LRRC15 gD-GPI EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17E는 막을 MβCD로 파괴한 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. CD248 단량체를 NiNTA 바이오센서에 로딩하고 필리핀 III으로 실온에서 30분 동안 전처리한 전장 LRRC15 EV와 함께 인큐베이션했다. 빈 소포 또는 필리핀 III은 음성 대조군으로 표시된다.
도 17F는 항-gD 항체에 대한 도 17D의 EV의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 18A는 세포에서 발현된 >500개의 다중 막관통 수용체에 대한 항체 표면 염색 수준(a.u.)을 보여주는 산점도 및 저발현 수용체(DRD2) 및 고발현 수용체(S1PR1)에 대한 대표적인 세포 표면 염색을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. 배경 염색은 선으로 표시된다.
도 18B는 N-말단 FLAG 태그와 C-말단 비너스(Venus)로 조작된 >400 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 비너스 태그의 형광(X축; 총 수용체(a.u.)) 및 항-FLAG 항체를 사용한 표면 염색 수준(a.u.)을 보여주는 산점도이다. 삽입된 이미지는 저발현 수용체(DRD2), 고발현 수용체(S1PR1), 및 매우 높게 발현된 단일 막관통 수용체(EGFR)에 대한 대표적인 세포 표면 염색(자홍색) 및 비너스 형광(녹색)을 보여주는 현미경 사진이다. 배경 염색은 형질감염되지 않은 세포에 대한 신호의 평균에 의해 결정되었고 선으로 표시된다.
도 18C는 다중 막관통(MTMR) 수용체 라이브러리의 1791개 구성원의 특징을 보여주는 원형 차트이다. >500개의 구성원만이 세포외 HIS 태그를 가지고 있으며, 이러한 수용체들의 약 절반만이 배경 위에 염색을 나타낸다.
도 18D는 낮은, 중간 및 높은 FLAG 염색 발현 수준을 갖는 도 18B의 GPCR의 비율을 나타내는 원형 차트이다. “중간” 수용체 발현은 배경 신호의 10배로 정의되었다.
도 19A는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 EGF-647의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. EGF-647은 EGFR에만 결합했으며, 이는 각 플레이트에 형질감염 대조군으로 프린트되었다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19B는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 RSPO3의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. RSPO3은 LGR4 및 LGR5에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19C는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 PVR의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군으로 추가되었던 단일 통과 막관통 수용체인 CD226에 결합했다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 19D는 다중-막관통 수용체 라이브러리의 구성원에 대한 PD-L1의 결합(a.u.)에 대한 스크리닝 결과를 보여주는 산점도이다. PD-L1은 부착 G 단백질 결합 수용체 B1(ADGRB1)인 PVR, 뿐만 아니라 양성 대조군으로 추가되었던 단일 통과 막관통 수용체 PD1, PDL2, CD80 및 EPHA3에 결합했다. 삽입된 패널은 형광 리간드를 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 20A는 태그가 있는 다중 통과 막관통 수용체를 포함하는 세포외 소포(EV)를 보여주는 개략도이다. 수용체의 세포 외 영역은 EV 외부에 있고 세포 내 영역은 EV의 내강에 있다. FLAG 태그와 형광 태그(Luc)의 위치가 표시된다.
도 20B는 EV를 보여주는 네거티브 염색 전자 현미경 이미지이다.
도 20C는 NanoSight 입자 추적을 사용하여 측정된, PVR 및 GAG로 형질감염된; PVR만으로 형질감염된; 또는 형질감염되지 않은(대조군) 세포들로부터의 EV의 크기 분포(nm) 및 농도(mL당 106개 입자)를 보여주는 그래프이다.
도 20D는 도 20C의 EV의 평균 크기(nm)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 20E는 PVR 및 GAG; PVR 단독; 또는 형질감염되지 않은 세포의 EV로 형질감염된 세포로부터 유래된 EV에 대한 항-gD 항체의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20F는 PVR 및 GAG; PVR 단독; 또는 형질감염되지 않은 세포의 EV로 형질감염된 세포로부터 유래된 EV에 대한 PVR 리간드 TIGIT(TIGIT Fc)의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20G는 G 단백질-결합 수용체(GPCR) ADGRB1, LGR4 및 LGR5를 포함하는 EV에 대한 항-FLAG 항체의 결합을 평가하는 BLI 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. GPCR은 N-말단 FLAG 태그를 포함하였다.
도 21A는 다중 막관통 수용체 라이브러리의 구성원 및 양성 대조군에 대한 PVR을 포함하는 EV의 결합(a.u.)에 대한 스크린의 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 GAG-neonGreen 융합으로부터의 소포 형광을 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 21B는 다중 막관통 수용체 라이브러리의 구성원 및 양성 대조군에 대한 PD-L1을 포함하는 EV의 결합(a.u.)에 대한 스크린의 결과를 보여주는 산점도이다. PVR은 양성 대조군 및 ADGRB1에 결합하였다. 이미징 아티팩트는 X로 표시된다. 삽입된 패널은 GAG-neonGreen 융합으로부터의 소포 형광을 보여주는 현미경 사진이다. DAPI 염색이 표시된다.
도 21C는 Fc-융합된 단일 막관통 수용체(STMR)의 세포외 도메인들을 포함하는 라이브러리의 구성원에 대한 ADGRB1의 결합(a.u.)에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. RTN4R 및 PD-L1과의 상호작용이 확인되었고 새로운 상호작용이 밝혀졌다.
도 22A는 ADGRB1 또는 LGR4를 포함하는 EV에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc, ICOSLG-Fc, 및 RTN4R-Fc(각각 단백질 A 플레이트에 접합됨)의 결합의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다.
도 22B는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc, ICOSLG-Fc 및 RTN4R-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다.
도 23은 GPCR 스크리닝 플랫폼의 설계를 보여주는 개략도이다. 포괄적인 라이브러리는 384웰 플레이트 형식으로 수집된다. 포괄적인 과발현 플라스미드들의 집합체가 384웰 이미징 플레이트에 프린트된다. 세포를 역 형질감염시킨 다음, 형광 리간드로 처리하고 고처리량, 고함량 이미저에서 분석한다.
도 24A는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 PD-L1-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 24B는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 ICOSLG-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 24C는 비너스에 융합된 ADGRB1을 발현하는 HEK 세포에 대한 재조합 단백질 RTN4R-Fc의 결합에 대한 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 병합된 이미지에서, DAPI는 파란색으로 표시되고; ADGRB1 융합 단백질의 비너스 신호는 녹색으로 표시되고; Fc 태그의 염색에 대한 신호는 자홍색으로 표시된다. 공동 국소화된 녹색 및 자홍색 신호는 흰색으로 표시된다. 모든 대비 및 밝기 설정은 도 22B와 일치한다.
도 25A는 HEK 세포에서 β어레스틴 및 SH2 동원에 대한 생물발광 에너지 전달(BRET) 분석 결과를 보여주는 그래프이다. PD-L1에 반응하는 어떠한 ADGRB1 또는 EphA3의 활성화도 관찰되지 않았다.
도 25B는 HEK 세포 처리 후 칼슘 감지(GCaMP6s 형광)를 보여주는 그래프이다. PD-L1에 반응하는 어떠한 반응도 ADGRB1 또는 EphA3의 다운스트림에서 관찰되지 않았다.
도 25C는 HEK 세포 처리 후 cAMP 자극(GLOSENSOR™에 의해 평가됨)을 보여주는 그래프이다. 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 25D는 HEK 세포 처리 후 cAMP 억제를 보여주는 그래프이다. 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 26A는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 ADGRB1을 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다.
도 26B는 Fc에 융합된 단일 막관통 수용체의 세포외 도메인들을 포함하는 라이브러리(STM 라이브러리)의 구성원에 대한 ADGRB1을 포함하는 EV들의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. RTN4R 및 PD-L1에 대한 결합이 확인되었고, 새로운 상호작용이 확인되었다. 새로운 히트들이 표지된다.
도 26B는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 LGR4를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다.
도 26D는 STM 라이브러리의 구성원에 대한 LGR4를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(RSPO3)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다.
도 26E는 분비 단백질 Fc 라이브러리의 구성원에 대한 LGR5를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다.
도 26F는 STM 라이브러리의 구성원에 대한 LGR5를 포함하는 EV의 결합에 대한 스크린 결과를 보여주는 산점도이다. 양성 대조군(항-FLAG 항체)이 표지된다. 새로운 히트들은 녹색으로 표시된다. 공유된 LGR4 및 LGR5 히트들은 파란색으로 표시된다.
도 27은 카르복시펩티다제 M(CPM) 활성 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다. CPM-FL: 전장 CPM을 포함하는 소포. CPMgD: gD-GPI(gD) CPM을 포함하는 소포. pRK EV: 벡터 대조군; PBS 단독: 완충액 대조군.
도 28은 전장 EPHA3(EPHA3-FL) 및 PDL1-Fc, EPHA3-Fc, EPHA3 리간드 EFNA1-Fc 및 EFNA5-Fc, 및 전장 PDL1을 포함하는 EV에서 검출된 총 EPHA3 및 인산화 EPHA3 종들(pEPHA2/3/4 and pEPHA3/4/5)의 수준을 보여주는 한 쌍의 웨스턴 블롯을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. pRK EV: 벡터 대조군.
발명의 상세한 설명
I.
정의
본원에서 사용되는, “생물학적 소포” 또는 “BV”라는 용어는 친세포, 예를 들어 포유동물 세포로부터 자연적으로 분비되는 지질 이중층-구분된 입자를 의미한다. BV는, 예를 들어, 세포외 소포(EV; 나노미터 크기의 입자, 예를 들어, 재조합 세포외 소포(rEV)), 엑소솜, 미세소포 또는 바이러스 유사 입자(VLP)일 수 있다. VLP는 예를 들어, Titeca 외, Nature Protocols, 12(5): 881-898, 2017에 기술되어 있다. BV 조성물 또는 제제는 EV, 엑소좀, 미세소포 또는 VLP 중 하나만을 포함할 수 있거나, EV, 엑소좀, 미세소포 및 VLP 중 2개, 3개 또는 4개 모두의 혼합물을 포함할 수 있다. BV는 모 세포의 내인성 기관(endogenous machinery)을 사용하여 폴딩되고 이들의 고유 막에 삽입된 단백질들을 포함한다. 일부 양상에서, BV는 모세포에 고유하지 않은 단백질, 예를 들어, 이를 발현하도록 모세포가 변형되어 있는 단백질(예를 들어, 이종 막-결합 단백질, 예를 들어, 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질)을 포함한다. 모 세포에 의한 BV의 생산은 모 세포를 막 출아제와 접촉시키고(예를 들어, 세포를 막 출아제, 예를 들어, HIV gag 단백질로 형질전환시킴) 및/또는 세포를 BV 형성을 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 증가될 수 있다. 일부 양상에서, BV는 모 세포로부터 정제된다(예를 들어, 모 세포를 포함하는 배양 배지로부터 정제됨).
본원에서 사용되는 용어 “막 출아제”는 모 세포에 의한 BV(예를 들어, 세포외 소포(EV), 엑소솜, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 제제를 지칭한다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 서열번호 1에 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 모 세포는 막 출아제로 형질전환된다. 세포는 추가적으로 또는 대안적으로 모 세포에 의해 BV(예: 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 조건(예: 배양 조건)에 노출될 수 있다. 막-출아제의 추가 예는 자가 조립 VLP(예를 들어, MLGag, AARDC1(예를 들어, hAARDC1) 및 Acyl.Hrs); 엑소좀 또는 종양 경로와 같은 내인성 소포 형성 경로를 향상시키는 제제(예를 들어, RhoA.F3OL, ARF6.Q67L, VPS4a, HAS3, CD9, CD63 및 CD81); 및 세포사멸체와 관련된 인자(예를 들어, 항시적으로 활성인 ROCK1)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 “약”은 기술 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원의 값 또는 매개변수에 대한 “약”의 지칭은 그 값 또는 매개변수 그 자체(per se)에 관한 양상들을 포함 (및 설명)한다.
본원에서 사용되는 용어 “단일 막관통 수용체”, “단일-통과 막관통 수용체” 또는 “STM 수용체”는 단일 막관통 도메인을 갖는 단백질을 지칭한다. 일부 양상에서, STM 수용체는 세포 표면에서 발현된다. 예시적인 STM 수용체는 표 4, 뿐만 아니라 PCT/US2020/025471, Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018, 및 Clark 외, Genome Res, 13: 2265-2270, 2003에 제공되어 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 양상에서, STM 단백질은 UniProt 주석 “류신-풍부”, “시스테인-풍부”, “ITIM/ITAM”(면역수용체 티로신 기반 억제 모티프/면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프), “TNFR”(종양 괴사 인자 수용체), “TLR/ILR”(톨 유사 수용체/인터루킨 수용체), “세마포린”, “키나제 유사”, “Ig 유사”(면역 글로불린 유사), “피브로넥틴”, “에프린”, “ EGF”, “사이토카인R” 또는 “카드헤린”을 가진다. STM 수용체는, 예를 들어, 아미노산 서열에서 신호 펩티드의 존재 또는 예측된 막관통 영역에 기초하여 식별될 수 있다. 일부 양상에서, STM 수용체는 세포외 도메인으로 발현된다.
본원에서 사용되는 용어 “세포외 도메인” 또는 “ECD”는 세포의 외부 원형질막 외부에 위치하는 것으로 예측되는 단백질 도메인을 지칭한다. 일부 경우에, ECD는 STM 수용체와 같은 수용체의 ECD이다. 일부 양상에서, ECD는 IgSF 단백질의 ECD이다. 일부 양상에서, ECD는 PDPN의 ECD이다. 일부 양상에서, 세포외 도메인의 경계는 단백질이 원형질막을 가로지르는 것을 나타내는 도메인, 예를 들어, 막관통 도메인(예를 들어, 막관통 나선)의 예측에 의해 식별될 수 있다. 일부 양상에서, 세포외 도메인의 존재는 단백질이 원형질막으로 트래피킹됨을 나타내는 도메인, 서열 또는 모티프, 예를 들어, 신호 서열 또는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 연결 부위의 존재에 의해 예측될 수 있다. 일부 양상에서, ECD의 경계는 UniProt 주석에 따라 결정된다. 일부 양상에서, ECD는 가용성이다. 일부 양상에서, 세포외 도메인은 전장 단백질과 관련하여 발현된다. 다른 양상에서, 세포외 도메인은 단리된 세포외 도메인, 예를 들어, 세포외에 존재하는 것으로 예측되는 단백질의 아미노산 잔기만을 포함하는 아미노산 잔기들의 서열로서 발현된다.
일부 양상에서, 단리된 ECD는 융합 단백질에 포함된다. 일부 양상에서, 융합 단백질에 포함되면 ECD의 용해도, 발현 용이성, 캡처 용이성(예: 단백질 A-코팅 플레이트에서), 다량체화 또는 일부 다른 바람직한 특성이 증가한다. 일부 양상에서, ECD 또는 ECD 융합 단백질은 단량체이다. 다른 양상에서, ECD 또는 ECD 융합 단백질은 다량체, 예를 들어 사량체 또는 오량체이다. 일부 양상에서, ECD는 인간 IgG에 융합된다. 일부 양상에서, ECD는 인간 Fc 태그에 융합된다. 일부 양상에서, ECD는 결합력 AVITAG™(Avi 태그)에 융합된다. 일부 양상에서, ECD는 폴리히스티딘(His) 태그에 융합된다. 일부 양상에서, ECD는 당단백질 D(gD) 태그 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 링커, 예를 들어, gD-GPI 태그에 융합된다. 다른 양상에서, ECD는 예를 들어, Bushell 외, Genome Res, 18: 622-630, 2008에 기재된 바와 같은 래트 연골 올리고머 기질 단백질(COMP) 및 β락타마제 단백질의 오량체화 도메인에 융합된다. 일부 양상에서, ECD 융합 단백질은 하나 이상의 도메인을 제거할 수 있도록 하기 위해, 절단 서열, 예를 들어, TEV 절단 서열을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 절단 서열에서 절단 가능한 Fc 태그 및 Avi 태그를 갖는 ECD 융합 단백질은 추가 가공되어, Fc 태그를 제거하고, Avi 태그를 비오티닐화하고, 비오티닐화된 ECD 융합 단백질을 형광 스트렙타비딘(SA)에 융합하여, 예를 들어, 사량체화된 ECD 융합 단백질을 형성한다. 일부 예에서, 단리된 ECD 또는 ECD 융합 단백질은 정제된다.
본원에서 사용되는 “조절인자”는 주어진 생물학적 활성, 예를 들어, 상호작용 또는 상호작용으로부터 발생하는 다운스트림 활성을 조절(예를 들어, 증가, 감소, 활성화 또는 억제)하는 제제이다. 조절인자 또는 후보 조절인자는, 예를 들어, 소분자, 항체, 항원-결합 단편(예를 들어, 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인), 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)일 수 있다.
“증가하다” 또는 “활성화하다”는 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체 증가를 유발하는 능력을 의미한다. 특정 양상에서, 증가 또는 활성화는 단백질-단백질 상호작용의 다운스트림 활성을 지칭할 수 있다.
“감소하다” 또는 “억제하다”는 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 75%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 특정 양상에서, 감소 또는 억제는 단백질-단백질 상호작용의 다운스트림 활성을 지칭할 수 있다.
“친화도”는 분자(예를 들어, 수용체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총합 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않은 한, 본원에 기재된 “결합 친화도”는 결합쌍(예를 들면, 수용체 및 리간드)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다.
본원에 사용된 “복합체” 또는 “복합체를 형성한”은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘(예를 들어, 반 데르 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자의 결합을 지칭한다. 한 양상에서, 복합체는 이종다량체이다. 본원에 사용된 용어 “단백질 복합체” 또는 폴리펩티드 복합체”는 단백질 복합체 (예를 들어, 화학적 분자, 예를 들어, 독소 또는 검출제를 포함, 그러나 이에 제한되지 않음)에서 단백질에 접합된 비-단백질 엔터티를 가지는 복합체를 포함한다.
“모 세포”라는 용어는 BV가 생산되는 세포를 지칭한다. 모 세포는 이러한 세포의 자손을 비롯하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 포함한다. 모 세포는 “형질감염된 세포”, “형질전환된 세포” 및 “형질전환체”를 포함하며, 이는 계대의 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 일부 양상에서, 모 세포는 외인성 핵산으로 안정적으로 형질전환된다. 다른 양상에서, 모 세포는 외인성 핵산으로 일시적으로 형질전환된다.
본원에서 사용된 용어 “류신-풍부 반복부-함유 단백질 15” 또는 “LRRC15”는 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터의 임의의 천연 LRRC15를 광범위하게 지칭한다. 그렇지 않으면 표시된다. 이 용어는 전장 LRRC15 및 LRRC15의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, LRRC15 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 LRRC15의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 LRRC15의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 제 Q8TF66에 제시된다. 사소한 서열 변이, 특히, LRRC15 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 LRRC15의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “세포 예정사 1 리간드 1” 또는 “PD-L1”은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 PD-L1을 광범위하게 지칭한다. PD-L1은 CD274라고도 한다. 이 용어는 전장 PD-L1 및 PD-L1의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, PD-L1 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 PD-L1의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 PD-L1의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 Q9NZQ7로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, PD-L1 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 PD-L1의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “폴리오바이러스 수용체” 또는 “PVR”는, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 고유 PVR를 광범위하게 지칭한다. 이 용어는 전장 PVR 및 PVR의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, PVR ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 PVR의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 PVR의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 A0A0C4DG49로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, PVR 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 PVR의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “CD80”은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 CD80을 광범위하게 지칭한다. CD80은 B7-1이라고도 한다. 이 용어는 전장 CD80 및 CD80의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, CD80 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 CD80의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 CD80의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 제 P33681로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, CD80 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 CD80의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “CD276”은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 CD276을 광범위하게 지칭한다. CD276은 B7-H3이라고도 한다. 이 용어는 전장 CD276 및 CD276의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, CD276 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 CD276의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 CD276의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 제 Q5ZPR3으로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, CD276 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 CD276의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “TEM1”, “CD248”, 및 “엔도시알린”은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 TEM1을 광범위하게 지칭한다. 이 용어는 전장 TEM1 및 TEM1의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, TEM1 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 TEM1의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 TEM1의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 제 Q9HCU0으로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, TEM1 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 TEM1의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용된 용어 “ADGRB1”, “부착 GPCR B1” 및 “부착 G 단백질-결합 수용체 B1”은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 ADGRB1을 광범위하게 지칭한다. 이 용어는 전장 ADGRB1 및 ADGRB1의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, ADGRB1 ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 ADGRB1의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 ADGRB1의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 제 O14514로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, TEM1 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 TEM1의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “ICOSLG”, “유도성 T 세포 동시자극 리간드” 및 “ICOS 리간드”는, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 출처로부터 얻은 임의의 천연 ICOSLG를 광범위하게 지칭한다. 이 용어는 전장 ICOSLG 및 ICOSLG의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, ICOSLG ECD를 포함한다. 이 용어는 또한 ICOSLG의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 ICOSLG의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 O75144으로 표시된다. 사소한 서열 변이, 특히, ICOSLG 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 ICOSLG의 보존적 아미노산 치환도 본 발명에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 “단백질”은, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 단백질을 지칭한다. 이 용어는 “전장”의, 비가공 단백질, 뿐만 아니라 세포에서 가공된 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체, 예를 들어, 아미노산 치환 돌연변이 또는 아미노산 결실 돌연변이를 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질의 단리된 영역 또는 도메인, 예를 들어, 세포외 도메인(ECD)을 포함한다.
“단리된” 단백질 또는 펩티드는 자연 환경의 구성요소에서 분리된 항체이다. 일부 실시형태들에서, 단백질 또는 펩티드는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 결정하였을 때 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
본원에 사용된 용어 “벡터”는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로 지칭된다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 항체 단편 (예를 들어, 비스-Fab)을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다.
“항원 결합 단변” 또는 “항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항원 결합 단편의 예로는 비스-Fab; Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, scFv, ScFab); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
“단일-도메인 항체”는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 특정 양상들에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(예로써, 미국 특허 제 6,248,516 B1 참고). 단일-도메인 항체의 예에는 VHH가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
“Fab” 단편은 항체의 파파인 분해에 의해 생성되는 항원-결합 단편이며 상기 Fab 단편은 전적으로 경(L) 쇄와 상기 중(H) 쇄의 가변 영역 도메인 (VH), 그리고 하나의 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1)으로 구성된다. 항체의 파파인 분해는 두 개의 동일한 Fab 단편을 생성한다. 항체를 펩신 처리하면, 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화물로 연결된 Fab 단편에 대체로 상응하며 여전히 항원과 가교(cross-linking)하는 단일한 큰 F(ab')2 단편이 수득된다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단의 추가적인 몇 개 잔기를 가지므로, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 표시한다. F(ab')2 항체 단편은 최초에 이들 사이에 힌지 시스테인을 보유하는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이의 카르복실 말단까지 늘어나는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 체계에 따를 때 잔기 447)은 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모든 Lys447 잔기가 제거된 항체 집단, Lys447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 Lys447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
“Fv”는 단단하게 비공유 결합된, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이 두 도메인의 폴딩으로부터 아미노산 잔기들을 항원 결합하게 하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(각각 H 및 L 쇄에서 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR들만을 포함하는 Fv의 절반)은 비록 종종 전체 결합 부위보다 친화도가 더 낮기는 하지만, 여전히 항원을 인식하고, 이에 결합하는 능력을 갖는다.
용어 “전장 항체”, “온전한 항체”, 및 “전체 항체”는 본원에서 호환적으로 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“sFv” 또는 “scFv”로도 약칭되는 “단일 사슬 Fv”는 단일 폴리펩티드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 상기 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하는데, 이 링커는 상기 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 한다. scFv 검토는, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Malmborg 외, J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995를 참조하라.
용어 “소분자”는 분자량이 약 2000달톤 이하, 예를 들어, 약 1000달톤 이하인 임의의 분자를 의미한다. 일부 양상에서, 소분자는 유기 소분자이다.
본원에서 사용되는 용어 “모사체” 또는 “분자 모방체”는 주어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 일부에 대한 형태 및/또는 결합 능력(예를 들어, 2차 구조, 3차 구조)에서 충분한 유사성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 폴리펩티드의 결합 파트너에 결합한다. 모방체는 그것이 모방하는 폴리펩티드보다 동일하거나 더 적거나 더 큰 친화도로 결합 파트너에 결합할 수 있다. 분자 모방체는 그것이 모방하는 폴리펩티드와 명백한 아미노산 서열 유사성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 모방은 자연적으로 발생하거나 조작될 수 있다. 일부 양상에서, 모방체는 표 1의 단백질의 모방체이다. 다른 양상에서, 모방체는 표 2의 단백질의 모방체이다. 또 다른 양상에서, 모방체는 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 모방체이다. 일부 양상에서, 모방체는 표 5의 단백질의 모방체이다. 다른 양상에서, 모방체는 표 6의 단백질의 모방체이다. 또 다른 양상에서, 모방체는 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 모방체이다. 일부 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행할 수 있다. 다른 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 둘 이상의 단백질의 서로에 대한(예: 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 또는 표 5의 단백질과 표 6의 단백질) “결합을 허용하는 조건”은 둘 이상의 단백질이 조절인자 또는 후보 조절인자 부재 시 상호작용하는 조건(예를 들어, 단백질 농도, 온도, pH, 염 농도)을 지칭한다. 결합을 허용하는 조건은 개별 단백질에 따라 다를 수 있으며 단백질-단백질 상호작용 분석(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 분석, 생물층 간섭측정 분석, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 세포외 상호작용 분석 및 세포 표면 상호작용 분석) 간에 다를 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.사로부터 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 아래와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
이때 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 인정된다. 달리 특정 언급이 없는 한, 본원에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.
본원에서 사용되는 용어 “샘플”은 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특성을 기준으로 특성화되고 및/또는 식별되어야만 하는 세포 및/또는 다른 분자 실체를 함유하는 목적하는 대상체 및/또는 개체로부터 수득되거나 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 문구 “질병 샘플” 및 이의 변화형은 특성화되는 세포 및/또는 분자 실체를 함유하는 것으로 공지된 또는 예상되는 관심 대상체로부터 수득된 임의의 샘플을 지칭한다. 샘플에는 조직 샘플, 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체 유체, 림프액, 활막 유체, 여포성 유체, 정액, 양수, 밀크, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액-유도된 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 구강상피 세포(buccal swab), 객담, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예컨대 균질화된 조직, 세포성 추출물, 및 이들의 조합이 비제한적으로 포함된다. 샘플은 보관 샘플, 신선한 샘플 또는 냉동 샘플일 수 있다. 일부 양상에서, 샘플은 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 종양 조직 샘플이다.
II.
단백질을 표시하는 생물학적 소포
막-결합 단백질(예: 수용체-리간드 상호작용)과 관련된 상호작용들에 대한 연구는 세포 외 환경에서 발생하는 세포 통신을 이해하는 데 중요하다. 그러나 이러한 상호 작용을 확인하고 이해하는 과정은, 부분적으로는 수용체-리간드 상호 작용이 막에서 일어나기 때문에 세포질 단백질보다 뒤쳐져 있다. 생리학적 막은 상호작용에 참여할 수 있는 지질, 스테롤, 단백질 및 글리칸의 복잡한 혼합을 포함한다. 또한, 막은 수용체를 클러스터링하고 방향을 지정하고 폴딩하는 데 도움을 주어 약한 단백질-단백질 상호 작용을 강화시킨다. 단백질-단백질 상호 작용을 평가하기 위한 표준 방법은 일반적으로 세포막이 없거나 세포막에서 추출해야 한다. 결과적으로, 일반적으로 사용되는 이러한 방법론은 수용체-리간드 상호작용을 과소하게 나타낸다.
본 발명은 생물학적 소포(BV), 예를 들어, 세포외 소포(EV)의 표면 상에 제시된 단백질(예를 들어, 막관통 수용체)을 특징으로 한다. 일부 양상에서, 본 발명은 (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질(이 때, 이종 막-결합 단백질은 BV의 외부 표면에 존재함) 및 (b) 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 한다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다.
일부 양상에서, 본 발명은 (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질(이 때, 이종 막-결합 단백질은 BV의 외부 표면에 존재함) 및 (b) 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 하며, 막 출아제는 HIV gag 단백질이고, 이 때 BV는 (i) 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 모 세포로부터 BV를 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된다.
A.
단백질 단편
일부 양상에서, 단백질 단편은 막관통 수용체, 예를 들어, 단일 통과 막관통(STM) 수용체 또는 다중 통과 막관통 수용체(다중 막관통 수용체; MTMR), 예를 들어, G 단백질-결합 수용체(GPCR)의 세포외 도메인이다. 예시적인 STM 수용체는 본원 섹션 III에 기재되어 있고 표 2 및 표 4에 제공되어 있다.
B.
앵커
일부 양상에서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 지질 막 표면에 고정(tether)시킨다. 일부 양상에서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드이다. 일부 양상에서, 앵커는 단백질 지질화에 사용되는 모이어티, 예를 들어, 시스테인 팔미토일화, 글리신 미리스토일화, 라이신 지방-아실화, 콜레스테롤 에스테르화, 시스테인 프레닐화 또는 세린 지방-아실화에 사용되는 모이어티이다.
C.
태그
일부 양상에서, 태그는 직접 또는 간접적으로 시각화되거나 다른 방식으로 탐지될 수 있다. 예를 들어, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있는 모이어티를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 당단백질 D(gD) 폴리펩티드일 수 있다. 일부 양상에서, 태그는 형광 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, 단백질 단편은 gD 태그 및 GPI 앵커를 포함하는 gD-GPI 구조체에 접합(예를 들어, 융합)된다.
D.
막 출아제
BV는, 모 세포에 존재하는 경우, 모 세포에 의한 BV(예를 들어, 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 막 출아제를 추가로 포함할 수 있다. 모 세포는 막 출아제로 형질감염될 수 있고, 막 출아제는, 예를 들어, 막 출아 과정 동안 BV에 의해 유전될 수 있다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 서열번호 1에 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 막-출아제(예를 들어, HIV gag 단백질)는 직접적으로 또는 간접적으로 가시화되거나 달리 검출될 수 있는 마커를 포함한다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 형광 단백질이다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소, 예를 들어, 레닐라 루시퍼라제(Rluc)이다. 추가적인 막 출아제는 하기 섹션 III(C)에 기술되어 있다.
세포는 추가적으로 또는 대안적으로 모 세포에 의해 BV(예: 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 조건(예: 배양 조건)에 노출될 수 있다. 막-출아제를 포함하는 EV는 재조합 EV(rEV)로 지칭될 수 있다.
막 출아제 및/또는 BV 생산을 증가시키는 제제 또는 조건은 모 세포에 의한 BV 생산을, 예를 들어 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 또는 4배 이상(예를 들어, 1.5 내지 2.5배, 2.5 내지 3.5배, 또는 3.5 내지 4.5배) 만큼 증가시킬 수 있다. 일부 양상에서, 막 출아제(예를 들어, HIV gag 단백질)는 모 세포에 의한 BV 생성을 약 4배 증가시킨다.
E.
모 세포 및 단리 방법
생물학적 소포(BV)는 모 세포로부터 유래된(예를 들어, 모 세포에 의해 생산되고 그로부터 분리된) 임의의 적합한 지질 소포 구조체를 포함한다. 일부 양상에서, BV는 포유동물 세포에 의해 생산된다. 이러한 세포는, 예를 들어, EXPI293FTM 세포일 수 있다. 일부 양상에서, BV는 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 또는 바이러스 유사 입자(VLP)이다. 일부 양상에서, BV 제제 또는 조성물은 EV, 엑소좀, 미세소포 및/또는 VLP의 혼합물을 포함한다. BV는, 예를 들어, 원심분리(예를 들어, 초원심분리)를 사용하여 모 세포 및/또는 대형 EV 및 단백질 응집체로부터 분리(예를 들어, 모 세포의 배양 배지로부터 분리)될 수 있다.
일부 양상에서, 모 세포는 이종 막-결합 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 막-출아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되어 있다. 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제는 단일 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있거나, 별도의 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있다.
모 세포의 표면 및/또는 BV의 표면에서 이종 막-결합 단백질 및/또는 막-출아제의 발현 수준을 평가할 수 있다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질의 발현 수준은 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 평가되며, 이 때 BV는 적어도, 항체와 접촉할 때 이종 막-결합 단백질과 결합된 태그에 대해 임계 수준 이상인 이동을 생성한다. 일부 양상에서, 태그는 gD 폴리펩티드이고, 항체는 항-gD 항체이고, BLI 분석이 30℃에서 수행될 때 이동은 적어도 1.5nm이다. 다른 양상에서, BV는 이종 막-결합 단백질에 특이적인 항체와 접촉된다.
일부 양상에서, BV는 BV를 직접 또는 간접적으로 시각화 가능하게 하는 마커, 예를 들어, 막 마커(예를 들어, 형광 막 마커)를 포함한다. 일부 양상에서, 막 마커는 콜레스테롤 마커, 예를 들어, AMPLEXTM Red이다.
III.
단백질-단백질 상호작용의 식별 방법
생물학적 소포(BV)는 결합능(binding-competent) 수용체를 얻기 위한 단백질 무 정제 방법을 제공한다. 이어서 BV 보유 수용체들을 수용체의 리간드들(예를 들어, 리간드들의 라이브러리)와의 상호작용에 대해 테스트할 수 있고, 그에 따라 단백질-단백질 상호작용을 식별하고 평가하는 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 발명은 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 표적 폴리펩티드들의 집합체를 제공하는 단계(선택적으로, 이 때 표적 폴리펩티드의 집합은 하나 이상의 고체 표면 상에 고정됨); (b) 단계 (a)의 집합체를, 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건하에서 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제(a membrane-budding agent)를 포함하는 생물학적 소포(BV)와 접촉시키는 단계(이 때, 막 출워제는 HIV gag 단백질이고, 이종 막-결합 단백질은 BV 표면에서 임계 수준 이상으로 발현됨); 및 (c) 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 단계를 포함한다.
A.
이종 막-결합 단백질
이종 막-결합 단백질은 EV에 통합될 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질이다. 다른 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함한다. 단백질 단편은, 예를 들어,세포외 도메인(예를 들어 관심 단백질의 세포외 도메인, 예를 들어 막관통 수용체)일 수 있다. ECD는 세포의 원형질막 외부에 위치할 것으로 예상되는 단백질의 도메인이다. 따라서 이러한 단백질의 도메인은 세포외 환경과의 상호작용에 이용가능하다, 예를 들어, 가용성 단백질 및 세포 또는 인접한 세포에 있는 다른 단백질의 ECD와 상호작용한다. 단백질의 ECD 또는 ECD들은 생물정보학 분석, 예를 들어 UniProt 주석의 분석에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, ECD의 경계는, 인접한 예상 막관통 영역, 예를 들어, 막관통 나선의 경계와 비교하여 식별될 수 있다. 일부 양상에서, 세포외 도메인의 존재는 단백질이 원형질막으로 트래피킹됨을 나타내는 도메인, 서열 또는 모티프, 예를 들어, 신호 서열 또는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 연결 부위의 존재에 의해 예측될 수 있다. 일부 양상에서, 세포외 도메인은 전장 단백질과 관련하여 발현된다. 다른 양상에서, 세포외 도메인은 단리된 세포외 도메인, 예를 들어, 세포외에 존재하는 것으로 예측되는 단백질의 아미노산 잔기만을 포함하는 아미노산 잔기들의 서열로서 발현된다. 일부 양상에서, 단리된 세포외 도메인은 융합 단백질에서 발현된다.
이종 막-결합 단백질이 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 일부 양상에서, 앵커는 BV의 지질 막 표면에 단백질 단편을 고정시킨다.일부 양상에서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드이다. 일부 양상에서, 앵커는 단백질 지질화에 사용되는 모이어티, 예를 들어, 시스테인 팔미토일화, 글리신 미리스토일화, 라이신 지방-아실화, 콜레스테롤 에스테르화, 시스테인 프레닐화 또는 세린 지방-아실화에 사용되는 모이어티이다.
이종 막-결합 단백질이 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 일부 양상에서, 태그는 직접적으로 또는 간접적으로 가시화되거나 다른 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있는 모이어티를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 당단백질 D(gD) 폴리펩티드일 수 있다. 일부 양상에서, 태그는 형광 단백질을 포함한다.
일부 양상에서, 단백질 단편은 gD 태그 및 GPI 앵커를 포함하는 gD-GPI 구조체에 접합(예를 들어, 융합)된다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 표 1에 제공된 단백질(예를 들어, gD-GPI 구조체에 접합된 표 1에 제공된 단백질의 ECD) 또는 아래 표 5에 제공된 단백질이다.
표 1. BV-발현 단백질
B.
BV 및 모 세포
생물학적 소포(BV)는 본원 섹션 II(E)에 기재된 바와 같은 모 세포로부터 유래된(예를 들어, 모 세포에 의해 생산되고 그로부터 분리된) 임의의 적합한 지질 소포 구조체를 포함한다.
일부 양상에서, 모 세포는 이종 막-결합 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및 막-출아제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되어 있다. 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제는 단일 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있거나, 별도의 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있다.
모 세포의 표면 및/또는 BV의 표면에서 이종 막-결합 단백질 및/또는 막-출아제의 발현 수준을 평가할 수 있다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질의 발현 수준은 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 평가되며, 이 때 BV는 적어도, 항체와 접촉할 때 이종 막-결합 단백질과 결합된 태그에 대해 임계 수준 이상인 이동을 생성한다. 일부 양상에서, 태그는 gD 폴리펩티드이고, 항체는 항-gD 항체이고, BLI 분석이 30℃에서 수행될 때, 임계 수준은 적어도 1.5nm의 이동이다. 다른 양상에서, BV는 이종 막-결합 단백질에 특이적인 항체와 접촉된다.
일부 양상에서, BV는 BV를 직접 또는 간접적으로 시각화 가능하게 하는 마커, 예를 들어, 막 마커(예를 들어, 형광 막 마커)를 포함한다. 일부 양상에서, 막 마커는 콜레스테롤 마커, 예를 들어, AMPLEXTM Red이다.
C.
막 출아제
BV는, 본원 섹션 II(D)에 기재된 바와 같은 모 세포에 의한 BV(예를 들어, 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 막 출아제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양상에서, HIV gag 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 서열번호 1에 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
추가의 예시적인 막-출아제는 자가 조립 VLP(예를 들어, MLGag, AARDC1(예를 들어, hAARDC1) 및 Acyl.Hrs); 엑소좀 또는 종양 경로와 같은 내인성 소포 형성 경로를 향상시키는 제제(예를 들어, RhoA.F3OL, ARF6.Q67L, VPS4a, HAS3, CD9, CD63 및 CD81); 및 세포사멸체와 관련된 인자(예를 들어, 항시적으로 활성인 ROCK1)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 막 출아제는 MLGag, Acyl.Hrs, ARRDC1(예를 들어, hAARDC1), ARF6(예를 들어, ARF6Q67L), RhoA(예를 들어, RhoA.F30L) 또는 이들의 조합이다.
일부 양상에서, 막 출아제는 Gag 단백질, 예를 들어, 키메라 Gag 단백질(예를 들어, Hammarstedt 외, J Virol. 78(11): 5686-97, 2004 또는 Chen 외, Proc Natl Acad Sci USA, 98(26): 15239-44, 2001에서 논의된 키메라 Gag 단백질)이다. 일부 양상에서, 키메라 Gag 단백질은 HIV Gag의 일부 및 상이한 레트로바이러스의 Gag의 일부를 포함한다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 키메라 Gag는 HIV Gag를 포함하고, 이 때 이의 국소화를 지시하는 것으로 알려진 HIV Gag의 영역은 뮤린 레트로바이러스인 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)의 기능적 상동성 영역으로 대체된다. 특정 실시형태에서, 교체된 HIV Gag 영역은 매트릭스 도메인(MA)이고, 그리하여 본원에서 MLGag로 지칭되는 키메라 Gag를 생성한다.
특정 실시형태에서, 키메라 및 전장 Gag 단백질은, 예를 들어, Stocking 외, Cell Mol. Life Sci., 65(21):3383-3398, 2008에 기재된 바와 같은 임의의 종으로부터 유래한 내인성 레트로바이러스(ERV)로부터 생성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 MLGag이다.
특정 실시형태에서, 소포 인자는 어레스틴 도메인-함유 단백질 1(ARRDC1)이다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 뮤린 ARRDC1(mARRDC1)이다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 인간 ARRDC1(hARRDC1)이다. ARRDC1은 부속 단백질의 테트라펩티드 PSAP 모티프이며 EV 형성을 유도하는 숙주 단백질이다. ARRDC 1의 과발현은 미세소포(MV) 형성을 향상시키는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 PSAP/PTAP 펩티드를 통한 Tsg 101의 동원에 의해 매개된다. ATPase VP S4a의 과발현은 MV 형성을 더욱 향상시킨다(Nabhan 외, Proc Natl Acad Sci U S A, 109(11): 4146-51, 2012).
특정 실시형태에서, 소포 인자는 ADP 리보실화 인자-6(ARF6)이다. ARF6은 ERK 의존 방식으로 종양 세포에서 미세소포 형성을 유도하는 Rho GTPase인 것으로 나타났다(Muralidharan-Chari 외, Curr Biol., 19(22): 1875-85, 2009). 특정 실시형태에서, 소포 인자는 ARF6의 항시적 활성 형태이다. 예를 들어, 제한 없이, ARF6의 항시적 활성 형태는 ARF6.Q67L이다(예를 들어, Peters 외, J. Cell Biol, 128(6):1003-1017, 1995 참조).
특정 실시형태에서, 소포 인자는 또한 종양 세포에서 미세소포 형성을 유도할 수 있는 돌연변이체 RhoA/ROCK1이다(Li 외, Oncogene, 31(45): 4740-9, 2012). 특정 실시형태에서, 소포 인자는 RhoA의 항시적 활성 형태이다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, RhoA의 항시적 활성 형태는 RhoA.F3OL이다(예를 들어, Lin 외, JBC, 274(33): 23633-23641, 1999 참조).
특정 실시형태에서, 소포 인자는 원형질막(PM) 결합 도메인, 자가-조립 도메인, 및 수송에 필요한 엔도좀 분류 복합체(ESCRT) 동원 도메인을 포함한다. EV 형성의 설계 원칙은 새로운 EV 인자/카고의 신속한 생성을 가능하게 하는 것이다. PM 표적화 및 고차 올리고머화가 EV 통합을 유도하는 것으로 나타났다(Fang 외, PLoS Biol., 5(6): e158, 2007). 특정 실시형태에서, 소포 인자는 Acyl.Hrs로서, 이는 아실화 태그의 PM 결합 도메인 및 꼬인 코일들의 자가-조립 도메인 및 ESCRT 동원 도메인으로 구성된 간세포 성장 인자-조절된 티로신 키나제 기질(Hrs)의 C-말단 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 기질의 PM 결합 도메인, 캡시드의 자가 조립 도메인, 및 p6의 ESCRT 동원 도메인을 포함하는 MLGag이다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 자가 조립 도메인 및 ESCRT 동원 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 소포 인자는 어레스틴 도메인의 자가-조립 도메인 및 ESCRT 동원 도메인을 포함하는 ARRDC1이다.
추가적인 소포 인자들은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 모든 단백질, 예를 들어, 인간 단백질의 cDNA 라이브러리의 스크린을 수행하여 EV의 생산을 증가시키는 단일 유전자 또는 유전자 조합을 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, CRISPR 또는 RNAi 스크린을 수행하여 EV 생산을 억제하는 단일 유전자 또는 유전자 조합을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 막-출아제(예를 들어, HIV gag 단백질)는 직접적으로 또는 간접적으로 가시화되거나 달리 검출될 수 있는 마커를 포함한다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소이다, 예를 들어, 효소는 레닐라 루시퍼라제(Rluc)이고 기질은 Rluc 기질이다.
세포는 추가적으로 또는 대안적으로 모 세포에 의해 BV(예: 세포외 소포(EV), 엑소좀, 미세소포 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP))의 생산을 증가시키는 조건(예: 배양 조건)에 노출될 수 있다.
막 출아제 및/또는 BV 생산을 증가시키는 제제 또는 조건은 모 세포에 의한 BV 생산을, 예를 들어 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 또는 4배 이상(예를 들어, 1.5 내지 2.5배, 2.5 내지 3.5배, 또는 3.5 내지 4.5배) 만큼 증가시킬 수 있다. 일부 양상에서, 막 출아제(예를 들어, HIV gag 단백질)는 모 세포에 의한 BV 생성을 약 4배 증가시킨다.
D.
표적 폴리펩티드들의 집합체
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 막관통 수용체 또는 이의 단편의 집합체이다. 일부 양상에서, 수용체는 단일 통과(single-pass) 막관통(STM) 수용체이다. STM 수용체 단백질들은 원형질막을 통과하는 단일 도메인을 갖는 큰 범주의 막 결합 수용체이다. 많은 STM 수용체가 세포 표면에서 발현되므로 세포외 상호작용체(extracellular interactome)에 참여할 수 있다. 예시적인 STM 수용체는 표 2와 4 그리고 Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018 및 Clark 외, Genome Res, 13: 2265-2270, 2003에 제공된다.
일부 양상에서, 단백질 단편은 세포외 도메인(ECD), 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 식별된 ECD이다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드 집합체의 각 구성원은 Fc-태그가 있는 세포외 도메인이고, 고체 표면은 단백질 A로 코팅된다. 일부 양상에서, 하나 이상의 표적 폴리펩티드는 하나 이상의 고체 표면 상의 별개의 위치에 고정된다. 다른 양상에서, 하나 이상의 표적 폴리펩티드는 표면에 고정되지 않는다.
표 2. STM 라이브러리 단백질
표 3. BV 발현 단백질과 STM 라이브러리 단백질 간의 상호작용
표 4. 태그가 있는 STM 라이브러리
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 단백질, 예를 들어, 표 4의 5%-15%, 15%-25%, 25%-35%, 35%-455, 45%-55%, 55%-65%, 65%-75%, 75%-85%, 85%-95%, 또는 95%-100%의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850, 적어도 900, 적어도 950, 적어도 1000, 적어도 1050, 적어도 1100, 적어도 1150개, 또는 1195개 모두의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다, 예를 들어, 표 4의 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 또는 1195개 모두의 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 수용체는, 예를 들어, GPCR 수퍼패밀리의 구성원인 다중 막관통 수용체(MTMR)이다.
E.
상호작용 분석
단백질-단백질 상호작용 분석을 수행하기 위해, 표적 폴리펩티드(예를 들어, 표면에 고정된 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 플레이트의 웰에 고정된 표적 폴리펩티드)의 집합체를 이종 막-결합 단백질과 접촉시킨다(예를 들어, 정제된 BV를 포함하는 용액과 접촉시킨다). 이어서 분석물은 결합되지 않은 BV를 제거하기 위해 한 번 이상 인큐베이션 및 세척될 수 있다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용은 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준을 초과하는 신호를 검출함으로써 식별된다. 검출된 신호는 다음과 같이 BV의 하나 이상의 시각화 가능한 구성요소들의 것일 수 있다.
일부 양상에서, 막-출아제(예를 들어, HIV gag 단백질)는 검출가능한 마커를 추가로 포함하고(예를 들어, 이에 접합되고), 상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 검출가능한 마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소이다. 일부 양상에서, 효소는 레닐라 루시퍼라제(Rluc)이고, 상기 분석은 Rluc 기질을 첨가하여 상호작용이 일어난 고체 표면 상의 위치에서 형광 신호를 생성하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양상에서, BV가 막 마커를 포함하고, 상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 막 마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 막 마커는 콜레스테롤 마커이다. 일부 양상에서, 콜레스테롤 마커는 AMPLEX™ Red이다.
일부 양상에서, 상호작용은 일시적인 상호작용이다.
일부 양상에서, 상호작용은 저 친화성 상호작용이다.
일부 양상에서, 표 1에 제공된 단백질 및 표 4에 제공된 STM 단백질은 상기 기재된 바와 같이 단백질-단백질 상호작용 분석에서 상호작용에 대해 테스트된다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 표 3에 제공된 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 LRRC15와 TEM1/CD248/엔도시알린, PLXDC2, PTPRD, SARAF, ASGR1, BMP10, CPM, LDLR, PILRA 및/또는 PRRG2 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 PD-L1/CD274와 C6orf72, LRTM1, CDHR2, IGF2R, NCR3 및/또는 SUSD3 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 PVR과 CLEC17A 및/또는 PVRL4 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 CD80/B7-1과 BTNL3, CDHR2, GLT8D2, KIAA1467, 및/또는 RNF152 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석은 CD276/B7-H3과 LRFN1, MXRA5, PVRL1, LRIT2, PLA2R1, 및/또는 SLITRK4 사이의 상호작용을 식별할 수 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 다중 막관통 수용체(MTMR), 예를 들어, GPCR 수퍼패밀리의 구성원은 상기 기재된 바와 같이 단백질-단백질 상호작용 분석에서 상호작용에 대해 테스트된다.
일부 양상에서, 표 5에 제공된 단백질 및 표 6에 제공된 단백질은 상기 기재된 바와 같이 단백질-단백질 상호작용 분석에서 상호작용에 대해 테스트된다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 표 7에 제공된 상호작용을 식별할 수 있다.
표 5. 쿼리 단백질
표 6. 라이브러리 단백질
표 7. 쿼리 단백질과 라이브러리 단백질 간의 상호작용
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 ADGRB1과 PD-L1, ICOSLG, DNER, 및/또는 CNTN6 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 LGR4와 CLPS, EDIL3, IZUMO4, IZUMO1, BTNL3, CD93, CEACAM16, IL-6, LRRC4C, SCARF1, 및/또는 TRIL 사이의 상호작용을 식별할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 분석으로 LGR5와 CLPS, EDIL3, IZUMO4, CD93, GPR125, IL6-R 및/또는 TRIL 사이의 상호작용을 확인할 수 있다.
F.
BV-단백질 복합체
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제를 포함하는 BV 및 (b) 표적 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 특징으로 하며, 이 때 이종 막-결합 단백질 및 표적 폴리펩티드는 서로에 결합된다. 예시적인 이종 막-결합 단백질 및 표적 폴리펩티드는 각각 섹션 IIIA 및 IIID에 기재되어 있다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드는 표면에 고정되고 복합체는 표면에 국소화된다.
IV.
단백질-단백질 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법
A.
상호작용의 조절 분석
i. 표 1 및 표 2의 단백질
일부 양상에서, 본 발명은 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 것을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 1의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때, 후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
ii. TEM1 및 LRRC15
일부 양상에서, 본 발명은 LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계; 및 (c) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
iii. 표 5 및 표 6의 단백질
일부 양상에서, 본 발명은 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 것을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 후보 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때, 후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
iv. PD-L1 및 ADGRB1
일부 양상에서, 본 발명은 PD-L1와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 PD-L1와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
v. ICOSLG 및 ADGRB1
일부 양상에서, 본 발명은 ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자의 부재 시 결합에 대한 후보 조절인자의 존재 시 결합에 있어서의 증가 또는 감소로 인해 후보 조절인자가 ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별된다.
vi. 상호작용의 조절 분석
일부 양상에서, 후보 조절인자는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에; 세포 배양 배지에; 조건화 배지에; 표 1의 단백질(예를 들어, BV에서 발현된 단백질 1의 형태) 및/또는 표 2의 단백질의 정제된 형태에; 및/또는 표 5의 단백질(예를 들어, BV에서 발현된 단백질 5의 형태) 및/또는 표 6의 단백질의 정제된 형태에 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM, 2 μμM, 3 μM, 5 μM, 또는 10 μM의 농도로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 0.1nM 내지 10μM의 농도로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 용액, 예를 들어, 가용성 형태로 제공된다.
일부 양상에서, 결합의 증가가 적어도 70%인 경우(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정) 후보 조절인자는 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 결합 증가는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)이다. 일부 양상에서, 결합의 증가는 적어도 70%이다.
일부 양상에서, 결합의 감소가 적어도 70%인 경우(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정) 후보 조절인자는 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 결합 감소는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)이다. 일부 양상에서, 결합의 감소는 적어도 70%이다. 단백질-단백질 상호작용의 조절인자, 뿐만 아니라 이러한 상호작용을 조절할 수 있는 제제를 식별하기 위한 예시적인 방법은 아래에 그리고 PCT/US2020/025471에 설명되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이 또는 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절은 단백질-단백질과 비교하여 조절인자의 존재 하에 단백질-단백질 상호작용의 증가로 식별될 수 있다. 조절인자의 부재 시 단백질-단백질 상호작용에 비해 조절인자의 존재 시 단백질-단백질 상호작용의 증가, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%의 증가, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 100% 초과(예: 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)의 증가로서 식별될 수 있다. 대안적으로, 조절은 조절인자 부재 시 단백질-단백질 상호작용에 비해 조절인자 존재 시 단백질-단백질 상호작용의 감소, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)의 단백질-단백질 상호 작용의 감소로서 식별될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용 분석법은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석법, 생물층 간섭계(BLI), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 세포외 상호작용 분석법, 세포 표면 상호작용 분석법 등이 될 수 있다.
단백질-단백질 상호작용 조절에 관한 SPR 분석
일부 양상에서, 단백질-단백질 상호작용에 대한 분석은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석이다. 일부 양상에서, 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질 또는 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합의 조절은 조절인자 부재 시에 비해 존재 시의 SPR 신호 반응 단위의 차이(RU)로서 측정된다.
단백질-단백질 상호작용 조절에 관한 BLI 분석
일부 양상에서, 단백질-단백질 상호작용에 대한 분석은 생물층 간섭계(BLI) 분석이다. 일부 양상에서, BLI 분석은 단리된 세포외 도메인(ECD)을 사용하여 수행된다. 일부 양상에서, 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질 또는 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합의 조절은 조절인자 부재 시에 비해 존재 시의 바이오센서 팁에서 측정된 파장 이동의 차이(Δλ)로서 측정된다.
단백질-단백질 상호작용 조절에 관한 ELISA
일부 양상에서, 단백질-단백질 상호작용에 관한 분석법은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)이다. 일부 양상에서, 제1 단백질이 플레이트에 결합되고(예를 들어, 플레이트에 직접 결합되거나 플레이트에 결합된 항체에 의해 인식되는 친화성 태그를 통해 플레이트에 결합됨), 제2 단백질은 가용성 형태, 예를 들어, 단리된 ECD로서 제공된다. 제1 단백질과 제2 단백질 사이의 상호작용은 제2 단백질 또는 이의 친화성 태그에 결합하는 항체를 제공함으로써 검출될 수 있으며, 이 때 항체는 항체의 존재에 대한 분석에서 검출, 예를 들어, 가시화될 수 있다.
단백질-단백질 상호작용 조절에 관한 기타 분석법
일부 양상에서, 분석은, 예를 들어, PCT/US2020/025471에 기재된 세포외 상호작용 분석이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 양상에서, 분석은, 예를 들어, PCT/US2020/025471에 기재된 세포 표면 상호작용 분석이다. 일부 양상에서, 분석법은 등온 적정 열량계(ITC) 분석법, 면역침전을 포함하는 분석법, 또는 ALPHASCREENTM 기술을 포함하는 분석법이다.
B.
다운스트림 활성에 있어서의 변화에 대한 분석
i. 표 1 및 표 2의 단백질
일부 양상에서, 본 발명은 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 후보 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 1의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 후보 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 1의 단백질에 대한 표 2의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 2의 단백질을 표 1의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 2의 단백질 및 표 1의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 2의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
ii. TEM1 및 LRRC15
일부 양상에서, 본 발명은 LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계; 및 (c) LRRC15의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) LRRC15에 대한 TEM1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 TEM1을 LRRC15와 접촉시키는 단계; 및 (c) TEM1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계 또는 ELISA에 의해 측정 시 적어도 70%이다.
iii. 표 5 및 표 6의 단백질
일부 양상에서, 본 발명은 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 후보 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 5의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자(예를 들어, 본원 섹션 IV에 기재된 후보 조절인자)를 제공하는 단계; (b) 표 5의 단백질에 대한 표 6의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 6의 단백질을 표 5의 단백질과 접촉시키는 단계(이 때 표 6의 단백질 및 표 5의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있음); 및 (c) 표 6의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별된다.
iv. PD-L1 및 ADGRB1
일부 양상에서, 본 발명은 PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) PD-L1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) PD-L1에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1을 PD-L1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계 또는 ELISA에 의해 측정 시 적어도 70%이다.
v. ICOSLG 및 ADGRB1
일부 양상에서, 본 발명은 ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG를 ADGRB1과 접촉시키는 단계; 및 (c) ICOSLG의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 후보 조절인자를 제공하는 단계; (b) ICOSLG에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1을 ICOSLG와 접촉시키는 단계; 및 (c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 비해 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화로 인해 후보 조절인자가 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계 또는 ELISA에 의해 측정 시 적어도 70%이다.
vi. 다운스트림 활성에 있어서의 변화에 대한 분석
일부 양상에서, 후보 조절인자는 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM, 2 μμM, 3 μM, 5 μM, 또는 10 μM의 농도로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 0.1nM 내지 10μM의 농도로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는, 예를 들어, 도 4F의 농도 범위로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 용액, 예를 들어, 가용성 형태로 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질을 포함하는 유기체, 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질을 포함하는 조직에, 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에, 세포 배양 배지에, 조건화 배지에, 및/또는 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 정제된 형태에 제공된다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질을 포함하는 유기체, 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질을 포함하는 조직에, 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에, 세포 배양 배지에, 조건화 배지에, 및/또는 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 정제된 형태에 제공된다.
일부 양상에서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제이다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 증가가 적어도 30%인 경우 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제이다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 증가가 적어도 30%인 경우 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성의 증가는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 100% 초과(예를 들어, 적어도 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성의 증가는 적어도 30%이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 증가이다.
일부 양상에서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제이다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 감소가 적어도 30%인 경우 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제이다. 일부 양상에서, 후보 조절인자는 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 감소가 적어도 30%인 경우 조절인자로 식별된다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성의 감소는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성의 감소는 적어도 30%이다. 일부 양상에서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속시간의 감소이다.
일부 양상에서, 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 하나 이상의 분석에서 평가된다. 일부 양상에서, 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 하나 이상의 분석에서 평가된다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 질병, 예를 들어, 암의 발생 또는 진행과 관련된 활성이다.
일부 양상에서, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 표 1의 단백질은 LRRC15이고, 표 2의 단백질은 TEM1이고, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석으로 측정하여, 조절인자의 존재 시 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% (예를 들어, 적어도 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시, 조절인자의 존재 시 적어도 20%만큼 감소된다.
일부 양상에서, 표 5의 단백질은 ADGRB이고, 표 2의 단백질은 PD-L1이고, 다운스트림 활성은 종양 성장이다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석으로 측정하여, 조절인자의 존재 시 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% (예를 들어, 적어도 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소된다. 일부 양상에서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시, 조절인자의 존재 시 적어도 20%만큼 감소된다.
일부 양상에서, 표 5의 단백질은 ADGRB이고, 표 2의 단백질은 PD-L1이며, 다운스트림 활성은 박테리아 세포 또는 세포사멸 세포의 포식이다. 일부 양상에서, 포식률은 조절인자의 존재 시 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% (예를 들어, 적어도 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소된다.
일부 양상에서, 표 5의 단백질은 ADGRB이고, 표 2의 단백질은 PD-L1이고, 다운스트림 활성은 T 세포 활성화이다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% (예를 들어, 적어도 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소된다. 일부 양상에서, T 세포 활성화는 조절인자의 존재 시 적어도 20%까지 증가된다.
C. 소분자
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 소분자이다. 소분자는 바람직하게는 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질 또는 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 정의된 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 분자이다. 결합 소분자는 공지된 방법론을 사용하여 식별되고 화학적으로 합성될 수 있다(예를 들어, PCT 국제출원 공개공보 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 소분자는 일반적으로 약 2000달톤 미만의 크기(예를 들어, 약 2000, 1500, 750, 500, 250 또는 200달톤 미만의 크기)이며, 이 이러한 유기 소분자는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있으며 잘 알려진 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 식별될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대한 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 잘 알려져 있음이 주목된다(예를 들어, PCT 국제출원 공개공보 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 소분자는, 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 하이드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, N-치환된 하이드라진, 하이드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 다이설파이드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카바메이트, 카보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭사이드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 감소된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)) 감소된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 증가된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)) 증가된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 감소된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)) 감소된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 증가된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)) 증가된다.
일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 감소된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)) 감소된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 증가된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)) 증가된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 감소된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)) 감소된다. 일부 양상에서, 소분자의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 증가된다(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)) 증가된다.
D. 항체 및 항원 결합 단편
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 양상에서, 항원-결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인이다. 일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1의 단백질에 결합한다. 다른 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2의 단백질에 결합한다.
일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성(예를 들어, 본원의 섹션 IIIB에 기재된 다운스트림 활성, 예를 들어, CAF 수축성, 면역 체크포인트 억제, 세포 증식 억제, 표적 인산화 조절, 세포 이동 억제, 종양 형성 억제, 세포 침윤 억제, 대식세포 분극화, 식균작용의 조절, 파골세포 분화, 신호 전달 경로의 활성화, 또는 사상충 형성)은 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예: 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30 %-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%) 감소)된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성(예를 들어, 본원 섹션 IIIB에 기재된 다운스트림 활성)은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 양상에서, 항원-결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인이다. 일부 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5의 단백질에 결합한다. 다른 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6의 단백질에 결합한다.
일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성(예를 들어, 본원의 섹션 IIIB에 기재된 다운스트림 활성, 예를 들어, CAF 수축성, 면역 체크포인트 억제, 세포 증식 억제, 표적 인산화 조절, 세포 이동 억제, 종양 형성 억제, 세포 침윤 억제, 대식세포 분극화, 식균작용의 조절, 파골세포 분화, 신호 전달 경로의 활성화, 또는 사상충 형성)은 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예: 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30 %-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%) 감소)된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성(예를 들어, 본원 섹션 IIIB에 기재된 다운스트림 활성)은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
E. 펩티드
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질에 결합하는 펩티드이다. 펩티드는 자연 발생적일 수 있거나 조작될 수 있는 펩티드일 수 있다. 일부 양상에서, 펩티드는 표 1의 단백질, 표 2의 단백질, 또는 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 단편이다. 펩티드는 전장 단백질과 같거나, 더 적거나, 더 큰 친화도로 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 펩티드는 전장 단백질의 모든 기능을 수행한다. 다른 양상에서, 펩티드는 전장 단백질의 모든 기능을 수행하는 것은 아니다.
일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질에 결합하는 펩티드이다. 펩티드는 자연 발생적일 수 있거나 조작될 수 있는 펩티드일 수 있다. 일부 양상에서, 펩티드는 표 5의 단백질, 표 6의 단백질, 또는 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 단편이다. 펩티드는 전장 단백질과 같거나, 더 적거나, 더 큰 친화도로 결합 파트너에 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 펩티드는 전장 단백질의 모든 기능을 수행한다. 다른 양상에서, 펩티드는 전장 단백질의 모든 기능을 수행하는 것은 아니다.
일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 펩티드의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
F. 모방체
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질에 결합하는 모방체, 예를 들어, 분자 모방체이다. 모방체는 표 1의 단백질, 표 2의 단백질, 또는 표 1의 단백질 또는 표 2의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 분자 모방체일 수 있다. 일부 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행할 수 있다. 다른 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행하는 것은 아니다.
일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 1의 단백질과 표 2의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 1의 단백질 및/또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
일부 양상에서, 조절인자 또는 후보 조절인자는 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질에 결합하는 모방체, 예를 들어, 분자 모방체이다. 모방체는 표 5의 단백질, 표 6의 단백질, 또는 표 5의 단백질 또는 표 6의 단백질에 결합하는 또 다른 단백질의 분자 모방체일 수 있다. 일부 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행할 수 있다. 다른 양상에서, 모방체는 모방된 폴리펩티드의 모든 기능을 수행하는 것은 아니다.
일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 5의 단백질과 표 6의 단백질의 결합은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 감소(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-100%)만큼 감소)된다. 일부 양상에서, 모방체의 존재 시 표 5의 단백질 및/또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성은 증가(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 100% 초과(예를 들어, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 또는 100% 초과)만큼 증가)된다.
V.
식별된 단백질-단백질 상호작용의 조절인자를 포함하는 치료 방법
일부 양상에서, 본원에 기재된 단백질-단백질 상호작용의 조절인자는 병리학적 상태, 질병, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 진행을 치료하거나 지연시키기 위해 사용된다.
일부 양상에서, 조절인자는 조절인자가 투여되었던 개체에서 단백질-단백질 상호작용의 다운스트림 활성, 예를 들어, 종양 형성 또는 종양 성장의 양, 강도 또는 기간을 증가시키거나 감소시킨다.
A.
암
일부 양상에서, 본원에 기재된 단백질-단백질 상호작용의 조절인자(예를 들어, LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자; PD-L1과 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자; 또는 ADGRB1과 ICOSLG 사이의 상호작용의 조절인자), 예를 들어, 소분자, 항체, 항원-결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 siRNA는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 사용된다. 일부 양상들에서, 대상체는 인간이다. 암은 고형 종양 암 또는 비-고형 종양 암일 수 있다. 고형암 종양에는 방광암, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 폐암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암 또는 전립선암, 또는 이의 전이 형태기 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양상에서, 암은 방광암이다. 방광암의 또 다른 양상은 요로상피 암종, 근육 침윤성 방광암(MIBC) 또는 비-근육 침윤성 방광암(NMIBC)을 포함한다. 일부 양상에서, 방광암은 전이성 요로상피암(mUC)이다. 일부 양상에서, 암은 유방암이다. 유방암의 또 다른 양상은 호르몬 수용체-양성(HR+) 유방암, 예를 들어 에스트로겐 수용체-양성(ER+) 유방암, 프로게스테론 수용체-양성(PR+) 유방암, 또는 ER+/PR+ 유방암을 포함한다. 유방암의 다른 양상에는 HER2-양성(HER2+) 유방암이 포함된다. 유방암의 또 다른 양상에는 삼중 음성 유방암(TNBC)이 포함된다. 일부 양상에서, 유방암은 초기 유방암이다. 일부 양상에서, 암은 폐암이다. 폐암의 추가 양상은 표피 성장 인자 수용체-양성(EGFR+) 폐암을 포함한다. 폐암의 다른 양상은 표피 성장 인자 수용체-음성(EGFR-) 폐암을 포함한다. 폐암의 또 다른 양상은 비-소세포 폐암, 예를 들어 편평 폐암 또는 비-편평 폐암을 포함한다. 폐암의 다른 양상에는 소세포 폐암이 포함된다. 일부 양상에서, 암은 두경부암이다. 두경부암의 또 다른 양상은 두경부 편평 세포 암종(SCCHN)을 포함한다. 일부 양상에서, 암은 신장암이다. 신장암의 또 다른 양상은 신장 세포 암종(RCC)을 포함한다. 일부 양상에서, 암은 간암이다. 간암의 또 다른 양상은 간세포 암종을 포함한다. 일부 양상에서, 암은 전립선암이다. 전립선암의 다른 양상은 거세저항성 전립선암(CRPC)을 포함한다. 일부 양상에서, 암은 고형 종양의 전이 형태이다. 일부 양상에서, 고형 종양의 전이성 형태는 흑색종, 유방암, 결장직장암, 폐암, 두경부암, 방광암, 신장암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암의 전이성 형태이다. 일부 양상에서, 암은 전이성 요로상피 암종(mUC)이다. 일부 양상에서, 암은 비-고형 종양 암이다. 비-고형 종양 암에는 B 세포 림프종이 포함되나 이에 제한되지 않는다. B 세포 림프종의 또 다른 양상에는, 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 균상식육종(MF)이 포함된다.
B. 병용 요법
전술한 치료 및 예방 방법의 일부 양상에서, 상기 방법은 개체에게 적어도 하나의 추가 요법(예를 들어, 1, 2, 3, 4가지 또는 4가지 초과의 추가 요법)을 투여하는 단계를 포함한다. 조절인자는 적어도 하나의 추가 요법 전에, 이와 동시에 또는 후에 개체에게 투여될 수 있다.
C. 전달 방법
본원에 기재된 방법에서 사용되는 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 단백질-단백질 상호작용 조절인자, 예를 들어, 소분자, 항체, 항원 결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 siRNA)은, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경피, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 척수강내, 비강내, 질내, 직장내, 국소적, 종양내, 복막내, 결막하, 방광내, 점막내, 심낭내, 제대내, 안구내, 안와내, 경구, 경피, 유리체내(예를 들어, 유리체강내 주사에 의해), 점안액에 의해, 흡입에 의해, 주사에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포에 직접적으로 국소 관류조에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림으로 또는 지질 조성물로를 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 이용되는 조성물은 또한 전신 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자들 (예를 들어, 투여되는 화합물 또는 조성물 및 치료될 상태, 질환 또는 질환의 중증도)에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태들에서, 단백질-단백질 상호작용의 조절인자는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식, 흡입, 척추강내, 뇌실내 또는 비강내 투여된다. 투약은 부분적으로는 투약이 단기인지 만성인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사, 가령, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 단백질-단백질 상호작용의 조절인자(및 임의의 추가 치료제)는 우수 의료 관행에 합치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요소가 포함된다. 상기 조절인자는 그럴 필요는 없지만 문제의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 선택적으로 제형화되고/되거나 동시에 투여된다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 제형에 존재하는 조절인자 또는 면역접합체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
VI.
변경된 결합 프로파일을 갖는 생물학적 소포를 식별하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 변경된 결합 프로파일을 갖는 생물학적 소포(BV)를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 하나 이상의 고체 표면에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계; (b) 관심 BV와 단계 (a) 집합체를 접촉시키는 단계; (c) 관심 BV와 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 상호작용 프로파일을 식별하는 단계; 및 (d) 관심 BV의 상호작용 프로파일을 대조군 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 관심 BV의 상호작용 프로파일과 대조군 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 관심 BV가 변경된 결합 프로파일을 갖는 것으로 식별된다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 단백질, 예를 들어, 표 4의 5%-15%, 15%-25%, 25%-35%, 35%-455, 45%-55%, 55%-65%, 65%-75%, 75%-85%, 85%-95%, 또는 95%-100%의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850, 적어도 900, 적어도 950, 적어도 1000, 적어도 1050, 적어도 1100, 적어도 1150개, 또는 1195개 모두의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다, 예를 들어, 표 4의 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 또는 1195개 모두의 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 먹이 단백질(예를 들어, STM 단백질)의 세포외 도메인은 천연 형태, 예를 들어, 야생형 단백질에서 관찰되는 형태를 갖는다. 일부 양상에서, 먹이 단백질(예를 들어, STM 단백질)의 세포외 도메인은 천연의 번역후 변형을 포함한다.
일부 양상에서, 관심 BV는 조작된 BV, 예를 들어, 변형되어있는(예를 들어, 이종 단백질, 예를 들어, 수용체를 발현하도록 변형되어 있는) 모 세포로부터 유래된 BV이다. 대조군 BV는, 예를 들어, 대조군 프로세스에 의해 생산된 BV 또는 변형되지 않은 모 세포로부터 유래된 BV일 수 있다.
일부 양상에서, BV는 약물 전달 비히클로서 사용하기 위한 BV이다. 대조군 BV는, 예를 들어, 원하는 약물 전달 비히클 특성을 갖는 BV일 수 있다. 일부 양상에서, 상기 방법은 품질 관리, 예를 들어, EV의 결합 프로파일의 예상치 못한 변화(예를 들어, 표적 수용체의 과발현, 치료제의 추가, 또는 EV를 생성하는 세포의 변형으로부터 발생하는 변화)를 검출하기 위해 사용된다.
일부 양상에서, 관심 BV는대상체의 샘플로부터 유래한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 얻은 EV에 대한 수용체의 편향되지 않은 프로파일링에 사용된다(예를 들어, 상이한 조직, 세포 유형, 종양 세포주 또는 면역 세포에 의해 생산된 EV의 비교에 사용됨). 일부 양상에서,관심 BV 및 대조군 BV는 상이한 조직 또는 상이한 세포 유형으로부터 유래한다. 일부 양상에서,관심 BV는 질환 조직(예를 들어, 종양 조직)으로부터 유래하고 대조군 BV는 건강한 조직으로부터 유래한다.
VII.
세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법
A.
세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 세포주를 변형시키는 단계; 및 (b) 세포주에 의해 생성된 생물학적 소포(BV)의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 세포주는 포유동물 세포주일 수 있다. 일부 양상에서, 포유동물 세포주는 뉴런 세포주, 섬유모세포 세포주 또는 면역 세포주이다. 일부 양상에서, 면역 세포주는 T-세포, B-세포 또는 단핵구 중 하나 이상을 포함하며(예를 들어, T-세포로 구성되거나, B-세포로 구성되거나, 단핵구로 구성되며), 이는 예를 들어, T 세포주, B 세포주 또는 단핵구 세포주이다.
일부 양상에서, 세포주는 관심 조직 유형(예를 들어, 질병 또는 건강한 조직 유형) 또는 관심 세포 유형을 나타내는(예를 들어, 이로부터 유래된) 포유동물 세포주 또는 관심 종양을 나타내는(예를 들어, 이로부터 유래된) 세포주(예를 들어, 종양 세포주)이다. 일부 양상에서, 세포주(예를 들어, 포유동물 세포주)는 대상체, 예를 들어, 질환을 갖는 대상체로부터 얻은 샘플로부터 유래된다.
예시적인 막-출아제는 본원의 섹션 III(C)에 제공된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, 세포주에서 막-출아제의 발현은 유도성이다. 세포주에 도입될 수 있는 막-출아제의 유도성 발현을 위한 예시적인 구조체는 (a) 소분자 추가 후 막-출아제의 발현을 경감시키거나 억제하는 유도성 프로모터(예를 들어, 세포 투과성 소분자), 예를 들어, T-REXTM 시스템; (b) 유도시 막-출아제를 신속하게 분해시키는 소분자-유도성 분해 시스템(예를 들어, TIR1 옥신 유도성 데그론(AID) 시스템); 및 (c) 막-출아제가 분해 도메인을 포함하고 유도시 단백질을 분해로부터 보호하는 소분자-유도성 안정화 시스템(예를 들어, Shield-1 - FKBP 시스템)을 포함한다. 구조체들의 통합은, 예를 들어, CRISPR-Cas9 또는 게놈 공학 기술을 사용하여 구조체들을 세이프 하버 유전자좌에 삽입함으로써 수행될 수 있다. 또는 PiggyBac 트랜스포존 시스템(SBI)과 같은 무작위 통합 방법을 사용할 수 있다. 세포주에서 막-출아제의 발현은 원하는 시점에서 유도될 수 있으므로; 세포주인 BV의 생산은 어떤 시점에서라도 유도될 수 있다.
일부 양상에서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 BV에서 하나 이상의 관심 막-결합 단백질(예를 들어, 하나 이상의 관심 수용체)의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 하나 이상의 고체 표면 상에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)에서 표적 폴리펩티드의 집합체를 BV와 접촉시키는 단계; 및 (c) BV와 표적 폴리펩티드 집합체의 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출하여 상호작용 프로파일을 식별하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 수행된다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 단백질, 예를 들어, 표 4의 5%-15%, 15%-25%, 25%-35%, 35%-45%, 45%-55%, 55%-65%, 65%-75%, 75%-85%, 85%-95%, 또는 95%-100%의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드들의 집합체는 표 4의 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850, 적어도 900, 적어도 950, 적어도 1000, 적어도 1050, 적어도 1100, 적어도 1150개, 또는 1195개 모두의 단백질의 세포외 도메인을 포함한다, 예를 들어, 표 4의 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 또는 1195개 모두의 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 먹이 단백질(예를 들어, STM 단백질)의 세포외 도메인은 천연 형태, 예를 들어, 야생형 단백질에서 관찰되는 형태를 갖는다. 일부 양상에서, 먹이 단백질(예를 들어, STM 단백질)의 세포외 도메인은 천연의 번역후 변형을 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 BV의 세포질 단백질 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, BV의 루멘에 존재하는 단백질을 특성화하는 단계를 포함함).
B.
세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 세포주의 상호작용 프로파일 변화를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 세포주를 변형시키는 단계; (b) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (c) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (d) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화가 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 세포주의 상호작용 프로파일 변화를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (b) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (c) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화가 식별된다.
일부 양상에서, 상기 방법은 세포주를 제1 시점 이후 및 제2 시점 전에 자극에 노출시키는 단계를 포함하므로; 이 방법을 사용하여 자극에 대한 노출의 결과로 발생하는 세포주의 상호 작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별할 수 있다. 자극은, 예를 들어, 신호를 유도하는 조건 또는 제제, 질병 관련 상태를 유도하는 조건 또는 제제 및/또는 분화를 유도하는 조건 또는 제제일 수 있다. 일부 양상에서, 세포주는 면역 세포주이고 질환 관련 상태는 면역 고갈이다.
다른 양상에서, 상기 방법은 세포주를 자극에 노출시키는 단계를 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 양상에서, 제1 시점과 제2 시점은 세포주의 분화 중에 상이한 단계가 되도록 선택되거나, 또는 제1 시점과 제2 시점에서 생산된 BV를 평가하여 세포주가 이 시점들 사이에서 분화되었는지 여부를 결정한다.
일부 양상에서, 이 방법은 하나 이상의 추가 시점들, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10개 이상의 추가 시점들에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 제2 시점 이후에 세포주를 자극에 노출시키는 단계, 예를 들어, 하나 이상의 추가 시점 이전에 세포주를 자극에 노출시키는 단계를 포함한다.
세포주는 포유동물 세포주일 수 있다. 일부 양상에서, 포유동물 세포주는 뉴런 세포주, 섬유모세포 세포주 또는 면역 세포주이다. 일부 양상에서, 면역 세포주는 T-세포, B-세포 또는 단핵구 중 하나 이상을 포함하며(예를 들어, T-세포로 구성되거나, B-세포로 구성되거나, 단핵구로 구성되며), 이는 예를 들어, T 세포주, B 세포주 또는 단핵구 세포주이다.
일부 양상에서, 세포주는 관심 조직 유형(예를 들어, 질병 또는 건강한 조직 유형) 또는 관심 세포 유형을 나타내는(예를 들어, 이로부터 유래된) 포유동물 세포주 또는 관심 종양을 나타내는(예를 들어, 이로부터 유래된) 세포주(예를 들어, 종양 세포주)이다. 일부 양상에서, 세포주(예를 들어, 포유동물 세포주)는 대상체, 예를 들어, 질환을 갖는 대상체로부터 얻은 샘플로부터 유래된다.
예시적인 막-출아제는 본원의 섹션 III(C)에 제공된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, 세포주에서 막-출아제의 발현은 유도성이다. 예시적인 막-출아제는 본원의 섹션 III(C)에 제공되며, 예시적인 유도성 구조체들은 상기 섹션 VII(A)에 기재되어 있다. 모 세포주에서 막-출아제의 발현 및 이에 따른 모 세포주에 의한 BV의 생산은 임의의 원하는 시점에서 유도될 수 있다. 예를 들어, 일부 양상에서, 막-출아제의 발현은 제1 시점, 제2 시점 및 선택적으로 하나 이상의 추가 시점에서 유도된다. 일부 양상에서, 막-출아제의 발현은 제1 시점과 제2 시점 사이의 구간에서 유도되지 않는다, 예를 들어, 막-출아제는 제1 시점과 제2 시점 사이의 구간에서 발현되지 않는다.
일부 양상에서, 제1 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 각각의 BV 상에서의 하나 이상의 관심 막-결합 단백질(예를 들어, 하나 이상의 관심 수용체)의 수준을 상기 섹션 VII(A)에 기재된 바와 같이 결정하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 제1 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV의 세포질 단백질 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, 제1 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV의 내강에 존재하는 단백질을 특성화하는 단계를 포함한다).
C.
세포주의 상호작용 프로파일을 비교하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 2개의 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 막-출아제를 포함하도록 각각의 세포주를 변형시키는 단계; (b) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (c) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (d) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이가 식별된다.
일부 양상에서, 본 발명은 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 2개의 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; (b) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계; 및 (c) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이로 인해 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이가 식별된다.
일부 양상에서, 제1 세포주 및 제2 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 양상에서, 제1 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 세포주에 의해 생산된 BV는 상이한 조직 또는 상이한 세포 유형으로부터 유래된다. 일부 양상에서, 제1 세포주에 의해 생산된 BV는 질환 조직(예를 들어, 종양 조직)으로부터 유래하고 제2 세포주에 의해 생산된 BV는 건강한 조직으로부터 유래한다.
예시적인 막-출아제는 본원의 섹션 III(C)에 제공된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, 세포주에서 막-출아제의 발현은 유도성이다. 예시적인 막-출아제는 본원의 섹션 III(C)에 제공되며, 예시적인 유도성 구조체들은 상기 섹션 VII(A)에 기재되어 있다.
일부 양상에서, 제1 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 각각의 BV 상에서의 하나 이상의 관심 막-결합 단백질(예를 들어, 하나 이상의 관심 수용체)의 수준을 상기 섹션 VII(A)에 기재된 바와 같이 결정하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 제1 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV 및 제2 시점에서 세포주에 의해 생산된 BV의 세포질 단백질 프로파일을 특성화하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 이종 막-출아제를 포함하는 BV를 특징으로 하며, 이 때 BV는 (i) 유도성 대조군하에서 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포주를 제공하는 단계; (ii) 막-출아제의 발현을 유도하는 단계, 및 (iii) 모 세포주로부터 BV를 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 막-출아제는 HIV gag 단백질이다. 일부 양상에서, 모 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 양상에서, BV는 세포외 소포(EV)이다.
VIII.
생물학적 소포를 이용한 막 단백질 활성의 평가 방법
일부 양상에서, 본 발명은 막-결합 단백질의 효소 활성을 평가하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 단백질을 포함하는 생물학적 소포(BV)에서 효소 활성에 대한 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
예시적인 BV는 본원 섹션 III(B)에 기재되어 있다. 일부 양상에서, 막-결합 단백질은 BV 및/또는 이의 모 세포에 대해 내인성이다, 즉, 내인성 막-결합 단백질의 효소 활성은 상기 방법을 사용하여 평가된다.
다른 양상에서, BV 막-결합 단백질은 BV의 외부 표면에 존재하는 이종 막-결합 단백질이다, 즉, 이종 막-결합 단백질의 효소 활성은 상기 방법을 사용하여 평가된다. 이종 막-결합 단백질을 포함하는 BV는 본원의 섹션 II에 기재되어 있다.
일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질이다. 다른 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편이다. 일부 양상에서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커(예를 들어, BV의 막 표면에 단백질 단편을 고정시키는 앵커, 예를 들어, 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드)이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 펩티다제이고 효소 활성에 대한 분석은 펩티다제 활성에 대한 분석, 예를 들어, 펩티다제의 하나 이상의 공지 또는 추정 기질의 분해에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 프로테아제이고 효소 활성에 대한 분석은 프로테아제 활성에 대한 분석, 예를 들어, 프로테아제의 하나 이상의 공지 또는 추정 기질의 분해에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 키나제이고 효소 활성에 대한 분석은 키나제 활성에 대한 분석, 예를 들어, 키나제의 하나 이상의 공지 또는 추정 기질의 인산화에 대한 분석이다.
일부 양상에서, 막-결합 단백질은 포스파타제이고 효소 활성에 대한 분석은 포스파타제 활성에 대한 분석, 예를 들어, 포스파타제의 하나 이상의 공지 또는 추정 기질의 탈인산화에 대한 분석이다.
IX.
생물학적 소포를 정제하는 방법
일부 양상에서, 본 발명은 배양 배지(예를 들어, 액체 배양 배지) 또는 대상체의 샘플(예를 들어, 액체 샘플, 예를 들어, 소변 샘플, 혈액 샘플, 또는 소화된 조직 샘플)로부터 얻은 생물학적 소포(BV)를 정제하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 BV(예를 들어, 배양 배지 중의 BV)를 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 일반 소포 결합제 단백질을 포함하는 고체 표면과 접촉시키는 단계를 포함한다.
표 8. 일반 소포 결합제 유전자
표 9. 일반 소포 결합제 유전자 및 점수의 목록
예시적인 BV는 본원 섹션 III(B)에 기재되어 있다. BV는 변형되지 않은 BV일 수 있거나 본원 섹션 II에 기재된 외인성 단백질(예를 들어, 이종 막-결합 단백질, 예를 들어, 전장 이종 막-결합 단백질 또는 단백질 단편, 태그, 및 앵커를 포함하는 이종 막-결합 단백질)을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, BV는 막-출아제를 포함하고 이는 (i) 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 모 세포로부터 BV를 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된다.
고체 표면은 친화성 정제에 적합한 임의의 고정 표면(stationary surface), 예를 들어, 컬럼(예를 들어, 단백질 A-작용기화된 비드를 포함하는 컬럼), 비드, 평면 또는 플레이트일 수 있다.
고체 표면은 임의의 적절한 방법을 사용하여 표 8 또는 표 9의 단백질 중 하나 이상을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질에 대해 친화성을 갖는 모이어티를 포함하고, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질과 접촉(예를 들어, 이러한 단백질로 세척)되므로, 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질을 고체 표면에 고정시킨다. 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질은 모이어티(예를 들어, 태그)를 포함하도록 변형될 수 있고, 고체 표면에 포함된 모이어티의 친화성은 모이어티 또는 태그에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 한 양상에서, 고체 표면은 단백질 A를 포함하고 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질은 Fc 영역을 포함하도록 변형되어 있다.
일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 단일 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 HAVCR1, MAG, TIMD4, SIGLEC7, CD300LF, SIRPA, SIGLEC9, MRC1, SIGLEC8, 또는 CD300LG를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 HAVCR1을 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 MAG를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 SIGLEC7을 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 CD300LF를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 HAVCR1, MAG, TIMD4, SIGLEC7, CD300LF, SIRPA, SIGLEC9, MRC1, SIGLEC8, 및 CD300LG 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 10개 모두 포함한다.
일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 25개 초과의 단백질을 포함한다, 예를 들어, 표 8 또는 표 9의 2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 또는 20-25개 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 단백질 중 2개를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 단백질 중 3개를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 단백질 중 4개를 포함한다. 일부 양상에서, 고체 표면은 표 8 또는 표 9의 단백질 중 5개를 포함한다.
일부 양상에서, 표 8 또는 표 9의 단백질 중 하나 이상은 인간 단백질이다. 일부 양상에서, BV는 인간 세포로부터 유래된다.
일부 양상에서, BV를 고체 표면과 접촉시키는 단계는 BV를 포함하는 대상체의 샘플(예를 들어, 액체 샘플, 예를 들어, 소변 샘플, 혈액 샘플 또는 소화된 조직 샘플) 또는 배양 배지를 고체 표면 위에서 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 배양 배지는 조건화 배지이다. 일부 양상에서, 배양 배지 또는 샘플은 BV를 생산하였던 하나 이상의 모 세포를 포함한다. 다른 양상에서, 배양 배지 또는 샘플은 모 세포를 포함하지 않는다, 예를 들어, 모 세포를 제거하도록 가공되어 있다.
일부 양상에서, 상기 방법은 고체 표면으로부터 BV를 탈착(예를 들어, 용출)하는 단계를 추가로 포함한다. BV는 고체 표면으로부터 BV를 탈착하는 데 적합한 임의의 방법을 사용하여 용출될 수 있다. 예를 들어, 세척(예: 철저한 세척, 예를 들어, 고염 세척) 및/또는 적절한 리간드를 사용하여 EV를 탈착시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 양상에서, 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질은 SIGLEC 패밀리 단백질의 구성원을 포함하며 하나 이상의 시알로글리칸이 용출에 사용된다.
일부 양상에서, 고체 표면은 단백질 A-작용기화 비드를 포함하는 컬럼이고, 상기 방법은 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질을 포함하는 조건화 배지를 컬럼 위로 유동시키는 단계(이 때 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질은 Fc 영역(예를 들어, 인간 Fc 영역)을 포함하도록 변형되어 있어, 표 8 또는 표 9의 하나 이상의 단백질을 고정시키며); 배양 배지 또는 BV를 포함하는 대상체로부터 얻은 샘플 또는 배양 배지를 컬럼 위에서 유동시키는 단계; 및 이러한 컬럼으로부터 BV를 용출하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 상기 방법은 초원심분리-기반 정제 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 방법은 초원심분리를 포함하지 않는다.
일부 양상에서, 상기 방법은 BV의 대규모 정제에 사용된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 적어도 10 mL의 샘플 부피를 사용하여 수행된다, 즉, 대상체로부터 얻은 적어도 10 mL의 배양 배지 또는 샘플이 상기 방법에 따라 처리된다. 예를 들어, 일부 양상에서, 상기 방법은 적어도 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 50 mL, 55 mL, 60 mL, 65 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL, 90 mL, 95 mL, 또는 100 mL의 샘플 부피를 사용하여 수행된다(예를 들어, 10-20 mL, 20-30 mL, 30-40 mL, 40-50 mL, 50-60 mL, 60-70 mL, 70-80 mL, 80-90 mL, 또는 90-100 mL의 샘플 부피를 사용하여 수행된다). 일부 양상에서, 상기 방법은 적어도 50 mL의 샘플 부피를 사용하여 수행된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 적어도 100 mL의 샘플 부피를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 일부 양상에서, 상기 방법은 적어도 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, 550 mL, 600 mL, 650 mL, 700 mL, 750 mL, 800 mL, 850 mL, 900 mL, 950 mL, 또는 1 L의 샘플 부피를 사용하여 수행된다(예를 들어, 100-200 mL, 200-300 mL, 300-400 mL, 400-500 mL, 500-600 mL, 600-700 mL, 700-800 mL, 800-900 mL, 또는 900 mL-1 L의 샘플 부피를 사용하여 수행된다).
이들 방법에 따라 정제된 BV는 본원에 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 공보 및 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
X.
실시예
실시예 1. 세포막 내 세포외 단백질-단백질 상호작용 검출을 위한 세포외 소포-기반 스크린
A.
배경
막 단백질은 세포외 신호를 세포내 반응으로 번역하는 데 중요한 역할을 한다. 이의 세포 표면 노출로 인해, 치료 분자에 대한 접근성이 증가하고 세포 거동을 조율하는 능력이 생기게되어, 매력적인 약물 표적이 된다. 따라서, 막 단백질이 인간 유전자의 ~30%만 구성하지만 모든 약물 표적의 60% 이상을 차지한다는 것은 놀라운 일이 아니다(Santos 외, Nat. Rev. Drug Discov., 16: 9-34, 2016).
따라서 수용체-리간드 상호작용의 식별은 세포외 환경에서 발생하는 세포 통신을 이해하는 데 중요하다. 그러나 막 단백질과 그 상호 작용 파트너의 특성화에서의 진전은 세포질 단백질의 특성화 보다 훨씬 뒤떨어져 있다. 이는 부분적으로 막 단백질을 그 고유한 형태로 발현하는 데 어려움이 있고 막 단백질에 공통적인 약한 상호 작용을 검출할 수 있는 충분한 만감도를 갖는 기술이 부족하기 때문이다(Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017; Wright, Mol. Biosyst. 5: 1405-1412, 2009). 일반적인 단백질-단백질 상호작용 발견을 위해 설계된 방법은 잘 접힌 정제 단백질(예를 들어, 마이크로어레이 또는 플레이트 기반 스크리닝 방법(Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017; Wright 외, Biochem. Soc. Trans,, 38: 919-922, 2010)), 또는 막과 세척액으로부터의 단백질 추출을 견딜 수 있는 강한 상호작용(예를 들어, 친화성 정제-질량 분석법(AP/MS) (Huttlin 외, bioRxiv, doi:10.1101/2020.01.19.905109, 2020))을 필요로 한다. 몇몇 보다 새로운 접근법들은 약한 상호작용을 강화하기 위해 다량체화를 사용함으로써 많은 막 단백질 상호작용들을 캡처할 수 있었지만(Bushell 외, Genome Res., 18: 622-630, 2008; Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019), 단백질이 그 고유한 막 내용물로부터 제거되기 때문에 여전히 중요한 상호 작용을 놓칠 수 있다.
생리학적 막은 상호작용에 참여할 수 있는 지질, 스테롤, 단백질 및 글리칸의 복잡한 혼합을 포함한다(Goi, Biochim. Biophys. Acta - Biomembr., 1838: 1467-1476, 2014). 또한, 막은 개별적으로 약한 단백질-단백질 상호작용을 클러스터링 및 배향에 의해 강화할 수 있다(Banjade 외, Elife, 3: 1-24, 2014; Taylor 외, Cell, 169: 108-119e.20, 2017; Hu 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110: 15283-15288, 2013). 수용체-리간드 상호 작용의 이러한 막 의존적 양상들은 스크리닝 방법 개발을 방해하는 주요한 문제점이다. 최근의 근접성-기반 기술의 발전으로 막에서의 상호 작용이 검출될 수 있으며 일시적인 결합제 연구에 중요한 역할을 해왔다(Geri 외, Science, 367: 1091-1097, 2020; Li 외, Cell, 180: 373-386.e15, 2020, Gingras 외, Curr. Opin. Chem. Biol., 48: 55-54, 2019). 그러나 이러한 기술들은 종종 직접적인 상호작용 파트너들을 인근의 구경꾼과 구별하는 데 어려움이 있어, 일반적으로 동일한 세포 내의 결합 파트너들에 초점을 맞추며(in-cis 상호 작용), 종종 고 처리량 연구와 호환되지 않는다. 나노디스크 및 리포좀 입자와 같은 다른 접근법들은 막 단백질 재구성을 가능하게 하여 어려운 수용체들을 연구하는 데 성공적으로 사용되어 왔다(Rouck 외, FEBS Lett., 591: 2057-2088, 2017; De Franceschi 외, J. Cell Sci., 132: 2019). 그러나 이러한 방법들은 단백질 정제를 필요로 하는데, 이러한 정제는 고유한 접힘을 방해할 수 있고 잠재적인 단백질 또는 비-단백질 보조 인자들을 거의 설명하지 못한다. 그 결과, 세포외 단백질 누화는 기존 데이터세트에서 현저하게 과소표시된 상태로 남아 있다( (Wright 외, Biochem. Soc. Trans., 38: 919-922, 2010; Bausch-Fluck 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 2018). 이러한 제한은 수용체 상호작용체의 특성화에 충분한 처리량과 민감도를 가진, 막 단백질 연구를 위해 특별히 설계된 추가 기술들의 필요성을 강조한다.
막 내부의 수용체 디스플레이 방법에 대한 필요성으로 인해 외피가 있는 바이러스의 구성부들을 활용하여, 수용체들을 포유동물 막에 통합시키는 여러 솔루션에 박차를 가했다. 예를 들어, 상이한 막 단백질들을 제시하는 단순 헤르페스 비리온(VirD)으로 구성된 마이크로어레이는 성공적으로 리간드 발견을 위한 GPCR 라이브러리로서 사용되었다(Hu 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 15283-15288, 2013; Da Syu 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019). 추가로, 재조합 세포외 소포(rEV)라고 불리는 HIV gag 단백질을 포함하는 세포외 소포는 면역화 및 항체 생성을 위한 다중 막관통 단백질(Tucker 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 115: E4990-E4999, 2018) 및 항체 선택 및 리간드-결합 특성화(Willis 외, Biochemistry, 47: 6988-6990, 2008)를 디스플레이하기 위해 사용되어왔다. 이들 rEV는 여러 질병의 세포 통신 및 병인에 소정의 역할을 하는 자연 발생 EV들과 유사한 지질 및 단백질 조성을 가지고 있다(Lavado-Garcia 외, J. Proteome Res., 19: 4516-4532, 2020; Geeurickx 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019). 따라서 rEV에 대한 상호작용체를 정의하면 표시된 관심 수용체의 결합 프로파일과 기본 EV 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
이러한 이전 접근 방식의 한계를 해결하기 위해, 막의 맥락에서 관심 표적의 제시와 직접 단백질-단백질 상호작용 스크린의 견고성을 결합한 분석은 상기 기재한 바와 같이 EV, 예를 들어, rEV를 사용하여 설계되었다. EV는 세포에서 자연적으로 분비되는 나노미터 크기의 지질 이중층으로 구분된 입자이다(Colombo 외, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30: 255-289, 2014). EV는 세포의 내인성 기관(endogenous machinery)을 사용하여 폴딩되고 이들의 고유 막에 삽입된 단백질들을 포함한다. 여기서, EV는 결합능 수용체를 얻기 위한 단백질 무 정제 방법을 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 자연적으로 분비되는 입자를 활용하기 위해, 수용체-리간드 발견을 위한 새로운 플랫폼인 RDIMIS(Receptor-Display In Membranes Interaction Screen)(EVEXIS(세포외 소포(EV) 기반 세포외 상호작용 스크린)라고도 함)가 개발되었다. RDIMIS는 EV에서 발현된 관심 단백질을 STM 엑토도메인의 종합적인 조건화 배지 라이브러리에 대해 스크리닝함으로써 단일-통과 막관통(STM) 단백질 상호작용체들을 신속하고 편향되지 않게 식별할 수 있다(Czajkowsky 외, EMBO Mol. Med., 4: 1015-1028, 2012; Martinez-Martin 외, Cell, 174: 1158-1171.e19, 2018).
RDIMIS는 수용체와 무관한 수용체-리간드 상호 작용을 밝히는 시간 효율적인 방법이므로 EV에 통합될 수 있는 대부분의 관심 표적에 적용할 수 있다. 막 단백질의 상호작용체 프로파일링에는 발현을 위한 플라스미드만 필요하다. EV 컨텍스트는 단순화된 플레이트 기반 시스템에서 단백질을 연구하는 이점을 유지하면서도 시간이 많이 걸리고 불확실한 단백질 정제를 제거한다. EV는 내인성 세포 기관을 사용하여 단백질을 번역하고, 폴딩하여 막에 삽입하므로, 기능성 단백질 발현 가능성이 최적이다. 또한, 조건화 배지에서 직접 STM 라이브러리 단백질을 캡처하여 모든 단백질 정제 단계를 제거하고, 이는 더 고 처리량의 연구를 가능하게 하며 단백질 활성을 손상시키지 않고 자원 소모 정제 단계를 또 한번 최소화시킨다(Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019). 이를 통해 세포가 단백질 및 EV를 생산하는 데 걸리는 시간에 의해 주로 제한되는 약 1주일 안에 관심 막 단백질의 상호작용체 특성화가 가능하다.
rEV 기반 접근법은 태그가 없는 전장 수용체 분자의 사용을 가능하게 하지만, gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인을 사용하면 유사한 결과를 얻을 수 있으며 수용체 통합을 측정하기 위한 파악하기 어려운 고친화성 항체의 필요성을 없앨 수 있다. gD-GPI 태그는 수용체 계열 전반에 걸쳐 작동하며 발현을 직접적으로 BLI로 정량적으로 비교할 수 있다. 이러한 태그화 전략은 또한 엑토도메인과 전장 단백질의 상호작용 프로파일을 직접 비교할 수 있게 하여 막관통 또는 세포질 도메인이 소정의 역할을 할 수 있는 상호작용을 빠르게 식별한다. 마지막으로, gD-GPI 태그는 비-막 단백질을 고정할 수 있는데, 이러한 단백질은 막에 근접한 세포외 기질 또는 분비 인자를 연구하는 방법을 제공한다.
rEV는 또한 고차 복합체 형성에서 소정의 역할을 할 수 있는 세포골격 요소들이 있는 세포질 내강 공간을 포함한다(Banjade 외, Elife, 3: 1-24, 2014; Keerthikumar 외, J. Mol. Biol., 428: 688-692, 2016). rEV는 세포막의 복잡성을 캡처하는 것 외에도, 그 작은 크기와 안정성(Colombo and Raposo, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30: 255-289, 2014)으로 인해 생리학적으로 관련된 맥락에서 고 처리량 스크리닝에 매우 매력적인 수단이 된다. 따라서 본 연구에서 구현된 접근 방식은 높은 적용 범위 집합체에서부터 수용체 계열 또는 단백질 질병 변이체와 같은 더 집중된 라이브러리에 이르기까지 선택한 모든 라이브러리에 결합될 수 있으므로, 쿼리 단백질 품질을 최대화하면서 상호작용체를 민감하고 상대적으로 낮은 리소스-집약적으로 식별할 수 있게 한다.
단백질 상호작용체의 식별 및 복잡하거나 정제하기 어려운 표적들의 디오퍼니제이션(deorphanization) 이상으로, RDIMIS 접근법은 수용체, 막 및 인간 EV 생물학 연구에 광범위하게 적용된다. RDIMIS는 HEK 세포 유래 인간 EV들의 집단에 대해 100개 이상의 소포 특이적 결합제를 식별하였으며 재조합 및 내인적으로 생성된 EV들의 상호작용체가 현저하게 유사하다는 것을 보여주었다. 이는 rEV와 내인성 EV의 프로테옴 및 지질 조성 사이에 강력한 유사성을 보여주는 이전 연구결과와 일치한다(Lavado-Garcia 외, J. Proteome Res., 19: 4516-4532, 2020; Geeurickx 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019). 따라서, 이러한 결합제는 내인성 EV 향성 및 신호전달에 대해 규명할 수 있다. 결과는 EV가 면역조절 단백질(즉, SIGLEC 계열, LILR 계열 및 CD300 계열), 성장 조절 단백질(즉, FGFR4, FLT1 및 NRP 단백질과 같은 성장 인자 수용체 및 여러 수용체-티로신 키나제) 또는 신경 단백질(예를 들어, APP 및 CLSTN 단백질)과 같은 주요 신호전달 단백질과 상호 작용한다는 것을 나타내며, 이는 EV가 세포 간 통신을 중재한다는 생각을 뒷받침한다. 본 연구는 질병-, 조직- 또는 세포-특이적 EV와 이들의 세포 통신 또는 면역 반응에서의 역할에 초점을 맞춘 추후 연구를 위한 단계를 설정한다. 처리량과 재현성을 감안할 때, 이 방법은 전 세계적으로 EV의 품질을 평가하는 방법을 제공한다. EV가 약물 전달을 위한 수단으로 이용되고 있기 때문에(Vader 외, Adv. Drug Deliv. Rev, 106: 148-156, 2016), RDIMIS는 EV 복잡성과 관련된 가변성, 면역원성 및 오프 타겟 효과에 대한 우려를 해결할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 이 플랫폼은 분자 수준에서 EV 기능에 영향을 미치는 플레이어를 규명하는 고유한 툴을 제공하기 때문에, 표적 수용체의 과발현, 치료제 추가 또는 EV를 생성하는 세포의 변형으로 인해 발생하는 EV 결합 프로파일의 예기치 않은 변화를 검출할 수 있다.
B.
막 제시를 위한 세포외 소포체
천연 막에서 수용체-리간드를 발견하는 방법에는 여러 부분들이 필요하다. 첫째, 안정적인 세포막 조각들을 캡처해야 한다. 이는 대부분의 세포에 의해 자연적으로 생성된 지질 이중층 함유 입자인 EV를 정제함으로써 이루어질 수 있다(도 1A-1C)(Colombo 외, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30: 255-289, 2014). EV는 -결합 거대분자들의 숙주를 통합시켜(Keerthikumar 외, J. Mol. Biol., 428: 688-692, 2016), 이들을 세포막 환경의 축소판이 되게 한다(도 2A). 이 환경은 종종 막 단백질 상호작용에 참여하여, EV를 고 처리량 플랫폼에 매우 매력적인 기반이 되게 한다.
둘째, 고 처리량의 민감한 스크리닝에는 대량의 EV가 필요할 수 있다. EV 생산을 최대화하기 위해, 단백질 발현에 효율적인 시스템을 제공하는 EXPI293FTM 세포를 선택하였다(Heath 외, Sci. Rep., 8: 1-12, 2008; Arena 외, MAbs, 11: 977). -986, 2019). EXPI293FTM 세포를 150rpm으로 진탕하면서 EXPI293FTM 발현 배지에서 배양했다. 모든 세포를 37℃5% CO2에서 배양하였다.
EV 생산을 더욱 촉진하기 위해(Geeurickx 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019; Cervera 외, J. Biotechnol., 166: 152-165, 2013), 세포들을 HIV gag 구조체로 형질감염시켰다(도 2B). Gag 발현은 20-500 nm 소포의 수율을 거의 4배 증가시켰다(도 2C).
셋째, EV를 검출하기 위해서는 강력하고 정량적인 방법이 필요하다. 세포는 다른 분자들의 복잡하고 가변적인 배경을 또한 포함하는 주변 배지로 EV를 방출한다. 이로 인해 다운스트림 분석에서 재현 가능한 정량 데이터를 얻는 것이 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해, 1단계 밀도-기반 EV 정제가 최적화되었다. 이는 응집체가 없는 순수하고 일관된 rEV 집단을 제공했다(도 1A 및 1B). 마지막으로, 고 처리량 스크리닝은 필연적으로 각 반응의 규모를 감소시킨다. 이것은 결합된 EV를 강력하고 정량적으로 검출하는 것에 어려움을 만든다. 따라서 레닐라 루시퍼라제(Rluc)는 HIV gag 구조체에 융합되었다. 이것은 거의 1000배 이상의 소포 농도에 선형적으로 비례하는 강력한 발광 신호를 제공했다(도 2D).
다음으로, EV가 수용체 디스플레이를 위한 플랫폼으로 광범위하게 적용 가능한지 여부를 결정하기 위해, gag-Rluc와 함께 태그가 없는 다양한 전장 수용체가 세포에서 과발현되었다. 테스트한 모든 경우에서, 수용체는 수용체에 특이적인 항체를 사용하여 EV에서 쉽게 검출될 수 있었다(도 4A). 더 큰 수용체 세트를 테스트하고 EV에 대한 통합을 측정하기 위해, 수용체 특이적 항체에 의존하지 않는 검출 방법이 필요했다. 이를 해결하기 위해, 관련 없는 수용체 엑토도메인 집합체를 당단백질 D(gD)-글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 태그에 융합시켰다. GPI는 막에서 엑토도메인을 유지시키는 지질 앵커를 제공하는 반면, gD 에피토프 태그는 항-gD 항체를 사용하여 엑토도메인을 검출할 수 있게 한다. 이들 수용체를 소포 내부로의 통합에 대해 테스트하였을 때, 분석된 대부분의 수용체는 항-gD 항체를 사용하여 EV에서 쉽게 검출가능하였다(도 4B, 4C 및 13A). 따라서 gD-GPI 태그화 전략을 사용하면 EV에서 다양한 단백질을 쉽게 검출할 수 있다.
C.
막 단백질을 발현하는 세포외 소포의 생성
HEK293T 또는 EXPI293TM 세포를 (명시된) 관심 수용체 또는 빈 벡터 대조군 및 Rluc(스크리닝을 위해) 또는 mNeonGreen(시각화를 위해)에 융합된 HIV gag를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 모든 플라스미드를 발현 벡터 pRK5(Genentech)에 클로닝하였다. 소포 수확을 위해, 세포를 300 xg에서 10분 동안 회전시킨 후 2000 xg에서 20분 동안 제거하거나(발현이 < 100 mL의 경우) 여과하여 제거했다(발현이 ≥ 100 mL인 경우). 전체 라이브러리 스크린의 경우, rEV 발현을 1L 규모로 수행하였으며 7일 동안 성장시켰다. cOmpleteTM EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche)가 사양에 따라 추가되었다. 정제를 완전히 용해시킨 후, 조건화 배지를 40분 동안 12,000 xg에서 원심분리시켜 남아있는 조밀한 미립자 및 미세소포를 제거했다. 상층액을 튜브당 약 60mL의 부피로 70mL 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브(Beckman Coulter)로 옮겼다. 주사기와 긴 바늘을 사용하여 50% 수크로스 10mL를 튜브 바닥부터 적층시켜 수크로스 쿠션을 형성했다. 샘플은 Ti-45 로터에서 90분 동안 100,000 xg로 원심분리하였다. 소포들이 수크로스 위에 뜬다. 소포 층 위의 배지를 흡인하였다. 2개의 튜브 분량의 쿠션과 소포를 조합하고 PBS를 사용하여 새로운 초원심분리기 튜브에서 70mL로 희석시켰다. 샘플을 100,000 xg에서 다시 원심분리하고 생성된 펠릿을 PBS에 용해시켰다. HALT™ 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)을 1x까지 첨가했다. 모든 원심분리는 4°C에서 수행되었다.
HEK293T 세포를 사용하여 소포에서 과발현 수용체 및 gag 단백질 융합이 검출 가능하다는 것을 확인했다. HEK293T는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 DMEM + GlutaMax에서 배양되었다.
실시예 2. PVR에 대한 결합제 파트너 식별
A.
EV를 이용한 PVR 결합 파트너 식별
EV에서 발현된 수용체가 접근 가능하고 결합능이 있는지 확인하기 위해, 수용체 PVR을 사용하여 개념 증명 연구가 수행되었다.
관심 수용체에 대한 결합 파트너를 식별하려면 rEV가 그 표면에 접근 가능하고 결합 가능한 수용체를 제시해야 한다. 폴리오바이러스 수용체(PVR)가 개념 증명 연구에 사용되었다. PVR은 다양한 결합 친화도의, 잘 특성화된 다양한 세포 표면 발현 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에 유용한 벤치마크이다(Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019). rEV의 PVR이 활성인지 여부를 확인하기 위해, 전장 PVR을 발현하는 rEV를 단리하고 세포 표면에서 발현되는 여러 PVR 결합 파트너에 대한 결합을 테스트했다. PVR-rEV는 PVR 리간드를 발현하는 세포에 선택적으로 결합하며, 테스트 조건하에서 형질감염되지 않은 세포에서는 배경을 무시할 수 있다(도 2E).
다음으로, gD-GPI 전략이 결합-적격 수용체를 제시하는지 여부를 결정하기 위해, PVR 엑토도메인을 gD-GPI 태그에 융합시켰다. gD-GPI 소포는 BLI의 항-마우스 IgG Fc 캡처 바이오센서(ForteBio)를 사용하여 10 μg/mL 마우스 항-gD 항체(Abcam)에 대해 PBS 중 0.1mg/mL의 총 단백질 농도로 측정되었다. 전장 PVR을 발현하는 EV와 유사하게, PVR 엑토도메인-gD-GPI EV는 PVR 리간드를 발현하는 세포에 선택적으로 결합하는데, 이는 태그가 있는 엑토도메인이 결합에 활성이었음을 나타낸다(도 1F). gD 태그는 또한 전자 현미경으로 EV에서 PVR 수용체 발현을 검출할 수 있게 했다(도 4C). 일반적인 소포 염색을 위해, 소포의 현탁액을 포름바르- 및 카본-코팅 TEM 그리드 표면에 15분 동안 흡착시켰다. 증류수로 간단히 헹구고 샘플을 2% 인텅스텐산(PTA)으로 60초 동안 염색한 다음 공기 건조시켰다. gD 에피토프 검출을 위해, 소포를 30분 동안 흡착시키고, Aurion 차단 용액으로 염소 접합체에 대해 30분 동안 차단시켰다. 그런 다음 샘플을 차단 용액에서 1시간 동안 마우스 항-gD(abcam)로 염색하고 염소-항 마우스 12nm 금 접합체를 사용하여 검출했다. 이후 샘플을 15분 동안 PBS로 세척하고, 1분 동안 물로 세척하고, 1분 동안 1% 우라닐 아세테이트로 염색한 후 블롯팅하고 공기 건조시켰다. JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경(TEM)과 GATAN ULTRASCAN® 1000 CCD 카메라를 사용하여 5,000x에서 50,000x까지의 배율로 이미징을 수행했다.
B.
EV 기반 분석과 재조합 단백질을 사용한 분석의 비교
다음으로, 우리는 rEV가 고처리량 분석의 세척 단계 및 처리 지연을 견딜 수 있을 만큼 충분히 단단하게 결합할 수 있는지 여부를 결정했다. 이를 위해, 우리는 전장 PVR 또는 PVR의 gD-GPI 태그 엑토도메인을 제시하는 rEV에서 그리고 알려진 리간드 CD226에 대한 재조합 단량체 PVR에서의 결합 동역학을 결정했다. 비-파괴 기술인 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여, rEV의 큰 크기를 고려할 때 예상된 바와 같이, 두 PVR rEV 유형 모두에 대해 강한 음의 BLI 신호가 관찰되었다(도 2G, 왼쪽 패널). 이는 PVR-rEV가 대조군으로서 인간 IgG와 함께 인큐베이션되었을 때에는 관찰되지 않았으며, 이는 이 신호가 특이적 상호작용임을 시사한다(도 2G, 오른쪽 패널). rEV는 10분 동안 해리가 거의 나타나지 않아 고처리량 스크리닝에 적합하다(도 2G, 오른쪽 패널). 또한 EV는 PVR 단량체에 비해 더 빠른 결합과 더 느린 해리를 달성했으며, 이는 더 높은 친화성 상호작용을 나타내는 것이다(도 2G, 오른쪽 패널). 특히, 세포 기반 분석(도 2E 및 2F)과 일관되게, gD-GPI 태그가 있는 PVR EV는 전장 PVR EV와 유사한 결합 프로파일을 보였으므로, 조작된 수용체가 인-트랜스 결합 파트너들의 검출에 적합함을 추가로 보여주는 것이다.
C.
BLI 방법
BLI 측정은 8채널 OCTET® RED 시스템(ForteBio)을 사용하여 수행되었다. PVR rEV 결합을 위해, CD226-Fc(R&D SYSTEMS®) 또는 천연 인간 IgG(abcam)를 항-인간 IgG Fc 캡처 바이오센서(ForteBio)에 25nM로 로딩했다. 모든 재조합 단백질을 300초 동안 로딩하였다. 모든 측정은 30°C에서 수행되었다. 분석은 Octet® 시스템 데이터 분석 소프트웨어(ForteBio)에서 수행되었다. (PBS 곡선이 표시되지 않은 경우) 기기의 드리프트를 고려하기 위해 PBS 완충액 대조군을 뺀다. 기준선에 정렬시키고 Savitzky-Golay 필터링을 수행했다. 600초 동안 2nm 이상의 결합(association)이 권장된다.
D.
EV 샘플 특성화 방법
EV 샘플의 총 단백질 농도는 샘플 1.5μL를 Quick Start Bradford 단백질 분석 시약(Bio-Rad) 148.5μL와 혼합하여 측정했다. 적정된 BSA 곡선에 대한 농도를 계산하였다. 이 시약에는 막을 투과시키는 메탄올이 포함되어 있으므로 세제를 첨가하지 않았다. NanoSight NTA(Malvern Panalytical)를 사용한 나노입자 추적 분석으로부터 EV 입자 수 및 농도를 계산하였다. 총 단백질 당 0.1mg/mL의 소포를 PBS에서 1000x로 희석하고 488nm 레이저를 사용하여 1분 길이의 기록을 5회 반복했다. 몰 농도를 계산하는 데 사용되었던 입자 농도를 제공하는 NTA 3.4 소프트웨어를 사용하여 기록(trace)을 분석했다.
E.
논의
본 실시예는 전장 천연 단백질 및 연구 중인 수용체 중 gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인이 EV에 통합되며 EV 기반 결합 연구를 할 수 있음을 보여준다. gD-GPI 태그화를 사용하여 엑토도메인을 EV에 고정하면 RDIMIS의 기능이 향상된다. 첫째, 이는 엑토도메인과 전장 단백질의 상호작용 프로파일을 비교할 수 있게 한다. 둘째, 관련이 없는 수용체를 연구할 때, gD-GPI 태그는 종종 사용할 수 없는 수용체 특이적 항체들을 필요로 하지 않으면서 수용체들 전반에 대한 발현 및 국재화를 비교하는 공통 방법을 제공한다. 마지막으로, gD-GPI 태그는 비-막 단백질을 고정할 수 있는데, 이러한 단백질은 막에 근접한 세포외 기질 또는 분비 인자를 연구하는 방법을 제공한다.
EV에서 관심 표적의 수준은 주로 모 세포의 발현 수준에 따라 달라지는 것으로 보인다. 따라서, 저발현 단백질의 경우, 결합 파트너의 효율적인 검출에 충분하게 발현하도록 하기 위해 실험 조건의 최적화가 필요할 수 있다.
실시예 3. RDIMIS는 STM 단백질 상호작용체를 고 처리량으로 식별할 수 있게 한다.
A.
고 처리량 스크린을 위한 EV 및 엑토도메인 라이브러리 설계
다음으로 수용체-리간드 상호작용의 고 처리량 발견에 RDIMIS 시스템이 사용되었다(도 3A).
편향되지 않은 식별을 위해, 관심 단백질을 발현하는 EV는 엑토도메인-Fc 태그 융합으로 발현되는 대부분의 인간 단일 통과 막관통(STM) 단백질로 구성된 이전에 개발된 조건화 배지 라이브러리와의 결합에 대해 평가되었다(Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018). 이러한 라이브러리를 생성하기 위해, 세포를 엑토도메인-Fc 태그 융합을 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시켜, Fc-태그가 있는 엑토도메인을 발현하여 성장 배지로 분비하도록 유도했다. 그런 다음 배지를 단백질 A 코팅 플레이트로 옮겼으며, 플레이트의 각 웰에는 서로 다른 Fc 태그가 있는 엑토도메인이 제공되었다. 이로 인해 고 처리량 스크리닝에 적합한 고정된 엑토도메인의 집합체가 생성되었다(Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018).
동시에, EV 생산을 위한 세포 배양은 관심 수용체 및 gag-레닐라 루시퍼라제(Rluc)를 인코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염되었다(도 3A). 수용체-함유 EV는 EV의 신속한 대규모 단리를 가능하게 하는 최적화된 정제 프로토콜을 사용하여 단리되었다(도 1A). EV를 단리한 후, STM 단백질 라이브러리가 포함된 플레이트와 함께 인큐베이션되었다. 그런 다음 플레이트를 철저히 세척하여 결합되지 않은 EV를 제거했다. 수용체-함유 EV와 웰에 고정된 STM 단백질 사이의 상호 작용을 검출하기 위해, Rluc 기질을 추가하고, 상호 작용이 발생했던 웰에서 형광 신호를 생성했다(도 3A).
B.
PVR EV의 STM 상호작용체
RDIMIS 플랫폼은 PVR-EV(gD-GPI 태그가 있는 PVR 엑토도메인을 보유하는 단리된 EV)의 STM 상호작용체를 연구하는 데 사용되었다. 소포 상에서의 수용체 제시는 BLI을 사용하여 그리고 gD 항체에 대한 rEV의 강력한 결합을 나타내는 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 4D 및 13A). 특히 RDIMIS는 2개의 독립적인 rEV 및 STM 라이브러리 제제에서 재현가능한 다음과 같은 모든 예상되는 PVR 결합 파트너를 식별했다: CD96, CD226, KIR2DL5A, PVRL3, PVRL4 및 TIGIT(도 3B, 파란색)(상관 계수 0.90, 도 16A). 이들 스크린은 샘플의 발현 또는 준비 중의 잠재적 가변성을 통제하기 위해 2개의 독립적인 PVR-EV 제제 및 2개의 독립적인 STM 라이브러리 제제를 사용하여 수행되었다. 더욱이, 중요한 것은, RDIMIS가 태그가 없는 전장 PVR(도 3C)을 보유하는 rEV를 연구하기 위해 활용될 때 히트들이 사실상 동일했다는 것이며, 전체 상관 계수는 0.88이었다(도 16A). 종합하면, 이러한 결과는 rEV 상에서 gD-GPI 태그가 있는 수용체의 발현이 관련 리간드 인-트랜스의 검출을 가능하게 하며, 이는 자동화 워크플로우 개발과 함께, 막 단백질 상호작용체들을, 고 친화도 및 저 친화도 상호작용을 검출함에 개선된 민감도로 그리고 편향되지 않은 방식으로 확실하게 식별할 수 있게 해준다.
C.
B7 게열 단백질의 STM 상호작용체
이 기술의 민감도를 더 벤치마킹하기 위해, 체크포인트 억제제 PD-L1을 포함한 탁월한 면역 수용체들을 포함하는 B7 계열의 면역조절 단백질의 세 가지 구성원을 연구하기 위해 플랫폼을 적용했다. 3개의 단백질 모두 gD-GPI 엑토도메인 융합물로 발현되었으며, 이에 의해 소포에서의 발현을 모니터링하고 rEV를 포함하는 PVR gD-GPI와 직접 비교할 수 있다. 모든 rEV에서, 태그가 있는 엑토도메인은 BLI(도 4D) 또는 웨스턴 블롯(도 13A)으로 분석할 때 PVR과 비등한 수준으로 항-gD 항체에 결합하였다.
a.
PD-L1 EV의 STM 상호작용체
RDIMIS는 PD-L1/CD274에 적용되었다. PD-L1은 위에서 설명한 바와 같이 스크리닝 전에 PD-L1 EV를 특성화할 수 있게 하기 위해 gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인으로서 발현되었다. PD-L1 EV는 gD 항체에 대한 결합을 BLI로 쉽게 검출가능함을 보여주었다(도 4D). PD-L1 EV는 STM 라이브러리와의 상호작용에 대해 스크리닝했을 때, 알려진 PD-L1 리간드인 PDCD1(PD1), EPHA3, CD80(B7.1) 및 PDCD1LG2(PDL2)를 높은 신뢰도로 식별했다. PD-L1/PD-L2 상호작용에 대한 추정된 해리 상수가 약 10 μM이므로(Lee 외, Nat. Commun., 7: 1-9, 2016), 이 결과는 RDIMIS가 생화학적으로 까다로운 약한 상호작용을 식별할 수 있음을 또한 입증한다. 또한, 다른 많은 고득점 히트들이 식별되었다(도 5A). IGF2R은 본원과 무관한 실험에서 광범위하게 끈적거리는 것으로 밝혀졌으므로(Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019) 비-특이적 상호작용인자로 표지되었으나 다른 히트들은 PD-L1에 대한 새로운 추정 결합제를 나타낸다.
b. CD80 및 CD276 EV의 STM 상호작용체
마지막으로, RDIMIS의 폭넓은 적용 가능성을 더욱 보장하기 위해, 새로운 플랫폼을 2개의 추가적인 막-발현 수용체인 CD80(B7-1) 및 CD276(B7-H3)에 적용했다(도 5B). 다시 한 번, 두 단백질에 대한 모든 관련 파트너들이 검출되었으며, 이는 세포 표면-발현된 표적들에 대한 이 방법론의 광범위한 유용성을 확인시켜주었다. 잘-기술되어 있는 결합제 CD28, CTLA4 및 PD-L1 그리고 더욱 최근에 기술된 바 있는 결합제 NGFR은 면역 수용체 CD80에 대해 최고 득점의 히트들로서 식별되었다. 스크리닝 기술의 발전을 통해 최근에야 디오퍼나이징된 B7-H3/CD276의 경우(Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019), RDIMIS는 최근 기술된 상호작용인자 IL20RA, 뿐만 아니라 동일한 연구에서 비특이적 상호작용인자로 밝혀진 MXRA5를 캡처하였다(도 5B). 특히, 두 경우 모두 알려진 상호작용 파트너들은 최고 득점의 히트들 중 하나였으며, 반면 이전에 문헌에서 기술되지 않았던 몇 가지 추가적인 추정된 수용체-특이적 결합 파트너들이 식별되어 이 방법의 민감도가 입증되었다.
D.
공개된 데이터베이스와 비교
다음으로, 이 4개의 주요 면역 수용체에 대해 식별된 상호작용 랜드스케이프의 수, RDIMIS 방법을 사용하여 식별된 수용체-특이적 히트들 간의 중첩, 그리고 STRING(Szklarczyk 외, Nucleic Acids Res., 47: D607-D613, 2019), Bioplex (Huttlin 외, bioRxiv, doi:10.1101/2020.01.19.905109, 2020) 및 Biogrid (Oughtred 외, Nucleic Acids Res., 47: D529-D541, 2019) 데이터베이스에 나열된 상호 작용들을 전반적으로 이해하기 위해(도 5C), 단백질 상호 작용에 대한 가장 포괄적인 저장소 중 일부를 평가했다.
균등한 비교를 위해, 본 연구에서 쿼리한 STM 라이브러리에 존재하는 단백질 간의 상호 작용만 고려했다. STRING 데이터베이스의 경우, 실험적 증거가 있는 것으로 지정된 상호작용들만 사용되었다. 모든 스크린에 대한 엄격한 히트들의 목록을 생성하기 위해, 각 스크린의 98% 분위수에서 컷오프가 이루어졌는데, 여기서 데이터 분포가 정규 분포에서 벗어나고 위쪽 꼬리가 길었기 때문이다. 모든 스크린에서, 특정 스크린의 신호가 다른 스크린의 신호보다 4배 이상인 경우 수용체-특이적 히트가 호출되었다.
예상대로, 잘 특성화된 상호 작용의 대부분은 상기 데이터베이스 중 적어도 하나에 표시되었으며, STRING의 12개 상호작용 중 11개는 우리의 데이터 세트와 중복되는 실험적 증거가 있는 것으로 나열되었다(도 5C). 또한, 연구 중인 모든 면역 수용체에서, RDIMIS는 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스에 나타나지 않았던 추정 상호작용들을 식별하였다(도 5C). 이것은 관심 수용체가 원형질막과 관련하여 연구될 때, 새로운 상호작용의 식별이 촉진될 수 있음을 시사한다.
CD80의 경우, STRING 데이터베이스는 추가 결합 파트너인 CD86을 제시하였다. STRING 데이터베이스에서 이러한 상호작용을 뒷받침하는 논문을 비롯하여 해당 문헌의 추가 검토는 이러한 단백질들이 상호작용하지 않음을 시사하였다. Bioplex와 Biogrid는 추가적인 추정 파트너를 식별하였으나, 이들 대부분은 검증되지 않았다.
E.
RDIMIS 스크린 방법
소포는 1 x PBS + 0.49mM MgCl2 + 0.9mM CaCl2(PCM) + 1% BSA 분획 V(Sigma)에서 0.03-0.05mg/mL(Bradford에 의해 측정됨)의 최종 농도로 희석되었다. 인간 수용체 라이브러리의 준비는, 단백질-단백질 상호 작용의 고 처리량 분석을 가능하게 하기 위해, 자동화된 액체 취급 장치들(플레이트 디스펜서 및 세척기)로 구성된 통합 로봇 시스템을 사용하여 수행되었다. Fc 태그가 있는 수용체 ECD를 포함하는 조건화 배지를 흰색 384웰 단백질 A-코팅된 플레이트(Thermo Fisher Scientific)에 분주하고 필요할 때까지 4°C에서 보관했다. ECD-Fcs의 농도는 다양하였으나, 평균 159μg/mL이었다. 플레이트를 PCM으로 3회 세척하여 조건화 배지의 결합되지 않은 성분들을 제거했다. 소낭포들을 플레이트에 첨가하고 밤새 4°C에 두었다. 플레이트를 PCM으로 3회 세척하여 결합되지 않은 소포를 제거하였다. 건조를 방지하기 위해, 25μL의 PCM을 플레이트에 추가했다. 정규화에 사용된 양성 대조군의 경우, 스크린에 사용된 동일한 소포 스톡 25μL를 모든 세척 단계 후에 각 플레이트의 첫 번째 컬럼에 추가했다. 이들은 세척되지 않기 때문에, 이러한 양성 대조군 웰들은 입력 값을 나타내지만, 자동화 제한으로 인해, 100% 결합된 웰과 비교하면 이들은 희석되는 것이다. PCM의 1μM 코엘렌테라진 h(Promega) 25μL를 웰들에 분주하고, 5분 동안 인큐베이션한 다음, 0.1초의 발광 판독 시간을 사용하여 TECAN에서 판독하였다. 스크린의 대부분의 웰들이 어떤 소포에도 결합하지 않았기 때문에, 추가 음성 대조군 웰들은 분석에 사용되지 않았으며; 오히려 전체 스크린에 대한 강도 분포와 관련하여 신호를 분석하여 히트들을 호출했다. 비어 있는 웰들은 해당 분포의 아래쪽 절반에 속하고 결합되지 않은 Fc 신호를 나타내지 않았던 ECD-Fc 조건화 배지를 제공받은 웰들 보다 더 높은 신호를 갖는 경향이 있었다.
F.
멤브레인 염색을 사용한 EV의 정량화
콜레스테롤은 EV의 지질 이중층의 주요 구성요소이다. EV는 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)로 표지되므로, 태그가 없는 표적들을 포함하는 EV 및/또는 내인성 EV를 검출할 수 있다. 벡터 대조군으로 형질감염되었지만 gag-Rluc를 포함하는 rEV 또는 형질감염되지 않은 세포로부터 수확된 EV를 사용하여 전체 RDIMIS 스크린이 수행되었다(도 12C). 두 EV 종들은 유사하게 거동하였는데(상관 계수 0.92), 이는 동일한 세포주에서 rEV와 자연적으로 생성된 EV가 유사한 결합 프로파일을 가짐을 보여주는 것이다.
EV는 상기 설명한 바와 같이 생성되고 수확되었다. gag-Rluc를 포함하는 PD-L1 또는 PVR gD-GPI EV를 흰색 384웰 플레이트에 연속 희석시키고, 권장 프로토콜을 따라 Rluc에 코엘렌테라진 h(RDIMIS에서와 같이)를 추가하거나 AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 EV 농도를 측정했다. AMPLEXTM Red 콜레스테롤 분석 키트를 사용하여 PD-L1 gD-GPI RDIMIS를 측정하기 위해, 일반 RDIMIS에서와 같이 EV를 결합시켰다. 그런 다음 플레이트를 흡인하여 건조시키고, 25μL의 AMPLEXTM Red 시약을 각 웰에 분주했다. 스톡 EV 용액을 각 플레이트의 첫 번째 컬럼에 추가하여 양성 대조군으로 사용했다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였으며 560 +/1 10nm에서의 여기 및 590 +/- 10nm에서의 형광 검출을 사용하는 Tecan M1000 InfinitePro에서 판독하였다(도 12A-12C).
콜레스테롤 에스테라제는, 모든 콜레스테롤 에스테르 또한 검출되도록 권장량으로 포함되었다. 소포는 EVEXIS 스크린에서와 같이 Fc-ECD 단백질과 함께 인큐베이션되었고 EVEXIS에서와 같이 세척되었다. 코엘란트라진-h를 추가하는 대신, 플레이트를 손으로 가볍게 두드려 건조시켰다. 루시퍼라제 신호에 대한 적정(titration)을 위해, 4개의 3x 연속 희석이 이루어졌다. 20μL의 0.5μM 코엘란트라진 h(Promega)를 추가하고 5분 동안 인큐베이션한 다음 Tecan M1000 InfinitePro에서 판독했다. 매뉴얼에 명시된 대로, Amplex Red 콜레스테롤 분석 믹스 20μL를 웰들에 추가하고 1시간 동안 인큐베이션한 후 판독했다. Tecan M1000 InfinitePro에서 0.1초의 발광 판독 시간을 사용하여 발광을 판독했다. TECAN에서 560 nm의 여기 및 590 nm의 방출 파장을 사용하여 형광을 판독했다. PBS와 코엘란트라진 h 및 Amplex Red 콜레스테로 분석 믹스만 있는 블랭크 웰도 측정하고 이 값을 신호에서 뺀다. PD-L1 gD-GPI EV 결합의 경우, 코엘란트라진 h와 Amplex Red 콜레스테롤 분석 중간에 웰을 가볍게 두드려 건조시켰다. 블랭크 웰을 빼는 대신, Fc-태그가 있는 종들이 형질감염되지 않았지만 조건화 배지가 여전히 추가되어있는 웰을 사용했다.
G.
LRTM1의 상호 작용
분석의 민감도를 추가로 평가하기 위해, 신호가 낮은 새로운 히트들 중 하나인 LRTM1을 조사했다. LRTM1을 위한 상업적으로 이용 가능한 단백질을 찾을 수 없었기 때문에, rEVs에서 발현된 LRTM1을 사용하여 상호 작용을 연구했다. 본 연구는 PD-L1 엑토도메인이 gD-GPI 태그가 있는 엑토도메인으로서 또는 전장 단백질로서 제시된 rEV 상의 LRTM1에 선택적으로 결합함을 보여주었다(도 13b). LRTM1 rEV는 또한 벡터 대조군으로 형질감염된 세포보다 세포 상에서 발현된 gD-GPI 태그 또는 전장 PD-L1에 선택적으로 결합하였다(도 13C). PD1(PDCD1)은 PD-L1의 알려진 상호 작용 파트너이자 암에서 체크포인트 차단 면역 요법의 표적이므로, 이러한 상호 작용이 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다. 증가하는 농도의 재조합 PD1-Fc 단백질은 농도 의존 방식으로 LRTM1 소포 결합을 능가할 수 있었는데(도 13D), 이는 이 단백질들이 PD-L1 상의 유사한 영역에 결합함을 시사한다.
실시예 4. RDIMIS를 통해 일반적인 세포외 소포 결합제를 식별할 수 있다.
흥미롭게도, 관련 없는 모든 스크린에서 예상 결합 파트너들 중에 흩어져 있는 추가 히트들이 나타났다(표 8). rEV는 복합 혼합물이기 때문에, 이러한 새로운 결합제들이 rEV에서 발현된 수용체에 또는 소포 자체에 특이적인지 여부가 명확하지 않았다. 이를 명확히하기 위해, 서로 다른 수용체들을 표시하는 rEV에 대한 스크린들을 직접 비교하여 공통 및 구별되는 결합제들을 식별했다. 배치-매칭된 스크린들은 서로에 대해 플롯팅되거나(도 5A 및 5B) 또는 관심 수용체 대신에 벡터 대조군으로 형질감염된 세포를 갖는 스크린에 대해 독립적으로 플롯팅되었다(도 14A-14F). 이를 통해 3개의 뚜렷한 그룹들: PVR-특이적 결합제(파란색), PD-L1-특이적 결합제(빨간색), 및 히트들의 집단이 드러났으며, 이들은 특정 스크린에서 풍부하지 않아, 수용체-특이적이지 않았다(도 5A 및 5B, 회색 음영; 표 8 및 9).
특히, CLEC 및 SIGLEC와 같은 당 결합제, 뿐만 아니라 LILR와 같은 신호전달 수용체 및 에프린 수용체를 비롯하여 여러 단백질 계열들이 일반적인 소포 결합제 목록에 풍부해졌다. 임의의 생물학적 경로 또는 기능이 과도하게 나타났는지 여부를 결정하기 위해, 도 5A 및 5B에 도시된 4개의 RDIMIS 스크린에서 식별된 일련의 일반적인 소포 결합제들에 대해 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하였다. 표 10은 PANTHER15.0 과다발현 테스트(2020-03-23 출시)를 사용하여 수행된 바와 같이, 표 8의 일반적인 소포 결합제에 대한 GO 농축 분석 결과를 보여준다. 표 11은 PANTHER16.0 방출 과다발현 테스트(Mi 외, Nucleic Acids Res, 49: D394-D403, 2021)를 사용하여 수행된 바와 같이, 표 9의 일반적인 소포 결합제에 대한 GO 농축 분석 결과를 보여준다. 상당히 풍부해진 분자 기능에는 탄수화물, 황 및 음이온 결합이 포함되며 모두 소포 및 세포막에 대한 일반적인 결합과 일치한다. 이 목록에는 또한 GO 세포 성분 분석(표 12)에 의해 3차 과립 및 3차 과립 막과 관련된 단백질이 풍부하였으므로 이들이 일반적인 EV 결합제임을 추가로 시사한다. GO 생물학적 공정 분석도 수행되었지만 유의미한 결과는 발견되지 않았다. 따라서, 이 플랫폼은 관련 없는 관심 표적들에 대한 상호작용체 전반에 걸쳐 보존되는 소포 특이적 결합제를 식별할 수 있게 하며, EV에 대해 이전에 알려지지 않았던 수용체를 제시한다.
표 10. 일반 소포 결합제에 대한 GO 농축 분석
FDR: 허위 발견률.
표 11. 일반 소포 결합제에 대한 GO 농축 분석
FDR: 허위 발견률.
표 12. 일반 소포 결합제에 대한 GO 세포 성분 분석
GO 분석은 많은 일반적인 소포 결합제가 통상적인 세포 표면 변형을 인식함을 시사하였으나, 많은 결합제들은 rEV에서 단백질 상호 작용 파트너들을 가질 수도 있다. 잠재적인 결합제 목록을 생성하기 위해, 일반적인 소포 결합제 목록을 공개된 면역글로불린 슈퍼패밀리 수용체(Verschueren 외, Cell, 182: 329-344.e19, 2020) 및 상호작용에 관한 STRING 데이터베이스(Szklarczyk 외, Nucleic Acids Res., 47: D607-D613, 2019)와 함께 상호참조하였다. 이들 데이터를 사용하여, 잠재적 상호 작용 네트워크가 생성되었다(도 15). 각 노드는 이러한 네트워크에서 발견되는 단백질로서, 일반 소포 결합제(녹색)인지 또는 공개된 연구 및 데이터베이스로부터 식별된 것인지(파란색) 여부에 따라 색상으로 구분되어 있다. 데이터 소스는 가장자리에 색상으로 구분되어 있다. 이러한 단백질들이 소포에 있을 가능성이 있는지 여부를 파악하기 위해, HEK293 세포들에 대한 발현 데이터를 상호 참조하였으며, Cell Atlas로부터 얻은 데이터를 사용하여 rEV를 생성하기 위해 EXPI293TM 세포에 대한 모 세포주를 사용하였다(Thul 외, Science, 356(6340), 2017). 단백질이 rEV에 통합되는 것이 일반적으로 세포에서의 단백질 발현과 상관관계가 있다는 발견에 기초하여, 많이 발현된 단백질 일수록 검출된 결합에 원인이 될 가능성이 높다고 추론되었다. 발현은 도 15에 각 단백질 명칭을 둘러싼 상자의 높이로 표시되며, 상자가 높을수록 발현이 더 많음을 나타낸다. 이 네트워크는 일반 소포 결합제 목록에 있는 단백질과의 상호 작용이 알려져있는 여러 단백질들이 많이 발현되었음을 제시한다.
동시에 수행된 스크린들에서(PVR gD-GPI 반복 2 및 PD-L1 gD-GPI; CD276 및 CD80 gD-GPI; LRRC15 및 PVR FL) 또는 동일한 수용체를 발현하는 세포들 사이에서(PVR gD- GPI 반복 또는 PVR-FL), 높은 재현성이 발견되었던 반면, 모든 스크린들이 서로에 대해 플롯되었을 때 약간의 가변성이 관찰되었다(도 16A). 특히, 낮은 상관관계 중 일부는 수용체 특이적 히트들(즉, PVR gD-GPI 대 PD-L1 gD-GPI)에 의해 주도되었지만, 최악의 상관관계를 가진 스크린은 CD80 gD-GPI 및 PVR FL 스크린이었다. 흥미롭게도, 이는 2개의 분리 가능한 일반 소포 결합제 집단들에 의해 주도되었는데, 하나는 스크린들 간에 일관된 것으로 보였고(도 16B, 하늘색 점), 다른 하나는 CD80 gD-GPI 스크린에서 풍부한 것이었다(도 16B, 금색 점). 그러나 두 집단 모두 CD80 gD-GPI 특이적 히트들과는 여전히 구별될 수 있었는데, 이는 해당 히트들이 CD80 gD-GPI 스크린에서 상당히 더 풍부했기 때문이다. 이는 y-축 근처를 확대하거나(도 16B) 모든 스크린들 간에 공통인 일반 소포 결합제 목록을 제거함으로써(도 16B) 알 수 있다. 이 두 집단들 간에 어느 정도 차이가 존재하였는지 결정하기 위해, 이 스크린에서 식별된 두 집단들에 대해 GO 분자 기능 분석을 수행했다(표 13 및 14). 흥미롭게도, 헤파린 및 글리코사미노글리칸 결합은 일반 소포 결합제의 제1 집단에서 풍부해진 반면(표 13), 시알산 결합 및 막관통 신호전달 활성은 제2 집단에서 풍부해졌다(표 14).
표 13. CD80 gD-GPI 농축된 일반 결합제
표 14. PVR FL 농축된 일반 결합제
각각의 개별 스크린들의 쌍에 대한 목록을 얻기 위해, 데이터 분포가 정규 분포에서 벗어나고 위쪽 꼬리가 길기 때문에 90% 분위수에서 컷오프를 그렸다. 이는 각 스크린에 대해 개별적으로 수행되었으며 최종 목록은 스크린 특이적 히트들을 제거한 모든 스크린 간에 공통된 유전자 목록이었다. 유전자의 순위를 매기기 위해, 모든 스크린들에서 강도를 평균화하고 해당 평균 별로 정렬했다. 유전자 온톨로지 분석은 일반 소포 결합제 목록 상의 PANTHER15.0 방출 과잉대표성 테스트(2020-03-23 공개) 또는 PANTHER16.0 방출 과잉대표성 테스트(Mi 외, Nucleic Acids Res, 49: D394-D403, 2021)를 사용하여 수행되었다 참조 목록은 STM 라이브러리의 모든 유전자 목록이었다. GO 분자 기능 완료, 생물학적 과정 완료 및 세포 구성체 완료 주석 데이터 세트는 피셔의 정확 검정을 사용하여 분석되었다.
따라서 RDIMIS 접근법은, 예를 들어, 인간 EV 생물학 연구를 위해 소포 특이적 결합제의 프로파일링을 허용한다. HEK 세포 유래 인간 EV에 대한 100개 이상의 결합제가 식별되었으며, 세포와의 EV 상호작용을 매개할 수 있는 추정 수용체를 시사하며, 이는 최적 툴의 부족으로 인해 캡처하기 어려운 소포 생물학의 한 양상이다(Gonda 외, Mol. Cancer Res., 17: 337-347, 2019). 우리의 결과는 EV가 주요 신호전달 단백질, 예를 들어, 면역조절 단백질(예를 들어, SIGLEC 계열, LILR 계열 및 CD300 계열), 성장 조절 단백질(예를 들어, FGFR4, FLT1 및 NRP 단백질과 같은 성장 인자 수용체 및 여러 수용체-티로신 키나제) 및 신경 단백질(예를 들어, APP 및 CLSTN 단백질)과 상호 작용한다는 것을 나타내며, 이는 EV가 세포 간 통신을 중재한다는 생각을 뒷받침한다. 처리량과 재현성을 감안할 때, 이 방법은 전 세계적으로 EV의 품질을 평가하는 방법을 제공한다. 또한, 이 플랫폼은 분자 수준에서 EV 기능에 영향을 미치는 플레이어를 규명하는 고유한 툴을 제공하고; 그러므로 표적 수용체의 과발현, 치료제 추가 또는 EV를 생성하는 세포의 변형으로 인해 발생하는 EV 결합 프로파일의 예기치 않은 변화를 검출하는데 사용될 수 있다.
실시예 5. RDIMIS는 CD248을 희귀 암 관련 수용체 LRRC15의 새로운 상호 작용 파트너로 식별한다.
위에서 설명한 결과는 RDIMIS가 다른 생화학적 스크리닝 접근법에 불응성인 어려운 표적들의 디오퍼니제이션(deorphanization)을 가능하게 할 수 있음을 시사했다. 예를 들어, RDIMIS는 암 관련 섬유모세포(CAF) 수용체 LRRC15를 연구하는 데 사용되었다. LRRC15는 최근 큰 종양과 관련된 CAF에 대한 특이적 마커로 등장했다(Dominguez 외, Cancer Discov., 10(2): 232-253, 2020). 이러한 생물학적 중요성에도 불구하고, 상호작용 파트너가 식별되지 않았으므로, LRRC15 생물학의 기본 양상들은 정의되지 않은 상태로 남아 있다. LRRC15 상호작용 파트너들은 이전에 구현된 기술인 소형 AVEXIS를 사용하여 처음 탐색되었다(Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018; Bushell 외, Genome Res., 18: 622-630, 2008). 이 기술은 위에서 설명한 STM 단백질 라이브러리에 대해 오량체화된 LRRC15 엑토도메인을 스크리닝한다. 이전에 이 기술에서 나타났던 일시적인 상호작용의 검출을 위한 AVEXIS 스크린의 높은 민감도에도 불구하고, LRRC15에 대한 결합 파트너는 식별되지 않았으며(도 6A), 이는 LRRC15가 최적의 활성을 위해 보다 생리학적으로 관련된 설정이 필요할 수 있음을 시사한다. 이 가설을 테스트하기 위해, LRRC15는 RDIMIS를 사용하여 gD-GPI(도 7A) 및 전장(도 7B) 수용체-rEV로 스크리닝되었다. 특히, 이 두 가지 노력 모두 사용가능한 데이터베이스에 설명되지 않은 LRRC15에 대한 추정 상호작용자 세트를 식별했습니다(도 6B).
CD248은 EZ-LINKTM Sulfo NHS-LC-LC-비오틴(Thermo Fisher)을 사용하여 비오티닐화되었고 Zeba 탈염 컬럼에서 7K MWCO(Thermo Fisher)로 정제되었다. CD248은 25nM로 스트렙타비딘(SA) 바이오센서에 로드되었다. LRRC15-Fc 단백질(Genentech)이 500 nM로 제공되었다. LRRC15 rEV는 0.25 mg/mL 총 단백질(2.5-3.5 nM)로 제공되었다.
CD248은 두 스크린 모두에서 최고 득점 히트였기 때문에, 그 발현은 종양 기질에서 상향조절되며(Rouleau 외, Clin. Cancer Res., 14: 7223-7236, 2008; Rouleau 외, Int. J. Oncol., 39: 73-89, 2011; Teicher 외, 10: 993-100, 2019), 이는 종양 성장을 촉진하는 것으로 제안되었으며(Maia 외, BMC Cancer, 2: 1-12, 2011), 추가 특성화를 위해 LRRC15-CD248 상호 작용을 선택했다. LRRC15 및 CD248은 고형 종양에서 독립적으로 상향조절되는 것으로 보고되었으나(Rouleau 외, Clin. Cancer Res., 14: 7223-7236, 2008; Purcell 외, Cancer Res., 78: 4059-4072, 2018), 이들이 동일한 종양 샘플에서 발현되었는지 여부는 불분명했다. CD248과 LRRC15(도 8A, 8B, 9A 및 9B)의 발현 사이의 유의미한 상관관계는 4가지 상이한 종양 적응증에 대한 The Cancer Genome Atlas(TCGA)의 벌크 RNA-seq 데이터에서 확인되었다. 이러한 상관관계는 CD248과 LRRC15가 동일한 세포 유형에서 발견되거나 공동 조절됨을 시사한다. 이 두 가지 가능성을 구별하기 위해, 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터를 재분석하여 LRRC15 및 CD248 발현을 강조표시했다(Puram 외, Cell, 171: 1611-1624e.24, 2017). 이 분석으로서 CAF의 하위 집합에서 LRRC15와 CD248이 공동 발현됨이 밝혀졌는데(공동 출현 점수(교차비) = 9.44)(도 8C), CD248은 모든 CAF 및 암-관련 혈관주위세포(CAP) 세포는 DCN 및 RGS5와 같은 마커를 사용하여 식별되었다(도 9C).
종합하면, 이들 결과는 RDIMIS를 재조합 단백질 발현에 의존하는 다른 기술에 적용할 수 없는 수용체에 대한 새로운 상호작용인자를 식별하는 강력한 방법으로 지정된다. 또한, LRRC15와 CD248 사이의 상호작용이 같은 세포에서 일어나는지 아니면 세포들 사이에서 일어나는지는 불분명하지만, 위의 분석은 이들 단백질이 환자 종양에서 상호작용할 충분한 기회가 있음을 시사하며, 이 상호작용이 관련될 수 있는 잠재적인 생물학적 맥락을 제공한다.
A.
LRRC15-CD248 상호작용은 막에서의 LRRC15 발현을 필요로 한다.
LRRC15-CD248 상호작용을 생물물리학적 및 생화학적 방법을 사용하여 추가로 특성화하였다. 먼저, CD248 오량체화된 엑토도메인을 사용하여 미니어처 AVEXIS 분석을 수행했다. LRRC15와 유사하게(도 6A), CD248 오량체화된 엑토도메인이 STM 단백질 라이브러리에 대해 스크리닝되었을 때 높은 신뢰도 히트가 확인되지 않다(도 10A). 이 결과와 일관되게, 상호작용이 BLI 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석되었을 때, 심지어 검출 민감도를 최대화하기 위한 실험 조건이 채용된 경우에도, LRRC15와 CD248 재조합 단백질 사이에 어떠한 결합도 관찰되지 않았다(도 10B 및 11A). BLI 분석 결과는 LRRC15와 CD248 모두가 재조합 엑토도메인으로서 테스트되었을 때 검출능한 결합이 없음을 확인시켜주었다. 대조적으로, 상호작용은 LRRC15가 EV 상에서 제시되었을 때 쉽게 검출가능하였다(도 11A). 유사하게, 이 상호작용은 세포의 원형질막에서도 관찰될 수 있다. 첫째, CD248에 결합된 LRRC15를 제시하는 rEV는 세포 표면에서(도 11B) 빈 벡터 대조군으로 형질감염된 세포보다 10배 이상 과발현되었다(도 11D). 둘째, LRRC15는 세포에서 발현되었으며 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 비오티닐화 및 사량체화된 CD248 재조합 단백질과 함께 인큐베이션되었다. 결합은 LRRC15-발현 세포에서 쉽게 검출가능하였지만, 대조군 단백질을 발현하는 세포에서는 그렇지 않았다(도 11B-11D). 이러한 분석결과는 이러한 상호 작용에 막이 필요하지만 구체적으로 rEV가 필요한 것은 아니라는 개념을 강화시킨다.
이 상호작용의 막 의존성의 기저에 무엇이 있는지 더 잘 이해하기 위해, rEV 막을 콜레스테롤 미세 구조를 형성하는 Filipin III를 사용하여 파괴하거나(도 17A-17C) 메틸-β시클로덱스트린(MβCD)으로 막 콜레스테롤을 고갈시킴으로써 변경하였다(도 17D-17F) (Petro 외, Toxicon, 48: 1035-1045, 2006). 100 μM Filipin III 또는 15 mM MβCD로 세포를 처리하는 것은 BLI에 의해 나타난 바와 같이 CD248 단량체에 대한 LRRC15 gD-GPI 발현 소포의 결합을 모두 제거했다. 이들 제제는 또한 항-gD 항체에 의한 gD 에피토프 태그의 검출에 영향을 미쳤다. 흥미롭게도, 100 μM Filipin III은 또한 LRRC15 FL rEV의 CD248에 대한 결합을 두드러지게 감소시켰지만, MβCD에서는 미미한 효과가 관찰되었다.
LRRC15와 CD248이 막 의존적 방식으로 상호 작용할 수 있음이 밝혀졌지만 이들이 동일한 생리적 환경에서 존재하는지 여부는 알려지지 않았다. LRRC15 및 CD248은 고형 종양에서 독립적으로 상향조절되는 것으로 보고된 반면(Rouleau 외, Clin. Cancer Res. 14: 7223-7236, 2008; Purcell 외, Cancer Res., 78: 4059-4072, 2018), 이들이 동일한 종양 샘플에서 발현되었는지 여부는 불분명했다. 4개의 상이한 종양 적응증에 대한 The Cancer Genome Atlas(TCGA)로부터 얻은 벌크 RNA-seq 데이터는 CD248 및 LRRC15의 발현 간 상당한 상관관계를 보여주었다(도 8A, 8B 및 9A-9C). 이러한 상관관계는 CD248과 LRRC15가 동일한 세포 유형에서 발견되거나 CD248과 LRRC15가 공동-조절됨을 시사한다. 이 질문에 답하기 위해 두경부암 환자의 단일 세포 RNA-seq 데이터를 재분석하여 LRRC15 및 CD248 발현을 표시하였다(Puram 외, Cell, 171: 1611-1624.e24, 2017). 이로서 CAF의 하위 집합에서 LRRC15와 CD248이 공동 발현됨이 밝혀졌는데(공동 출현 점수(교차비) = 9.44)(도 8C), CD248은 모든 CAF 및 암-관련 혈관주위세포(CAP)는 DCN 및 RGS5와 같은 마커를 사용하여 식별되었다(도 9C). 상호 작용의 막 의존성을 설명할 수 있는 몇 가지 모델이 존재한다. 가장 간단한 모델은 LRRC15 엑토도메인은 적절한 폴딩을 위해 막 환경을 필요로 한다는 것이다. 흥미롭게도, 전장 및 gD-GPI 태그 엑토도메인 모두 이러한 상호작용을 캡처하기 때문에, 이 의존성을 담당하는 결정인자는 막관통 도메인 또는 막과 엑토도메인 사이의 정확한 공간 내에 있지 않을 수 있다. 또 다른 그럴듯한 설명은 막의 존재가 테스트된 오량체화 이상으로 단백질 결합력을 증가시켜 상호작용을 안정화시키는 고도로 클러스터링된 수용체 배열의 형성을 촉진한다는 것이다. 이것은 Filipin III과 MβCD가 이러한 상호작용을 파괴할 수 있다는 증거에 의해 일부분 뒷받침된다. 특히, 막에서 콜레스테롤과 같은 하이드록시스테롤에 결합하지만 이를 제거하지는 않는 것으로 생각되는 Filipin III(Bolard, BBA-Rev. Biomembr., 864: 257-304, 1986)은 수용체의 클러스터링 능력을 감소시킬 수 있다. Filipin III은 막에 일반적인 파괴를 일으켜 전장 및 gD-GPI 태그가 있는 종 모두에 영향을 미칠 수 있지만, MβCD의 영향은 주로 gD-GPI 태그가 있는 LRRC15에 있었다. 이것은 엽산 수용체와 같은 GPI 고정 수용체가 클러스터링을 위해 막 콜레스테롤에 의존한다는 것을 시사하는 연구(Rothberg 외, J. Cell Biol., 111: 2931-2938, 1990)와 일치한다. 대안적으로, LRRC15-CD248 상호작용은 복합체를 촉진하거나 안정화시키는 아직 알려지지 않은 인자의 동원에 의존할 수 있다.
면역형광 분석을 위해, HEK293T 세포를 37°C에서 30분 동안 0.1mg/mL 폴리-D-리신(Gibco)으로 코팅된 96-웰 SENSOPLATESTM(Greiner Bio-One)에 나누어 넣었다. 제조업체의 사양에 따라 LTX 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형광 rEV 실험의 경우, gag-mNeonGreen 및 관심 수용체로 일시적으로 공동 형질감염된 EXPI293FTM 세포로부터 rEV를 수확했다. 세포와 파편을 제거하기 위해 이들을 300 x g에서 10분 원심분리 및 3,000 x g에서 1시간 원심분리 후 90분 동안 100,000 x g에서 초원심분리하여 정제하였다. rEV를 PBS에 재현탁하고 4°C에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션했다. 세포를 PBS로 세척하고 4% PFA를 사용하여 10분 동안 고정시켰다. CD248 단백질(R&D Systems)을 EZ-LINKTM Sulfo NHS-LC-LC-비오틴(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 비오티닐화하고, Zeba 7K MWCO 탈염 컬럼에서 정제하고, 스트렙타비딘-APC(Agilent)를 사용하여 사량체화했다. DNA를 10 μg/mL Hoechst 33342(Tocris Bioscience)로 염색하였다.
종합하면, 이러한 결과는 CD248이 LRRC15의 새로운 상호작용 파트너임을 확인시켜주며, LRRC15-CD248 상호작용이 막과 관련하여 촉진됨을 나타낸다. 이러한 발견은 RDIMIS의 장점을 나타내는데, RDIMIS는 막 단백질과 관련된 그리고 재조합 단백질의 사용을 필요로 하는 다른 기술들에 내성이 있는 상호작용의 검출 성능 증가를 제공한다.
단백질 상호작용체의 식별 외에도, rEV-기반 수용체 디스플레이는 막에서 수용체 거동의 정량적 탐색결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, BLI는 막에서 수용체의 그 리간드와의 결합 동역학을 특성화하는 데 사용할 수 있다(도 11A).
실시예 6. G 단백질-결합 수용체 상호작용 스크리닝을 통해 부착소 GPCR B1 (ADGRB1)라고 불리는 PD-L1(세포 예정사 리간드 1)에 대한 새로운 수용체를 발견할 수 있다.
A.
배경
G 단백질 결합 수용체(GPCR) 수퍼패밀리는 인간 게놈에서 세포외 단백질의 거의 20%를 포함하며 모든 FDA 승인 약물의 1/3 이상이 그 표적이다. 그러나 일반적으로 세포 외 단백질 상호 작용을 방해하는 두 가지 생물학적 약물만이 GPCR을 표적으로 한다. GPCR은 부분적으로 GPCR의 세포외 상호작용 매핑이 나머지 인간 게놈보다 뒤쳐져 있기 때문에 생물학적 약물 개발에서 뒤쳐져 있다. 따라서, 암에서 면역 요법을 표적으로 하는 수용체의 상호 작용을 매핑하기 위해 GPCR 중심의 세포외 상호작용 스크린이 수행되었다. 부착소 GPCR B1 (ADGRB1)라고 불리는 PD-L1(세포 예정사 리간드 1)에 대한 새로운 수용체가 관찰되었다. 두 번째로, ADGRB1의 상호작용은 인간 게놈의 대부분의 단일 막관통 수용체에 대해 매핑되었고, ICOSLG(유도성 T 세포 공동자극 리간드)와의 새로운 상호작용이 관찰되었다. 이 데이터는 새로운 생물학을 매핑하고 암 치료 개입을 위한 새로운 방법을 개발하는 데 있어 GPCR 상호작용 스크리닝의 가능성을 보여준다.
종종 “상호작용학(interactomics)”이라고 불리는 상호작용 매핑 분야는 세포 단백질/단백질 상호작용을 이해하기 위해 개발되었다. 1989년 효모-2-하이브리드 스크린의 개발을 시작으로(Young, Biology of Reproduction, 58(2): 302-311, 1998), 상호작용 매핑은 단백질 상호작용 네트워크가 생리학적 조건에서 그l고 질병에서 어떻게 기능하는지에 대한 많은 통찰력을 제공하였다. 최근 상호작용학 분야는 상황 특이적 단백질 네트워크의 철저한 매핑으로 폭발적으로 증가했다(Go 외, Nature, 595: 120-124, 2021; Huttlin 외, Cell, 184(11): 3022-3040, 2021). 단백질/단백질 상호작용 매핑의 주요 과제 중 하나는 세포막에 포매된 단백질들을 포함시키는 것이다. 세포외 공간에서 상호작용 네트워크를 정의하는 것은 종종 시스테인 감소 및 당화와 같은 번역 후 변형을 포함하는 전형적으로 일시적인 상호작용으로 인해 훨씬 더 어렵다 (Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017). 따라서 세포 외 단백질 상호 작용 매핑은 상호 작용학 분야에서 뒤쳐져 있는데, 이는 이 분야를 발전시키기 위해 새로운 기술이 필요했기 때문이다.
세포외 상호작용 기술 개발에 대한 주요 통찰력 중 하나는, 일시적이지만 생리학적으로 관련된 세포외 단백질 상호작용을 해독하는 데 중요한 구성요소가 결합력이라는 인식이었다(Gonzalez, Methods, 57(4): 448-458, 2012). 스크린은 결합력을 활용하여 인간 게놈에 있는 대부분의 세포외 단백질에 걸친 상호작용을 매핑하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 폴리오바이러스 수용체(PVR)가 TIGIT(T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인)와 상호작용한다는 발견은 잠재적인 단백질을 Fc-태그가 있는 이량체로서 스크리닝함으로써 이루어졌다(Yu 외, Nature Immunology, 10(1): 48-57, 2009). 마이크로비드는 리간드를 다량체화하고 단백질 마이크로어레이에 대해 스크리닝하여 인간 아데노바이러스의 세포외 상호작용체를 매핑하기 위해 사용되어 왔다(Martinez-Martin 외, Nature Communications, 7: 11473, 2016). 유사하게, 배큘로바이러스는 수용체를 이러한 단백질 마이크로어레이들에 대해 스크리닝 하기 위한 다량체화된 프로브로서 제시하는 방법으로 사용되어 왔다((Tom 외, Analytical Biochemistry, 479: 1-5, 2015). Fc-태깅된 세포외 단백질의 대규모 라이브러리는 마이크로비드(Husain 외, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019) 그리고 또한 결합력에 기반한 세포외 상호작용 스크리닝을 위한 유전적 융합에 의해 다량체화된 리간드(Martinez-Martin 외, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018; Verschueren 외, Cell, 182: 329-344.e19, 2020)를 사용한 상호작용 스크린에 사용되어왔다. 그러나 이러한 성공에도 불구하고 세포 외 단백질 중 하나의 주요 계열은 여전히 상호작용 스크린에서 다루기 힘들다: 다중-막관통 수용체(MTMRs).
인간 게놈은 5,000개 이상의 수용체 및 세포외 공간과 상호 작용하는 분비 단백질을 인코딩한다. 단일 막관통 수용체는 2,000개 이상의 이러한 세포외 단백질을 포함하는 반면, 분비 단백질은 600개 이상을 나타낸다(Uhln 외, Science Signaling, 12(609), 2019). 나머지 2,000개 미만의 세포외 단백질은 MTMR이고 그 중 800개 이상이 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 수퍼패밀리에 속한다. GPCR 수퍼패밀리는 이에 대해 성공적인 임상 치료제를 개발한 풍부한 역사를 가지고 있으며, 모든 FDA 승인 약물의 1/3이 이러한 800개의 GPCR 중 100개 이상을 표적으로 한다(Congreve 외, Cell, 181(1): 81-91, 2020). GPCR 수퍼패밀리의 나머지 구성원은 400개 이상의 후각 수용체를 포함하지만, 이러한 수용체는 대부분 후각 상피에서 발현이 제한적이다. 그러나 후각 수용체는 생리학의 중요한 동인이자 후각 수용체가 후각 상피 외부에서 발현되는 조직의 질병 모델에서 조절이상인 것으로 밝혀졌기 때문에 약물 개발 고려 대상에서 제외되어서는 안 된다(Pronin and Slepak, The Journal of Biological Chemistry, 296: 100475, 2021). GPCR 수퍼패밀리는 거의 모든 생리학적 시스템에서 필수적이며 수용체가 원형질막에서 발현되기 때문에 성공적인 약물 표적이지만 그 발현은 상대적으로 낮고 특정 세포 유형으로 제한된다.
GPCR 슈퍼패밀리의 원형질막 국소화 및 낮고 제한된 발현은 이들 단백질을 약물 개발에 이상적인 표적이 되게 하는 반면, 이러한 동일한 특성들은 GPCR 생물학 연구에 고유한 과제를 제시한다. 실제로 중요한 생리학적 기능을 제어하는 미지의 리간드를 가진 고아 GPCR이 여전히 100개 이상 존재한다(Laschet 외, Biochemical Pharmacology, 153: 62-74, 2018). 추가로, GPCR의 상호작용 매핑은 다른 세포외 단백질보다 뒤떨어져 있다(Dunn 외, Pharmacological Reviews, 71(4): 503-519, 2019). GPCR은 또한 생물학적 약물 개발에서 과소 대표된다. GPCR은 FDA 승인 약물의 30% 이상을 포함하지만, GPCR 슈퍼패밀리는 FDA 승인된 생물학적 약물의 2%의 표적일 뿐이다(Hutchings, Expert Opinion on Biological Therapy, 20(8); 925-935, 2020. 생물학적 약물 개발은 강력한 단백질 상호작용 중단 또는 향상, 조직 표적화 및 접합된 약물 전달을 가능하게 한다(Lu 외, Journal of Biomedical Science, 27(1): 1, 2020). 둘째, 항원으로 사용할 수 있는 거의 모든 알로스테릭 부위에 대한 복합 약전단을 개발할 수 있다; 이러한 가능성은 편향된 작용제 또는 알로스테릭 조절제와 같은 차세대 GPCR 약물 분류의 개발을 가속화할 수 있다. 따라서 상호 작용 매핑 및 생물학적 약물 특성화를 가능하게 하는 일련의 GPCR 중심 툴이 구축되었다.
본원에 설명된 첫 번째 GPCR 중심 플랫폼은 리간드 다량체화를 활용하여 세포 표면에서 단백질/단백질 상호작용을 검출하는 세포 과발현 시스템이다. 두 번째로, GPCR은 재조합 세포외 소포에 패키징되었고(Geeurickx 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019) 최근에 공개된 Fc-태그가 있는 단일 막관통 수용체 세포외 도메인 라이브러리에 대한 상호작용에 대해 스크리닝되었다(Verschueren 외, Cell, 182: 329-344.e19, 2020). 이러한 보완적 접근법을 사용하여, 인간 게놈의 모든 GPCR에서 고아 리간드를 스크리닝할 수 있고 세포외 공간 내 대부분의 단백질에 대해 고아 GPCR을 스크리닝할 수 있다.
B.
포괄적인 세포 기반 과발현 상호작용 스크린의 사용은 부착 수용체 B1(ADGRB1)이 PD-L1(세포예정사 리간드 1)에 대한 새로운 수용체임을 나타낸다
포유동물 과발현 벡터의 다중 막관통 수용체들의 포괄적인 라이브러리는 DNASU 플라스미드 저장소(Seiler 외, Nucleic Acids Research, 42 (Database issue), D1253-1260)와 공동으로 개발되어 게이트웨이 기증자 벡터 내 다중 막관통 수용체들의 집합체를 pT-Rex-DEST31 플라스미드(Invitrogen)로 복제하였다. 이는 N-말단 HIS 태그를 생성하였으며 세포 표면에서 검출되었다(도 18A). 또한, N-말단 FLAG 태그와 C-말단 비너스(Venus)가 있는 G 단백질-결합 수용체-중심 DNA 라이브러리가 생성되었다. GPCR 집합체는 저발현 수용체의 검출을 가능하게 하였다(도 18B). 전체적으로, HIS-태그가 있는 MTMR 집합체에서는 대부분 비표지 수용체가 세포 표면에서 과발현할 수 있는 반면(도 18C), GPCR-비너스 집합체에서는 배경 염색 이상에서 저발현 수용체가 검출될 수 있다(도 18D).
이 포괄적인 라이브러리를 사용하여, 4개의 형광 표지된 펩티드 리간드를 고 처리량 형질감염 및 하이 컨텐츠 이미징을 사용하여 스크리닝했다(도 23). EGF와 RSPO3는 특성이 잘 알려진 수용체를 가지고 있기 때문에 선택되었다. PD-L1 및 PVR은 수용체의 면역글로불린 수퍼패밀리의 복잡한 네트워크에 결합하고 많은 생물학적 치료제들의 표적이다(Andrews 외, Nat Immunol, 20: 1425-1434, 2019). EGF-647은 형질감염 대조군으로서 각 플레이트에 첨가된 대조군 EGFR에만 결합하였다(도 19A). R-스폰딘 3(RSPO3)은 APC 표지된 스트렙타비딘과의 비오티닐화 및 사량체화가 가능하도록 Avidity AVITAG™(Avi 태그)에 융합되었다. 이러한 사량체화된 RSPO3은 그 공지된 G 단백질 결합 수용체, 류신 풍부 반복부 GPCR(LGR) 4 및 5에 결합한다(도 19B). 폴리오 바이러스 수용체(PVR)의 세포외 도메인은 사량체화되었고 대조군으로서 스크린에 추가된 대조군 단일-막관통 수용체 CD226에만 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 19C).
세포예정사 리간드 1(PD-L1)의 세포외 도메인이 형광 사량체로서 스크리닝되었을 때, 이는 대조군 및 부착 GPCR B1(ADGRB1)에도 결합하였다(도 19D). 이 예상치 못한 발견에 기초하여 잠재적인 상호작용 단백질 계열에 대한 하나의 GPCR의 완전한 상호작용을 매핑하는 방법이 개발되었다.
C.
ADGRB1 및 류신 풍부 GPCR에 대한 소포 기반 상호작용 맵
재조합 세포외 소포(rEVs) (Geeurickx 외, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019)는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 상호작용을 매핑하기 위해 사용되었다. rEV는 실시예 1에 기술된 바와 같이 HIV로부터의 GAG 단백질과 함께 관심 수용체를 공동 형질감염시킴으로써 생성된다. GAG는 균일한 패키징 배향(도 20A) 및 크기(도 20B-20D)를 갖는 마이크로소포 및 엑소좀의 생성을 자극한다(Geeurickx 외, Nature Protocols, 16: 603-633, 2021). GAG 공동-형질감염은 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 나타낸 바와 같이 소포 내부로의 수용체의 패키징(도 20E 및 20F) 및 rEV로 효율적으로 트래피킹된 GPCR(도 20G)을 향상시켰다. BLI는 연관 곡선이 역전된 소포의 검출을 가능하게 하였으며(Cameron 외, Octet® Potency Assay: Development, Qualification and Validation Strategies. Satorius Application Note, 2021), 이는 이러한 연관이 우리의 BLI 판독값에서 rEV-크기의 입자로 인한 것이라 확신할 수 있게 하였다.
폴리오바이러스 수용체(PVR) 및 세포예정사 리간드 1(PD-L1)은 형광 표지된 GAG와 함께 소포에 패키징되었고, 이러한 rEV들은 포괄적인 다중 막관통 라이브러리에 대해 스크리닝되었다. 도 18A-18D의 재조합 단백질에서와 같이, PVR은 대조군 단일 막관통 수용체에만 결합된 rEV(도 21A) 및 대조군 수용체 뿐만 아니라 ADGRB1에도 결합된 PD-L1(도 21B)에 패키징되었다.
다음으로, 최근 공개된(Martinez-Martin 외, Nature Communications, 7: 11473, 2016; Verschueren 외, Cell, 182: 329-344.e19, 2020) 결합력 기반 단백질의 세포외 상호작용 라이브러리는 rEV에 패키징된 GPCR의 상호 작용을 매핑하도록 조정되었다. 간단히 말하면, 이러한 라이브러리는 배지로의 분비를 위한 신호 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터에서 Fc-태그가 있는 단백질들의 대규모 집합체를 포함한다. 형질감염 후, 조건화 배지는 위에서 설명한 대로 단백질 A 코팅된 흰색 플레이트에서 인큐베이션되어 배지에서 단백질을 캡처한다. 이 스크린을 위해, 수용체-리간드 상호작용의 신속하고 민감한 검출을 가능하게 하기 위해 각각의 GPCR을 Rluc8에 융합시켰다(Loening 외, Protein Engineering, Design & Selection, 19(9): 391-400, 2006). 단백질 라이브러리의 구성원에 결합하는 rEV들에 패키징된 GPCR들은 루시퍼라제가 생성한 빛을 사용하여 검출되었다.
ADGRB1은 Fc에 융합된 단일 막관통 수용체 세포외 도메인(STM 라이브러리)의 집합체에 대해 스크리닝되었다(도 21C). ADGRB1과 RTN4R 패밀리 구성원(Chong 외, Genome Biology, 19(1): 205, 2018) 및 PD-L1 사이의 상호작용이 확인되었다. PD-L1과 관련된 단백질인 ICOSLG를 포함하여 다수의 새로운 상호작용이 또한 밝혀졌다(표 15; Greenwald 외, Annual Review of Immunology, 23: 515-548, 2005). 도 26A-26F는 STM 라이브러리 또는 Fc에 융합된 분비 단백질 라이브러리에 대한 ADGRB1, LGR4 또는 LGR5를 포함하는 EV들의 결합에 대한 스크린 결과를 보여준다. 이들 스크린에서 식별된 새로운 상호작용을 표 15에 나타낸다.
표 15. 스크린에서 식별된 상호작용
D.
재조합 단백질은 발견된 ADGRB1 결합제 확인시켜준다
일부 상호작용을 확인하기 위해 재조합 단백질을 사용하였다(도 22A). 비너스에 융합된 ADGRB1을 과발현하는 세포(도 22B)를 Fc 태그에 융합된 재조합 PD-L1, ICOSLG 또는 RTN4R로 처리하고 강력한 결합을 Fc 태그에 대한 염색으로 관찰하였다. 이러한 결합은 ADGRB2 또는 ADGRB3에서는 관찰되지 않았다(도 24A-24C).
E.
논의
G 단백질-결합 수용체(GPCR) 상호작용 매핑은 강력하지만 아직 개발되지 않은 연구 영역이다. 본 실시예에서는, 두 개의 상호 작용 매핑 플랫폼이 GPCR을 수용하도록 조정되었다(도 23). 첫 번째는 고아 리간드에 대한 새로운 수용체를 발견하는 데 사용할 수 있는 세포 기반 플랫폼이다. 여기에서, 이 세포 기반 플랫폼은 ADGRB1(부착 GPCR B1)이라고 하는, PD-L1에 대한 이전에 인정되지 않은 수용체를 발견하는 데 사용되었다. 둘째, 위에서 설명한 대로 재조합 세포외 소포(rEV)에서 GPCR을 사용하여 결합력 기반 상호 작용 스크린을 구현했다. 이러한 방식으로 잠재적인 상호 작용 파트너들의 라이브러리들에 대해 관심 있는 GPCR을 스크리닝할 수 있다. 이 소포 기반 플랫폼을 사용하여, ADGRB1이 ICOSLG에 결합하는 것으로 나타났다.
ADGRB1은 현저하게 긴 N-말단을 공유하는 33개의 부착 GPCR 계열에 속한다. 부착 GPCR은 골지체에서 이러한 긴 세포외 도메인을 자가단백질분해하는 것으로 생각되지만 원형질막에서 함께 복합체를 유지시킨다. 리간드의 결합 시, 큰 세포외 도메인은 7개의 막관통 도메인으로부터 해리되고, 남아있는 짧은 줄기는 프로테아제 활성화 수용체 패밀리와 유사한 방식으로 7개의 막관통 도메인을 활성화시킨다(Nijmeijer 외, Biochemical Pharmacology, 114: 88-102, 2016). 부착 GPCR은 G 단백질을 활성화하고 또한 어레스틴을 동원하는 것으로 밝혀진 바 있다(Kishore 외, The Journal of Biological Chemistry, 291(7): 3385-3394). ADGRB1의 대형 세포외 도메인은 지질다당류 및 포스파티딜세린에 결합하고, 수용체 활성화는 박테리아 세포 및 세포사멸 세포의 포식을 유도하는 것으로 여겨진다(Park 외, Nature, 450(7168): 430-434, 2007; Das 외, The FASEB Journal, 28(5): 2214-2224). 대식세포에서의 ADGRB1 발현은 이전에 입증된 바 있으나(Park 외, Nature, 450(7168): 430-434, 2007); 이러한 관찰결과는 최근에 도전을 받아왔다(Hsiao 외, Frontiers in Immunology, 10: 962, 2019). ADGRB1은 또한 암세포에서 하향 조절되는 종양 억제 유전자로 알려져 있다(Zhu 외, Cancer Cell, 33(6): 1004-1016e15, 2018).
T 세포 활성화를 위한 2개의 고전적 리간드(PD-L1 및 ICOSLG)에 결합하는 ADGRB1이 관찰되었다는 것은 흥미로운 사실이다. 그러나, 이들 리간드는 PD-L1이 T 세포를 억제하고 ICOSLG가 T 세포를 활성화시키는 T 세포 활성화에 반대 효과를 갖는 것으로 알려져 있다 (Greenwald 외, Annual Review of Immunology, 23: 515-548, 2005). 종양이 T 세포를 피하는 방법 중 하나는 PD-L1을 과발현하여 T 세포의 침묵을 유발하여 종양이 면역 체계를 피하도록 하는 것이다. 실제로, PD-1/PD-L1은 T 세포 침묵을 억제하기 위해 생물학적 약물의 표적이 되었으며 암에 대해 입증된 임상적으로 효과적인 면역 요법이다(Lee 외, Scientific Reports, 7(1): 5532, 2017). PD-1/PD-L1 차단이 효과가 없을 수 있으므로 ADGRB1과 PD-L1 및 ICOSLG의 상호작용은 약물 개발을 위한 새로운 방법을 제공할 수 있다(Lee 외, Frontiers in Pharmacology, 12: 681320, 2021).
해결하지 못한 한 가지 질문은 ADGRB1과 PD-L1 및 ICOSLG의 상호 작용이 신호전달에 미치는 영향이다. 이종 세포주에서 ADGRB1 기반 신호전달 모델을 개발하는 것은 어려웠다(도 25A-25D). 최근에, 또 다른 부착 GPCR 계열 구성원이 N-말단 결합에 반응하여 Gαi를 활성화하고 또한 7개의 막관통 도메인에 직접 결합하는 콜레스테롤 처리에 의해 활성화되는 것으로 나타났다(Ping 외, Nature, 589(7843), 620-626, 2021). 이전 연구에서는 ADGRB1이 HEK 세포에서 절단되지 않고(Ara 외, The EMBO Journal, 31(6): 1364-1378, 2012), 또한 ADGRB1이 ELMO라는 비-정규 이펙터를 통해 신호를 보낸다는 것을 보여주었다 (Park 외, Nature, 450(7168): 430-434, 2007). ADGRB1의 활성화는 관련 세포주 또는 생체 내에서만 가능할 수 있다.
GPCR은 많은 약물 개발 프로그램의 중요한 표적이다. GPCR에 대한 많은 소분자 제제가 임상에 성공적으로 도입되었다. 그러나 생물학적 제제와 같은 새로운 약물 양식은 GPCR 약물 개발을 위한 소분자보다 뒤떨어져 있다. 새로운 방식, 특히, 항체 기반 생물학적 제제는 세포외 단백질 상호 작용을 표적하고 수용체 활성화를 조절하는 강력한 방법을 제공한다. 여기에서, GPCR 세포외 상호 작용을 매핑하는 방법이 개발되었으며 암 면역 요법에 영향을 미치는 새로운 상호 작용이 발견되었다.
F.
재료 및 방법
세포 배양물
HEK 293T 및 COS7 세포는 DMEM + 10% FBS, 10mM HEPES pH 7.4 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/mL)에서 유지되었다. EXPI293FTM 세포를 EXPI293TM 발현 배지에서 150 RPM으로 진탕하면서 배양하였다.
다중-막관통 수용체 라이브러리 생성
수용체를 pT-Rex-DEST31 플라스미드(Invitrogen) 또는 pRK 플라스미드(Genentech)에 클로닝하고 서열을 검증했다. 100 ng의 수용체 DNA(10 μL/웰에 대해 10 ng/μL)를 384 웰 블랙 Aurora 마이크로플레이트(카탈로그 번호 ABC2-312-1B-PDL)의 각 웰에 플레이팅했다. DNA-프린트된 Aurora 플레이트를 밀봉하여 실험 당일까지 -20°C에서 보관하였다.
형질감염 당일, DNA 인쇄된 Aurora 플레이트를 실온에서 해동하고 원심분리시켰다. 1:0.0072로 희석된 LIPOFECTAMINETM LTX 및 1:0.0024로 희석된 PLUSTM 시약(Thermo Fisher, 카탈로그 번호15338100)이 포함된 Opti-MEMTM(Thermo Fisher, 카탈로그 번호11058021) 20μL를 384웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37°C에서 5% CO2로 함께 20분간 인큐베이션하였다. 그 후, DMEM + 10% FBS, HEPES 및 P/S에 150,000개 세포/mL로 희석된 COS7 세포 20 μL를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 5% CO2와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다.
수용체 발현 분석
48시간 후, 수용체 형광으로 발현을 검증하였다. 세포들은 Opti-MEMTM + 5% BSA에서 45분 동안 37°C에서, 5% CO2와 함께 고갈되었다. 다음으로, 토끼 항-HIS 항체(Cell Signaling, 카탈로그 번호 2365) 또는 마우스 항-FLAG 항체(Sigma, 카탈로그 번호 F3165)를 Opti-MEMTM + 5% BSA에 1:1000으로 희석하고 세포에서 45분 동안 4°C에서 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 PBS + Ca/Mg로 세척하고 실온에서 20분 동안 4% PFA로 고정한 다음 다시 PBS + Ca/Mg로 세척하고 Opti-MEMTM + 5% BSA에서 실온에서 1:1000으로 희석한 토끼 또는 마우스 Alexa-647 2차 항체로 염색했다. 그런 다음 세포를 세척한 후, DAPI 염색(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 62248)을 실온에서 20분 동안 1μg/mL로 하고 다시 세척했습니다. 이미징 당일까지 4°C에서 PBS + Ca/Mg에 보관한다.
수용체 발현은 DAPI, GFP 및 Cy5에 대한 사전 설정 필터가 있는 IN Cell 애널라이저 6000(GE Healthcare)에서 10X 대물렌즈를 사용하여 2개의 이미징 필드를 캡처하여 평가했다. IN Cell 애널라이저 6000 디벨롭먼트 소프트웨어를 사용하여 DAPI, GFP 및 Cy5 채널에 대한 관심 영역을 그리고 총 대상체의 수 뿐만 아니라 전체 필드의 픽셀 밀도를 카운트하였다. 총 발현은 GFP 채널을 총 세포 수(DAPI 카운트)로 나눈 값으로 표시된다. 표면 발현은 항체 채널(Cy5)을 총 세포 수로 나눈 값으로 표현된다.
세포 기반 상호작용 스크리닝
수용체 발현 분석과 유사하게, Opti-MEMTM + 5% BSA에서 형질감염 48시간 후 세포를 차단하였다. 1차 항체 대신, Opti-MEMTM + 5% BSA에 희석된 100nM의 사량체화된 리간드로 세포를 4°C에서 45분간 처리하였다. 사량체는 이전에 기술된 바를 약간 변형하여 제조되었다(Verschueren 외, Cell, 182(2): 329-344.e19, 2020). 간략히 말하면, 스트렙타비딘-APC(Agilent, PJ27S) 및 관심 비오티닐화된 단백질(RSPO3 및 PVR은 자체 생산, PD-L1은 Bio-Techne에서 구입, 카탈로그 번호 AVI156)의 총 질량을 계산했다. 필요한 단백질의 총 부피를 분취하고 소정 부피의 스트렙타비딘을 4단계로 첨가하였으며, 단계들 사이에 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 최종 첨가 및 인큐베이션 후, 사량체를 Opti-MEMTM + 5% BSA에서 100nM의 최종 농도로 희석하였다. EGF-647의 경우, 형광 단백질을 Thermo Fisher사로부터(카탈로그 번호 E35351) 구입하여 Opti-MEMTM + 5% BSA에서 100nM로 희석했다. 그런 다음 세포를 PBS + Ca/Mg로 세척하고 실온에서 20분 동안 4% PFA에서 고정시키고, 다시 세척하고 DAPI 염색(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 62248)하고 이미징 일자까지 4°C에서 PBS + Ca/Mg에 보관했다.
소포 기반 상호작용 스크리닝을 위해, 사량체화 리간드 대신 소포를 첨가하였고 GAG를 Neon Green에 융합시켰다.
수용체 발현 분석을 위해 상기 기술된 바와 같이 이미징을 수행하였다.
재조합 세포외 소포 제제
100mL의 EXPI293FTM 세포를 50μg의 GAG DNA와 50μg의 수용체로 분할한 100μg의 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 세포를 원심분리시키고 배지를 0.2 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 여과된 배지에 프로테아제 억제제(Roche)를 첨가하고 30분 동안 2,000 x g의 느린 속도로 원심분리하였다. 다음으로, 배지를 90분 동안 100,000 x g에서 원심분리하였다. 소포 펠릿들을 PBS + Ca/Mg에서 재구성하고 실험 당일까지 보관하였다.
전자 현미경
전자 현미경은 본원에 기재된 바와 같이 수행되었다. 소포의 현탁액을 포름바르 및 카본 코팅된 TEM 그리드의 표면에 15분 동안 흡착시켰다. 증류수로 간단히 헹구고 샘플을 EV 프렙 클린업을 위해 2% 인텅스텐산(PTA)으로 60초 동안 염색한 다음 공기 건조시켰다. 이후 샘플을 15분 동안 PBS로 세척하고, 1분 동안 물로 세척하고, 1분 동안 1% 우라닐 아세테이트로 염색한 후 블롯팅하고 공기 건조시켰다. JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경(TEM)과 GATAN ULTRASCAN® 1000 CCD 카메라를 사용하여 5000x에서 50000x까지의 배율로 이미징을 수행했다. 눈금 막대는 이미지에 표시된다.
나노사이트(NanoSight)
소포를 깨끗한 PBS에 희석하고 NanoSight(Malvern Panalytical) 데이터를 수집하고 깨끗한 PBS를 기준선으로 사용하여 3회 실험에 대해 평균을 냈다.
생물층 간섭계
소포를 PBS에 희석하고 gD 항체(abcam, 카탈로그 번호 ab6507) 및 FLAG 항체(Sigma, 카탈로그 번호 F3165)를 PBS에서 1:10으로 희석하였으며; TIGIT-Fc(Bio-techne 카탈로그 번호 7898-TGB)를 100μg/mL로 희석했다. AMC 팁(Sartorius, 카탈로그 번호 18-5088) 또는 AHC 팁(카탈로그 번호 18-5060)을 사용하여 각각 항체 또는 Fc 태그를 캡처했다.
소포 기반 상호작용 스크리닝
소포 기반 상호작용 스크린은 위에서 설명한 바와 같이 수행되었다. 대조군 단백질 및 후속 실험을 위해, 재조합 단백질 및 항체를 백색 384 웰 단백질 A 코팅된 플레이트(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 NCI15133)의 빈 웰에 첨가하고 4℃에서 적어도 24시간 동안 인큐베이션하였다.
리간드 결합
리간드 결합을 위해, 관심 수용체가 인산칼슘 형질감염을 사용하여 HEK 세포에서 일시적으로 과발현된 다음 Aurora 이미징 플레이트에 플레이팅된 것을 제외하고는 상호작용 스크리닝과 동일한 프로토콜이 사용되었다. 사량체화된 리간드 대신, Fc-융합 단백질(BIO-TECHNE®, PD-L1 카탈로그 번호 AVI156, ICOSLG 카탈로그 번호 AVI165, 및 RTN4R 카탈로그 번호 1208-NG)을 10 μg/mL의 농도로(각 이량체에 대해 ~70 nM) 세포에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 Alexa-647에 융합된 항-인간 Fc를 2차 항체로 사용하고 이미지를 IN Cell 애널라이저 6000에서 캡처했다.
실시예 7. 상이한 세포주들에서 rEV 기반 RDIMIS를 사용한 세포 상태 프로파일링
상기 실시예는 rEV를 사용하여 관심 수용체와의 상호작용을 식별하고 특성화할 수 있음을 입증한다. 또한, 일반적으로 rEV와 상호작용하는 다수의 결합 파트너가 식별되었다(예를 들어, 실시예 4 참조). 이러한 상호 작용들은 관심 수용체와 많은 다른 막 및 세포질 단백질이 모 세포의 발현 수준에 비례하는 수준으로 rEV에 통합되는 것처럼 보이기 때문에, rEV에 대한 기원 세포(모 세포) 상태의 스냅샷을 캡처할 수 있다.
따라서 rEV가 세포 표면 단백질을 캡처할 수 있고(예를 들어, 주어진 시점에서 세포 표면 단백질의 대표적인 샘플을 캡처할 수 있음) 그리하여 RDIMIS가 상이한 세포 상태를 가진 세포들과 관련된 상호 작용들을 프로파일링하는 데 사용될 수 있다고 가설을 세운다. 구체적으로, rEV는 rEV의 모 세포와의 세포 상호작용에 대한 프록시로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 질병 특이적 자극, 분화 및 세포 유형 차이로 인해 발생하는 중요한 상호작용을 캡처할 수 있다. 이 접근법의 한 가지 장점은 복합체 및 복잡한 상호 작용 역학을 포함한 세포 표면 단백질의 응집체 결합 거동 뿐만 아니라 당화 마크 및 지질과 같은 비-단백질 구성요소에 의존하는 상호작용들을 캡처한다는 것이다.
방법
다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포주에 대해 소포 출아 인자를 발현하는 안정한 세포주 및 RDIMIS에 대한 판독값(예를 들어, RDIMIS에 대한 판독값에 부착된 소포 출아 인자, 예를 들어, gag-레닐라 루시퍼라제(gag-RLuc))이 생성된다: T 세포(JURKAT), B 세포(BJAB) 및 단핵구(THP1)를 제시하는 면역 세포주; 신경 세포주; 및 섬유모세포 세포주. 이들 세포주로부터 실시예 1에 기재된 바와 같이 rEV가 생성된다.
이로부터 생성된 세포주 및 rEV는 다음을 위해 실시된다:
1. 상이한 세포 유형을 대표하는 상이한 세포주들로부터 얻은 rEV의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 특성화; 그리고
2. 동일한 세포주로부터 얻은 rEV의 상호작용 프로파일의 시간 경과에 따른 특성화(예: 자극 추가 전과 후, 신호전달 유도 전과 후 및/또는 질병 관련 상태(예: 면역 탈진) 유도 전과 후의 시점에서 또는 분화 경로 또는 프로파일에서 2개 이상의 시점에서). 한 접근법에서, rEV는, 예를 들어, 자극이 적용된 후, 선택된 시점에서 수집된다. 또 다른 접근법에서, 출아 인자가 선택된 기간 동안에만 존재(예를 들어, 발현)되도록 세포주가 변형된다. 출아 인자의 발현은 다음을 사용하여 제어할 수 있다:
(a) 소분자(예: 세포 투과성 소분자), 예를 들어, T-REXTM 시스템의 추가 후 출아 인자의 발현을 완화하거나 억제하는 유도성 프로모터;
(b) 단백질(예: 출아 인자)이 유도 시 빠르게 분해되는 소분자-유도 분해 시스템(예: TIR1 옥신 유도성 데그론(AID) 시스템); 또는
(c) 단백질(예: 출아 인자)이 분해 도메인을 포함하고 유도 시 단백질이 분해로부터 보호되는 소분자-유도 안정화 시스템(예를 들어, Shield-1 - FKBP 시스템).
구조체들의 통합은, 예를 들어, CRISPR-Cas9 또는 게놈 공학 기술을 사용하여 구조체들을 세이프 하버 유전자좌에 삽입함으로써 수행될 수 있다. 또는 PiggyBac 트랜스포존 시스템(SBI)과 같은 무작위 통합 방법을 사용할 수 있다.
실시예 8. 막 단백질 관련 효소 활성을 측정하기 위한 EV 사용
본 실시예는 EV가 막과 관련하여 막 단백질 및 막 관련 단백질을 제시하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 이는 펩티다제, 프로테아제 및 포스파타제와 같은 효소 활성이 있는 단백질이 포함된다. 이러한 단백질의 활성은 EV에서 감지 및 분석할 수 있으므로, 일반적으로 재조합 단백질용으로 설계된 분석법들을 사용하여 막 내부에서 또는 막 위에서 막 단백질들의 효소 효과를 생화학적으로 특성화할 수 있게 한다.
한 접근법에서, 효소 활성을 갖는 단백질을 포함하는 rEV는 막 단백질에 대한 효소 분석에 사용된다. 또 다른 접근법에서, 효소 활성을 갖는 단백질을 포함하는 rEV는, 예를 들어, 분자 글루에 대한 약물 발견에 사용되며, 여기서 펩티다제, 프로테아제, 포스파타제 및 키나제는 동일한 EV에서 또 다른 막 단백질로 동원되거나 특이적 막-결합 효소 활성들을 억제할 수 있다.
펩티다제 활성 분석
개념 증명으로서, 카르복시펩티다제 M(CPM)의 펩티다제 활성이 소포에서 검출되고 분석될 수 있는지 여부를 테스트했다. 전장(FL) 또는 gD-GPI(gD) CPM은 소포에서 발현되었다.
펩티다제 활성에 대한 분석은 다음과 같이 수행되었다. 본 분석은 재조합 인간 카르복시펩티다제 M 단백질(R&D SYSTEMS®)을 사용하기 위해 제조업체에서 제공한 프로토콜에서 변형되었다.
1.
EV를 희석시켰다. 200μL 분석 완충액을 추가하고, 아래에 나열된 추가 시약들을 추가했다.
2.
기질 Bz-Ala-Arg-OH(50mM 스톡 용액)를 분석 완충액(6300μL 분석 완충액 중 126μL)에서 1mM로 희석하였다.
3.
150μL의 EV와 150μL 1mM 기질을 혼합했다. 1mM 기질 150μL만을 포함하는 대조군을 준비하였다.
4.
반응을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
5.
0.1%(v/v) 2-메르캅토에탄올을 함유하는 0.2M NaOH에 15mM o-PA를 함유하는 용액 300μL를 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 중단시켰다. (1260 μL 2M NaOH + 12.6 μL Bme + 507 μL o-PA + 10.8 mL 물)
6.
반응을 중단시킨 후, 150 μL의 EV를 대조군에 추가했다.
7.
모든 샘플들을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
8.
배양된 샘플 195μL를 플레이트에 3번 반복하여 로딩했다.
9.
남은 EV 용액도 플레이트에 추가하여 기질 배경이 없음을 확인하였다.
10.
평가변수 모드에서, 각각 330nm 및 450nm(상단 판독)의 여기 및 방출 파장에서 샘플을 판독했다.
분석 결과를 도 27에 보여준다. CPM-발현 EV에서 강력한 펩티다제 활성이 검출되었다(도 27). 이 활성은 CPM을 과발현하지 않는 EV들(pRK EV; 펩티다제 활성의 배경 수준을 나타내는 벡터 대조군)에서 관찰된 활성 보다 훨씬 더 컸다. 이 활성은 재조합 단백질을 사용하여 관찰된 펩티다제 활성에 비해 더 쉽게 검출할 수 있다.
키나제 활성 분석
키나제 활성의 징후가 소포 상에서 검출될 수 있음 또한 증명되었다: 도 28에서 보는 바와 같이, EPHA3 리간드 EFNA1-Fc 및 EFNA5-Fc와 함께 EPHA3 EV의 공동-발현은 소포들에서 검출된 EPHA3 인산화된 종들의 양을 증가시켰다. EV를 용해하고 샘플 완충액에 넣고 아크릴아미드 구배 젤에서 실행하여 단백질 종을 분리했다. 그런 다음 EPHA3, 인-특이성 물질(phospho-specifics), 튜불린 항체 및 1차 항체로 블롯팅하고 형광 태그가 있는 2차 항체(680 및 800nm LI-COR® 염료) 또는 항-인간 항체로 검출하여 발현되고 있는 다양한 단백질의 Fc 영역을 검출했다. 그런 다음 블롯을 LI-COR® 기기에서 이미징했다. 동일한 샘플을 상단 및 하단 이미지에 해당하는 2개의 상이한 젤에 개별적으로 로드했다.
실시예 9. 소포 정제를 위한 일반 EV 결합제 사용
현재까지 EV 정제를 위한 황금 표준은 길고 번거로운 과정인 초원심분리이다. 특정 EV를 정제하는 친화성 기반 방법이 있지만, 이들은 너무 더럽거나 수용체 특이적이거나 RDIMIS 스크리닝 및 대량의 EV가 필요한 기타 응용에서 사용하기에는 너무 작은 규모로 설계되었다.
실시예 4에 기재된 바와 같이, 일반적인 소포 결합제가 식별되었다. 이러한 일반 소포 결합제는 조건화 배지로부터 직접 EV를 친화도 정제하는 데 사용될 수 있다. 일반적인 소포 결합제는 본원에 기재된 순수한 재조합 EV들에 결합하는 능력에 따라 순위가 매겨졌으며(표 9) 일반적으로 인간 EV를 정제하는 데 사용할 수 있다. 한 접근 방식에서, 위의 예에 설명된 결합 조건들을 컬럼에 재현한다. 한 접근법에서, 상기 컬럼은 단백질 A-작용기화 비드를 포함한다(예를 들어, PROTEIN A SEPHAROSE® 열임). Fc 영역(예를 들어, 인간 Fc 영역)을 포함하도록 변형된 하나 이상의 최상급 일반 EV 결합제(표 9)를 함유하는 조건화 배지를 컬럼 위로 유동시키고, 컬럼을 세척한 다음, EV를 함유하는 조건화 배지를 컬럼 위로 유동시킨다. 그런 다음, EV들은 적절한 방법, 예를 들어, SIGLEC 단백질 계열에 대한 시알로글리칸과 같은 특정 리간드 및/또는 고 염과 같은 철저한 세척을 사용하여 용출된다. 필요에 따라 빠른 초원심분리-기반 클린업을 수행할 수 있다.
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<130> 50474-231WO4
<150> US 63/227,039
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<211> 500
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<400> 1
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
20 25 30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
50 55 60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp
85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
100 105 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val
115 120 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His
130 135 140
Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
165 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
180 185 190
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile
245 250 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
355 360 365
Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg
370 375 380
Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
385 390 395 400
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
405 410 415
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
420 425 430
Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe
435 440 445
Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg
450 455 460
Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp
465 470 475 480
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp
485 490 495
Pro Ser Ser Gln
500
Claims (175)
- 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 고체 표면에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)의 집합체를, 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건하에서 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제(membrane-budding agent)를 포함하는 생물학적 소포(BV)와 접촉시키는 단계이며, 이종 막-결합 단백질은 BV 표면에서 임계 수준 이상으로 발현되는 것인 단계, 및
(c) 이종 막-결합 단백질과 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 표적 폴리펩티드 중 하나 이상은 하나 이상의 고체 표면 상의 별개의 위치에 고정되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준보다 높은 신호를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
막-출아제는 검출가능한 마커를 추가로 포함하고,
상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 검출가능한 마커의 수준을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. - 제5항에 있어서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소인 방법.
- 제6항에 있어서,
효소는 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase, Rluc)이고,
기질은 Rluc 기질인 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
BV가 막 마커를 포함하고,
상호작용을 검출하는 단계는 고체 표면 상의 위치에서 임계 수준 보다 높은 막 마커의 수준을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. - 제8항에 있어서, 막 마커는 콜레스테롤 마커인 방법.
- 제9항에 있어서, 콜레스테롤 마커는 AMPLEX™ Red인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용은 일시적 상호작용인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용은 저친화성 상호작용인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 막 표면에 고정(tether)시키는 것인 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드인 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 태그는 직접적으로 또는 간접적으로 시각화될 수 있는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함하는 것인 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 태그는 당단백질 D(gd) 폴리펩티드인 방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 막-결합 단백질의 발현 수준은 생물층 간섭계(BLI) 분석을 사용하여 결정되는 것인 방법.
- 제20항에 있어서,
태그는 gD 폴리펩티드이고,
이종 막-결합 단백질의 발현은 항-gD 항체를 사용하여 검출되고,
임계 수준은 30℃에서 BLI 분석을 사용하여 측정 시 1.5 nm의 이동(shift)인 방법. - 제17항에 있어서, 태그는 형광 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 막-결합 단백질은 막관통 수용체 또는 이의 단편인 방법.
- 제23항에 있어서, 수용체는 단일 통과(single-pass) 막관통(STM) 수용체인 방법.
- 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 단편은 세포외 도메인인 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 폴리펩티드 집합체의 각 구성원은 Fc-태그가 있는 세포외 도메인이고,
고체 표면은 단백질 A로 코팅된 것인 방법. - 제26항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하고, BV의 외부 표면에 존재하는 이종 막-결합 단백질 및
(b) 막-출아제
를 포함하는 BV. - (a) 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하고, BV의 외부 표면에 존재하는 이종 막-결합 단백질 및
(b) 막-출아제
를 포함하는 BV로서,
(i) 이종 막-결합 단백질 및 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포를 제공하는 단계 및
(ii) 모 세포로부터 BV를 단리하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 생산되는 BV. - 제32항 또는 제33항에 있어서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 BV.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 지질 막 표면에 고정시키는 것인 BV.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커는 GPI 폴리펩티드인 BV.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 태그는 직접적으로 또는 간접적으로 시각화될 수 있는 것인 BV.
- 제37항에 있어서, 태그는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함하는 것인 BV.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 태그는 gD 폴리펩티드인 BV.
- 제37항에 있어서, 태그는 형광 단백질을 포함하는 것인 BV.
- 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 단편은 막관통 수용체의 세포외 도메인인 BV.
- 제41항에 있어서, 막관통 수용체는 STM 수용체인 BV.
- 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 태그에 대한 항체와 접촉할 때 BLI 분석을 사용하여 측정 시 임계 수준 이상인 이동을 생성하는 BV.
- 제43항에 있어서,
태그는 gD 폴리펩티드이고,
항체는 항-gD 항체이고,
임계 수준은 30℃에서 BLI 분석을 사용하여 측정 시 1.5nm의 이동인 BV. - 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 막-출아제는 검출가능한 마커를 포함하는 것인 BV.
- 제45항에 있어서, 검출가능한 마커는 기질 존재 시 형광 신호를 생성하는 효소인 BV.
- 제46항에 있어서,
효소는 Rluc이고,
기질은 Rluc 기질인 BV. - 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 막 마커를 포함하는 BV.
- 제48항에 있어서, 막 마커는 콜레스테롤 마커인 BV.
- 제49항에 있어서, 콜레스테롤 마커는 AMPLEX™ Red인 BV.
- 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 모 세포에 의해 생산되는 것인 BV.
- 제51항에 있어서, 세포외 소포(EV)인 BV.
- 제51항에 있어서, 엑소좀 또는 미세소포인 BV.
- 제51항에 있어서, 바이러스 유사 입자(VLP)인 BV.
- 제33항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 모 세포는
이종 막-결합 단백질을 인코딩하는 플라스미드 및
막-출아제를 인코딩하는 플라스미드
로 형질감염되어 있는 것인 BV. - 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소는, 후보 조절인자를 표 1의 단백질과 표 2의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 2의 단백질에 대한 표 1의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 1의 단백질을 표 2의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 1의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 표 1의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 1의 단백질에 대한 표 2의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 2의 단백질을 표 1의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 1의 단백질 및 표 2의 단백질은 표 3에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 2의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 제56항에 있어서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, BLI 분석 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정 시 적어도 70%인 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제인 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 조절인자는 표 1 또는 표 2의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제인 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속 시간의 감소인 방법.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속 시간의 증가인 방법.
- 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 소분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)인 방법.
- 제64항에 있어서, 항원 결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인인 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1의 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2의 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1의 단백질은 LRRC15인 방법.
- 제68항에 있어서, 표 2의 단백질은 TEM1인 방법.
- 제68항 또는 제69항에 있어서, 다운스트림 활성은 종양 성장인 방법.
- 제70항에 있어서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소되는 것인 방법.
- 제71항에 있어서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 LRRC15를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 TEM1을 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
- LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계, 및
(c) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소는, 후보 조절인자를 LRRC15와 TEM1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) TEM1에 대한 LRRC15의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 LRRC15를 TEM1과 접촉시키는 단계, 및
(c) LRRC15의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 LRRC15의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) LRRC15에 대한 TEM1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 TEM1을 LRRC15와 접촉시키는 단계, 및
(c) TEM1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 TEM1의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 제75항에 있어서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 다운스트림 활성은 종양 성장인 방법.
- 제79항에 있어서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소되는 것인 방법.
- 제80항에 있어서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소되는 것인 방법.
- 변경된 결합 프로파일을 갖는 생물학적 소포(BV)를 식별하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 고체 표면에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계,
(b) 상기 단계 (a)의 집합체를 관심 BV와 접촉시키는 단계,
(c) 관심 BV와 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출함으로써 상호작용 프로파일을 식별하는 단계, 및
(d) 관심 BV의 상호작용 프로파일을 대조군 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하고,
관심 BV의 상호작용 프로파일과 대조군 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이는, 관심 BV를 변경된 결합 프로파일을 갖는 것으로 식별하는 것인 방법. - 제82항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제83항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제84항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제85항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제86항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 BV는 조작된 BV인 방법.
- 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 BV는 대상체의 샘플로부터 유래하는 것인 방법.
- 제89항에 있어서, 관심 BV 및 대조군 BV는 상이한 조직 또는 상이한 세포 유형으로부터 유래하는 것인 방법.
- 제89항에 있어서,
관심 BV는 질환 조직으로부터 유래하고,
대조군 BV는 건강한 조직으로부터 유래하는 것인 방법. - 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소는, 후보 조절인자를 표 5의 단백질과 표 6의 단백질 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 6의 단백질에 대한 표 5의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 5의 단백질을 표 6의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 5의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 표 5의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) 표 5의 단백질에 대한 표 6의 단백질의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 표 6의 단백질을 표 5의 단백질과 접촉시키는 단계이며, 표 5의 단백질 및 표 6의 단백질은 표 7에서 상호작용하는 것으로 보고되어 있는 것인 단계, 및
(c) 표 6의 단백질의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 제92항에 있어서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, BLI 분석 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정 시 적어도 70%인 방법.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 억제제인 방법.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 조절인자는 표 5 또는 표 6의 단백질의 다운스트림 활성의 활성화제인 방법.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속 시간의 감소인 방법.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 다운스트림 활성에 있어서의 변화는 다운스트림 활성의 양, 강도 또는 지속 시간의 증가인 방법.
- 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 소분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 모방체, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)인 방법.
- 제100항에 있어서, 항원 결합 단편은 비스-Fab, Fv, Fab, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv, ScFab, VH 도메인 또는 VHH 도메인인 방법.
- 제100항 또는 제101항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5의 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 제100항 또는 제101항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6의 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 제92항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표 5의 단백질은 ADGRB1인 방법.
- 제104항에 있어서, 표 6의 단백질은 PD-L1인 방법.
- 제104항 또는 제105항에 있어서, 다운스트림 활성은 종양 성장인 방법.
- 제106항에 있어서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소되는 것인 방법.
- 제107항에 있어서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소되는 것인 방법.
- 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 PD-L1을 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
- 제104항에 있어서, 표 6의 단백질은 ICOSLG인 방법.
- 제110항에 있어서, 다운스트림 활성은 T 세포 활성화인 방법.
- 제111항에 있어서, T 세포 활성화는 조절인자의 존재 시 증가되는 것인 방법.
- 제112항에 있어서, T 세포 활성화는 적어도 20%만큼 증가되는 것인 방법.
- 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 ICOSLG를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
- 제104항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 조절인자는 ADGRB1을 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
- PD-L1과 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계, 및
(c) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소는, 후보 조절인자를 PD-L1과 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) ADGRB1에 대한 PD-L1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 PD-L1을 ADGRB1과 접촉시키는 단계, 및
(c) PD-L1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 PD-L1의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) PD-L1에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1를 PD-L1과 접촉시키는 단계, 및
(c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 제116항에 있어서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%인 방법.
- 제117항 또는 제118항에 있어서, 다운스트림 활성은 종양 성장인 방법.
- 제120항에 있어서, 종양 성장은 조절인자의 존재 시 감소되는 것인 방법.
- 제121항에 있어서, 종양 성장은 종양 성장 분석에서 측정 시 적어도 20%만큼 감소되는 것인 방법.
- ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG를 ADGRB1과 접촉시키는 단계, 및
(c) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 결합에 대한 후보 조절인자 존재 시의 결합에 있어서의 증가 또는 감소는, 후보 조절인자를 ICOSLG와 ADGRB1 사이의 상호작용의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) ADGRB1에 대한 ICOSLG의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ICOSLG를 ADGRB1과 접촉시키는 단계, 및
(c) ICOSLG의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 ICOSLG의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자를 식별하는 방법으로서,
(a) 후보 조절인자를 제공하는 단계,
(b) ICOSLG에 대한 ADGRB1의 결합을 허용하는 조건하에서 후보 조절인자의 존재 또는 부재 시 ADGRB1를 ICOSLG와 접촉시키는 단계, 및
(c) ADGRB1의 다운스트림 활성을 측정하는 단계
를 포함하고,
후보 조절인자 부재 시의 다운스트림 활성에 대한 후보 조절인자 존재 시의 다운스트림 활성에 있어서의 변화는, 후보 조절인자를 ADGRB1의 다운스트림 활성의 조절인자로서 식별하는 것인 방법. - 제123항에 있어서, 결합에 있어서의 증가 또는 감소는 SPR 분석, BLI 분석 또는 ELISA로 측정 시 적어도 70%인 방법.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, 다운스트림 활성은 T 세포 활성화인 방법.
- 제126항에 있어서, T 세포 활성화는 조절인자의 존재 시 감소되는 것인 방법.
- 제127항에 있어서, T 세포 활성화는 적어도 20%만큼 증가되는 것인 방법.
- 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법으로서,
(a) 세포주를 막-출아제를 포함하도록 변형시키는 단계, 및
(b) 세포주에 의해 생산된 생물학적 소포(BV)의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계
를 포함하는 방법. - 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 세포주의 상호작용 프로파일을 특성화하는 방법으로서,
세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계
를 포함하는 방법. - 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별하는 방법으로서,
(a) 세포주를 막-출아제를 포함하도록 변형시키는 단계,
(b) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계,
(c) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계, 및
(d) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하고,
제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이는, 상기 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별하는 것인 방법. - 막-출아제를 포함하도록 변형된 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별하는 방법으로서,
(a) 제1 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계,
(b) 제2 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계, 및
(c) 제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하고,
제1 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 시점에 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이는, 상기 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 변화를 식별하는 것인 방법. - 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주인 방법.
- 제134항에 있어서, 포유동물 세포주는 면역 세포주, 신경 세포주, 또는 섬유모세포 세포주인 방법.
- 제135항에 있어서, 면역 세포주는 T-세포, B-세포, 또는 단핵구 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 시점 이후 제2 시점 이전에 세포주를 자극에 노출시키는 단계
를 포함하는 방법. - 제137항에 있어서, 자극은 신호전달을 유도하는 조건 또는 제제인 방법.
- 제137항에 있어서, 자극은 질환 관련 상태를 유도하는 조건 또는 제제인 방법.
- 제139항에 있어서,
세포주는 면역 세포주이고,
질환 관련 상태는 면역 고갈인 방법. - 제137항에 있어서, 자극은 분화를 유도하는 조건 또는 제제인 방법.
- 제132항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 추가 시점에서 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 두 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법으로서,
(a) 각 세포주를 막-출아제를 포함하도록 변형시키는 단계,
(b) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계,
(c) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계, 및
(d) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하고,
제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이는, 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 것인 방법. - 막-출아제를 포함하도록 변형되어 있는 두 세포주의 상호작용 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 방법으로서,
(a) 제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계,
(b) 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계, 및
(c) 제1 세포주에서 생성된 BV의 상호작용 프로파일을 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하고,
제1 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일과 제2 세포주에 의해 생성된 BV의 상호작용 프로파일 사이의 차이는, 두 세포주의 표면 단백질 프로파일에 있어서의 차이를 식별하는 것인 방법. - 제130항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 막-출아제의 발현은 유도성인 방법.
- 제130항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 BV에서 하나 이상의 관심 막-결합 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제130항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는 BV에서 하나 이상의 관심 수용체의 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제130항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, BV의 상호작용 프로파일을 특성화하는 단계는
(a) 하나 이상의 고체 표면에 고정된 표적 폴리펩티드의 집합체를 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)의 표적 폴리펩티드의 집합체를 BV와 접촉시키는 단계, 및
(c) BV와 표적 폴리펩티드 집합체의 적어도 하나의 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출하여 상호작용 프로파일을 식별하는 단계
를 포함하는 방법을 사용하여 수행되는 것인 방법. - 제148항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 25%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제149항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 50%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제150항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 75%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제151항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 단백질의 적어도 90%의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제152항에 있어서, 표적 폴리펩티드의 집합체는 표 4의 모든 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제130항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
BV의 세포질 단백질 프로파일을 특성화하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제130항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 이종 막-출아제를 포함하는 BV로서,
(i) 유도성 대조군하에서 막-출아제를 발현하도록 변형되어 있는 모 세포주를 제공하는 단계,
(ii) 막-출아제의 발현을 유도하는 단계, 및
(iii) 모 세포주로부터 BV를 단리하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 생산되는 BV. - 제156항에 있어서, 막-출아제는 HIV gag 단백질, Acyl.Hrs, ARRDC1 및 ARF6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 BV.
- 제156항 또는 제157항에 있어서, 모 세포주는 포유동물 세포주인 BV.
- 제158항에 있어서, 세포외 소포(EV)인 BV.
- 막-결합 단백질의 효소 활성을 평가하는 방법으로서,
상기 단백질을 포함하는 BV에서 효소 활성에 대한 분석을 수행하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제160항에 있어서,
막-결합 단백질은 펩티다제이고,
효소 활성에 대한 분석은 펩티다제 활성에 대한 분석인 방법. - 제160항에 있어서,
막-결합 단백질은 프로테아제이고,
효소 활성에 대한 분석은 프로테아제 활성에 대한 분석인 방법. - 제160항에 있어서,
막-결합 단백질은 키나제이고,
효소 활성에 대한 분석은 키나제 활성에 대한 분석인 방법. - 제160항에 있어서,
막-결합 단백질은 포스파타제이고,
효소 활성에 대한 분석은 포스파타제 활성에 대한 분석인 방법. - 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 막-결합 단백질은 BV가 유래된 모 세포에 내인성인 방법.
- 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 막-결합 단백질은 BV가 유래된 모 세포에 이종인 방법.
- 제166항에 있어서, 이종 막-결합 단백질은 전장 단백질인 방법.
- 제166항에 있어서, 이종 막-결합 단백질은 단백질 단편, 태그 및 앵커를 포함하는 것인 방법.
- 제168항에 있어서, 앵커는 단백질 단편을 BV의 막 표면에 고정시키는 것인 방법.
- 제168항 또는 제169항에 있어서, 앵커는 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 폴리펩티드인 방법.
- 배양 배지 또는 대상체의 샘플로부터 BV를 정제하는 방법으로서,
표 8 또는 표 9의 단백질 중 하나 이상을 포함하는 고체 표면과 BV를 접촉시키는 단계
를 포함하는 방법. - 제171항에 있어서, 대상체의 샘플은 소변 샘플, 혈액 샘플 또는 소화된 조직 샘플인 방법.
- 제171항 또는 제172항에 있어서,
고체 표면은 단백질 A-작용기화 비드를 포함하는 컬럼이고,
표 8 또는 표 9의 단백질 중 하나 이상을 포함하는 조건화 배지를 컬럼에 유동시키는 단계를 포함하며,
표 8 또는 표 9의 상기 하나 이상의 단백질은 Fc 영역을 포함하도록 변형되어 있는 것인 방법. - 제173항에 있어서,
BV를 포함하는 배양 배지를 컬럼에 유동시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제174항에 있어서,
BV를 용출시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
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