TW202229866A

TW202229866A - 顯示細胞表面蛋白質的生物囊泡及其相關方法

Info

Publication number: TW202229866A
Application number: TW110144708A
Authority: TW
Inventors: 馬丁納迪亞馬丁尼茲; 尚恩Ｍ皮特森; 聖亞曹
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2020-12-01
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2022-08-01
Also published as: EP4256349A1; US20240027469A1; IL303228A; MX2023006223A; CA3201626A1; AU2021392625A1; JP2023552748A; WO2022119805A1; KR20230116843A

Abstract

本文提供顯示細胞表面蛋白質的生物囊泡，以及使用此等囊泡鑑定和表徵蛋白質-蛋白質交互作用的方法。

Description

顯示細胞表面蛋白質的生物囊泡及其相關方法

質膜所表現之蛋白質及其交互作用子在啟動訊號傳導至細胞之胞質液中發揮突出作用，因此是大多數生物途徑的關鍵調節素。越來越多的證據表明，受體在細胞外環境中具有復雜的交互作用配偶體情景，直接影響其生物功能。因此，受體-配體串擾失調通常是病理及疾病進展的基礎。然而，由於與將膜蛋白維持在其天然構形蛋白質中相關的生化挑戰以及受體之間通常較弱的交互作用，因此受體交互作用網絡仍然在研。

因此，對於鑑定細胞表面蛋白質之間交互作用的方法和組成物以及具有此類交互作用的新穎調節劑及使用其等之方法的需求尚未得到滿足。

在一個態樣中，本揭露提供一種鑑定蛋白質-蛋白質交互作用之方法，該方法包含：(a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物；(b) 將步驟 (a) 的集合物與包含異源膜相關蛋白和膜出芽劑之生物囊泡 (BV) 在允許該異源膜相關蛋白與標靶多肽中之至少一個標靶多肽結合的條件下接觸，其中該異源膜相關蛋白被以閾值水平或高於閾值水平表現於 BV 表面上；且 (c) 檢測異源膜相關蛋白與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定蛋白質-蛋白質交互作用。

在一些態樣中，標靶多肽中之一個或多個被固定至一個或多個固體表面上的不同位置。

在一些態樣中，檢測交互作用包含檢測固體表面上的位置處的高於閾值水平的訊號。

在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。

在一些態樣中，膜出芽劑進一步包含可檢測標記，且檢測交互作用包含檢測固體表面上的位置處的高於閾值水平的可檢測標記的水平。在一些態樣中，可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶。在一些態樣中，酶為海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc)，且受質為 Rluc 受質。

在一些態樣中，BV 包含膜標記，且檢測交互作用包含檢測固體表面上的位置處的高於閾值水平的膜標記的水平。在一些態樣中，膜標記為膽固醇標記。在一些態樣中，膽固醇標記為 AMPLEX ^TMRed。

在一些態樣中，交互作用為短暫交互作用。

在一些態樣中，交互作用為低親和力交互作用。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白為全長蛋白。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物。

在一些態樣中，錨定物將該蛋白質片段栓繫至 BV 之膜的表面。在一些態樣中，錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。

在一些態樣中，標籤可直接或間接地可視化。在一些態樣中，標籤包含可使用抗體或抗體片段檢測的部分。在一些態樣中，標籤為醣蛋白 D (gD) 多肽。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白的表現水平係使用生物層干涉 (BLI) 測定來確定。

在一些態樣中，標籤為 gD 多肽，使用抗 gD 抗體檢測該異源膜相關蛋白的表現，且如在 30℃ 使用該 BLI 測定所測量，該閾值水平為 1.5 nm 的偏移。

在一些態樣中，標籤包含螢光蛋白。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白為跨膜受體或其片段。在一些態樣中，受體為單通道跨膜 (STM) 受體。

在一些態樣中，蛋白質片段為細胞外域。

在一些態樣中，標靶多肽之集合物的每個成員是帶有 Fc 標籤的細胞外域，且其中固體表面被蛋白質 A 包覆。

在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 25% 的蛋白質的細胞外域。在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 50% 的蛋白質的細胞外域。在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 75% 的蛋白質的細胞外域。在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 90% 的蛋白質的細胞外域。在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之所有蛋白質的細胞外域。

在另一態樣中，本揭露提供一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中異源膜相關蛋白存在於 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中異源膜相關蛋白存在於 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑，該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾以表現異源膜相關蛋白及膜出芽劑的親代細胞，及 (ii) 從親代細胞中分離 BV。

在一些態樣中，錨定物將蛋白質片段栓繫至 BV 之脂質膜的表面。在一些態樣中，錨定物為 GPI 多肽。

在一些態樣中，標籤可直接或間接地可視化。在一些態樣中，標籤包含可使用抗體或抗體片段檢測的部分。在一些態樣中，標籤為 gD 多肽。

在一些態樣中，標籤包含螢光蛋白。

在一些態樣中，蛋白質片段為跨膜受體之細胞外域。在一些態樣中，跨膜受體為 STM 受體。

在一些態樣中，其中當與針對標籤的抗體接觸時，如使用 BLI 測定所測量，BV 產生等於或高於閾值水平的偏移。

在一些態樣中，標籤為 gD 多肽，該抗體為抗 gD 抗體，且如在 30℃ 使用 BLI 測定所測量，閾值水平為 1.5 nm 的偏移。

在一些態樣中，膜出芽劑包含可檢測標記。在一些態樣中，可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶。在一些態樣中，酶為 Rluc，且受質為 Rluc 受質。

在一些態樣中，BV 包含膜標記。在一些態樣中，膜標記為膽固醇標記。在一些態樣中，膽固醇標記為 AMPLEX ^TMRed。

在一些態樣中，BV 係藉由哺乳動物親代細胞產生。在一些態樣中，BV 為細胞外囊泡 (EV)。在一些態樣中，BV 為胞外體或微囊泡。在一些態樣中，BV 為病毒樣顆粒 (VLP)。

在一些態樣中，親代細胞已用編碼異源膜相關蛋白的質體及編碼膜出芽劑的質體轉染。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間交互作用的調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 1 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 1 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 2 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 2 之蛋白質與表 1 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 2 之蛋白質與表 1 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 2 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 2 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，如藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定、BLI 測定或酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。

在一些態樣中，調節劑為表 1 或表 2 之蛋白質的下游活性之抑制劑。在一些態樣中，調節劑為表 1 或表 2 之蛋白質的下游活性之活化劑。

在一些態樣中，下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的減少。在一些態樣中，下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的增加。

在一些態樣中，調節劑為小分子、抗體或其抗原結合片段、肽、模擬物、反義寡核苷酸或小干擾 RNA (siRNA)。

在一些態樣中，抗原結合片段為雙-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域。

在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 1 之蛋白質。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 2 之蛋白質。

在一些態樣中，表 1 之蛋白質為 LRRC15。在一些態樣中，表 2 之蛋白質為 TEM1。在一些態樣中，下游活性為腫瘤生長。在一些態樣中，腫瘤生長在調節劑的存在下減少。在一些態樣中，如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。

在一些態樣中，調節劑為靶向 LRRC15 的抗體或其抗原結合片段。

在一些態樣中，調節劑為靶向 TEM1 的抗體或其抗原結合片段。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 與 TEM1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 LRRC15 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 LRRC15 的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 TEM1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 TEM1 與 LRRC15 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 TEM1 與 LRRC15 接觸；及 (c) 測量 TEM1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 TEM1 的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，如藉由 SPR 測定、BLI 測定或 ELISA 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。

在一些態樣中，下游活性為腫瘤生長。

在一些態樣中，腫瘤生長在調節劑的存在下減少。在一些態樣中，如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定具有改變的結合型態的生物囊泡 (BV) 之方法，該方法包含：(a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物；(b) 使步驟 (a) 的集合物與所關注 BV 接觸；(c) 檢測該所關注 BV 與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定交互作用型態；及 (d) 將所關注 BV 的交互作用型態與對照 BV 的交互作用型態進行比較，其中依所關注 BV 的交互作用型態與對照 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該所關注 BV 為具有改變的結合型態的 BV。

在一些態樣中，所關注 BV 為工程化 BV。

在一些態樣中，所關注 BV 源自來自受試者之樣品。在一些態樣中，所關注 BV 及對照 BV 源自不同組織或不同細胞類型。在一些態樣中，所關注 BV 源自患病組織且對照 BV 源自健康組織。

在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白複合物，該蛋白複合物包含：(a) BV，該 BV 包含異源膜相關蛋白及膜出芽劑；及 (b) 標靶多肽，其中異源膜相關蛋白與標靶多肽彼此結合。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 5 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 5 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定表 6 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許表 6 之蛋白質與表 5 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 6 之蛋白質與表 5 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 6 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 6 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，調節劑為表 5 或表 6 之蛋白質的下游活性之抑制劑。

在一些態樣中，調節劑為表 5 或表 6 之蛋白質的下游活性之活化劑。

在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 5 之蛋白質。

在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 6 之蛋白質。

在一些態樣中，表 5 之蛋白質為 ADGRB1。

在一些態樣中，表 6 之蛋白質為 PD-L1。

在一些態樣中，下游活性為腫瘤生長。在一些態樣中，腫瘤生長在調節劑的存在下減少。在一些態樣中，如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。

在一些態樣中，調節劑為靶向 PD-L1 的抗體或其抗原結合片段。

在一些態樣中，表 6 之蛋白質為 ICOSLG。

在一些態樣中，下游活性為 T 細胞活化。在一些態樣中，T 細胞活化在調節劑的存在下增加。在一些態樣中，T 細胞活化增加至少 20%。

在一些態樣中，調節劑為靶向 ICOSLG 的抗體或其抗原結合片段。

在一些態樣中，調節劑為靶向 ADGRB1 的抗體或其抗原結合片段。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 PD-L1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 PD-L1 的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ADGRB1 與 PD-L1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 PD-L1 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 ADGRB1 的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 ICOSLG 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ICOSLG 的下游活性之調節劑。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ADGRB1 與 ICOSLG 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 ICOSLG 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ADGRB1 的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，下游活性為 T 細胞活化。在一些態樣中，T 細胞活化在調節劑的存在下減少。在一些態樣中，T 細胞活化增加至少 20%。

在另一態樣中，本揭露提供一種表徵細胞株之交互作用型態的方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株以包含膜出芽劑；及 (b) 表徵細胞株所產生之生物囊泡 (BV) 的交互作用型態。

在另一態樣中，本揭露提供一種表徵已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態之方法，該方法包含表徵細胞株所產生之 BV 的交互作用型態。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株以包含膜出芽劑；(b) 表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態；(c) 表徵由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態，其中依在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含：(a) 表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態；(b) 表徵由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較在第一時間點所產生之 BV 的該交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的該交互作用型態，其中依在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。

在一些態樣中，細胞株為哺乳動物細胞株。在一些態樣中，哺乳動物細胞株為免疫細胞株、神經元細胞株或纖維母細胞株。在一些態樣中，免疫細胞株包含 T 細胞、B 細胞或單核球中之一種或多種。

在一些態樣中，該方法包含在第一時間點之後和第二時間點之前將細胞株暴露於刺激中。

在一些態樣中，刺激為誘導傳訊的條件或藥劑。在一些態樣中，刺激為誘導疾病相關狀態的條件或藥劑。在一些態樣中，細胞株為免疫細胞株且疾病相關狀態為免疫衰竭。

在一些態樣中，刺激為誘導分化的條件或藥劑。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵該細胞株在一個或多個額外時間點所產生之 BV 的交互作用型態。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株中之各者以包含膜出芽劑；(b) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；(c) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態，其中依在第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含：(a) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；(b) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態，其中依第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。

在一些態樣中，膜出芽劑的表現是可誘導的。

在一些態樣中，表徵 BV 的交互作用型態包含確定 BV 上一種或多種所關注膜相關蛋白的水平。

在一些態樣中，表徵 BV 的交互作用型態包含確定 BV 上一種或多種所關注受體的水平。

在一些態樣中，使用包含以下的方法來表徵該 BV 的交互作用型態：(a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物；(b) 將步驟 (a) 中的標靶多肽之集合物與 BV 接觸；及 (c) 檢測該 BV 與該標靶多肽之集合物中的至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定交互作用型態。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵 BV 的細胞質蛋白型態。

在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。

在另一態樣中，本揭露提供一種包含異源膜出芽劑之 BV，其中該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾為在可誘導控制下表現膜出芽劑的親代細胞株；(ii) 誘導膜出芽劑之表現，及 (iii) 從親代細胞株中分離 BV。

在一些態樣中，親代細胞株為哺乳動物細胞株。

在一些態樣中，BV 為細胞外囊泡 (EV)。

在另一態樣中，本揭露提供一種評估膜相關蛋白的酶活性之方法，該方法包含對包含該蛋白質的 BV 進行酶活性測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為肽酶，且酶活性測定為肽酶活性測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為蛋白酶，且酶活性測定為蛋白酶活性測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為激酶，且酶活性測定為激酶活性測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為磷酸酶，且酶活性測定為磷酸酶活性測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為 BV 來源之親代細胞的內源蛋白。

在一些態樣中，膜相關蛋白為該 BV 來源之親代細胞的異源蛋白。在一些態樣中，異源膜相關蛋白為全長蛋白。在一些態樣中，異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物。在一些態樣中，錨定物將蛋白質片段栓繫至 BV 之膜的表面。在一些態樣中，錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。

在另一態樣中，本揭露提供一種從培養基或從來自受試者的樣品中純化 BV 之方法，該方法包含使 BV 與包含表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種的固體表面接觸，其中表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種已被修飾為包含 Fc 區。

在一些態樣中，來自受試者的樣品為尿液樣品、血液樣品或經消化的組織樣品。

在一些態樣中，固體表面為包含蛋白質 A 功能化珠粒的管柱，且該方法包含使包含表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種的條件培養基流過管柱。

在一些態樣中，該方法進一步包含使包含 BV 的培養基流過管柱。

在一些態樣中，該方法進一步包含溶析 BV。

相關申請的交叉引用

本申請案主張 2020 年 12 月 1 日申請之美國專利申請案第 63/120,167 號及 2021 年 6 月 17 日申請之美國專利申請案第 63/212,021 號以及 2021 年 7 月 29 日申請之美國專利申請案第 63/227,039 號之優先權，該等專利申請案中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。 序列表

本申請包含序列表，該序列表已經以 ASCII 格式以電子方式提交，且以全文引用方式併入本文。該 ASCII 複本創建於 2021 年 11 月 29 日，命名為 50474-231TW4_Sequence_Listing_11_29_21_ST25，且大小為 4,713 位元組。 I. 界定

如本文所用，術語「生物囊泡」或「BV」是指由親代細胞 (例如，哺乳動物細胞) 天然分泌的脂雙層界定的粒子。BV 可為例如細胞外囊泡 (EV；奈米級顆粒，例如，重組細胞外囊泡 (rEV))、胞外體、微囊泡或病毒樣顆粒 (VLP)。VLP 描述於例如 Titeca 等人, NatureProtocols, 12(5): 881-898, 2017 中。BV 組成物或製劑可僅包括 EV、胞外體、微囊泡或 VLP 中之一種，或可包括 EV、胞外體、微囊泡及 VLP 中之兩種、三種或全部四種的混合物。BV 包含使用親代細胞之內源機制折疊並插入其天然膜的蛋白質。在一些態樣中，BV 包括並非天然於親代細胞的蛋白質，例如，親代細胞經修飾以表現的蛋白質 (例如，異源膜相關蛋白，例如，包含蛋白質片段、標籤及錨定物的異源膜相關蛋白)。親代細胞所產生之 BV 可藉由使親代細胞與膜出芽劑接觸 (例如，用膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 轉化細胞) 及/或使細胞暴露於促進 BV 之形成的條件下來增加。在一些態樣中，從親代細胞中純化 BV (例如，從包含親代細胞的培養基中純化)。

如本文所用，術語「膜出芽劑」是指增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP)) 的藥劑。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，HIV gag 蛋白具有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列。在一些態樣中，HIV gag 蛋白與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少 90% 同一性，例如，與 SEQ ID NO: 1 具有 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性。在一些態樣中，親代細胞經膜出芽劑轉化。細胞可另外或可替代地暴露於增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP)) 的條件 (例如，培養條件) 下。膜出芽劑的另外的實例包括自組裝 VLP (例如，MLGag、AARDC1 (例如 hAARDC1) 及 Acyl.Hrs)；增強內源性囊泡形成途徑諸如胞外體或腫瘤途徑的藥劑 (例如，RhoA.F3OL、ARF6.Q67L、VPS4a、HAS3、CD9、CD63 及 CD81)；以及與凋亡體相關的因子 (例如，組成型活性 ROCK1)。

如本文所用，術語「約」係指本技術領域技術人員易於知曉的各個值的通常誤差範圍。在本文中，涉及「約」的值或參數包括 (並描述) 指向該值或參數本身之態樣。

如本文所用之術語「單一跨膜受體」、「單通道跨膜受體」或「STM 受體」是指具有單一跨膜域的蛋白質。在一些態樣中，STM 受體在細胞表面上表現。例示性 STM 受體提供於表 4 以及以下文獻中：PCT/US2020/025471；Martinez-Martin 等人， Cell, 174(5): 1158-1171, 2018；及 Clark 等人， Genome Res, 13: 2265-2270, 2003，彼等之內容以引用方式全部併入本文中。在一些態樣中，STM 蛋白具有 UniProt 註釋「富含白胺酸」、「富含半胱胺酸」、「ITIM/ITAM」(基於免疫受體酪胺酸的抑制模體/基於免疫受體酪胺酸的活化模體)、「TNFR」(腫瘤壞死因子受體)、「TLR/ILR」(Toll 樣受體/介白素受體)、「Semaphorin」、「激酶樣」、「Ig 樣」(免疫球蛋白樣)、「纖網蛋白」、「Ephrin」、「EGF」、「細胞激素 R」或「鈣黏蛋白」。STM 受體可基於例如胺基酸序列中存在之訊號肽或預測之跨膜區來鑑定。在一些態樣中，STM 受體作為細胞外域表現。

如本文所用，術語「細胞外域」或「ECD」是指預測定位於細胞外質膜之外的蛋白域。在一些情況下，ECD 為受體 (例如 STM 受體) 之 ECD。在一些態樣中，ECD 為 IgSF 蛋白之 ECD。在一些態樣中，ECD 為 PDPN 之 ECD。在一些態樣中，細胞外域之邊界可藉由預測指示蛋白質穿過質膜的域 (例如，跨膜域 (例如，跨膜螺旋)) 來鑑定。在一些態樣中，細胞外域之存在可藉由指示蛋白質被運輸至質膜的域、序列或模體 (例如，訊號序列或多醣磷脂肌醇 (GPI) 連接位點) 之存在來預測。在一些態樣中，ECD 之邊界根據 UniProt 註釋確定。在一些態樣中，ECD 為可溶的。在一些態樣中，細胞外域在全長蛋白的情境下表現。在其他態樣中，細胞外域表現為分離之細胞外域，例如，僅包含預測在細胞外的蛋白質之胺基酸殘基的胺基酸殘基序列。

在一些態樣中，分離之 ECD 包含在融合蛋白中。在一些態樣中，包含在融合蛋白中，提高了 ECD 的溶解度、表現容易程度、捕獲 (例如，在蛋白質 A 塗覆的板上) 容易程度或某些其他所需之特性。在一些態樣中，ECD 或 ECD 融合蛋白為單體。在其他態樣中，ECD 或 ECD 融合蛋白為多聚體，例如，四聚體或五聚體。在一些態樣中，ECD 融合至人類 IgG。在一些態樣中，ECD 融合至人類 Fc 標籤。在一些態樣中，ECD 融合至人類親合性 AVITAG™ (Avi 標籤)。在一些態樣中，ECD 融合至多組胺酸 (His) 標籤。在一些態樣中，ECD 融合至醣蛋白 D (gD) 標籤及多醣磷脂肌醇 (GPI) 連接子 (例如，gD-GPI 標籤)。在其他態樣中，ECD 融合至大鼠軟骨寡聚基質蛋白 (COMP) 及 β-內醯胺酶蛋白之五聚化域，例如，如 Bushell 等人, Genome Res, 18: 622-630, 2008 所述。在一些態樣中，ECD 融合蛋白進一步包括一個截切序列，例如 TEV 截切序列，以允許去除一個或多個域。在一些情況下，具有在截切序列中可截切的 Avi 標籤及 Fc 標籤的 ECD 融合蛋白經進一步加工以去除 Fc 標籤，使 Avi 標籤生物素化，並使生物素化 ECD 融合蛋白融合至螢光鏈黴親和素 (SA) 以例如形成四聚化 ECD 融合蛋白。在一些情況下，分離之 ECD 或 ECD 融合蛋白經純化。

如本文所用，「調節劑」為調節 (例如，增加、減少、活化或抑制) 給定生物活性 (例如，交互作用或由交互作用得到的下游活性) 的試劑。調節劑或候選調節劑可為例如小分子、抗體、抗原結合片段 (例如，雙-Fab、Fv、Fab、Fab’-SH、F(ab’) ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域)、肽、模擬物、反義寡核苷酸 (ASO) 或小干擾 RNA (siRNA)。

「增加」或「活化」意指引起總體增加例如 20% 或更大、50% 或更大或 75%、85%、90% 或 95% 或更大的能力。在某些態樣中，增加或活化可指蛋白質-蛋白質交互作用之下游活性。

「減少」或「抑制」意指引起總體降低例如 20% 或更大、50% 或更大或 75%、85%、90% 或 95% 或更大的能力。在某些態樣中，減少或抑制可指蛋白質-蛋白質交互作用之下游活性。

「親和力」指分子 (例如受體) 之單個結合位點與其結合配偶體 (例如配體) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如受體及配體) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K _D) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。

如本文所使用，「複合物」或「複合的」涉及兩個或多個分子不是經由肽鍵的鍵及/或力 ( 例如，凡得瓦力、疏水力、親水力) 相互作用的締合。在一個態樣中，複合物是異源多聚體。應理解，如本文所使用，術語「蛋白質複合物」或「多肽複合物」包括具有與蛋白質複合物中之蛋白質結合的非蛋白質實體的複合物 (例如，包括但不限於例如毒素或檢測劑的化學分子)。

術語「親代細胞」是指由其產生 BV 的細胞。親代細胞包括已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。親代細胞包括「轉染細胞」、「轉形細胞」和「轉形體」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括與自原始轉變細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性的突變子代細胞。在一些態樣中，親代細胞外源性核酸穩定轉形。在其他態樣中，親代細胞外源性核酸瞬時轉形。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「含有富含白胺酸的重複序列的蛋白質 15」或「LRRC15」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 LRRC15，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋全長 LRRC15 及 LRRC15 之分離區或分離域，例如 LRRC15 ECD。該術語亦涵蓋天然 LRRC15 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 LRRC15 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 Q8TF66 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 LRRC15 的功能及/或活性的 LRRC15 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「程式性細胞死亡 1 配體 1」或「PD-L1」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 PD-L1，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。PD-L1 亦稱為 CD274。該術語涵蓋全長 PD-L1 及 PD-L1 之分離區或分離域，例如 PD-L1 ECD。該術語亦涵蓋天然 PD-L1 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 PD-L1 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 Q9NZQ7 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 PD-L1 的功能及/或活性的 PD-L1 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「小兒麻痺病毒受體」或「PVR」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 PVR，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋全長 PVR 及 PVR 之分離區或分離域，例如 PVR ECD。該術語亦涵蓋天然生成之 PVR 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類 PVR 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 A0A0C4DG49 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 PVR 的功能及/或活性的 PVR 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「CD80」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 CD80，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。CD80 亦稱為 B7-1。該術語涵蓋全長 CD80 及 CD80 之分離區或分離域，例如 CD80 ECD。該術語亦涵蓋天然 CD80 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 CD80 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 P33681 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 CD80 的功能及/或活性的 CD80 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「CD276」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 CD276，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。CD276 亦稱為 B7-H3。該術語涵蓋全長 CD276 及 CD276 之分離區或分離域，例如 CD276 ECD。該術語亦涵蓋天然 CD276 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 CD276 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 Q5ZPR3 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 CD276 的功能及/或活性的 CD276 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「TEM1」、「CD248」及「內皮唾液酸蛋白」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 TEM1，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋全長 TEM1 及 TEM1 之分離區或分離域，例如 TEM1 ECD。該術語亦涵蓋天然 TEM1 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 TEM1 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 Q9HCU0 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 TEM1 的功能及/或活性的 TEM1 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「ADGRB1」、「黏附 GPCR B1」及「黏附 G 蛋白偶合受體 B1」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 ADGRB1，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋全長 ADGRB1 及 ADGRB1 之分離區或分離域，例如 ADGRB1 ECD。該術語亦涵蓋天然 ADGRB1 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。例示性人類 ADGRB1 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 O14514 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 TEM1 的功能及/或活性的 TEM1 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所用之術語「ICOSLG」、「可誘導之 T 細胞共刺激配體」及「ICOS 配體」泛指任何哺乳動物來源的任何天然 ICOSLG，該哺乳動物來源包括靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋全長 ICOSLG 及 ICOSLG 之分離區或分離域，例如 ICOSLG ECD。該術語亦涵蓋天然生成之 ICOSLG 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類 ICOSLG 之胺基酸序列顯示於 UniProt 登錄號 O75144 下。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 ICOSLG 的功能及/或活性的 ICOSLG 的保守胺基酸取代。

除非另有說明，否則如本文所使用之術語「蛋白質」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然蛋白質，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物（例如，人類）和囓齒動物（例如，小鼠和大鼠）。該術語涵蓋「全長」未經加工的蛋白質以及在細胞中加工產生的任何形式的蛋白質。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體，例如，胺基酸取代突變或胺基酸缺失突變。該術語亦包括蛋白質之分離區或分離域，例如細胞外域 (ECD)。

「單離的」蛋白質或多肽是從其自然環境的組分中分離出來的蛋白質或多肽。在一些態樣中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。

「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。

如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠引導與其操作性連接之核酸的表現。此等載體在本文稱為「表現載體」。

本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。

「抗原結合片段」或「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合的抗原之完整抗體的一部分。抗原結合片段之實例包括但不限於雙-Fab、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv、ScFab) 抗原片段形成的多特異性抗體。

單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 ( 參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。單域 (single-domain) 抗體的實例包括但不限於 VHH。

「Fab」片段是藉由木瓜蛋白酶消化抗體產生的抗原結合片段，並完整的 L 鏈以及 H 鏈的可變區域 (VH) 及一個重鏈的第一恆定域 (CH1) 組成。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的 Fab 片段。胃蛋白酶對抗體的處理產生單一大的 F(ab') ₂片段，該片段大致對應於兩個具有二價抗原結合活性並且仍能夠交聯抗原的雙硫鍵連接的 Fab 片段。Fab' 片段與 Fab 片段的不同之處在於，在 CH1 域的羧基末端具有額外的少數殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是指恆定域之半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基的 Fab'。F(ab') ₂抗體片段最初作為成對 Fab' 片段產生，其具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學耦聯也是已知的。

本文中術語「Fc 區域」用於定義免疫球蛋白重鏈之 C 端區域，包括天然序列 Fc 區域及變異 Fc 區域。儘管免疫球蛋白重鏈之 Fc 區域之邊界可能略有變化，但通常將人 IgG 重鏈之 Fc 區域定義為從 Cys226 或 Pro230 位置之胺基酸殘基延伸至其羧基端。例如，在抗體生產或純化過程中，或藉由重組工程化編碼抗體重鏈之核酸，可去除 Fc 區域之 C 端離胺酸 (根據 EU 編號系統之殘基 447)。因此，完整抗體之組成物可包含去除所有 Lys447 殘基之抗體群體、未去除 Lys447 殘基之抗體群體及具有含及不包含 Lys447 殘基之抗體混合物之抗體群體。

「Fv」由緊密、非共價結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區域的二聚體組成。由這兩個結構域的折疊產生六個高度變異環 (H 和 L 鏈各 3 個環)，這些環形成用於抗原結合之胺基酸殘基，並賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單一可變域 (或僅包含三個針對抗原的 CDR 的半個 Fv) 也具有辨識和結合抗原的能力，儘管親和力低於整個結合位點。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有含有如本文中所定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。

「單鏈 Fv」也簡稱為「sFv」或「scFv」，是包含連接到單一多肽鏈中的 VH 和 VL 抗體域的抗體片段。較佳地，scFv 多肽在 VH 及 VL 域之間進一步包含多肽連接子，其使 scFv 能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於 scFv 片段的綜述，參見 Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 主編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；Malmborg 等人，J. Immunol. Methods 183:7-13，1995。

術語「小分子」是指任何分子量為約 2000 道爾頓或以下 (例如約 1000 道爾頓或以下) 的分子。在一些態樣中，小分子為有機小分子。

如本文所用，術語「模擬物」、「肽模擬物」、「多肽模擬物」或「分子模擬物」是指在構形和/或結合能力 (例如，二級結構、三級結構) 方面與給定多肽或該多肽的一部分具有足夠高的相似性以結合至該多肽的結合配偶體。模擬物可以等於、小於或大於其模擬的多肽的親和力結合結合配偶體。分子模擬物與其模擬的多肽可具有或不具有明顯的胺基酸序列相似性。模擬物可天然產生，或者可經工程改造。在一些態樣中，模擬物為表 1 之蛋白質的模擬物。在其他態樣中，模擬物為表 2 之蛋白質的模擬物。在又一些其他態樣中，模擬物為結合至表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的另一種蛋白質的模擬物。在一些態樣中，模擬物為表 5 之蛋白質的模擬物。在其他態樣中，模擬物為表 6 之蛋白質的模擬物。在又一些其他態樣中，模擬物為結合至表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的另一種蛋白質的模擬物。在一些態樣中，模擬物可執行所模擬之多肽的所有功能。在其他態樣中，模擬物不執行所模擬之多肽的所有功能。

如本文所用，術語「允許兩種或更多種蛋白質 (例如，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質或表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質) 彼此結合的條件」是指以下條件 (例如，蛋白質濃度、溫度、pH、鹽濃度)，在該等條件下，兩種或更多種蛋白質將在不存在調節劑或候選調節劑的情況下交互作用。允許結合的條件可能因個別蛋白質而異，並可能在蛋白質-蛋白質交互作用測定 (例如，表面電漿子共振測定、生物層干涉測定、酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、細胞外交互作用測定及細胞表面交互作用測定) 之間有所不同。

相對於參考多肽序列之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，係指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後（如有必要），可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保留取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生％胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。

在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 是序列比對程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式比對中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 是 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的％胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的％胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有％胺基酸序列同一值。

如本文所用，術語「樣品」係指獲自或源自所關注之受試者及/或個體的組成物，其包含例如，基於物理、生化、化學及/或生理特性表徵及/或鑑定之細胞及/或其他分子實體。舉例而言，片語「疾病樣品」及其變化形式係指獲自所關注受試者之任何樣品，其應期望或已知含有待表徵之細胞及/或分子實體。樣品包括但不限於組織樣品、原代或培養細胞或細胞株、細胞上清液、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、玻璃狀液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、血漿、血清、血源性細胞、尿液、腦脊液、唾液、口腔拭子、痰、淚液、汗液、黏液、腫瘤溶解物、組織培養基、組織萃取物諸如均質化組織、腫瘤組織、細胞萃取物及其組合。樣品可為存檔樣品、新鮮樣品或冷凍樣品。在一些態樣中，腫瘤樣品為福馬林固定且石蠟包埋的 (FFPE) 腫瘤組織樣品。 II. 顯示蛋白質的生物囊泡

涉及膜結合蛋白之交互作用 (例如，受體-配體交互作用) 的研究有助於理解發生於細胞外環境中的細胞通訊。然而，在鑑定及理解這些交互作用方面的進展落後於細胞蛋白質，部分原因在於受體-配體交互作用發生於細胞膜中。生理膜包含脂質、甾醇、蛋白質及聚醣的複雜混合物，所有這些都可能參與交互作用。此外，膜有助於聚集、定向和折疊受體，增強弱的蛋白質-蛋白質交互作用。評估蛋白質-蛋白質交互作用的標準方法通常需要不存在細胞膜或從細胞膜中萃取。因此，這些常用方法不足以代表受體-配體交互作用。

本揭露提供在生物囊泡 (BV) (例如，細胞外囊泡 (EV)) 的表面上顯示的蛋白質 (例如，跨膜受體)。在一些態樣中，本揭露提供一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中異源膜相關蛋白存在於 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。

在一些態樣中，本揭露提供一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中異源膜相關蛋白存在於 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑，其中該膜出芽劑為 HIV gag 蛋白，該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾以表現異源膜相關蛋白及膜出芽劑的親代細胞，及 (ii) 從親代細胞中分離 BV。 A. 蛋白質片段

在一些態樣中，蛋白質片段為跨膜受體 (例如，單通道跨膜 (STM) 受體或多程跨膜受體 (多跨膜受體；MTMR)，例如 G 蛋白偶合受體 (GPCR)) 的細胞外域。例示性 STM 受體如本文之章節 III 所述，並提供於表 2 及表 4 中。 B. 錨定物

在一些態樣中，錨定物將蛋白質片段栓繫至 BV 之脂質膜的表面。在一些態樣中，錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。在一些態樣中，錨定物為用於蛋白質脂化的部分，例如，用於半胱胺酸棕櫚醯化、甘胺酸肉豆蔻醯化、離胺酸脂肪醯化、膽固醇酯化、半胱胺酸異戊二烯化或絲胺酸脂肪醯化的部分。 C. 標籤

在一些態樣中，標籤可直接或間接地可視化或以其他方式檢測。例如，標籤可包含使用抗體或抗體片段進行檢測的部分，例如，可為醣蛋白 D (gD) 多肽。在一些態樣中，標籤包含螢光蛋白。在一些態樣中，蛋白質片段結合 (例如，融合) 至包含 gD 標籤及 GPI 錨定物的 gD-GPI 構建體。 D. 膜出芽劑

BV 可進一步包含膜出芽劑，該膜出芽劑當存在於親代細胞中時增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP))。可用膜出芽劑轉染親代細胞，且膜出芽劑可由 BV 遺傳，例如在膜出芽過程中。

在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，HIV gag 蛋白具有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列。在一些態樣中，HIV gag 蛋白與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少 90% 同一性，例如，與 SEQ ID NO: 1 具有 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性。在一些態樣中，膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 包含可直接或間接地可視化或以其他方式檢測的標記。在一些態樣中，可檢測標記為螢光蛋白。在一些態樣中，可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶，例如海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc)。額外膜出芽劑如下文章節 III(C) 中所述。

細胞可另外或可替代地暴露於增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP)) 的條件 (例如，培養條件) 下。包含膜出芽劑的 EV 可稱為重組 EV (rEV)。

增加 BV 產生的膜出芽劑及/或藥劑或條件可使親代細胞所產生之 BV 增加例如 1.5 倍、2 倍、2.5 倍、3 倍、3.5 倍、4 倍或 4 倍以上 (例如，1.5 至 2.5 倍、2.5 至 3.5 倍或 3.5 至 4.5 倍)。在一些態樣中，膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 使親代細胞所產生之 BV 增加約 4 倍。 E. 親代細胞及分離方法

生物囊泡 (BV) 包括源自親代細胞 (例如，由其產生並從中分離) 的任何合適的脂質囊泡結構。在一些態樣中，BV 係藉由哺乳動物細胞產生。該細胞為例如 EXPI293F ^TM細胞。在一些態樣中，BV 為細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡或病毒樣顆粒 (VLP)。在一些態樣中，BV 製劑或組成物包括 EV、胞外體、微囊泡及/或 VLP 的混合物。BV 可從親代細胞及/或大 EV 及蛋白質聚集體分離 (例如，從親代細胞的培養基中分離)，例如使用離心 (例如，超速離心) 進行分離。

在一些態樣中，親代細胞已用編碼異源膜相關蛋白的質體及編碼膜出芽劑的質體轉染。異源膜相關蛋白及膜出芽劑可由單一質體編碼，或可由單獨的質體編碼。

可評估親代細胞表面上及/或 BV 表面上之異源膜相關蛋白及/或膜出芽劑的表現水平。在一些態樣中，使用生物層干涉 (BLI) 評估異源膜相關蛋白的表現水平，其中當針對與異源膜相關蛋白相關之標籤的抗體接觸時，BV 產生至少等於或高於閾值水平的偏移。在一些態樣中，標籤為 gD 多肽，抗體為抗 gD 抗體，並且當 BLI 測定在 30℃ 下進行時，偏移為至少 1.5 nm。在其他態樣中，BV 與異源膜相關蛋白特異性抗體接觸。

在一些態樣中，BV 包含使 BV 直接或間接可視化的標記，例如膜標記 (例如，螢光膜標記)。在一些態樣中，膜標記為膽固醇標記，例如，AMPLEX ^TMRed。 III. 鑑定蛋白質 - 蛋白質交互作用的方法

生物囊泡 (BV) 提供了用於獲得適合結合的受體的免蛋白質純化的方法。然後可測試攜帶受體的 BV 與受體之配體 (例如，配體庫) 的交互作用，從而提供鑑定並評估蛋白質-蛋白質交互作用的方法。

在一個態樣中，本揭露提供一種鑑定蛋白質-蛋白質交互作用之方法，該方法包含：(a) 提供標靶多肽的集合物，視情況其中該標靶多肽的集合物固定在一個或多個固體表面上；(b) 將步驟 (a) 的集合物與包含異源膜相關蛋白和膜出芽劑之生物囊泡 (BV) 在允許該異源膜相關蛋白與標靶多肽中之至少一個標靶多肽結合的條件下接觸，其中該膜出芽劑為 HIV gag 蛋白，且其中該異源膜相關蛋白被以閾值水平或高於閾值水平表現於 BV 表面上；且 (c) 檢測異源膜相關蛋白與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定蛋白質-蛋白質交互作用。 A. 異源膜相關蛋白

異源膜相關蛋白可為能夠併入 EV 中的任何蛋白質或多肽或其片段。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白為全長蛋白。在其他態樣中，異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物。蛋白質片段可為例如細胞外域 (例如，所關注蛋白質 (例如跨膜受體) 之細胞外域)。ECD 為預測定位在細胞質膜之外的蛋白質域。因此，該蛋白質域可與細胞外環境交互作用，例如，與可溶性蛋白質及細胞或相鄰細胞上其他蛋白質的 ECD 交互作用。蛋白質的一種或多個 ECD 可藉由生物信息學分析來鑑定，例如，藉由 UniProt 註釋的分析來鑑定。例如，ECD 之邊界可相對於相鄰預測跨膜區 (例如跨膜螺旋) 之邊界來鑑定。在一些態樣中，細胞外域之存在可藉由指示蛋白質被運輸至質膜的域、序列或模體 (例如，訊號序列或多醣磷脂肌醇 (GPI) 連接位點) 之存在來預測。在一些態樣中，細胞外域在全長蛋白的情境下表現。在其他態樣中，細胞外域表現為分離之細胞外域，例如，僅包含預測在細胞外的蛋白質之胺基酸殘基的胺基酸殘基序列。在一些態樣中，分離之細胞外域在融合蛋白中表現。

在一些態樣中，其中異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物，錨定物將蛋白質片段栓繫至 BV 之脂質膜的表面。在一些態樣中，錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。在一些態樣中，錨定物為用於蛋白質脂化的部分，例如，用於半胱胺酸棕櫚醯化、甘胺酸肉豆蔻醯化、離胺酸脂肪醯化、膽固醇酯化、半胱胺酸異戊二烯化或絲胺酸脂肪醯化的部分。

在一些態樣中，其中異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物，標籤可直接或間接地可視化或以其他方式檢測。例如，標籤可包含使用抗體或抗體片段進行檢測的部分，例如，可為醣蛋白 D (gD) 多肽。在一些態樣中，標籤包含螢光蛋白。

在一些態樣中，蛋白質片段結合 (例如，融合) 至包含 gD 標籤及 GPI 錨定物的 gD-GPI 構建體。在一些態樣中，異源膜相關蛋白為表 1 中提供的蛋白質 (例如，表 1 中提供的與 gD-GPI 構建體結合的蛋白質的 ECD) 或下表 5 中提供的蛋白質。表 1. 由 BV 表現的蛋白質

LRRC15

PD-L1/CD274

PVR

CD80/B7-1

CD276/B7-H3

B. BV 及親代細胞

生物囊泡 (BV) 包括源自親代細胞 (例如，由其產生並從中分離) 的任何合適的脂質囊泡結構，如本文之章節 II(E) 中所述。

可評估親代細胞表面上及/或 BV 表面上之異源膜相關蛋白及/或膜出芽劑的表現水平。在一些態樣中，使用生物層干涉 (BLI) 評估異源膜相關蛋白的表現水平，其中當針對與異源膜相關蛋白相關之標籤的抗體接觸時，BV 產生至少等於或高於閾值水平的偏移。在一些態樣中，標籤為 gD 多肽，抗體為抗 gD 抗體，並且當 BLI 測定在 30℃ 下進行時，閾值水平為偏移至少 1.5 nm。在其他態樣中，BV 與異源膜相關蛋白特異性抗體接觸。

在一些態樣中，BV 包含使 BV 直接或間接可視化的標記，例如膜標記 (例如，螢光膜標記)。在一些態樣中，膜標記為膽固醇標記，例如，AMPLEX ^TMRed。 C. 膜出芽劑

BV 可進一步包含膜出芽劑，該膜出芽劑增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP))，如本文之章節 II(D) 中所述。

在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，HIV gag 蛋白具有 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列。在一些態樣中，HIV gag 蛋白與 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列具有至少 90% 同一性，例如，與 SEQ ID NO: 1 具有 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性。

例示性膜出芽劑的另外的實例包括自組裝 VLP (例如，MLGag、AARDC1 (例如 hAARDC1) 及 Acyl.Hrs)；增強內源性囊泡形成途徑諸如胞外體或腫瘤途徑的藥劑 (例如，RhoA.F3OL、ARF6.Q67L、VPS4a、HAS3、CD9、CD63 及 CD81)；以及與凋亡體相關的因子 (例如，組成型活性 ROCK1)。

在一些實施例中，膜出芽劑為 MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1 (例如，hAARDC1)、ARF6 (例如，ARF6Q67L)、RhoA (例如，RhoA.F30L) 或它們的組合。

在一些態樣中，膜出芽劑為 gag 蛋白，例如嵌合 gag 蛋白 (例如以下文獻中所述之嵌合 gag 蛋白：Hammarstedt 等人, J Virol.78(11): 5686-97, 2004 或 Chen 等人, Proc Natl Acad Sci USA,98(26): 15239-44, 2001)。在一些態樣中，嵌合 Gag 蛋白包含來自不同反轉錄病毒的一部分 HIV Gag 和一部分 Gag。例如，但不作為限制，嵌合 Gag 包含 HIV Gag，其中已知指導其定位的 HIV Gag 的區域以來自莫洛尼 (Moloney) 鼠白血病病毒 (murine leukemia virus，MLV)，鼠反轉錄病毒的功能同源區取代。在某些實施例中，HIV Gag 的取代區域為基質域 (matrix domain, MA)，以生成本文中稱為 MLGag 的嵌合 Gag。在某些實施例中，嵌合和全長 Gag 蛋白可以從源自任何物種的內源性反轉錄病毒 (ERV) 序列產生，例如，如 Stocking 等人, Cell Mol. Life Sci.,65(21):3383-3398, 2008 中所述。在某些實施例中，囊泡因子為 MLGag。

在某些實施例中，囊泡因子為含抑制蛋白域蛋白 1 (ARRDC1)。在某些實施例中，囊泡因子為鼠 ARRDC1 (mARRDC1)。在某些實施例中，囊泡因子為人類 ARRDC1 (hARRDC1)。ARRDC1 是輔助蛋白的四肽 PSAP 模體，且為誘導 EV 形成的宿主蛋白。已表明 ARRDC 1 的過表現導致增強微囊泡 (MV) 的形成。該作用是經由 PSAP/PTAP 肽補充 Tsg 101 介導的。ATPase VP S4a 的過表現導致 MV 形成的進一步增強 (Nabhan 等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 109(11): 4146-51, 2012)。

在某些實施例中，囊泡因子為 ADP 核糖基化因子-6 (ARF6)。已顯示 ARF6 為一種 Rho GTP 酶，它以 ERK 依賴性方式驅動腫瘤細胞中微囊泡的形成 (Muralidharan-Chari 等人, Curr Biol., 19(22): 1875-85, 2009)。在某些實施例中，囊泡因子為 ARF6 的持續性活化形式。例如，但不作為限制，ARF6 的持續性活化形式為 ARF6.Q67L (參見例如，Peters 等人, J. Cell Biol, 128(6):1003-1017, 1995)。

在某些實施例中，囊泡因子為突變的 RhoA/ROCK1，其亦可驅動腫瘤細胞中的微囊泡形成 (Li 等人, Oncogene, 31(45): 4740-9, 2012)。在某些實施例中，囊泡因子為 RhoA 的持續性活化形式。例如，但不作為限制，RhoA 的持續性活化形式為 RhoA.F3OL (參見例如，Lin 等人, JBC, 274(33): 23633-23641, 1999)。

在某些實施例中，囊泡因子包含原生質膜 (plasma membrane, PM) 結合域、自組裝域和轉運所需的胞內體分選複合物 (endosomal sorting complex required for transport, ESCRT) 補充域。EV 形成的設計原則是能夠快速產生新的 EV 因子/貨 (cargo)。已顯示 PM 靶向和高階低聚合驅動 EV 併入 (Fang 等人, PLoS Biol., 5(6): e158, 2007)。在某些實施例中，囊泡因子為 Acyl.Hrs，其包含醯基化標籤的 PM 結合域和肝細胞生長因子調節的酪胺酸激酶受質 (Hrs) 的 C 端域，由捲曲螺旋的自組裝域組成，以及 ESCRT 補充域。在某些實施例中，囊泡因子為 MLGag，其包含基質 (Matrix) 的 PM 結合域、殼體的自組裝域和 p6 的 ESCRT 補充域。在某些實施例中，囊泡因子包含自組裝域和 ESCRT 補充域。在某些實施例中，囊泡因子為 ARRDC1，其包含抑制蛋白域的自組裝域和 ESCRT 補充域。

可藉由本技術領域已知的任何方法鑑定另外的囊泡因子。例如，但不作為限制，可對所有蛋白質 (例如，人類蛋白質) 的 cDNA 庫進行篩檢，以鑑定增加 EV 產生的單個基因或基因組合。可替代地或另外地，可進行 CRISPR 或 RNAi 篩選來鑑定抑制 EV 產生的單個基因或基因組合。

在一些態樣中，膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 包含可直接或間接地可視化或以其他方式檢測的標記。在一些態樣中，可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶，例如，該酶為海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc)，且該受質為 Rluc 受質。

細胞可另外或可替代地暴露於增加親代細胞所產生之 BV (例如，細胞外囊泡 (EV)、胞外體、微囊泡及/或病毒樣顆粒 (VLP)) 的條件 (例如，培養條件) 下。

增加 BV 產生的膜出芽劑及/或藥劑或條件可使親代細胞所產生之 BV 增加例如 1.5 倍、2 倍、2.5 倍、3 倍、3.5 倍、4 倍或 4 倍以上 (例如，1.5 至 2.5 倍、2.5 至 3.5 倍或 3.5 至 4.5 倍)。在一些態樣中，膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 使親代細胞所產生之 BV 增加約 4 倍。 D. 標靶多肽之集合物

在一些態樣中，標靶多肽之集合物為跨膜受體或其片段的集合物。在一些態樣中，受體為單通道跨膜 (STM) 受體。STM 受體蛋白是一大類膜結合受體，其具有穿過質膜的單一域。許多 STM 受體在細胞表面上表現，因此可能參與細胞外分子互動組。例示性 STM 受體提供於表 2 及表 4 中，並提供於以下文獻中：Martinez-Martin 等人, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018；及 Clark 等人, Genome Res, 13: 2265-2270, 2003。

在一些態樣中，蛋白質片段為細胞外域 (ECD)，例如，ECD 鑑定如上所述。在一些態樣中，標靶多肽之集合物的每個成員為帶有 Fc 標籤的細胞外域，且固體表面被蛋白質 A 包覆。在一些態樣中，標靶多肽中之一種或多種被固定至一個或多個固體表面上的不同位置。在其他態樣中，一個或多個標靶多肽未固定至表面。表 2. STM 庫蛋白

TEM1/CD248/內皮唾液酸蛋白

PLXDC2

PTPRD

SARAF

ASGR1

BMP10

CPM

LDLR

PILRA

PRRG2

C6orf72

LRTM1

CDHR2

IGF2R

NCR3

SUSD3

CLEC17A

PVRL4

BTNL3

CDHR2

GLT8D2

KIAA1467

RNF152

LRFN1

MXRA5

PVRL1

LRIT2

PLA2R1

SLITRK4

表 3. BV 所表現之蛋白質與 STM 庫蛋白質之間的交互作用

*配偶體* A	*配偶體* B
LRRC15	TEM1/CD248/內皮唾液酸蛋白
PLXDC2
PTPRD
SARAF
ASGR1
BMP10
CPM
LDLR
PILRA
PRRG2
PD-L1/CD274	C6orf72
LRTM1
CDHR2
IGF2R
NCR3
SUSD3
PVR	CLEC17A
PVRL4
CD80/B7-1	BTNL3
CDHR2
GLT8D2
KIAA1467
RNF152
CD276/B7-H3	LRFN1
MXRA5
PVRL1
LRIT2
PLA2R1
SLITRK4

表 4. 帶標籤的 STM 庫

獵物蛋白縮名	獵物蛋白 Entrez ID	獵物蛋白縮名	獵物蛋白 Entrez ID	獵物蛋白縮名	獵物蛋白 Entrez ID
1110032F04RIK	68725	FCRLA	84824	NOTCH2	4853
A1BG	1	FCRLB	127943	NOTCH3	4854
ACE	1636	FGFR1	2260	NOTCH4	4855
ACE2	59272	FGFR2	2263	NPDC1	56654
ACPP	55	FGFR3	2261	NPHS1	4868
ACPT	93650	FGFR4	2264	NPR1	4881
ACVR1	90	FGFRL1	53834	NPR2	4882
ACVR1B	91	FLRT1	23769	NPR3	4883
ACVR1C	130399	FLRT2	23768	NPTN	27020
ACVR2A	92	FLRT3	23767	NRCAM	4897
ACVR2B	93	FLT1	2321	NRG1	3084
ACVRL1	94	FLT3	2322	NRG2	9542
ADAM10	102	FLT3LG	2323	NRG4	145957
ADAM11	4185	FLT4	2324	NRN1	51299
ADAM12	8038	FNDC3A	22862	NRN1L	123904
ADAM15	8751	FNDC4	64838	NRP1	8829
ADAM17	6868	FNDC9	408263	NRP2	8828
ADAM18	8749	FOLR1	2348	NRXN1	9378
ADAM19	8728	FOLR2	2350	NRXN2	9379
ADAM2	2515	FRRS1L	23732	NRXN3	9369
ADAM20	8748	FSTL4	23105	NT5E	4907
ADAM21	8747	FSTL5	56884	NTM	50863
ADAM22	53616	FURIN	5045	NTNG1	22854
ADAM23	8745	FXYD5	53827	NTRK1	4914
ADAM28	10863	GAS1	2619	NTRK2	4915
ADAM29	11086	GFRA1	2674	NTRK3	4916
ADAM30	11085	GFRA2	2675	OMG	4974
ADAM32	203102	GFRA3	2676	OPCML	4978
ADAM33	80332	GFRA4	64096	OSCAR	126014
ADAM7	8756	GFRAL	389400	OSMR	9180
ADAM8	101	GHR	2690	OSTM1	28962
ADAM9	8754	GLG1	2734	OTOA	146183
AGER	177	GLIPR1	11010	P2RX2	22953
AJAP1	55966	GLIPR1L2	144321	PAPLN	89932
ALCAM	214	GML	2765	PARM1	25849
ALK	238	GP1BA	2811	PCDHGB6	56100
ALPI	248	GP1BB	2812	PCDHGC3	5098
ALPL	249	GP2	2813	PCDHGC5	93708
ALPP	250	GP5	2814	PCSK4	54760
AMHR2	269	GP6	51206	PCSK7	9159
AMICA1	120425	GP9	2815	PDCD1	5133
AMIGO1	57463	GPA33	10223	PDCD1LG2	80380
AMIGO2	347902	GPC1	2817	PDGFRA	5156
AMIGO3	386724	GPC2	221914	PDGFRB	5159
AMN	81693	GPC3	2719	PDGFRL	5157
ANTXR1	84168	GPC4	2239	PDPN	10630
ANTXR2	118429	GPC6	10082	PEAR1	375033
APCDD1	147495	GPIHBP1	338328	PECAM1	5175
APCDD1L	164284	GPNMB	10457	磷脂酶抑制劑
APLP1	333	GPR116	221395	PI16	221476
APLP2	334	GPR124	25960	PIGR	5284
APOO	79135	GPR125	166647	PIK3IP1	113791
APP	351	GUCY2C	2984	PILRA	29992
AREG	374	GUCY2D	3000	PILRB	29990
ART1	417	GUCY2F	2986	PLA2R1	22925
ART3	419	GYPA	2993	PLB1	151056
ART4	420	GYPB	2994	PLXDC1	57125
ATRAID	51374	GYPC	2995	PLXDC2	84898
ATRN	8455	GYPE	2996	PLXNA1	5361
ATRNL1	26033	HAPLN2	60484	PLXNA2	5362
AXL	558	HAPLN3	145864	PLXNA3	55558
AZGP1	563	HAPLN4	404037	PLXNA4	91584
BACE1	23621	HAVCR1	26762	PLXNB1	5364
BACE2	25825	HAVCR2	84868	PLXNB2	23654
BAMBI	25805	HBEGF	1839	PLXNB3	5365
BCAM	4059	HCST	10870	PLXNC1	10154
BCAN	63827	HEG1	57493	PLXND1	23129
BMPR1A	657	HEPACAM	220296	PMEL	6490
BMPR1B	658	HEPACAM2	253012	PMEPA1	56937
BMPR2	659	HEPH	9843	PODXL	5420
BOC	91653	HEPHL1	341208	PODXL2	50512
BSG	682	HFE	3077	PRIMA1	145270
BST1	683	HFE2	148738	PRLR	5618
BST2	684	HHLA2	11148	PRND	23627
BTC	685	HYAL2	8692	PRNP	5621
BTLA	151888	ICAM1	3383	PROCR	10544
BTN1A1	696	ICAM2	3384	PRRG2	5639
BTN2A1	11120	ICAM3	3385	PRRG3	79057
BTN2A2	10385	ICAM4	3386	PRRG4	79056
BTN2A3P	54718	ICAM5	7087	PRSS21	10942
BTN3A1	11119	ICOS	29851	PRSS41	360226
BTN3A2	11118	ICOSLG	23308	PRSS55	203074
BTN3A3	10384	IFNAR1	3454	PRSS8	5652
BTNL2	56244	IFNAR2	3455	PRTG	283659
BTNL3	10917	IFNGR1	3459	PSG1	5669
BTNL8	79908	IFNGR2	3460	PSG2	5670
BTNL9	153579	IFNLR1	163702	PSG3	5671
BUTR1	100129094	IGDCC3	9543	PSG4	5672
C10orf26	54838	IGDCC4	57722	PSG5	5673
C10orf35	219738	IGF1R	3480	PSG6	5675
C10orf54	64115	IGF2R	3482	PSG7	5676
C11orf24	53838	IGFBP7	3490	PSG8	440533
C11orf87	399947	IGFBPL1	347252	PSG9	5678
C11orf92	399948	IGFLR1	79713	PTCRA	171558
C12orf53	196500	IGLON5	402665	PTGFRN	5738
C12orf59	120939	IGSF1	3547	PTK7	5754
C14orf132	100132684	IGSF11	152404	PTPRA	5786
C14orf180	400258	IGSF21	84966	PTPRB	5787
C14orf37	145407	IGSF3	3321	PTPRC	5788
C15orf24	56851	IGSF5	150084	PTPRCAP	5790
C16orf54	728070	IGSF6	10261	PTPRD	5789
C16orf91	283951	IGSF8	93185	PTPRE	5791
C16orf92	146378	IGSF9	57549	PTPRF	5792
C17orf80	55028	IGSF9B	22997	PTPRG	5793
C18orf1	753	IL10RA	3587	PTPRH	5794
C19orf18	147685	IL10RB	3588	PTPRJ	5795
C19orf24	55009	IL11RA	3590	PTPRK	5796
C19orf38	255809	IL12B	3593	PTPRM	5797
C19orf63	284361	IL12RB1	3594	PTPRN	5798
C19orf75	284369	IL12RB2	3595	PTPRN2	5799
C1orf101	257044	IL13RA1	3597	PTPRO	5800
C1orf130	400746	IL13RA2	3598	PTPRR	5801
C1orf159	54991	IL15RA	3601	PTPRS	5802
C1orf85	112770	IL17RA	23765	PTPRT	11122
C2orf82	389084	IL17RB	55540	PTPRU	10076
C2orf89	129293	IL17RC	84818	PTPRZ1	5803
C3orf18	51161	IL17RD	54756	PVR	5817
C3orf35	339883	IL17RE	132014	PVRL1	5818
C3orf45	132228	IL18BP	10068	PVRL2	5819
C4orf32	132720	IL18R1	8809	NECTIN3	25945
C4orf34	201895	IL18RAP	8807	PVRL4	81607
C5orf15	56951	IL1R1	3554	PXDN	7837
C6orf25	80739	IL1R2	7850	PXDNL	137902
C6orf72	116254	IL1RAP	3556	QSOX1	5768
C9orf11	54586	IL1RAPL1	11141	QSOX2	169714
CA12	771	IL1RAPL2	26280	RAET1E	135250
CA14	23632	IL1RL1	9173	RAET1G	353091
CA4	762	IL1RL2	8808	RAET1L	154064
CA9	768	IL20RA	53832	RAMP1	10267
CACHD1	57685	IL20RB	53833	RAMP2	10266
CACNA2D3	55799	IL21R	50615	RAMP3	10268
CACNA2D4	93589	IL22RA1	58985	RECK	8434
CADM1	23705	IL23R	149233	RELL1	768211
CADM2	253559	IL27RA	9466	RELT	84957
CADM3	57863	IL2RA	3559	RET	5979
CADM4	199731	IL2RB	3560	RGMA	56963
CATSPERD	257062	IL2RG	3561	RGMB	285704
CATSPERG	57828	IL31RA	133396	ROBO1	6091
CAV3	859	IL3RA	3563	ROBO2	6092
CCDC107	203260	IL4R	3566	ROBO3	64221
CCDC47	57003	IL5RA	3568	ROBO4	54538
CD101	9398	IL6R	3570	ROR1	4919
CD109	135228	IL6ST	3572	ROR2	4920
CD14	929	IL7R	3575	ROS1	6098
CD160	11126	IL9R	3581	RPN1	6184
CD163	9332	ILDR1	286676	RPRML	388394
CD164	8763	ILDR2	387597	RTN4R	65078
CD164L2	388611	IMPG2	50939	RTN4RL1	146760
CD177	57126	INSR	3643	RYK	6259
CD180	4064	INSRR	3645	SARAF	51669
CD19	930	ISLR	3671	SCARF1	8578
CD1A	909	ISLR2	57611	SCARF2	91179
CD1B	910	ITFG1	81533	SCN1B	6324
CD1C	911	ITGA1	3672	SCN2B	6327
CD1D	912	ITGA10	8515	SCN3B	55800
CD1E	913	ITGA11	22801	SCN4B	6330
CD2	914	ITGA2	3673	SDC1	6382
CD200	4345	ITGA2B	3674	SDC2	6383
CD200R1	131450	ITGA3	3675	SDC3	9672
CD200R1L	344807	ITGA4	3676	SDC4	6385
CD22	933	ITGA5	3678	SDK1	221935
CD226	10666	ITGA6	3655	SDK2	237979
CD24	100133941	ITGA7	3679	SECTM1	6398
CD244	51744	ITGA8	8516	SEL1L3	23231
CD247	919	ITGA9	3680	SELE	6401
CD248	57124	ITGAD	3681	SELL	6402
CD27	939	ITGAE	3682	SELP	6403
CD274	29126	ITGAL	3683	SELPLG	6404
CD276	80381	ITGAM	3684	SEMA3A	10371
CD28	940	ITGAV	3685	SEMA3B	7869
CD300A	11314	ITGAX	3687	SEMA3C	10512
CD300C	10871	ITLN1	55600	SEMA3D	223117
CD300E	342510	IZUMO1	284359	SEMA3E	9723
CD300LB	124599	IZUMO2	126123	SEMA3F	6405
CD300LD	100131439	JAG1	182	SEMA3G	56920
CD300LF	146722	JAG2	3714	SEMA4A	64218
CD300LG	146894	JAM2	58494	SEMA4B	10509
CD302	9936	JAM3	83700	SEMA4C	54910
CD320	51293	JTB	10899	SEMA4D	10507
CD33	945	KAZALD1	81621	SEMA4F	10505
CD34	947	KCNE4	23704	SEMA4G	57715
CD3D	915	KDR	3791	SEMA5A	9037
CD3E	916	KIAA0090	23065	SEMA5B	54437
CD3G	917	KIAA0319	9856	SEMA6A	57556
CD4	920	KIAA0319L	79932	SEMA6B	10501
CD40	958	KIAA1024	23251	SEMA6C	10500
CD44	960	KIAA1324	57535	SEMA6D	80031
CD46	4179	KIAA1324L	222223	SEMA7A	8482
CD47	961	KIAA1644	85352	SERTM1	400120
CD48	962	KIR2DL1	3802	SEZ6	124925
CD5	921	KIR2DL2	3803	SEZ6L	23544
CD52	1043	KIR2DL3	3804	SEZ6L2	26470
CD55	1604	KIR2DL4	3805	SGCA	6442
CD58	965	KIR2DL5A	57292	SGCE	8910
CD6	923	KIR2DL5B	553128	SHISA2	387914
CD68	968	KIR2DS1	3806	SHISA3	152573
CD7	924	KIR2DS2	100132285	SHISA4	149345
CD79A	973	KIR2DS3	3808	SHISA5	51246
CD79B	974	KIR2DS4	3809	SIGIRR	59307
CD80	941	KIR2DS5	3810	SIGLEC1	6614
CD83	9308	KIR3DL1	3811	SIGLEC10	89790
CD84	8832	KIR3DL2	3812	SIGLEC11	114132
CD86	942	KIR3DL3	115653	SIGLEC12	89858
CD8A	925	KIR3DP1	548594	SIGLEC14	100049587
CD8B	926	KIR3DS1	3813	SIGLEC15	284266
CD93	22918	KIR3DX1	90011	SIGLEC16	400709
CD96	10225	KIRREL	55243	SIGLEC5	8778
CD99	4267	KIRREL2	84063	SIGLEC6	946
CD99L2	83692	KIRREL3	84623	SIGLEC7	27036
CDCP1	64866	KIT	3815	SIGLEC8	27181
CDH1	999	KITLG	4254	SIGLEC9	27180
CDH10	1008	KL	9365	SIRPA	140885
CDH11	1009	KLB	152831	SIRPB1	10326
CDH12	1010	KLRAP1	10748	SIRPB2	284759
CDH13	1012	KREMEN1	83999	SIRPD	128646
CDH15	1013	KREMEN2	79412	SIRPG	55423
CDH16	1014	L1CAM	3897	SIT1	27240
CDH17	1015	LAG3	3902	SKINTL	391037
CDH18	1016	LAIR1	3903	SLAMF1	6504
CDH19	28513	LAIR2	3904	SLAMF6	114836
CDH2	1000	LAMP1	3916	SLAMF7	57823
CDH20	28316	LAMP2	3920	SLAMF8	56833
CDH22	64405	LAMP3	27074	SLAMF9	89886
CDH24	64403	LAMP5	24141	SLITRK1	114798
CDH26	60437	LAX1	54900	SLITRK2	84631
CDH3	1001	LAYN	143903	SLITRK3	22865
CDH4	1002	LCTL	197021	SLITRK4	139065
CDH5	1003	LDLR	3949	SLITRK5	26050
CDH6	1004	LDLRAD2	401944	SLITRK6	84189
CDH7	1005	LDLRAD3	143458	SMAGP	57228
CDH8	1006	LEPR	3953	SOGA3	387104
CDH9	1007	LIFR	3977	SORCS1	114815
CDHR3	222256	LILRA1	11024	SORCS2	57537
CDHR5	53841	LILRA2	11027	SORCS3	22986
CDON	50937	LILRA3	11026	SORL1	6653
CEACAM1	634	LILRA4	23547	SORT1	6272
CEACAM16	388551	LILRA5	353514	SPACA1	81833
CEACAM18	729767	LILRA6	79168	SPACA4	171169
CEACAM19	56971	LILRB1	10859	SPATA9	83890
CEACAM20	125931	LILRB2	10288	SPINT1	6692
CEACAM21	90273	LILRB3	11025	SPINT2	10653
CEACAM3	1084	LILRB4	11006	SPN	6693
CEACAM4	1089	LILRB5	10990	SPRN	503542
CEACAM5	1048	LINGO1	84894	STAB1	23166
CEACAM6	4680	LINGO2	158038	STAB2	55576
CEACAM7	1087	LINGO3	645191	STIM1	6786
CEACAM8	1088	LINGO4	339398	SUSD1	64420
CHL1	10752	LMLN	89782	SUSD2	56241
CHODL	140578	LOC160348	160348	SUSD3	203328
CILP	8483	LOC256223	256223	SUSD4	55061
CILP2	148113	LOC374383	374383	SUSD5	26032
CLCA2	9635	LOC376666	376666	TACSTD2	4070
CLCA4	22802	LOC652900	652900	TAPBP	6892
CLEC14A	161198	LRCH4	4034	TAPBPL	55080
CLMP	79827	LRFN1	57622	TARM1	441864
CLSTN1	22883	LRFN2	57497	TCP11	6954
CLSTN2	64084	LRFN3	79414	TCTN2	79867
CLSTN3	9746	LRFN4	78999	TCTN3	26123
CNTFR	1271	LRFN5	145581	TDGF1	6997
CNTN1	1272	LRIG1	26018	TECTA	7007
CNTN2	6900	LRIG2	9860	TECTB	6975
CNTN3	5067	LRIG3	121227	TEK	7010
CNTN4	152330	LRIT1	26103	TEX101	83639
CNTN5	53942	LRIT2	340745	TEX29	121793
CNTN6	27255	LRIT3	345193	TGFA	7039
CNTNAP1	8506	LRP10	26020	TGFBR1	7046
CNTNAP2	26047	LRP11	84918	TGFBR2	7048
CNTNAP3	79937	LRP12	29967	TGFBR3	7049
CNTNAP4	85445	LRP3	4037	TGOLN2	10618
CNTNAP5	129684	LRP4	4038	THBD	7056
CPM	1368	LRP5	4041	THSD1	55901
CR1	1378	LRP6	4040	THSD7A	221981
CR2	1380	LRP8	7804	THSD7B	80731
CRB1	23418	LRPAP1	4043	THY1	7070
CRB2	286204	LRRC15	131578	TIE1	7075
CRB3	92359	LRRC19	64922	TIGIT	201633
CRIM1	51232	LRRC24	441381	TIMD4	91937
CRLF1	9244	LRRC25	126364	TLR1	7096
CRLF2	64109	LRRC26	389816	TLR10	81793
CRTAM	56253	LRRC3	81543	TLR2	7097
CSF1	1435	LRRC32	2615	TLR3	7098
CSF1R	1436	LRRC33	375387	TLR4	7099
CSF2RA	1438	LRRC37A	9884	TLR5	7100
CSF2RB	1439	LRRC37A2	474170	TLR6	10333
CSF3R	1441	LRRC37A3	374819	TLR7	51284
CSPG4	1464	LRRC37B	114659	TLR8	51311
CSPG5	10675	LRRC38	126755	TLR9	54106
CTLA4	1493	LRRC3B	116135	TMEFF1	8577
CUZD1	50624	LRRC4	64101	TMEFF2	23671
CX3CL1	6376	LRRC4B	94030	TMEM108	66000
CXADR	1525	LRRC4C	57689	TMEM119	338773
CXCL16	58191	LRRC52	440699	TMEM123	114908
CXorf68	100132963	LRRC55	219527	TMEM130	222865
CYYR1	116159	LRRC66	339977	TMEM132A	54972
DAG1	1605	LRRN1	57633	TMEM132B	114795
DCBLD1	285761	LRRN2	10446	TMEM132D	121256
DCBLD2	131566	LRRN3	54674	TMEM132E	124842
DCC	1630	LRRN4	164312	TMEM154	201799
DDOST	1650	LRRN4CL	221091	TMEM156	80008
DDR1	780	LRRTM1	347730	TMEM158	25907
DDR2	4921	LRRTM2	26045	TMEM167A	153339
DGCR2	9993	LRRTM3	347731	TMEM167B	56900
DLK1	8788	LRRTM4	80059	TMEM183A	92703
DLK2	65989	LRTM1	57408	TMEM183B	653659
DLL1	28514	LRTM2	654429	TMEM190	147744
DLL3	10683	LSAMP	4045	TMEM207	131920
DLL4	54567	LSR	51599	TMEM213	155006
DNER	92737	LTBR	4055	TMEM240	339453
DPCR1	135656	LTK	4058	TMEM25	84866
DPEP1	1800	LY6D	8581	TMEM27	57393
DPEP2	64174	LY6E	4061	TMEM52	339456
DPEP3	64180	LY6G6C	80740	TMEM59	9528
DSC1	1823	LY6G6D	58530	TMEM59L	25789
DSC2	1824	LY6G6F	259215	TMEM81	388730
DSC3	1825	LY6H	4062	TMEM92	162461
DSCAM	1826	LY6K	54742	TMEM95	339168
DSCAML1	57453	LY75	4065	TMEM9B	56674
DSG1	1828	LY9	4063	TMIE	259236
DSG2	1829	LYPD1	116372	TMIGD1	388364
DSG3	1830	LYPD3	27076	TMIGD2	126259
DSG4	147409	LYPD5	284348	TMPRSS12	283471
DTPQ5903	147645	LYPD6	130574	TMX4	56255
ECSM2	641700	LYPD6B	130576	TNFRSF10A	8797
EDA2R	60401	LYSMD3	116068	TNFRSF10B	8795
EDAR	10913	LYSMD4	145748	TNFRSF10C	8794
EFNA3	1944	LYVE1	10894	TNFRSF10D	8793
EFNA5	1946	M6PR	4074	TNFRSF11A	8792
EFNB1	1947	MADCAM1	8174	TNFRSF11B	4982
EFNB2	1948	MAG	4099	TNFRSF12A	51330
EFNB3	1949	MAMDC4	158056	TNFRSF13B	23495
EGF	1950	MANSC1	54682	TNFRSF13C	115650
EGFR	1956	MCAM	4162	TNFRSF14	8764
ELFN1	392617	MDGA1	266727	TNFRSF17	608
ELFN2	114794	MDGA2	161357	TNFRSF18	8784
EMB	133418	MEGF10	84466	TNFRSF19	55504
EMCN	51705	MEGF11	84465	TNFRSF1A	7132
ENG	2022	MEGF8	1954	TNFRSF1B	7133
ENPP5	59084	MEGF9	1955	TNFRSF21	27242
EPCAM	4072	MEP1A	4224	TNFRSF25	8718
EPGN	255324	MEP1B	4225	TNFRSF4	7293
EPHA1	2041	MERTK	10461	TNFRSF6B	8771
EPHA10	284656	MET	4233	TNFRSF8	943
EPHA2	1969	MFAP3	4238	TNFRSF9	3604
EPHA3	2042	MFAP3L	9848	TNFSF15	9966
EPHA4	2043	MFI2	4241	TP53I13	90313
EPHA5	2044	MICA	4276	TPBG	7162
EPHA6	285220	MICB	4277	TPO	7173
EPHA7	2045	MILR1	284021	TPSG1	25823
EPHA8	2046	MMGT1	93380	TREH	11181
EPHB1	2047	MMP14	4323	TREM1	54210
EPHB2	2048	MMP15	4324	TREM2	54209
EPHB3	2049	MMP16	4325	TREML1	340205
EPHB4	2050	MMP24	10893	TREML2	79865
EPHB6	2051	MOG	4340	TREML4	285852
EPOR	2057	MPEG1	219972	TRIL	9865
ERBB2	2064	MPL	4352	TXNDC15	79770
ERBB3	2065	MPZ	4359	TYRO3	7301
ERBB4	2066	MPZL1	9019	TYROBP	7305
EREG	2069	MPZL2	10205	ULBP1	80329
ERMAP	114625	MPZL3	196264	ULBP2	80328
ERN2	10595	MR1	3140	ULBP3	79465
ESAM	90952	MRC1	4360	UMOD	7369
EVA1C	59271	MRC2	9902	UMODL1	89766
EVC2	132884	MSLN	10232	UNC5A	90249
EVI2A	2123	MST1R	4486	UNC5B	219699
EVI2B	2124	MUC1	4582	UNC5C	8633
F11R	50848	MUC13	56667	UNC5D	137970
F3	2152	MUC15	143662	UPK3BL	100134938
FAIM3	9214	MUC21	394263	VASN	114990
FAM171A1	221061	MUSK	4593	VCAM1	7412
FAM171B	165215	MXRA5	25878	VLDLR	7436
FAM174A	345757	MXRA7	439921	VNN1	8876
FAM174B	400451	MXRA8	54587	VNN2	8875
FAM187A	66784	MYEOV	26579	VNN3	55350
FAM187B	148109	NAGPA	51172	VPREB1	7441
FAM189A2	9413	NCAM1	4684	VPREB3	29802
FAM200A	221786	NCAM2	4685	VSIG1	340547
FAM209A	200232	NCAN	1463	VSIG10	54621
FAM209B	388799	NCLN	56926	VSIG2	23584
FAS	355	NCR1	9437	VSIG4	11326
FCAMR	83953	NCR2	9436	VSTM1	284415
FCAR	2204	NCR3	259197	VSTM2A	222008
FCER1A	2205	NCSTN	23385	VSTM2B	342865
FCGR1A	2209	NEGR1	257194	VSTM2L	128434
FCGR1B	2210	NEO1	4756	VSTM4	196740
FCGR1C	100132417	NETO1	81832	VSTM5	387804
FCGR2A	2212	NETO2	81831	VTCN1	79679
FCGR2B	2213	NFAM1	150372	WFIKKN1	117166
FCGR2C	9103	NFASC	23114	WFIKKN2	124857
FCGR3A	2214	NGFR	4804	XG	7499
FCGR3B	2215	NLGN1	22871	XPNPEP2	7512
FCGRT	2217	NLGN2	57555	ZAN	7455
FCRL1	115350	NLGN3	54413	ZP1	22917
FCRL2	79368	NLGN4X	57502	ZP2	7783
FCRL3	115352	NLGN4Y	22829	ZP3	7784
FCRL4	83417	NOMO1	23420	ZP4	57829
FCRL5	83416	NOMO3	408050	ZPBP	11055
FCRL6	343413	NOTCH1	4851	ZPBP2	124626
				ZPLD1	131368

在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含表 4 之蛋白質的至少 5%、至少 6%、至少 7%、至少 8%、至少 9%、至少 10%、至少 11%、至少 12%、至少 13%、至少 14%、至少 15%、至少 16%、至少 17%、至少 18%、至少 19%、至少 20%、至少 21%、至少 22%、至少 23%、至少 24%、至少 25%、至少 26%、至少 27%、至少 28%、至少 29%、至少 30%、至少 31%、至少 32%、至少 33%、至少 34%、至少 35%、至少 36%、至少 37%、至少 38%、至少 39%、至少 40%、至少 41%、至少 42%、至少 43%、至少 44%、至少 45%、至少 46%、至少 47%、至少 48%、至少 49%、至少 50%、至少 51%、至少 52%、至少 53%、至少 54%、至少 55%、至少 56%、至少 57%、至少 58%、至少 59%、至少 60%、至少 61%、至少 62%、至少 63%、至少 64%、至少 65%、至少 66%、至少 67%、至少 68%、至少 69%、至少 70%、至少 71%、至少 72%、至少 73%、至少 74%、至少 75%、至少 76%、至少 77%、至少 78%、至少 79%、至少 80%、至少 81%、至少 82%、至少 83%、至少 84%、至少 85%、至少 86%、至少 87%、至少 88%、至少 89%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或 100% (例如，表 4 之蛋白質的 5% 至 15%、15% 至 25%、25% 至 35%、35% 至 45%、45% 至 55%、55% 至 65%、65% 至 75%、75% 至 85%、85% 至 95% 或 95% 至 100%) 的細胞外域。

在一些態樣中，標靶多肽之集合物包含具有表 4 之蛋白質中之至少 100 種、至少 150 種、至少 200 種、至少 250 種、至少 300 種、至少 350 種、至少 400 種、至少 450 種、至少 500 種、至少 550 種、至少 600 種、至少 650 種、至少 700 種、至少 750 種、至少 800 種、至少 850 種、至少 900 種、至少 950 種、至少 1000 種、至少 1050 種、至少 1100 種、至少 1150 種或全部 1195 種的細胞外域，例如，包含具有表 4 之多肽中之 100 種至 150 種、150 種至 200 種、200 種至 250 種、250 種至 300 種、300 種至 350 種、350 種至 400 種、400 種至 450 種、450 種至 500 種、500 種至 550 種、550 種至 600 種、600 種至 650 種、650 種至 700 種、750 種至 800 種、800 種至 850 種、850 種至 900 種、900 種至 950 種、950 種至 1000 種、1000 種至 1050 種、1050 種至 1100 種、1100 種至 1150 種或全部 1195 種的細胞外域。

在其他態樣中，受體為多跨膜受體 (MTMR)，例如，GPCR 超家族之成員。 E. 交互作用測定

為執行蛋白質-蛋白質交互作用測定，使標靶多肽之集合物 (例如，固定至表面的標靶多肽，例如，固定在平板的孔中的標靶多肽) 與包含異源膜相關蛋白的 BV 接觸 (例如，與包含經純化之 BV 的溶液接觸)。然後可培育該測定並洗滌一次或多次以去除未結合之 BV。

在一些態樣中，藉由檢測固體表面上的位置處的高於閾值水平的訊號，鑑定異源膜相關蛋白與至少一個標靶多肽之間的交互作用。訊號檢測可來自 BV 之一種或多種可視化組分，如下所示。

在一些態樣中，膜出芽劑 (例如，HIV gag 蛋白) 進一步包含可檢測標記 (例如，與其結合)，且檢測交互作用包含檢測固體表面上的位置處的高於閾值水平的可檢測標記的水平。在一些態樣中，可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶。在一些態樣中，酶為海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc)，且測定進一步包含添加 Rluc 受質，從而在固體表面上發生交互作用的位置處產生螢光訊號。

在一些態樣中，交互作用為短暫交互作用。

在一些態樣中，交互作用為低親和力交互作用。

在一些態樣中，在如上所述之蛋白質-蛋白質交互作用測定中測試表 1 中所提供之蛋白質與表 4 中所提供之 STM 蛋白質的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定表 3 中所提供之交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 LRRC15 與 TEM1/CD248/內皮唾液酸蛋白、PLXDC2、PTPRD、SARAF、ASGR1、BMP10、CPM、LDLR、PILRA 及/或 PRRG2 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 PD-L1/CD274 與 C6orf72、LRTM1、CDHR2、IGF2R、NCR3 及/或 SUSD3 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 PVR 與 CLEC17A 及/或 PVRL4 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 CD80/B7-1 與 BTNL3、CDHR2、GLT8D2、KIAA1467 及/或 RNF152 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 CD276/B7-H3 與 LRFN1、MXRA5、PVRL1、LRIT2、PLA2R1 及/或 SLITRK4 之間的交互作用。在一些態樣中，在如上所述之蛋白質-蛋白質交互作用測定中測試一種或多種多跨膜受體 (MTMR) (例如，GPCR 超家族之成員) 的交互作用。

在一些態樣中，在如上所述之蛋白質-蛋白質交互作用測定中測試表 5 中所提供之蛋白質與表 6 中所提供之蛋白質的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定表 7 中所提供之交互作用。表 5. 查詢蛋白質

ADGRB1

LGR4

LGR5

表 6. 庫蛋白質

PD-L1

ICOSLG

DNER

CNTN6

CLPS

EDIL3

IZUMO4

IZUMO1

BTNL3

CD93

CEACAM16

IL-6

LRRC4C

SCARF1

TRIL

CLPS

EDIL3

IZUMO4

CD93

GPR125

IL6R

SCARF1

TRIL

表 7. 查詢蛋白質與庫蛋白質之間的交互作用

配偶體 A	配偶體 B
ADGRB1	PD-L1
ICOSLG
DNER
CNTN6
LGR4	CLPS
EDIL3
IZUMO4
IZUMO1
BTNL3
CD93
CEACAM16
IL-6
LRRC4C
SCARF1
TRIL
LGR5	CLPS
EDIL3
IZUMO4
CD93
GPR125
IL6R
SCARF1
TRIL

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 ADGRB1 與 PD-L1、ICOSLG、DNER 及/或 CNTN6 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 LGR4 與 CLPS、EDIL3、IZUMO4、IZUMO1、BTNL3、CD93、CEACAM16、IL-6、LRRC4C、SCARF1 及/或 TRIL 之間的交互作用。

在一些態樣中，本文所述之測定可鑑定 LGR5 與 CLPS、EDIL3、IZUMO4、CD93、GPR125、IL6-R 及/或 TRIL 之間的交互作用。 F. BV- 蛋白複合物

在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白複合物，該蛋白複合物包含：(a) BV，該 BV 包含異源膜相關蛋白及膜出芽劑；及 (b) 標靶多肽，其中異源膜相關蛋白與標靶多肽彼此結合。例示性異源膜相關蛋白及標靶多肽分別如章節 IIIA 及 IIID 中所述。在一些態樣中，標靶多肽被固定在表面上，且複合物位於表面上。 IV. 鑑定蛋白質 - 蛋白質交互作用之調節劑的方法 A. 交互作用調節之測定 i. 表 1 及表 2 之蛋白質

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間交互作用的調節劑。 ii. TEM1 及 LRRC15

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 與 TEM1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑。 iii. 表 5 及表 6 之蛋白質

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節劑。 iv. PD-L1 及 ADGRB1

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。 v. ICOSLG 及 ADGRB1

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。 vi. 交互作用調節之測定

在一些態樣中，將候選調節劑提供給細胞 (例如，哺乳動物細胞)；提供給細胞培養基；提供給條件培養基；提供給純化形式的表 1 之蛋白質 (例如，BV 上所表現之蛋白質 1 的形式) 及/或表 2 之蛋白質；及/或提供給純化形式的表 5 之蛋白質 (例如，BV 上所表現之蛋白質 5 的形式) 及/或表 6 之蛋白質。在一些態樣中，候選調節劑以至少 0.1 nM、0.5 nM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 µM、2 µM、3 µM、5 µM 或 10 µM 的濃度提供。在一些態樣中，候選調節劑以 0.1 nM 與 10 µM 之間的濃度提供。在一些態樣中，候選調節劑在溶液中 (例如，以可溶形式) 提供。

在一些態樣中，如果結合的增加為至少 70% 時 (例如，如藉由表面電漿子共振、生物層干涉或酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 所測量)，將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，結合的增加為至少 5%、至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%)。在一些態樣中，結合的增加為至少 70%。

在一些態樣中，如果結合的減少為至少 70% 時 (例如，如藉由表面電漿子共振、生物層干涉或酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 所測量)，將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，結合的減少為至少 5%、至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。在一些態樣中，結合的減少為至少 70%。用於鑑定蛋白質-蛋白質交互作用之調節劑以及可調節該等交互作用的藥劑的例示性方法如下文及 PCT/US2020/025471 所述，該專利以全文引用方式併入本文。

表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間或表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節可被鑑定為在調節劑存在下的蛋白質-蛋白質交互作用相比於不存在調節劑的情況下的蛋白質-蛋白質交互作用增加，例如，蛋白質-蛋白質交互作用增加 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、95%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。可替代地，調節可被鑑定為在調節劑存在下的蛋白質-蛋白質交互作用相比於不存在調節劑的情況下的蛋白質-蛋白質交互作用降低，例如，蛋白質-蛋白質交互作用降低 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、95% 或 100% (例如，10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。用於蛋白質-蛋白質交互作用的測定可為例如表面電漿子共振 (SPR) 測定、生物層干涉 (BLI) 測定、酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、細胞外交互作用測定或細胞表面交互作用測定。 用於蛋白質 - 蛋白質交互作用之調節的 SPR 測定

在一些態樣中，用於蛋白質-蛋白質交互作用的測定為表面電漿子共振 (SPR) 測定。在一些態樣中，表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之結合或表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之結合的調節可作為存在調節劑的情況下相比於不存在於調節劑的情況下的 SPR 訊號反應單位 (RU) 差異來測量。 用於蛋白質 - 蛋白質交互作用之調節的 BLI 測定

在一些態樣中，用於蛋白質-蛋白質交互作用的測定為生物層干涉 (BLI) 測定。在一些態樣中，BLI 測定使用分離之細胞外域 (ECD) 進行。在一些態樣中，表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之結合或表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之結合的調節可作為存在調節劑的情況下相比於不存在於調節劑的情況下在生物感測器尖端所測得的波長偏移 (Δλ) 差異來測量。 用於蛋白質 - 蛋白質交互作用之調節的 ELISA

在一些態樣中，用於蛋白質-蛋白質交互作用的測定為酶聯免疫吸附測定 (ELISA)。在一些態樣中，第一蛋白質結合至平板 (例如，直接結合至平板或經由結合至平板的抗體識別的親和標籤而結合至平板)，並且第二蛋白質以可溶形式 (例如，作為分離之 ECD) 提供。可藉由提供與第二蛋白質或其親和標籤結合的抗體來檢測第一蛋白質與第二蛋白質之間的交互作用，其中可在存在抗體的情況下的測定中檢測 (例如，可視化) 抗體。 用於蛋白質 - 蛋白質交互作用之調節的其他測定

在一些態樣中，測定為細胞外交互作用測定，例如，如 PCT/US2020/025471 中所述，該專利以全文引用方式併入本文。在一些態樣中，測定為細胞表面交互作用測定，例如，如 PCT/US2020/025471 中所述。在一些態樣中，測定為等溫滴定熱量測定 (ITC)、包括免疫沉澱的測定或包括 ALPHASCREEN ^TM技術的測定。 B. 下游活性變化之測定 i. 表 1 及表 2 之蛋白質

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 1 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 1 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 2 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 2 之蛋白質與表 1 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 2 之蛋白質與表 1 之蛋白質接觸，其中表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 2 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 2 之蛋白質的下游活性之調節劑。 ii. TEM1 及 LRRC15

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 LRRC15 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 LRRC15 的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 TEM1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 TEM1 與 LRRC15 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 TEM1 與 LRRC15 接觸；及 (c) 測量 TEM1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 TEM1 的下游活性之調節劑。在一些態樣中，結合的增加或減少為至少 70%，如藉由表面電漿子共振、生物層干涉或 ELISA 所測量。 iii. 表 5 及表 6 之蛋白質

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 5 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 5 之蛋白質的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定表 6 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑 (例如，如本文章節 IV 中所述之候選調節劑)；(b) 在允許表 6 之蛋白質與表 5 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使表 6 之蛋白質與表 5 之蛋白質接觸，其中表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 6 之蛋白質的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 6 之蛋白質的下游活性之調節劑。 iv. PD-L1 及 ADGRB1

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 PD-L1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 PD-L1 的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ADGRB1 與 PD-L1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 PD-L1 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為 ADGRB1 的下游活性之調節劑。在一些態樣中，結合的增加或減少為至少 70%，如藉由表面電漿子共振、生物層干涉或 ELISA 所測量。 v. ICOSLG 及 ADGRB1

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 ICOSLG 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ICOSLG 的下游活性之調節劑。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含：(a) 提供候選調節劑；(b) 在允許 ADGRB1 與 ICOSLG 結合的條件下，在存在或不存在候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 ICOSLG 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ADGRB1 的下游活性之調節劑。在一些態樣中，結合的增加或減少為至少 70%，如藉由表面電漿子共振、生物層干涉或 ELISA 所測量。 vi. 下游活性變化之測定

在一些態樣中，候選調節劑以至少 0.1 nM、0.5 nM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 µM、2 µM、3 µM、5 µM 或 10 µM 的濃度提供。在一些態樣中，候選調節劑以 0.1 nM 與 10 µM 之間的濃度提供。在一些態樣中，提供各種濃度 (例如，如圖 4F 所示) 的候選調節劑。在一些態樣中，候選調節劑在溶液中 (例如，以可溶形式) 提供。在一些態樣中，將候選調節劑提供給包含表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的生物體，提供給包含表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的組織，提供給細胞 (例如，哺乳動物細胞)，提供給細胞培養基，提供給條件培養基，及/或提供給純化形式的表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質。在一些態樣中，將候選調節劑提供給包含表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的生物體，提供給包含表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的組織，提供給細胞 (例如，哺乳動物細胞)，提供給細胞培養基，提供給條件培養基，及/或提供給純化形式的表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質。

在一些態樣中，調節劑為表 1 或表 2 之蛋白質的下游活性之活化劑。在一些態樣中，如果表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的下游活性的增加為至少 30%，則將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，調節劑為表 5 或表 6 之蛋白質的下游活性之活化劑。在一些態樣中，如果表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的下游活性的增加為至少 30%，則將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，下游活性的增加為 5%、至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 100% 或超過 100% (例如，至少 5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%)。在一些態樣中，下游活性的增加為至少 30%。在一些態樣中，下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的增加。

在一些態樣中，調節劑為表 1 或表 2 之蛋白質的下游活性之抑制劑。在一些態樣中，如果表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的下游活性的減少為至少 30%，則將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，調節劑為表 5 或表 6 之蛋白質的下游活性之抑制劑。在一些態樣中，如果表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的下游活性的減少為至少 30%，則將候選調節劑鑑定為調節劑。在一些態樣中，下游活性的減少為 5%、至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，至少 5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。在一些態樣中，下游活性的減少為至少 30%。在一些態樣中，下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的減少。

在一些態樣中，在一種或多種測定中評估表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的下游活性。在一些態樣中，在一種或多種測定中評估表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的下游活性。

在一些態樣中，下游活性是與疾病 (例如，癌症) 之發展或進展相關的活性。

在一些態樣中，下游活性為腫瘤生長。在一些態樣中，表 1 之蛋白質為 LRRC15，表 2 之蛋白質為 TEM1，且下游活性為腫瘤生長。在一些態樣中，在調節劑存在下，腫瘤生長減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，至少 10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)，如腫瘤生長測定中所測量。在一些態樣中，在調節劑存在下，腫瘤生長減少至少 20%，如腫瘤生長測定中所測量。

在一些態樣中，表 5 之蛋白質為 ADGRB，表 2 之蛋白質為 PD-L1，且下游活性為腫瘤生長。在一些態樣中，在調節劑存在下，腫瘤生長減少至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，至少 10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)，如腫瘤生長測定中所測量。在一些態樣中，在調節劑存在下，腫瘤生長減少至少 20%，如腫瘤生長測定中所測量。

在一些態樣中，表 5 之蛋白質為 ADGRB，表 2 之蛋白質為 PD-L1，且下游活性為吞噬細菌細胞或凋亡細胞。在一些態樣中，在調節劑存在下，吞噬率增加至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，至少 10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。

在一些態樣中，表 5 之蛋白質為 ADGRB，表 2 之蛋白質為 ICOSLG，且下游活性為 T 細胞活化。在一些態樣中，T 細胞活化增加至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90% 或 100% (例如，至少 10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%)。在一些態樣中，在調節劑存在下，T 細胞活化增加至少 20%。 C. 小分子

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑為小分子。小分子是除本文所定義之結合多肽或抗體之外的分子，它們可結合，較佳的是特異性地結合至表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質或表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質。結合小分子可使用已知方法進行鑑定和化學合成 (參見例如 PCT 公開號 WO00/00823 及 WO00/39585)。結合小分子的大小通常小於約 2000 道爾頓 (例如，小於約 2000、1500、750、500、250 或 200 道爾頓)，其中能夠結合、較佳的是特異性地結合至如本文所述之多肽的該等有機小分子可使用眾所周知的技術來鑑定，而無需過度實驗。就此而言，值得注意的是，篩檢小分子庫中能夠結合到多肽標靶的分子的技術是本領域所熟知的 (參見例如 PCT 公開號 WO00/00823 及 WO00/39585)。結合小分子可為例如醛、酮、肟、腙、半卡腙、卡肼、一級胺、二級胺、三級胺、N-取代肼、醯肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、醯胺、脲、胺基甲酸酯、碳酸酯、縮酮、硫縮酮、縮醛、硫縮醛、芳基鹵化物、芳基磺酸鹽、烷基鹵化物、烷基磺酸鹽、芳族化合物、雜環化合物、苯胺、烯烴、炔烴、二醇、胺基醇、㗁唑啶、㗁唑啉、四氫噻唑、噻唑啉、烯胺、磺醯胺、環氧化物、吖𠰂、異氰酸酯、磺醯氯、重氮化合物、醯氯等。

在一些態樣中，在小分子存在下，表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的結合減少 (例如，減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。

在一些態樣中，在小分子存在下，表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的結合減少 (例如，減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在小分子存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。 D. 抗體及抗原結合片段

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑為結合表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗原結合片段為雙-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 1 之蛋白質。在其他態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 2 之蛋白質。

在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合減少 (例如，減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性 (例如，如本文章節 III B中所述之下游活性，例如，CAF 收縮性、免疫查核點抑制、細胞增殖抑制、標靶磷酸化調節、細胞遷移抑制、腫瘤形成抑制、細胞侵襲抑制、巨噬細胞極化、吞噬作用調節、蝕骨細胞分化、傳訊途徑活化或形成絲狀偽足) 降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性 (例如，如本文章節 III B中所述之下游活性) 提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑為結合表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗原結合片段為雙-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 5 之蛋白質。在其他態樣中，抗體或其抗原結合片段結合表 6 之蛋白質。

在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合減少 (例如，減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性 (例如，如本文章節 III B中所述之下游活性，例如，CAF 收縮性、免疫查核點抑制、細胞增殖抑制、標靶磷酸化調節、細胞遷移抑制、腫瘤形成抑制、細胞侵襲抑制、巨噬細胞極化、吞噬作用調節、蝕骨細胞分化、傳訊途徑活化或形成絲狀偽足) 降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在抗體或抗原結合片段存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性 (例如，如本文章節 III B中所述之下游活性) 提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。 E. 肽

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑是與表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質結合的肽。肽可天然產生，或者可經工程改造。在一些態樣中，肽為表 1 之蛋白質、表 2 之蛋白質或結合至表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的另一種蛋白質的片段。肽可以等於、小於或大於全長蛋白的親和力結合結合配偶體。在一些態樣中，肽執行全長蛋白的所有功能。在其他態樣中，肽不執行全長蛋白的所有功能。

在一些態樣中，在肽存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑是與表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質結合的肽。肽可天然產生，或者可經工程改造。在一些態樣中，肽為表 5 之蛋白質、表 6 之蛋白質或結合至表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的另一種蛋白質的片段。肽可以等於、小於或大於全長蛋白的親和力結合結合配偶體。在一些態樣中，肽執行全長蛋白的所有功能。在其他態樣中，肽不執行全長蛋白的所有功能。

在一些態樣中，在肽存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在肽存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。 F. 模擬物

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑為模擬物，例如，結合至表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的分子模擬物。模擬物可為表 1 之蛋白質、表 2 之蛋白質或結合至表 1 之蛋白質或表 2 之蛋白質的另一種蛋白質的分子模擬物。在一些態樣中，模擬物可執行所模擬之多肽的所有功能。在其他態樣中，模擬物不執行所模擬之多肽的所有功能。

在一些態樣中，在模擬物存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 1 之蛋白質及表 2 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 1 之蛋白質及/或表 2 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。

在一些態樣中，調節劑或候選調節劑為模擬物，例如，結合至表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的分子模擬物。模擬物可為表 5 之蛋白質、表 6 之蛋白質或結合至表 5 之蛋白質或表 6 之蛋白質的另一種蛋白質的分子模擬物。在一些態樣中，模擬物可執行所模擬之多肽的所有功能。在其他態樣中，模擬物不執行所模擬之多肽的所有功能。

在一些態樣中，在模擬物存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 5 之蛋白質及表 6 之蛋白質的結合增加 (例如，增加 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性降低 (例如，降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90% 或 90% 至 100%))。在一些態樣中，在模擬物存在下，表 5 之蛋白質及/或表 6 之蛋白質的下游活性提高 (例如，提高 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超過 100% (例如，5% 至 10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、70% 至 80%、80% 至 90%、90% 至 100% 或超過 100%))。 V. 包含具有已鑑定蛋白質 - 蛋白質交互作用的調節劑的治療方法

在一些態樣中，利用本文所述之蛋白質-蛋白質交互作用的調節劑治療或延遲病理狀態、疾病、病症或病狀 (例如，癌症) 的進展。

在一些態樣中，調節劑在經調節劑投予的個體中提高或降低蛋白質-蛋白質交互作用之下游活性 (例如，腫瘤形成或腫瘤生長) 的量、強度或持續時間。 A. 癌症

在一些態樣中，利用本文所述之蛋白質-蛋白質交互作用的調節劑 (例如，LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑；PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑；或 ADGRB1 與 ICOSLG 之間交互作用的調節劑)，例如小分子、抗體、抗原結合片段、肽、模擬物、反義寡核苷酸或 siRNA，治療有此需要之受試者的癌症或延遲其進展。在一些態樣中，受試者為人。癌症可為實性瘤癌症或非實性瘤癌症。實體癌腫瘤包括但不限於膀胱癌、黑色素瘤、乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌或前列腺癌或其轉移形式。在一些態樣中，該癌症為膀胱癌。膀胱癌的另外態樣包括泌尿上皮癌、肌肉浸潤性膀胱癌 (muscle invasive bladder cancer, MIBC) 或非肌肉浸潤性膀胱癌 (non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)。在一些態樣中，膀胱癌是一種轉移性泌尿上皮癌 (mUC)。在一些態樣中，該癌症為乳癌。乳癌的另外態樣包括激素受體陽性 (HR+) 乳癌，例如雌激素受體陽性 (ER+) 乳癌、助孕酮受體陽性 (PR+) 乳癌或 ER+/PR+ 乳癌。乳癌的其他態樣包括 HER2 陽性 (HER2+) 乳癌。乳癌的另外其他態樣包括三陰性乳癌 (TNBC)。在一些態樣中，乳癌是早期乳癌。在一些態樣中，該癌症為肺癌。肺癌的另外態樣包括上皮生長因子受體陽性 (EGFR+) 肺癌。肺癌的其他態樣包括上皮生長因子受體陰性 (EGFR-) 肺癌。肺癌的另外其他態樣包括非小細胞肺癌，例如鱗狀肺癌或非鱗狀肺癌。肺癌的其他態樣包括小細胞肺癌。在一些態樣中，該癌症是頭頸癌。頭頸癌的另外態樣包括頭頸鱗狀細胞癌 (SCCHN)。在一些態樣中，該癌症為腎癌。腎癌的另外態樣包括腎細胞癌 (renal cell carcinoma，RCC)。在一些態樣中，該癌症為肝癌。肝癌的另外態樣包括肝細胞癌。在一些態樣中，該癌症為前列腺癌。前列腺癌的另外態樣包括去勢抗性前列腺癌 (castration-resistant prostate cancer，CRPC)。在一些態樣中，癌症是實性瘤的轉移形式。在一些態樣中，實性瘤的轉移形式是黑素瘤、乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌或前列腺癌。在一些態樣中，癌症為轉移性泌尿上皮癌 (mUC)。在一些態樣中，該癌症是非實性瘤癌症。非實性瘤癌症包括但不限於 B 細胞淋巴瘤。B 細胞淋巴瘤的另外態樣包括，例如慢性淋巴球性白血病 (chronic lymphocytic leukemia，CLL)、瀰漫性大 B 細胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、濾泡性淋巴瘤，骨髓化生不良症候群 (myelodysplastic syndrome，MDS)，非何杰金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma，NHL)、急性淋巴母細胞性白血病 (acute lymphoblastic leukemia，ALL)、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia，AML) 或蕈狀肉芽腫 (mycosis fungoides，MF)。 B. 組合療法

在上述治療和預防方法中的一些態樣中，該方法包括向個體投予至少一種額外療法 (例如，一種、兩種、三種、四種或多於四種額外療法)。調節劑可在至少一種額外療法之前、同時或之後投予個體。 C. 遞送方法

本文所述之方法中利用的組成物 (例如，本文所述之蛋白質-蛋白質交互作用的調節劑，例如小分子、抗體、抗原結合片段、肽、模擬物、反義寡核苷酸或 siRNA) 可以任何合適的方法投予，包括例如經靜脈內、肌內、皮下、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、瘤內、經腹膜、結膜下、囊泡內、經黏膜、心包內、臍內、眼內、眶內、口服、透皮、玻璃體內 (例如，經玻璃體內注射)、經滴眼液、經吸入、經注射、經植入、經輸注、經連續輸注、經局部直接灌注浴標靶細胞、經套管、經灌洗、經乳脂或經脂質組成物進行投予。本文所述之方法中使用的組成物亦可以全身或局部投予。投予方法可以根據多種因素而變化（例如，投予之化合物或組成物以及待治療之病狀、疾病或疾患的嚴重程度）。在一些態樣中，蛋白質-蛋白質交互作用的調節劑經靜脈內、肌內、皮下、局部、口服、經皮、腹膜內、眶內、經植入、經吸入、鞘內、心室內或鼻內投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。

本文所述之蛋白質-蛋白質交互作用的調節劑 (及任何額外之治療劑) 可按照與良好醫學實踐一致的方式進行調配、給藥和投予。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。調節劑並非必須，但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所論述病症之一種或多種藥劑一起調配及/或投予。該等其他治療劑的有效量取決於存在於調配物中的調節劑的量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。 VI. 鑑定具有改變的結合型態的生物囊泡的方法

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定具有改變的結合型態的生物囊泡 (BV) 之方法，該方法包含：(a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物；(b) 使步驟 (a) 的集合物與所關注 BV 接觸；(c) 檢測該所關注 BV 與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定交互作用型態；及 (d) 將所關注 BV 的交互作用型態與對照 BV 的交互作用型態進行比較，其中依所關注 BV 的交互作用型態與對照 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該所關注 BV 為具有改變的結合型態的 BV。

在一些態樣中，獵物蛋白 (例如，STM 蛋白) 之細胞外域具有天然構形，例如，在野生型蛋白質中觀察到的構形。在一些態樣中，獵物蛋白 (例如，STM 蛋白) 之細胞外域包含天然轉譯後修飾。

在一些態樣中，所關注 BV 為工程化 BV，例如，BV 源自經修飾之親代細胞 (例如，經修飾以表現異源蛋白質，例如受體)。對照 BV 可為例如藉由對照方法所產生的 BV 或源自未經修飾之親代細胞的 BV。

在一些態樣中，BV 為用為藥物遞送載體的 BV。對照 BV 可為例如具有所需之藥物遞送載體的特徵的 BV。在一些態樣中，該方法用於質量控制，例如用於檢測 EV 之結合型態的意外變化 (例如，由於標靶受體之過表現、添加治療劑或產生 EV 的細胞之修飾而引起的變化)。

在一些態樣中，所關注 BV 源自來自受試者之樣品。在一些態樣中，該方法用於對受試者樣品中 EV 的受體進行無偏型態分析 (例如，用於比較由不同組織、細胞類型、腫瘤細胞株或免疫細胞所產生之 EV)。在一些態樣中，所關注 BV 及對照 BV 源自不同組織或不同細胞類型。在一些態樣中，所關注 BV 源自患病組織 (例如，腫瘤組織)，且對照 BV 源自健康組織。 VII. 表徵細胞株之交互作用型態的方法 A. 表徵細胞株之交互作用型態的方法

在一些態樣中，本揭露提供一種表徵細胞株之交互作用型態的方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株以包含膜出芽劑；及 (b) 表徵細胞株所產生之生物囊泡 (BV) 的交互作用型態。

在一些態樣中，本揭露提供一種表徵已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態之方法，該方法包含表徵細胞株所產生之 BV 的交互作用型態。

在一些態樣中，細胞株可為哺乳動物細胞株。在一些態樣中，哺乳動物細胞株為神經元細胞株、纖維母細胞株或免疫細胞株。在一些態樣中，免疫細胞株包含 T 細胞、B 細胞或單核球中之一種或多種 (例如，由 T 細胞組成或由 B 細胞組成或由單核球組成)，例如為 T 細胞株、B 細胞株或單核球細胞株。

在一些態樣中，細胞株為代表 (例如，源自) 所關注組織類型 (例如，患病或健康組織類型) 或所關注細胞類型的哺乳動物細胞株或代表 (例如，源自) 所關注腫瘤 (例如，腫瘤細胞株) 的細胞株。在一些態樣中，細胞株 (例如，哺乳動物細胞株) 為源自來自受試者 (例如罹患疾病之受試者) 之樣品。

例示性膜出芽劑提供於本文章節 III(C) 中。在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，細胞株中膜出芽劑的表現是可誘導的。可引入細胞株中的可誘導的膜出芽劑的表現的例示性構建體包括 (a) 在添加入小分子後減輕或抑制膜出芽劑的表現的可誘導啟動子 (例如，可滲透細胞的小分子)，例如 T-REX ^TM系統；(b) 小分子誘導的降解系統，其中膜出芽劑在誘導後迅速降解 (例如，TIR1 生長素可誘導的降解決定子 (AID) 系統)；(c) 小分子誘導的穩定係統，其中膜出芽劑包含降解域，且蛋白質在誘導時被保護以免於降解 (例如，Shield-1 – FKBP 系統)。可進行構建體的整合，例如，藉由使用 CRISPR-Cas9 或基因體工程技術將構建體插入安全港基因座。可替代地，可使用隨機整合的方法，諸如 PiggyBac 轉位子系統 (SBI)。可在任何所需的時間點誘導細胞株中膜出芽劑的表現；因此，可在任何時間點誘導細胞株產生 BV。

在一些態樣中，表徵 BV 的交互作用型態包含確定 BV 上一種或多種所關注膜相關蛋白 (例如，一種或多種所關注受體) 的水平。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵 BV 的細胞質蛋白型態 (例如，包含表徵存在於 BV 的內腔內的蛋白質)。 B. 鑑定細胞株之交互作用型態的變化之方法

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株以包含膜出芽劑；(b) 表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態；(c) 表徵由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態，其中依在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含：(a) 表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態；(b) 表徵由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較在第一時間點所產生之 BV 的該交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的該交互作用型態，其中依在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。

在一些態樣中，該方法包含在第一時間點之後和第二時間點之前將細胞株暴露於刺激中；因此，該方法可用於鑑定作為暴露於刺激的結果的細胞株之交互作用型態的變化。刺激可為例如誘導傳訊的條件或藥劑、誘導疾病相關狀態的條件或藥劑及/或誘導分化的條件或藥劑。在一些態樣中，細胞株為免疫細胞株且疾病相關狀態為免疫衰竭。

在其他態樣中，該方法不包含將細胞株暴露於刺激中。例如，在一些態樣中，選擇的第一時間點及第二時間點處於細胞株分化過程中的不同階段，或評估在第一時間點及第二時間點產生的 BV 以確定細胞株在各時間點之間是否已分化。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵細胞株在一個或多個額外時間點 (例如，在 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個、10 個或超過 10 個額外時間點) 所產生之 BV 的交互作用型態。在一些態樣中，該方法包含在第二時間點之後將細胞株暴露於刺激中，例如，在一個或多個額外時間點之前將細胞株暴露於刺激中。

細胞株可為哺乳動物細胞株。在一些態樣中，哺乳動物細胞株為神經元細胞株、纖維母細胞株或免疫細胞株。在一些態樣中，免疫細胞株包含 T 細胞、B 細胞或單核球中之一種或多種 (例如，由 T 細胞組成或由 B 細胞組成或由單核球組成)，例如為 T 細胞株、B 細胞株或單核球細胞株。

例示性膜出芽劑提供於本文章節 III(C) 中。在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，細胞株中膜出芽劑的表現是可誘導的。例示性膜出芽劑提供於本文章節 III(C) 中，且例示性可誘導的構建體描述於上述章節 VII(A) 中。可在任何所需之時間點誘導親代細胞株中膜出芽劑的表現，因此誘導親代細胞株產生 BV。例如，在一些態樣中，在第一時間點、第二時間點及視情況在一個或多個額外時間點誘導膜出芽劑的表現。在一些態樣中，在第一時間點與第二時間點之間的間隔內不誘導膜出芽劑的表現，例如，在第一時間點與第二時間點之間的間隔內不表現膜出芽劑。

在一些態樣中，表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態與由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態包含確定如上文章節 VII(A) 中所述之 BV 中之每一者上的一種或多種所關注膜相關蛋白的水平 (例如，一種或多種所關注受體)。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的細胞質蛋白型態與由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的細胞質蛋白型態 (例如，包含表徵存在於由細胞株在第一時間點所產生之 BV 及由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的內腔內的蛋白質)。 C. 比較細胞株之交互作用型態的方法

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含：(a) 修飾細胞株中之各者以包含膜出芽劑；(b) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；(c) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態，其中依在第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。

在一些態樣中，本揭露提供一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含：(a) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；(b) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態，其中依第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態與第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。

在一些態樣中，第一細胞株及第二細胞株為哺乳動物細胞株。在一些態樣中，第一細胞株所產生之 BV 及第二細胞株所產生之 BV 源自不同組織或不同細胞類型。在一些態樣中，第一細胞株所產生之 BV 源自患病組織 (例如，腫瘤組織)，第二細胞株所產生之 BV 源自健康組織。

例示性膜出芽劑提供於本文章節 III(C) 中。在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，細胞株中膜出芽劑的表現是可誘導的。例示性膜出芽劑提供於本文章節 III(C) 中，且例示性可誘導的構建體描述於上述章節 VII(A) 中。

在一些態樣中，該方法進一步包含表徵由細胞株在第一時間點所產生之 BV 的細胞質蛋白型態與由細胞株在第二時間點所產生之 BV 的細胞質蛋白型態。

在另一態樣中，本揭露提供一種包含異源膜出芽劑之 BV，其中該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾為在可誘導控制下表現膜出芽劑的親代細胞株；(ii) 誘導膜出芽劑之表現，及 (iii) 從親代細胞株中分離 BV。在一些態樣中，膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。在一些態樣中，膜出芽劑為 HIV gag 蛋白。在一些態樣中，親代細胞株為哺乳動物細胞株。在一些態樣中，BV 為細胞外囊泡 (EV)。 VIII. 使用生物囊泡評估膜蛋白活性的方法

在一些態樣中，本揭露提供一種評估膜相關蛋白的酶活性之方法，該方法包含對包含該蛋白質的生物囊泡 (BV) 進行酶活性測定。

例示性 BV 描述於本文章節 III(B) 中。在一些態樣中，膜相關蛋白為 BV 及/或其親代細胞的內源蛋白，亦即使用該方法評估內源性膜相關蛋白的酶活性。

在其他態樣中，BV 膜相關蛋白為存在於 BV 的外面的異源膜相關蛋白，亦即使用該方法評估異源膜相關蛋白的酶活性。包含異源膜相關蛋白的 BV 如本文章節 II 中所述。

在一些態樣中，異源膜相關蛋白為全長蛋白。在其他態樣中，異源膜相關蛋白為蛋白質片段。在一些態樣中，異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物 (例如，錨定物將蛋白質片段栓繫至 BV 之膜表面，例如醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽)。

在一些態樣中，膜相關蛋白為肽酶，且酶活性測定為肽酶活性之測定，例如，用於肽酶之一種或多種已知或推定受質之降解的測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為蛋白酶，且酶活性測定為蛋白酶活性之測定，例如，用於蛋白酶之一種或多種已知或推定受質之降解的測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為激酶，且酶活性測定為激酶活性之測定，例如，用於激酶之一種或多種已知或推定受質之磷酸化的測定。

在一些態樣中，膜相關蛋白為磷酸酶，且酶活性測定為磷酸酶活性之測定，例如，用於磷酸酶之一種或多種已知或推定受質之去磷酸化的測定。 IX. 純化生物囊泡的方法

在一些態樣中，本揭露提供一種從培養基 (例如，液體培養基) 或來自受試者的樣品 (例如，液體樣品，例如尿液樣品、血液樣品或經消化的組織樣品) 中純化生物囊泡 (BV) 的方法，該方法包含使 BV (例如，培養基中之 BV) 與表 8 或表 9 之通用囊泡結合蛋白中之一種或多種的固體表面接觸。表 8. 通用囊泡結合基因

AGER	CLEC4A	GFRA2	MAG	ROBO2
ALK	CLEC4G	GLG1	MRC1	RTN4R
AMICA1	CLSTN2	HAVCR1	MSR1	SARAF
APLP2	CLSTN3	HAVCR2	NFASC	SELL
APP	CR2	HBEGF	NLGN3	SELP
ASGR1	CSF1R	ICAM5	NRG2	SIGLEC10
BTC	DDOST	IFNLR1	NRP1	SIGLEC14
C14orf180	DPCR1	IGFBPL1	NRP2	SIGLEC15
C19orf59	EDA	IGSF3	OLR1	SIGLEC5
CD177	EPHA6	IL15RA	PLXDC2	SIGLEC6
CD22	EPHA7	IL1RL1	PRND	SIGLEC7
CD300A	EPHB1	KLRK1	PRNP	SIGLEC8
CD300E	EPHB2	KREMEN1	PSG4	SIGLEC9
CD300LB	EPHB3	KREMEN2	PSG5	SIRPA
CD300LF	FCAMR	LAG3	PTPRB	SIRPG
CD300LG	FCRL2	LDLR	PTPRD	SPRN
CD33	FGFR4	LILRA1	PTPRF	TIE1
CD6	FGFRL1	LILRA3	PTPRS	TIMD4
CD72	FIBCD1	LILRA6	PXDN	TMEM132A
CILP	FLT1	LILRB2	RARRES1	TNFRSF11B
CLEC10A	FSTL5	LILRB5	RNF13	TREML2
CLEC14A	GFRA1	LRPAP1	ROBO1	WBP1

表 9. 通用囊泡結合基因和評分列表

基因名稱	平均評分	基因名稱	平均評分
HAVCR1 MAG TIMD4 SIGLEC7 CD300LF SIRPA SIGLEC9 MRC1 SIGLEC8 CD300LG MSR1 SIGLEC10 CD22 IGSF3 SIRPG FCRL2 ROBO1 SELP CLEC10A C19orf59 SIGLEC15 TMEM132A FGFRL1 ASGR1 GFRA1 CLEC14A TREML2 FLT1 PTPRD PTPRB PRND GFRA2 NRP1 RNF13 APLP2 SARAF HBEGF EPHB2 FSTL5 CD300A	1.463141 1.120588 0.984632 0.972398 0.805923 0.76706 0.737391 0.688295 0.674243 0.669373 0.572835 0.558422 0.544031 0.533152 0.495548 0.486656 0.463355 0.458027 0.426572 0.419371 0.414953 0.413924 0.401978 0.401957 0.394782 0.383711 0.368332 0.364596 0.360015 0.353434 0.344341 0.339367 0.331184 0.32993 0.320281 0.318255 0.309675 0.299617 0.296042 0.294351	NRP2 LDLR PILRA IFNLR1 SIGLEC5 NRG2 LILRA3 EPHB1 OLR1 CD33 CD177 CD72 LILRB2 PRNP RARRES1 EPHA6 FIBCD1 AGER PTPRS ICAM5 C14orf180 NLGN3 BTC PLXDC2 EPHB3 IL15RA LAG3 LILRA1 MEGF10 ROBO2 IL1RL1 PSG4 LILRB5 SIGLEC6 LILRA6 ALK PSG5 CD2 PTPRF SORT1	0.283246 0.280714 0.266112 0.265823 0.264558 0.256761 0.251963 0.248776 0.246329 0.240488 0.240066 0.23771 0.233592 0.232195 0.231731 0.228359 0.225934 0.225417 0.221677 0.22125 0.220482 0.21094 0.202919 0.199299 0.197941 0.193258 0.193037 0.190473 0.189179 0.181367 0.177439 0.169163 0.162532 0.156384 0.153831 0.15204 0.147583 0.137838 0.118992 0.110567

例示性 BV 描述於本文章節 III(B) 中。BV 可為未修飾 BV，或可包含如本文章節 II 中所述之外源蛋白質 (例如，異源膜相關蛋白，例如全長異源膜相關蛋白或含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白)。在一些態樣中，BV 包含膜出芽劑，並由包含以下的方法產生：(i) 提供已被修飾以表現膜出芽劑的親代細胞；及 (ii) 從親代細胞中分離 BV。

固體表面可為適於親和純化的固定表面，例如，管柱 (例如，包含蛋白質 A 功能化珠粒的管柱)、珠粒、平面或平板。

固體表面可使用任何適當的方法修飾，以包含表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種。在一些態樣中，固體表面包含與表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種具有親和力的部分，且固體表面與表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種接觸 (例如，用其洗滌)，從而將表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種固定在固體表面上。表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種可經修飾以包含一部分 (例如，標籤)，且固體表面所包含的該部分的親和性可為與該部分或標籤的親和性。例如，在一個態樣中，固體表面包含蛋白質 A，且表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種已經修飾以包含 Fc 區。

在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之單一蛋白質。在一些態樣中，固體表面包含 HAVCR1、MAG、TIMD4、SIGLEC7、CD300LF、SIRPA、SIGLEC9、MRC1、SIGLEC8 或 CD300LG。在一些態樣中，固體表面包含 HAVCR1。在一些態樣中，固體表面包含 MAG。在一些態樣中，固體表面包含 SIGLEC7。在一些態樣中，固體表面包含 CD300LF。在一些態樣中，固體表面包含 HAVCR1、MAG、TIMD4、SIGLEC7、CD300LF、SIRPA、SIGLEC9、MRC1、SIGLEC8 及 CD300LG 中之 2 種、3 種、4 種、5 種、6 種、7 種、8 種、9 種或全部 10 種。

在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之蛋白質中之 2 種、3 種、4 種、5 種、6 種、7 種、8 種、9 種、10 種、11 種、12 種、13 種、14 種、15 種、16 種、17 種、18 種、19 種、20 種、21 種、22 種、23 種、24 種、25 種或超過 25 種，例如，包含表 8 或表 9 之蛋白質中之 2 至 5 種、5 至 10 種、10 至 15 種、15 至 20 種或 20 至 25 種。在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之蛋白質中之兩種。在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之蛋白質中之三種。在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之蛋白質中之四種。在一些態樣中，固體表面包含表 8 或表 9 之蛋白質中之五種。

在一些態樣中，表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種為人類蛋白質中之一種或多種。在一些態樣中，BV 源自人類細胞。

在一些態樣中，使 BV 與固體表面接觸包含使培養基或來自受試者的包含 BV 的樣品 (例如，液體樣品，例如尿液樣品、血液樣品或經消化的組織樣品) 在固體表面上流動。在一些態樣中，培養基為條件培養基。在一些態樣中，培養基或樣品包含產生 BV 的一個或多個親代細胞。在其他態樣中，培養基或樣品不包含親代細胞，例如，經加工以去除親代細胞。

在一些態樣中，該方法進一步包含將 BV 與固體表面分離 (例如，從中溶析出)。可使用任何適合將 BV 與固體表面分離的方法溶析出 BV。例如，可使用洗滌液 (例如，苛刻的洗滌液，例如高鹽含量洗滌液) 及/或適當的配體分離 EV。例如，在一些態樣中，表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種包含 SIGLEC 家族蛋白質，並將一種或多種唾液酸聚醣 (sialoglycan) 用於溶析中。

在一些態樣中，固體表面為包含蛋白質 A 功能化珠粒的管柱，且該方法包含使包含表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種的條件培養基流過管柱，其中表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種已經修飾以包含 Fc 區 (例如，人類 Fc 區)，從而固定表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種；使培養基或來自受試者的包含 BV 的樣品流過管柱；及將 BV 從管柱溶析出。

在一些態樣中，該方法包含基於超速離心的淨化步驟。在其他態樣中，該方法不包含超速離心。

在一些態樣中，該方法用於 BV 之大規模純化。在一些態樣中，該方法使用至少 10 mL 的樣品體積，亦即至少 10 mL 的培養基或來自受試者的樣品根據該方法所述進行了處理。例如，在一些態樣中，該方法使用至少 15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45 mL、50 mL、55 mL、60 mL、65 mL、70 mL、75 mL、80 mL、85 mL、90 mL、95 mL 或 100 mL 的樣品體積進行 (例如，使用 10 mL 至 20 mL、20 mL 至 30 mL、30 mL 至 40 mL、40 mL 至 50 mL、50 mL 至 60 mL、60 mL 至 70 mL、70 mL 至 80 mL、80 mL 至 90 mL 或 90 mL 至 100 mL 的樣品體積進行)。在一些態樣中，該方法使用至少 50 mL 的樣品體積進行。在一些態樣中，該方法使用至少 100 mL 的樣品體積進行。例如，在一些態樣中，該方法使用至少 150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、350 mL、400 mL、450 mL、500 mL、550 mL、600 mL、650 mL、700 mL、750 mL、800 mL、850 mL、900 mL、950 mL 或 1 L 的樣品體積進行 (例如，使用 100 mL 至 200 mL、200 mL 至 300 mL、300 mL 至 400 mL、400 mL 至 500 mL、500 mL 至 600 mL、600 mL 至 700 mL、700 mL 至 800 mL、800 mL 至 900 mL 或 900 mL 至 1 L 的樣品體積進行)。

根據這些方法純化的 BV 可用於本文所述的任何方法中。

本說明書中引用的所有專利、專利公開及參考文獻的內容藉由引用全文併入本文。 X. 實例實例 1. 用於檢測膜中之細胞外蛋白質 - 蛋白質交互作用的基於細胞外囊泡的篩檢 A. 先前技術

膜蛋白在將細胞外線索轉化為細胞內反應方面起重要作用。它們的細胞表面暴露增加了治療分子的可及性，並且它們協調細胞行為的能力使其成為有吸引力的藥物標靶。因此，不足為奇的是，雖然它們僅佔人類基因的約 30%，但佔所有藥物標靶的 60% 以上 (Santos 等人, Nat. Rev. Drug Discov., 16: 9-34, 2016)。

因此，鑑定受體-配體交互作用有助於理解發生於細胞外環境中的細胞通訊。然而，膜蛋白及其交互作用配偶體的表徵進展遠遠落後於細胞質蛋白的表徵。其部分原因在於難以表現天然構形的膜蛋白，並且缺乏具有足夠靈敏度以檢測膜蛋白常見的弱交互作用的技術 (Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017；Wright, Mol. Biosyst.5: 1405-1412, 2009)。設計用於一般蛋白質-蛋白質交互作用發現的方法需要折疊良好的純化蛋白 (例如，基於微陣列或基於平板的篩檢方法 (Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017；Wright 等人, Biochem. Soc. Trans,, 38: 919-922, 2010))，或可從膜和洗滌液中萃取蛋白質的強交互作用 (例如，親和純化-質譜 (AP/MS) (Huttlin 等人, bioRxiv, doi:10.1101/2020.01.19.905109, 2020))。雖然一些新穎的方法已經能夠藉由使用多聚化增強弱交互作用以捕獲許多膜蛋白交互作用 (Bushell 等人, Genome Res.,18: 622-630, 2008；Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019)，但它們仍然可能遺漏關鍵的交互作用，因為蛋白質已離開其天然膜情境。

生理膜包含可參與交互作用的脂質、甾醇、蛋白質與聚醣的複雜混合物 (Goñi, Biochim.Biophys. Acta - Biomembr.,1838: 1467-1476, 2014)。此外，膜可藉由聚集及定向單獨增強弱的蛋白質-蛋白質交互作用 (Banjade 等人, Elife, 3: 1-24, 2014; Taylor 等人, Cell, 169: 108-119e.20, 2017；Hu 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,110: 15283-15288, 2013)。受體-配體交互作用的這些膜依賴性態樣仍然是篩檢方法發展的主要瓶頸。基於接近性的技術的最新進展允許檢測膜中的交互作用，並有助於研究瞬時結合物 (Geri 等人, Science, 367: 1091-1097, 2020；Li et al., Cell, 180: 373-386.e15, 2020；Gingras 等人, Curr. Opin. Chem. Biol.,48: 55-54, 2019)。然而，這些技術通常難以區分直接交互作用配偶體和附近的旁觀者 (bystander)，通常重點關注同一細胞內的結合配偶體 (在順式交互作用中)，並且通常與高通量研究不相容。替代方法諸如奈米圓盤及脂質體顆粒能夠重建膜蛋白，並已成功用於研究具有挑戰性的受體 (Rouck 等人, FEBS Lett.,591: 2057-2088, 2017；De Franceschi 等人, J. Cell Sci., 132: 2019)。然而，這些方法需要蛋白質純化，該過程可能破壞天然折疊且極少考慮潛在的蛋白質或非蛋白質輔因子。因此，細胞外蛋白質串擾在現有資料集中的代表性仍然明顯不足 (Wright 等人, Biochem. Soc. Trans.,38: 919-922, 2010；Bausch-Fluck 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.,2018)。這些限制凸顯了對專門為研究膜蛋白而設計、具有足夠高的通量及靈敏度來表徵受體分子互動組的額外技術的需要。

對膜內受體顯示方法的需求刺激了若干解決方案，這些解決方案利用包膜病毒的機制將受體併入哺乳動物膜中。例如，由顯示不同膜蛋白的單純皰疹病毒顆粒 (VirD) 組成的微陣列已成功用為配體發現的 GPCR 庫 (Hu 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,110: 15283-15288, 2013；Da Syu 等人, Nat. Commun., 10: 1-12, 2019)。此外，包含 HIV gag 蛋白的細胞外囊泡，稱為重組細胞外囊泡 (rEV)，已被用於顯示用於免疫及抗體產生的多跨膜蛋白 (Tucker 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 115: E4990-E4999, 2018) 以及抗體選擇及配體結合表徵 (Willis 等人, Biochemistry, 47: 6988-6990, 2008)。這些 rEV 具有類似於天然存在的 EV 的脂質和蛋白質組成，在多種疾病的細胞通訊及發病機制中發揮作用 (Lavado-Garcia 等人, J. Proteome Res., 19: 4516-4532, 2020；Geeurickx 等人, Nat. Commun.,10: 1-12, 2019)。因此，定義 rEV 的分子互動組可提供對顯示的所關注受體的結合型態及基礎 EV 生物學的見解。

為解決這些先前方法的局限性，使用如上所述之 EV (例如 rEV) 設計出一種將蛋白質-蛋白質交互作用直接篩檢的穩健性與在膜的背景下呈現所關注標靶相結合的測定法。EV 是由細胞天然分泌的奈米級、脂雙層界定的粒子 (Colombo 等人, Annu. Rev. Cell Dev.Biol., 30: 255-289, 2014)。EV 包含使用細胞之內源機制折疊並插入其天然膜的蛋白質。本文表明，EV 提供了用於獲得適合結合的受體的免蛋白質純化的方法。為利用這些天然分泌的顆粒，開發出一種新的受體-配體平台，亦即 RDIMIS ( Receptor- Display In Membranes Interaction Screen，膜交互作用篩檢中的受體顯示) (亦稱為 EVEXIS (extracellular vesicle (EV)-based extracellular interaction screen，基於細胞外囊泡 (EV) 的細胞外交互作用篩檢))。RDIMIS 藉由針對 STM 胞外域之綜合條件培養基庫篩檢 EV 上表現的任何所關注蛋白質，允許快速、無偏鑑定單通道跨膜 (STM) 蛋白質分子互動組 (Czajkowsky 等人, EMBO Mol. Med.,4: 1015-1028, 2012；Martinez-Martin 等人, Cell, 174: 1158-1171.e19, 2018)。

RDIMIS 是一種用於闡明受體-配體交互作用的省時的方法，該方法與受體無關，因此適用於可併入 EV 中的大多數所關注標靶。分析膜蛋白的分子互動組只需一種質體來表現。EV 背景避免了耗時且不確定的蛋白質純化，同時保留了在簡化的、基於平板的系統中研究蛋白質的優勢。EV 使用內源性細胞機制將蛋白質翻譯、折疊並插入膜中；因此，表現功能蛋白的可能性是最佳的。此外，直接從條件培養基中捕獲 STM 庫蛋白消除了所有蛋白質純化步驟，實現了更高通量的研究，並再次在不影響蛋白質活性的情況下最大限度減少了消耗資源的純化步驟 (Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019)。這使得對所關注膜蛋白的分子互動組的表徵可以在約一週內完成，其主要受限於細胞產生蛋白質及 EV 所需的時間。

雖然基於 rEV 的方法能夠使用全長無標記受體分子，但使用帶有 gD-GPI 標籤的胞外域可獲得類似的結果，且無需使用規避性高親和力抗體來測量受體併入。gD-GPI 標籤跨受體家族工作，並允許直接定量比較 BLI 的表現。該標記策略亦能夠直接比較胞外域及全長蛋白的交互作用型態，快速鑑定跨膜域或胞質域可能發揮作用的交互作用。最後，gD-GPI 標籤可錨定非膜蛋白，提供一種研究細胞外基質或膜附近的分泌因子的方法。

rEV 亦包含具有細胞骨架元素的細胞質腔空間，這些細胞骨架元素可在高階複合物形成中發揮作用 (Banjade 等人, Elife, 3: 1-24, 2014；Keerthikumar 等人, J. Mol. Biol., 428: 688-692, 2016)。除捕獲細胞膜的複雜性之外，rEV 的小尺寸及穩定性 (Colombo 及 Raposo, Annu. Rev. Cell Dev.Biol.,30: 255-289, 2014) 使其成為在生理相關背景下進行高通量篩檢的非常具吸引力的載體。因此，本研究中實施的方法可與任何選擇的庫相結合，從高覆蓋率集合物到更集中的庫 (諸如受體家族或蛋白質疾病變異體)，實現對分子互動組的靈敏且資源密集性相對較低的鑑定，同時最大限度提高查詢蛋白質的質量。

在鑑定蛋白質分子互動組及使復雜或難以純化的標靶脫孤之外，RDIMIS 方法在受體、膜以及人類 EV 生物學的研究中具有廣泛的應用。RDIMIS 在 HEK 細胞源性人類 EV 群體中鑑定出一百多種囊泡特異性結合物，並表明重組和內源性 EV 的分子互動組非常相似。此結果與先前的研究一致，這些研究表明 rEV 和內源性 EV 的蛋白質組及脂質組成之間具有強相似性 (Lavado-Garcia 等人, J. Proteome Res., 19: 4516-4532, 2020；Geeurickx 等人, Nat. Commun.,10: 1-12, 2019)。因此，這些結合物可能有助於揭示內源性 EV 趨性及傳訊。結果表明，EV 與主要傳訊蛋白諸如免疫調節蛋白 (亦即 SIGLEC 家族、LILR 家族及 CD300 家族)、生長調節蛋白 (亦即生長因子受體，如 FGFR4、FLT1 及 NRP 蛋白質，以及幾種受體-酪胺酸激酶) 或神經元蛋白質 (亦即 APP 及 CLSTN 蛋白質) 交互作用，支持 EV 介導細胞間通訊的觀點。本研究為未來聚焦於疾病、組織或細胞特異性 EV 及其在細胞通訊或免疫反應中的作用的研究奠定了基礎。鑑於通量及重現性，該方法提供了一種在全球範圍內評估 EV 質量的方法。由於正在探索 EV 作為藥物遞送的途徑 (Vader 等人, Adv. Drug Deliv.Rev,106: 148-156, 2016)，因此 RDIMIS 可提供一種方法來解決與 EV 複雜性相關的變異性、免疫原性及脫靶效應的問題。由於該平台提供了一種獨特的工具來解析在分子水平上影響 EV 功能的參與者，因此它能夠檢測由標靶受體過表現、添加治療劑或細胞修飾所引起的 EV 之結合型態的意外變化。 B. 用於膜顯示的細胞外囊泡

一種發現天然膜中的受體-配體的方法需要幾個部分。首先，它必須捕獲穩定的細胞膜碎片。此目標可藉由純化 EV、由大多數細胞天然產生的含脂雙層的顆粒來實現 (圖1A-1C) (Colombo 等人, Annu. Rev. Cell Dev.Biol., 30: 255-289, 2014)。EV 併入許多膜相關大分子 (Keerthikumar 等人, J. Mol. Biol.,428: 688-692, 2016)，使其成為細胞膜環境的微型生態池 (圖 2A)。該環境經常參與膜蛋白交互作用，使 EV 成為高通量平台的非常有吸引力的基礎。

其次，高通量、靈敏的篩檢可能需要大量 EV。為最大限度地提高 EV 的產量，選擇 EXPI293F ^TM細胞，該等細胞提供了一種高效的蛋白質表現系統 (Heath 等人, Sci. Rep.,8: 1-12, 2008；Arena 等人, MAbs, 11: 977-986, 2019)。EXPI293F ^TM細胞在 EXPI293 ^TM表現培養基中培養，在 150 rpm 下振搖。所有細胞均於 37℃ 及 5% CO ₂下培養。

為進一步促進 EV 生產 (Geeurickx 等人, Nat. Commun.,10: 1-12, 2019；Cervera 等人, J. Biotechnol., 166: 152-165, 2013)，用 an HIV gag 構建體轉染細胞 (圖 2B)。Gag 表現使 20 nm 至 500 nm 囊泡的產率增加了近 4 倍 (圖 2C)。

第三，檢測 EV 需要採用穩健的定量方法。細胞將其 EV 釋放到周圍培養基中，該培養基亦包含其他分子的複雜且可變的背景。這些因素使得從下游測定中獲得可重現的定量資料變得具有挑戰性。為解決該問題，對基於密度的單步 EV 純化進行了優化。由此得到純化且一致的不含聚集體的 rEV 族群 (圖1A 及圖 1B）。最後，高通量篩檢必然縮小每次反應的規模。這為結合 EV 的穩健的定量檢測提出了挑戰。因此，將海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc) 與 HIV gag 構建體融合。由此得到在近三個數量級內與囊泡濃度成線性比例的穩健的發光訊號 (圖 2D)。

接下來，為確定 EV 是否廣泛適合用為受體顯示的平台，各種全長無標籤受體與 gag-Rluc 一起在細胞中過表現。在所有測試的情況下，使用受體特異性抗體，可輕鬆檢出 EV 中的受體 (圖 4A)。為測試更大的受體組並測量其在 EV 中的結合，需要不依賴於受體特異性抗體的檢測方法。為解決該問題，將無關受體胞外域集合物融合至醣蛋白 D (gD)-多醣磷脂肌醇 (GPI) 標籤。GPI 提供一種脂質錨定物，可維持膜中的胞外域，而 gD 抗原決定基標籤允許使用抗 gD 抗體進行胞外域檢測。當測試這些受體併入囊泡時，使用抗 gD 抗體，可輕鬆檢出 EV 中所測定的大多數受體 (圖4B、4C 和 13A)。因此，gD-GPI 標記策略可輕鬆檢測 EV 中的各種蛋白質。 C. 生成表現膜蛋白的細胞外囊泡

將 HEK293T 或 EXPI293 ^TM細胞用所關注受體或空載體對照 (如所示) 及表現融合至 Rluc (用於篩檢) 或 mNeonGreen (用於可視化) 的 HIV gag 的質體瞬時轉染。將所有經轉染之質體選殖到表現載體 pRK5 (建南德克) 中。在囊泡收穫時，藉由以 300 x g 旋轉 10 分鐘然後以 2000 x g 清除 20 分鐘 (對於表現＜ 100 mL) 或濾除 (對於表現 ≥ 100 mL) 來去除細胞。在全庫篩檢時，rEV 表現以 1 L 規模進行並生長 7 天。按規格添加 cOmplete ^TM無 EDTA 蛋白酶抑制劑混合片 (Roche)。待片劑完全溶解後，將條件培養基以 12,000 x g 離心 40 分鐘，以去除任何殘留的緻密顆粒及微囊泡。將上清液以每管約 60 mL 的體積轉移至 70 mL 聚碳酸酯超速離心管 (Beckman Coulter) 中。使用注射器和長針將 10 mL 50% 蔗糖從管底分層，形成蔗糖墊。樣品在 Ti-45 轉子中以 100,000 x g 離心 90 分鐘。囊泡漂浮在蔗糖頂部。吸取囊泡層上方的培養基。將兩管蔗糖墊與囊泡合併，並在新的超速離心管中使用 PBS 稀釋至 70 mL。樣品再次以 100,000 x g 離心，並將所得沉澱溶於 PBS 中。添加 1x 的 HALT ^TM蛋白酶抑制劑混合物 (Thermo Fisher Scientific)。所有離心皆於 4℃ 下進行。

利用 HEK293T 細胞確認囊泡中包含可檢測的過表現受體及 gag 蛋白融合。HEK293T 在補充有 10% FBS 及青黴素/鏈黴素的 DMEM + GlutaMax (Thermo Fisher Scientific) 中培養。實例 2. 鑑定 PVR 的結合配偶體 A. 使用 EV 鑑定 PVR 的結合配偶體

為確定 EV 上表現的受體是否可及且適合結合，使用受體 PVR 進行了概念驗證研究。

鑑定所關注受體之結合配偶體需要 rEV 在其表面上顯示可及且適合結合的受體。使用小兒麻痺病毒受體 (PVR) 進行概念驗證研究。PVR 是一個有用的基準，因為已知其能夠結合各種具有不同結合親和力的經充分表徵的細胞表面所表現之受體 (Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019)。為確定 rEV 上之 PVR 是否有活性，分離表現全長 PVR 的 rEV，並測試其與細胞表面上表現的許多 PVR 結合配偶體的結合。PVR-rEV 選擇性結合表現 PVR 配體的細胞，在測試條件下未轉染之細胞中的背景可忽略不計 (圖 2E)。

接下來，為確定 gD-GPI 策略是否導致適合結合的受體顯示，將 PVR 胞外域與 gD-GPI 標籤融合。使用抗小鼠 IgG Fc 捕獲生物感測器 (ForteBio)，藉由 BLI 測量 PBS 中針對 10 µg/mL 小鼠抗 gD 抗體 (Abcam) 的總蛋白質濃度為 0.1 mg/mL 的 gD-GPI 囊泡。與表現全長 PVR 的 EV 類似，PVR 胞外域-gD-GPI EV 選擇性結合表現 PVR 配體的細胞，表明帶標籤的胞外域具有結合活性 (圖 1F)。gD 標籤亦使地能夠藉由電子顯微術檢測 EV 上之 PVR 受體表現 (圖 4C)。對於一般的囊泡染色，將囊泡之懸浮液在塗有聚乙烯醇縮甲醛及碳的 TEM 網格表面上吸附 15 分鐘。用蒸餾水短暫沖洗後，將樣品用 2% 磷鎢酸 (PTA) 染色 60 秒，然後風乾。在 gD 抗原決定基檢測中，將囊泡吸附 30 分鐘，並用山羊結合物的 Aurion 封閉液封閉 30 分鐘。然後將樣品在封閉液中用小鼠抗 gD (abcam) 染色 1 小時，並使用山羊抗小鼠 12nm 金結合物進行檢測。然後將樣品用 PBS 洗滌 15 分鐘，用水洗滌 1 分鐘，然後用 1% 醋酸氧鈾鹽染色 1 分鐘，然後吸乾並風乾。使用 JEOL JEM-1400 透射電子顯微鏡 (TEM) 及 GATAN ULTRASCAN® 1000 CCD 相機以 5,000 倍至 50,000 倍的放大倍率進行成像。 B. 基於 EV 的測定與使用重組蛋白的測定之間的比較

接下來，確定了 rEV 能否緊密結合以經受高通量測定的洗滌步驟和處理延遲。為此，確定了顯示全長 PVR 或 PVR 及重組單體 PVR 的帶有 gD-GPI 標籤的胞外域 rEV 以與已知配體 CD226 的結合動力學。鑑於 rEV 的大尺寸 (圖 2G，左圖)，正如預期的那樣，使用非破壞性技術生物層干擾 (BLI)，觀察到兩種類型的 PVR rEV 皆獲得強的負 BLI 訊號。當 PVR-rEV 與作為對照的人類 IgG 共培育時未觀察到此結果，表明這是一種特異性交互作用 (圖 2G，右圖)。rEV 在 10 分鐘內幾乎沒有解離，使其適用於高通量篩檢 (圖 2G，右圖)。此外，EV 相對於 PVR 單體實現了更快的結合及更慢的解離，表明存在更高親和力的交互作用 (圖 2G，右圖)。值得注意且與細胞測定 (圖2E 及圖 2F) 一致，帶有 gD-GPI 標籤的 PVR EV 與全長 PVR EV 表現出類似的結合型態，進一步表明工程化受體適合檢測反式結合配偶體。 C. BLI 方法

使用 8 通道 OCTET® RED 系統 (ForteBio) 進行 BLI 測量。對於 PVR rEV 結合，將 CD226-Fc (R&D SYSTEMS®) 或天然人 IgG (abcam) 以 25 nM 加載到抗人類 IgG Fc 捕獲生物感測器 (ForteBio) 上。所有重組蛋白皆於 300 秒內加載。所有測量皆於 30℃ 下進行。使用 Octet® 系統資料分析軟體 (ForteBio) 進行分析。扣除 PBS 緩衝劑對照以解決儀器中的漂移 (除非顯示 PBS 曲線)。對齊到基線並執行 Savitzky-Golay 過濾。建議在 600 秒內實現大於 2 nm 的結合。 D. EV 樣品表徵方法

藉由將 1.5 µL 樣品與 148.5 µL 快速啟動 Bradford 蛋白質測定試劑 (Bio-Rad) 混合來測量 EV 樣品的總蛋白濃度。根據滴定的 BSA 曲線計算濃度。該試劑包含甲醇，可透過膜，因此未添加清潔劑。使用 NanoSight NTA (Malvern Panalytical)，藉由奈米粒子追蹤分析計算 EV 粒子數及濃度。將總蛋白濃度為 0.1mg/mL 的囊泡用 PBS 稀釋 1000 倍，並使用 488 nm 激光器重複運行 5 次，記錄 1 分鐘長的資料。使用 NTA 3.4 軟體分析曲線，該軟體提供了用於計算莫爾濃度的顆粒濃度。 E. 討論

該實例表明，研究受體的全長、天然蛋白質及帶有 gD-GPI 標籤的胞外域皆併入 EV 中，且適用於基於 EV 的結合研究。使用 gD-GPI 標記將胞外域錨定至 EV，增加了 RDIMIS 的能力。首先，它能夠比較胞外域與全長蛋白的交互作用型態。其次，當研究無關受體時，gD-GPI 標籤提供了一種比較各受體上之表現及定位的通用方法，無需使用通常不可用的受體特異性抗體。最後，gD-GPI 標籤可錨定非膜蛋白，提供一種研究細胞外基質或膜附近的分泌因子的方法。

EV 中所關注標靶之含量似乎主要取決於親代細胞中的表現水平。因此，對於低表現蛋白，可能需要優化實驗條件以實現足夠高之表現，以有效檢測結合配偶體。實例 3. RDIMIS 能夠以高通量鑑定 STM 蛋白分子互動組 A. 設計用於高通量篩檢的 EV 及胞外域庫

然後使用 RDIMIS 系統以實現受體-配體交互作用的高通量發現 (圖 3A)。

為實現無偏鑑定，使用先前開發的條件培養基庫評估表現所關注蛋白質的 EV 的結合，該庫由表現為胞外域 Fc 標籤融合物的大多數人類單通道跨膜 (STM) 蛋白組成 (Martinez-Martin 等人, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018)。為生成該庫，將細胞用編碼胞外域 Fc 標籤融合物的質體轉染，以誘導其表現帶有 Fc 標籤的胞外域並將其分泌至生長培養基中。然後將培養基轉移至蛋白質 A 塗覆的板上，該平板的每個孔皆接受不同的帶有 Fc 標籤的胞外域。由此得到適合高通量篩檢的固定胞外域的集合物 (Martinez-Martin 等人, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018)。

同時，將用於 EV 生產的細胞培養物用編碼所關注受體及 gag-海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc) 的質體瞬時轉染 (圖 3A)。使用優化的純化方案分離含受體的 EV，該方案能夠實現 EV 的快速大規模分離 (圖 1A)。分離 EV 後，將其與包含 STM 蛋白庫的平板共培育。然後徹底洗滌平板以去除未結合之 EV。為檢測含受體的 EV 與固定在孔中的 STM 蛋白質之間的交互作用，添加 Rluc 受質，從而在發生交互作用的孔中產生螢光訊號 (圖 3A)。 B. PVR EV 之 STM 分子互動組

利用 RDIMIS 平台研究 PVR-EV (經分離之攜帶 gD-GPI 帶有標籤的 PVR 胞外域的 EV) 的 STM 分子互動組。使用 BLI 及西方墨點法確認了囊泡上受體之顯示，表明 rEV 與 gD 抗體穩健結合 (圖4D 及圖 13A)。值得注意的是，RDIMIS 在兩種獨立的 rEV 及 STM 庫製備物 (相關係數為 0.90；圖 16A) 中鑑定出所有預期之 PVR 結合配偶體：CD96、CD226、KIR2DL5A、PVRL3、PVRL4 及 TIGIT (圖 3B，藍色)。這些篩檢使用兩種獨立的 PVR-EV 製劑及兩個獨立的 STM 文庫製備物進行，以控制表現或樣品製備過程中的潛在變異性。此外，重要的是，當利用 RDIMIS 研究攜帶全長、無標籤 PVR 的 rEV 時，匹配結果幾乎相同 (圖 3C)，總體相關係數為 0.88 (圖 16A)。總之，這些結果進一步表明，帶有 gD-GPI 標籤的受體在 rEV 上的表現允許檢測相關的反式配體，其結合所開發的自動化工作流程，能夠以無偏方式穩健地鑑定膜蛋白分子互動組，並增強檢測高親和力及低親和力交互作用的靈敏度。 C. B7 家族蛋白質之 STM 分子互動組

為進一步對該技術的靈敏度進行基準測試，將該平台應用於研究 B7 免疫調節家族的三個成員，其中包含主要的免疫受體，包括查核點抑制劑 PD-L1。所有三種蛋白質皆表現為 gD-GPI 胞外域融合物，允許監測其在囊泡中的表現，並直接與包含 rEV 的 PVR gD-GPI 進行比較。在所有 rEV 中，帶有標籤的胞外域以與 PVR 相當的位準結合抗 gD 抗體，如藉由 BLI (圖 4D) 或藉由西方墨點法 (圖 13A) 所測定。 a. PD-L1 EV 之 STM 分子互動組

將 RDIMIS 應用於 PD-L1/CD274。PD-L1 表現為帶有 gD-GPI 標籤的胞外域，以允許在篩檢前表徵 PD-L1 EV，如上所述。PD-L1 EV 顯示出可藉由 BLI 輕鬆檢出的與 gD 抗體之結合 (圖 4D)。當篩檢與 STM 庫的交互作用時，PD-L1 EV 以高可信度鑑定出已知 PD-L1 配體 PDCD1 (PD1)、EPHA3、CD80 (B7.1) 及 PDCD1LG2 (PDL2)。由於 PD-L1/PD-L2 交互作用的估計解離常數為約 10 µM (Lee 等人, Nat. Commun., 7: 1-9, 2016)，因此該結果進一步證明 RDIMIS 能夠鑑定具有生化挑戰性的弱交互作用。此外，鑑定出許多其他高分匹配結果 (圖 5A)。雖然在無關實驗中發現 IGF2R 具有廣泛的黏性 (Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019) 並因此被標記為非特異性交互作用子，但其他匹配結果代表 PD-L1 的新的推定結合物。 b. CD80 及 CD276 EV 的 STM 分子互動組

最後，為進一步確保 RDIMIS 的廣泛適用性，將新平台應用於兩種額外的膜表現之受體，亦即 CD80 (B7-1) 及 CD276 (B7-H3) (圖 5B)。同樣，檢測到這兩種蛋白質的所有相關配偶體，確認了該方法對細胞表面所表現之靶標的廣泛效用。獲得充分描述的結合物 CD28、CTLA4 及 PD-L1 以及最近描述的結合物 NGFR 被鑑定為免疫受體 CD80 的最高分的匹配結果。在 B7-H3/CD276 的情況下，最近才通過篩檢技術的進步脫孤 (Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019)，RDIMIS 捕獲了最近描述的交互作用子 IL20RA 以及 MXRA5 (在同一項研究中發現其為一種非特異性交互作用子) (圖 5B)。值得注意的是，在兩種情況下，已知的交互作用配偶體皆為得分最高的匹配結果，同時還鑑定出其他幾個先前未在文獻中描述的推定的受體特異性結合配偶體，證明了該方法的靈敏度。 D. 與公開資料庫的比較

接下來，為全面了解針對這四種主要免疫受體所鑑定出的交互作用情景的數量，對使用 RDIMIS 方法所鑑定出的受體特異性匹配結果與 STRING (Szklarczyk 等人, Nucleic Acids Res.,47: D607-D613, 2019)、Bioplex (Huttlin 等人, bioRxiv, doi:10.1101/2020.01.19.905109, 2020) 及 Biogrid (Oughtred 等人, Nucleic Acids Res., 47: D529-D541, 2019) 資料庫 (一些最全面的蛋白質交互作用庫) 中列出的交互作用之間的疊加 (圖 5C) 進行評估。

為進行公平的比較，僅考慮本研究中查詢的 STM 庫中存在的蛋白質之間的交互作用。對於 STRING 資料庫，僅使用指定為具有實驗證據的交互作用。為在所有篩檢中生成嚴格的匹配結果列表，在每次篩檢的 98% 分位數處繪製截止值，因為資料的分佈偏離正態分佈並具有長的上尾。在所有篩檢中，如果特定篩檢中的訊號為另一個篩檢的至少 4 倍，則稱其為受體特異性匹配結果。

如所預期的，大多數得到充分表徵的交互作用出現在至少一個資料庫中，STRING 中 12 種交互作用中的 11 種被列為具有與我們的資料集重疊的實驗證據 (圖 5C)。此外，對於研究的所有免疫受體，RDIMIS 鑑定出不存在於公開可用的資料庫中的推定交互作用 (圖 5C)。這表明當在質膜的背景下研究所關注受體時，可能有助於鑑定新的交互作用。

對於 CD80，根據 STRING 資料庫提出一種額外的結合配偶體，亦即 CD86。進一步審查文獻 (包括 STRING 資料庫中為支持該交互作用而引用的論文) 表明，這些蛋白質似乎不發生交互作用。雖然 Bioplex 及 Biogrid 確實鑑定出其他推定配偶體，但這些配偶體在很大程度上尚未經過驗證。 E. RDIMIS 篩檢方法

將囊泡用 1 x PBS + 0.49 mM MgCl ₂+ 0.9 mM CaCl ₂(PCM) + 1% BSA Fraction V (Sigma) 稀釋至最終濃度為 0.03 mg/mL 至 0.05 mg/mL (如 Bradford 所測量)。使用由自動液體處理裝置 (板分配器及洗滌機) 組成的集成機器人系統進行人類受體庫的製備，以實現蛋白質-蛋白質交互作用的高通量分析。將包含帶有 Fc 標籤的受體 ECD 的條件培養基分配至 384 孔蛋白質 A 塗覆的板 (Thermo Fisher Scientific) 中，並儲存於 4℃ 下備用。ECD-Fcs 的濃度有所變化，但平均值為 159 µg/mL。將平板用 PCM 洗滌 3 次以去除條件培養基中未結合之組分。將囊泡添加至板中，於 4℃ 下靜置過夜。將平板用 PCM 洗滌 3 次，以去除未結合之囊泡。為防止乾燥，將 25 µL PCM 添加到板中。對於用於標準化的陽性對照，在所有洗滌步驟後，將 25 µL 用於篩檢的相同囊泡儲備液添加至每個平板的第一列中。由於這些陽性對照孔未經洗滌，因此它們代表了輸入值，儘管由於自動化限制，它們相比於 100% 結合的孔經過稀釋。將 PCM 中的 25 µL 1 µM 腔腸素 h (Promega) 分配至孔中，培育 5 分鐘，然後使用 0.1 秒的發光讀取時間在 TECAN 上讀取。由於篩檢中的大多數孔未與任何囊泡結合，因此在分析中未使用額外的陰性對照孔；相反，訊號係相對於整個篩檢的強度分佈進行分析，以得到匹配結果。空孔傾向於比接收 ECD-Fc 條件培養基的孔具有更高的訊號，這些孔落入分佈的下半部分，並不代表未結合 Fc 訊號。 F. 使用膜染色對 EV 進行定量

膽固醇是 EV 脂雙層的主要組分。將 EV 用 AMPLEX ^TMRed 膽固醇測定套組 (Thermo Fisher) 標記，從而能夠檢測包含無標籤之標靶的 EV 及/或內源性 EV。使用經載體對照轉染但包含 gag-Rluc 的 rEV 或從未轉染之細胞中收穫的 EV 進行完整的 RDIMIS 篩檢 (圖 12C)。兩種 EV 物質的表現相似 (相關係數為 0.92)，表明 rEV 與同一細胞株天然產生的 EV 具有相似的結合型態。

產生並收穫 EV，如上所述。將包含 gag-Rluc 的 PD-L1 或 PVR gD-GPI EV 連續稀釋至白色 384 孔板中，並使用 Rluc 藉由添加腔腸素 h (如在 RDIMIS 中) 或使用 AMPLEX ^TMRed 膽固醇測定套組 (Thermo Fisher) 按照建議的方案測量 EV 濃度。為使用 AMPLEX ^TMRed 膽固醇測定套組測量 PD-L1 gD-GPI RDIMIS，使 EV 如正常 RDIMIS 一樣結合。然後將平板吸乾，並將 25 µL AMPLEX ^TMRed 試劑分配至各孔中。將 EV 儲備液添加至各板的第一列中，用為陽性對照。將平板於 37℃ 下培育 30 分鐘，並在 Tecan M1000 InfinitePro 上讀數，使用 560 +/- 10 nm 的激發波長並在 590 +/- 10 nm 下進行螢光檢測 (圖12A-12C)。

膽固醇酯酶以建議的量包含在內，以確保亦檢測到所有膽固醇酯。將囊泡與 Fc-ECD 蛋白質共培育 (如在 EVEXIS 篩檢中一樣)，並與 EVEXIS 一樣進行洗滌。與添加腔腸素-h 相反，將平板手動甩乾。為針對螢光素酶訊號進行滴定，進行四次 3 倍系列稀釋。添加 20 µL 0.5 µM 腔腸素 h (Promega)，培育 5 分鐘，並在 Tecan M1000 InfinitePro 上讀數。將 20 µL Amplex Red 膽固醇測定混合物 (如手冊中所規定) 添加至孔中，培育 1 小時，然後讀數。在 Tecan M1000 InfinitePro 上使用 0.1 秒的發光讀數時間讀取發光。在 TECAN 中使用 560 nm 的激發波長和 590 nm 的發射波長讀取螢光。亦測量僅含 PBS 及腔腸素 h 以及 Amplex Red 膽固醇測定混合物的空白孔，並將該值從訊號中扣除。對於 PD-L1 gD-GPI EV 結合，將孔在腔腸素 h 及 Amplex Red 膽固醇測定之間甩乾。與扣除空白孔的結果相反，使用經轉染無 Fc 標籤的物質但仍添加條件培養基的孔。 G. LRTM1 之交互作用

為進一步評估該測定的靈敏度，研究一種具有低訊號的新匹配結果 LRTM1。由於無法找到 LRTM1 的市售蛋白質，因此使用 rEV 上所表現的 LRTM1 研究交互作用。該研究表明，PD-L1 胞外域選擇性結合 rEV 上的 LRTM1，表現為帶有 gD-GPI 標籤的胞外域或全長蛋白 (圖 13B)。LRTM1 rEV 亦選擇性地結合細胞上所表現的帶有 gD-GPI 標籤的或全長 PD-L1，而非結合經載體對照轉染的細胞 (圖 13C)。由於 PD1 (PDCD1) 是 PD-L1 的已知的交互作用配偶體，並且是癌症中查核點阻斷免疫治療的標靶，因此進行實驗以確定這些交互作用是否存在競爭。濃度增加的重組 PD1-Fc 蛋白能夠以濃度依賴性方式勝出 LRTM1 囊泡結合 (圖 13D)，表明這些蛋白質與 PD-L1 上的相似區域結合。實例 4. RDIMIS 能夠鑑定通用細胞外囊泡結合物

有趣的是，所有無關篩檢皆顯示了分散在預期的結合配偶體之間的額外匹配結果 (表 8)。由於 rEV 為複雜的混合物，目前尚不清楚這些新型結合物是特定於 rEV 上所表現之受體，還是特定於囊泡本身。為解決該問題，直接比較顯示不同受體的 rEV 篩檢結果，以鑑定共同的結合物及不同的結合物。對批次匹配的篩檢結果彼此作圖 (圖5A 及圖 5B) 或針對單獨完成的經載體對照轉染而非所關注受體轉染的細胞的篩檢結果作圖 (圖14A-14F)。由此揭示出三個不同的組：PVR 特異性結合物 (藍色)，PD-L1 特異性結合物 (紅色)，以及在特定篩檢中未富集並因此無受體特異性的匹配結果的族群 (圖5A 及圖 5B，灰色陰影；表 8 及表 9)。

值得注意的是，幾個蛋白質家族富集於通用囊泡結合物列表中，包括糖結合物 (如 CLEC 及 SIGLEC) 以及傳訊受體 (如 LILR 及 Ephrin 受體)。為確定是否有任何生物途徑或功能得到過表現，對圖 5A 及圖 5B 中所示的四次 RDIMIS 篩檢中鑑定出一組通用囊泡結合物進行基因本體 (GO) 富集分析。表 10 示出表 8 的通用囊泡結合物的 GO 富集分析結果，如使用 PANTHER15.0 過表現測試 (2020-03-23 發佈) 所進行的。表 11 示出表 9 的通用囊泡結合物的 GO 富集分析結果，如使用 PANTHER16.0 版過表現測試所進行的 (Mi 等人, Nucleic Acids Res, 49: D394-D403, 2021)。顯著富集的分子功能包括碳水化合物、硫及陰離子結合，其皆與囊泡及細胞膜的一般結合一致。藉由 GO 細胞組分分析 (表 12)，該列表還富含與三級顆粒及三級顆粒膜相關的蛋白質，進一步表明這些是一般 EV 結合物。亦進行 GO 生物過程分析，但未發現顯著結果。因此，該平台能夠鑑定針對所關注的無關標靶的分子互動組上保守的囊泡特異性結合物，表明先前未知的 EV 受體。表 10. 通用囊泡結合物的 GO 富集分析

GO 分子功能	原始 P 值	FDR
碳水化合物衍生物結合	9.40E-09	1.02E-05
陰離子結合	1.82E-07	9.88E-05
唾液酸結合	3.65E-07	1.32E-04
肝素結合	2.59E-06	7.02E-04
硫化合物結合	6.37E-06	1.38E-03
碳水化合物結合	6.48E-06	1.17E-03
醣胺聚醣結合	6.14E-05	9.50E-03
羧酸結合	8.90E-05	1.20E-02
有機酸結合	8.90E-05	1.07E-02
軸突引導受體活性	1.47E-04	1.59E-02
小分子結合	2.09E-04	2.06E-02

FDR：誤發現率。表 11. 通用囊泡結合物的 GO 富集分析

GO 分子功能	原始 P 值	FDR
碳水化合物衍生物結合	1.20E-07	1.29E-04
唾液酸結合	2.10E-07	1.13E-04
肝素結合	6.57E-06	2.36E-03
硫化合物結合	1.45E-05	2.60E-03
碳水化合物結合	8.41E-06	.26E-03
醣胺聚醣結合	7.87E-09	1.06E-02
羧酸結合	8.63E-06	1.86E-03
軸突引導受體活性	3.01E-04	2.94E-02
跨膜傳訊受體活性	6.67E-05	1.03E-02
傳訊受體活性	7.89E-05	9.44E-03
分子轉導物活性	7.89E-05	8.50E-03

FDR：誤發現率。表 12. 通用囊泡結合物的 GO 細胞組分分析

GO 細胞組分	原始 P 值	FDR
三級顆粒膜	1.80E-05	1.28E-02
三級顆粒	7.25E-05	2.58E-02
胞質囊泡	2.38E-04	5.65E-02
胞內囊泡	2.46E-04	4.38E-02

雖然 GO 分析表明許多通用囊泡結合物識別常見的細胞表面修飾，但許多結合物在 rEV 中亦可具有蛋白質交互作用配偶體。為生成潛在結合物的列表，在通用囊泡結合物列表中交叉引用已發表的免疫球蛋白超家族受體 (Verschueren 等人, Cell, 182: 329-344.e19, 2020) 及交互作用的 STRING 資料庫 (Szklarczyk 等人, Nucleic Acids Res 。 ,47: D607-D613, 2019)。使用這些資料，生成潛在交互作用的網絡 (圖 15)。每個節點皆為在網絡中發現的蛋白質，根據其為通用囊泡結合物 (綠色) 還是從已發表的研究及資料庫中鑑定的結合物 (藍色) 進行顏色編碼。資料源在邊緣以顏色編碼。為了解這些蛋白質是否可能存在於囊泡中，使用來自 Cell Atlas 的資料交叉引用 HEK293 細胞 (用於生成 rEV 的 EXPI293 ^TM細胞的親代細胞株) 的表現資料 (Thul 等人, Science, 356(6340), 2017)。基於蛋白質併入 rEV 通常與其在細胞中的表現相關的發現，有理由認為高表現蛋白質更有可能負責所檢測到的結合。表現顯示為圖 15 中各蛋白質名稱周圍框的高度，框愈高則表示表現水平愈高。該網絡顯示出幾種高表現的蛋白質，這些蛋白質與通用囊泡結合物列表中的蛋白質具有已知的交互作用。

雖然發現同時進行 (PVR gD-GPI 重複 2 及 PD-L1 gD-GPI；CD276 及 CD80 gD-GPI；LRRC15 及 PVR FL) 或表現相同受體的細胞之間 (PVR gD-GPI 重複或 PVR-FL) 的篩檢具有高重現性，但是當對所有篩檢結果彼此作圖時，觀察到一些變化 (圖 16A)。特定而言，雖然一些較低的相關性係由受體特異性匹配結果驅動 (亦即 PVR gD-GPI 與 PD-L1 gD-GPI)，但相關性最差的篩檢為 CD80 gD-GPI 及 PVR FL 篩檢。有趣的是，這是由兩種可分離的通用囊泡結合物族群驅動的，其中一種似乎在篩檢之間保持一致 (圖 16B，天藍色點)，另一種在 CD80 gD-GPI 篩檢中富集 (圖 16B，金色點)。但是，這兩個族群仍然可與 CD80 gD-GPI 特異性匹配結果區分開來，因為這些匹配結果在 CD80 gD-GPI 篩檢中明顯更豐富。這一結果可藉由在 y 軸附近放大 (圖 16B) 或藉由刪除所有篩檢之間共同的通用囊泡粘合劑列表 (圖 16B) 觀察到。為確定這兩個族群之間是否存在一些差異，對該篩檢中鑑定出的兩個族群進行 GO 分子功能分析 (表 13 及表 14)。有趣的是，肝素及醣胺聚醣結合在通用囊泡結合物的第一族群中富集 (表 13)，而唾液酸結合及跨膜傳訊活性在第二族群中富集 (表 14)。表 13. 富含 CD80 gD-GPI 的通用結合物

GO 分子功能	原始 p 值	FDR
肝素結合	4.52E-08	4.87E-05
硫化合物結合	1.42E-07	7.62E-05
醣胺聚醣結合	3.78E-06	1.36E-03
碳水化合物衍生物結合	1.75E-04	4.71E-04

表 14. 富含 PVR FL 的通用結合物

GO 分子功能	原始 p 值	FDR
唾液酸結合	4.58E-07	4.93E-04
陰離子結合	3.98E-06	2.14E-03
跨膜 Ephrin 受體活性	5.21E-06	1.87E-03
碳水化合物衍生物結合	5.90E-06	1.59E-03
Ephrin 受體活性	9.69E-06	2.09E-03
羧酸結合	1.10E-05	1.98E-03
碳水化合物結合	5.29E-05	8.14E-03
跨膜受體蛋白酪胺酸激酶活性	3.64E-04	4.90E-02

為得到每一對篩檢的列表，在 90% 分位數處繪製截止值，因為資料的分佈偏離正態分佈並具有長的上尾。針對每種篩檢單獨完成此操作，且最終列表為所有篩檢之間共同的基因列表，該列表中刪除了針對特定篩檢的匹配結果。為對基因進行排序，對所有篩檢的強度取平均值，並按該平均值排序。使用 PANTHER15.0 版過表現測試 (2020-03-23 發佈) 或 PANTHER16.0 版過表現測試 (Mi 等人, Nucleic Acids Res, 49: D394-D403, 2021) 對通用囊泡結合物的列表進行基因本體分析。參考列表為 STM 庫中所有基因的列表。使用 Fisher 精準檢定分析 GO 分子功能完整、生物過程完整及細胞組分完整註釋資料集。

因此，RDIMIS 方法允許對囊泡特異性結合物進行分析，例如用於研究人類 EV 生物學。鑑定出 HEK 細胞源性人類 EV 的 100 多種結合物，提出可能介導 EV 與細胞之交互作用的推定受體，囊泡生物學的一個態樣由於缺乏最佳工具而難以理解 (Gonda 等人, Mol. Cancer Res., 17: 337-347, 2019)。結果表明，EV 與主要傳訊蛋白諸如免疫調節蛋白 (例如，SIGLEC 家族、LILR 家族及 CD300 家族)、生長調節蛋白 (例如，生長因子受體，如 FGFR4、FLT1 及 NRP 蛋白質，以及幾種受體-酪胺酸激酶) 且神經元蛋白質 (例如，APP 及 CLSTN 蛋白質) 交互作用，支持 EV 介導細胞間通訊的觀點。鑑於通量及重現性，該方法提供了一種在全球範圍內評估 EV 質量的方法。此外，該平台提供了一種獨特的工具來解析在分子水平上影響 EV 功能的參與者；因此它能夠用於檢測由標靶受體過表現、添加治療劑或細胞修飾所引起的 EV 之結合型態的意外變化。實例 5. RDIMIS 將 CD248 鑑定為孤立癌症相關受體 LRRC15 的新型交互作用配偶體

上述結果表明，RDIMIS 能夠使其他生化篩檢方法難以解決的具有挑戰性的標靶脫孤。作為一實例，利用 RDIMIS 研究癌症相關纖維母細胞 (CAF) 受體 LRRC15。LRRC15 最近作為與大腫瘤相關的 CAF 的特異性標記物出現 (Dominguez 等人, Cancer Discov.,10(2): 232-253, 2020)。儘管具有該生物學重要性，但尚未鑑定出交互作用配偶體，因此 LRRC15 生物學的基本態樣仍然不明確。首先使用先前實施的技術 (小型化 AVEXIS) 搜索 LRRC15 交互作用配偶體 (Martinez-Martin 等人, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018；Bushell 等人, Genome Res.,18: 622-630, 2008)。該技術針對上述 STM 蛋白庫篩檢五聚化 LRRC15 胞外域。儘管 AVEXIS 篩檢在用於檢測短暫交互作用方面具有高靈敏度，如先前使用該技術所顯示的，但未鑑定出 LRRC15 的結合配偶體 (圖 6A)，表明 LRRC15 可能需要更具生理相關性的設置以獲得最佳活性。為測試該假設，使用 RDIMIS 將 LRRC15 作為 gD-GPI (圖 7A) 及全長 (圖 7B) 受體-rEV 進行篩檢。值得注意的是，這兩項研究皆鑑定出 LRRC15 的類似的推定交互作用子，這些交互作用子在可用資料庫中未見描述 (圖 6B)。

將 CD248 使用 EZ-LINK ^TMSulfo NHS-LC-LC-生物素 (Thermo Fisher) 生物素化，並在具有 7K MWCO 的 Zeba 脫鹽管柱上 (Thermo Fisher) 上淨化。將 CD248 以 25 nM 的濃度加載至鏈黴親和素 (SA) 生物感測器上。提供濃度為 500 nM 的 LRRC15-Fc 蛋白質 (Genentech)。提供總蛋白濃度為 0.25 mg/mL 的 LRRC15 rEV (2.5 nM 至 3.5 nM)。

由於 CD248 在兩種篩檢中皆為得分最高的匹配結果，因此其表現在腫瘤基質中上調 (Rouleau 等人, Clin. Cancer Res., 14: 7223-7236, 2008；Rouleau 等人, Int. J. Oncol., 39: 73-89, 2011；Teicher 等人, 10: 993-100, 2019)，並且提出其促進腫瘤生長 (Maia 等人, BMC Cancer, 2: 1-12, 2011)，選擇 LRRC15-CD248 交互作用進行進一步表徵。雖然 LRRC15 及 CD248 經獨立報導在實性瘤中上調 (Rouleau 等人, Clin. Cancer Res., 14: 7223-7236, 2008；Purcell 等人, Cancer Res.,78: 4059-4072, 2018)，尚不清楚它們是否在相同的腫瘤樣品中表現。CD248 和 LRRC15 的表現之間的顯著相關性 (圖8A、圖 8B、圖 9A 及圖 9B) 在來自美國癌症基因體圖譜計畫 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 的四種不同的腫瘤適應症的大量 RNA-seq 資料中得到鑑定。這些相關性表明 CD248 及 LRRC15 發現於同一細胞類型上，或者受到共調節。為區分這兩種可能性，重新分析來自頭頸癌患者的單細胞 RNA-seq 資料，以突出 LRRC15 及 CD248 表現 (Puram 等人, Cell, 171: 1611-1624e.24, 2017)。該分析表明，LRRC15 及 CD248 在 CAF 之亞群上共表現 (共出現評分 (勝算比) = 9.44) (圖 8C)，其中 CD248 表現出更廣泛的表現，包括使用標記物諸如 DCN及 RGS5鑑定出的所有 CAF 及癌症相關外被細胞 (CAP) (圖 9C)。

總之，這些結果將 RDIMIS 定位為一種穩健的方法，能夠鑑定出不適用依賴重組蛋白表現的其他技術的受體的新型交互作用子。此外，雖然尚不清楚 LRRC15 與 CD248 之間的交互作用發生於同一細胞上還發生於細胞之間，但上述分析表明，這些蛋白質有充足的機會在患者腫瘤中交互作用，提供該交互作用可能相關的潛在的生物學背景。 A. LRRC15-CD248 交互作用需要在膜上表現 LRRC15

使用生物物理及生化方法進一步表徵 LRRC15-CD248 交互作用。首先，使用 CD248 五聚化胞外域進行微型 AVEXIS 測定。與 LRRC15 (圖 6A) 類似，當針對 STM 蛋白庫篩檢 CD248 五聚化胞外域時，未鑑定出高可信度匹配結果 (圖 10A)。與該結果一致，當藉由 BLI 或表面電漿子共振分析交互作用時，未觀察到 LRRC15 與 CD248 重組蛋白之間的結合，即使採用最大限度提高檢測靈敏度的實驗條件亦如此 (圖10B 及 11A)。當 LRRC15 及 CD248 作為重組胞外域進行測試時，BLI 分析確認缺乏可檢測的結合。相比之下，當 LRRC15 顯示在 EV 上時，易於檢測到交互作用 (圖 11A)。同樣，亦可在細胞的質膜上觀察到該交互作用。首先，結合 CD248 的 LRRC15 的 rEV 在細胞表面上的過表現 (圖 11B) 是經空載體對照轉染的細胞的十倍以上 (圖 11D)。其次，LRRC15 在細胞上表現，並與 CD248 重組蛋白共培育，該重組蛋白使用螢光標記的鏈黴親和素進行了生物素化及四聚化。對於表現 LRRC15 的細胞，易於檢測到結合，但對於表現對照蛋白的細胞則不然 (圖11B-11D)。這些測定強化了該交互作用需要膜而非特定 rEV 的觀點。

為更好地理解該交互作用的膜依賴性的根本原因，藉由使用形成膽固醇超結構的 Filipin III 破壞 rEV 膜 (圖17A-17C) 或藉由使用甲基-β-環糊精 (MβCD) 耗盡膜膽固醇 (圖17D-17F) 以改變該等 rEV 膜 (Petro 等人, Toxicon, 48: 1035-1045, 2006)。如 BLI 所示，用 100 µM Filipin III 或 15 mM MβCD 處理細胞幾乎消除了表現 LRRC15 gD-GPI 的囊泡與 CD248 單體的結合。這些試劑亦影響藉由抗 gD 抗體對 gD 抗原決定基標籤的檢測。有趣的是，雖然 100 µM Filipin III 亦顯著降低了 LRRC15 FL rEV 與 CD248 的結合，但觀察到 MβCD 的影響很小。

儘管表明 LRRC15 及 CD248 能以膜依賴性方式交互作用，但尚不清楚它們能否存在於相同的生理環境中。雖然 LRRC15 及 CD248 經獨立報導在實性瘤中上調 (Rouleau 等人, Clin. Cancer Res.14: 7223-7236, 2008；Purcell 等人, Cancer Res.,78: 4059-4072, 2018)，尚不清楚它們是否在相同的腫瘤樣品中表現。來自美國癌症基因體圖譜計畫 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 的四種不同的腫瘤適應症的大量 RNA-seq 資料表明 CD248 與 LRRC15 的表現之間存在顯著相關性 (圖8A、8B 和 9A-9C)。該相關性表明 CD248 及 LRRC15 發現於同一細胞類型上，或者 CD248 及 LRRC15 受到共調節。為幫助解答該問題，重新分析來自頭頸癌患者的單細胞 RNA-seq 資料以突出 LRRC15 及 CD248 表現 (Puram 等人, Cell, 171: 1611-1624.e24, 2017)。結果表明，LRRC15 及 CD248 在 CAF 之亞群上共表現 (共出現評分 (勝算比) = 9.44) (圖 8C)，其中 CD248 表現出更廣泛的表現，包括使用標記物諸如 DCN及 RGS5鑑定出的所有 CAF 及癌症相關外被細胞 (CAP) (圖 9C)。有幾種模型可以解釋交互作用的膜依賴性。最簡單的模型為 LRRC15 胞外域需要膜環境以正確折疊。有趣的是，由於全長及帶有 gD-GPI 標籤的胞外域皆捕獲該交互作用，導致該依賴性的決定因素可能不在跨膜域內或膜與胞外域之間的精確間距內。另一種可能的解釋是，膜的存在促進了高度聚集的受體陣列的形成，增加了超出所測試的五聚化的蛋白質親合性以穩定交互作用。這在一定程度上得到 Filipin III 和 MβCD 能破壞該交互作用的證據的支持。特定而言，Filipin III 被認為結合但不去除膜中的膽固醇等羥基甾醇 (Bolard, BBA- Rev. Biomembr., 864: 257-304, 1986)，可能降低受體聚集的能力。雖然 Filipin III 可能對膜造成普遍破壞，從而影響全長及帶有 gD-GPI 標籤的物質，但 MβCD 的影響主要針對帶有 gD-GPI 標籤的 LRRC15。這一結果與表明 GPI 錨定受體 (如葉酸受體) 依賴膜膽固醇聚集的研究一致 (Rothberg 等人, J. Cell Biol., 111: 2931-2938, 1990)。可替代地，LRRC15-CD248 交互作用可取決於促進或穩定複合物的未知因素的補充。

在免疫螢光測定中，將 HEK293T 細胞分裝到包覆以 0.1 mg/mL 聚-D-離胺酸 (Gibco) 的 96 孔 SENSOPLATES ^TM(Greiner Bio-One) 中，於 37℃ 下處理 30 分鐘。根據製造商的規格，使用 LTX 試劑 (Thermo Fisher Scientific) 轉染細胞。在螢光 rEV 實驗中，從經 gag-mNeonGreen 及所關注受體瞬時共轉染的 EXPI293F ^TM細胞中收穫 rEV。藉由以 300 x g 離心 10 分鐘並以 3,000 x g 離心 1 小時後以 100,000 x g 超速離心 90 分鐘，將其純化以去除細胞及碎片。將 rEV 再懸浮於 PBS 中，並與細胞在 4℃ 下共培育 30 分鐘。將細胞用 PBS 洗滌，並使用 4% PFA 固定 10 分鐘。使用 EZ-LINK ^TMSulfo NHS-LC-LC-生物素 (Thermo Fisher Scientific) 將 CD248 蛋白質 (R&D Systems) 生物素化，在 Zeba 7K MWCO 脫鹽管柱上淨化，並使用鏈黴親和素-APC (Agilent) 進行四聚化。將 DNA 用 10 µg/mL Hoechst 33342 (Tocris Bioscience) 染色。

總之，這些結果確認 CD248 是 LRRC15 的新型交互作用配偶體，並表明 LRRC15-CD248 交互作用在膜的背景下得到促進。這些發現突出了 RDIMIS 的優勢，為檢測涉及膜蛋白且需要使用重組蛋白的其他技術不適用的交互作用提供了更高的性能。

在鑑定蛋白質分子互動組之外，基於 rEV 的受體顯示可定量探索膜中的受體行為。例如，BLI 可用於表徵受體與其配體在膜中的結合動力學 (圖 11A)。實例 6. G 蛋白偶合受體交互作用篩檢能夠發現 PD-L1 ( 程式性細胞死亡配體 1) 的新型受體，稱為黏附 GPCR B1 (ADGRB1) A. 先前技術

G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 超家族包含人類基因體中近 20% 的細胞外蛋白，是 FDA 批准的所有藥物中超過三分之一的標靶。然而，僅有兩種通常破壞細胞外蛋白質交互作用的生物藥物靶向 GPCR。GPCR 在生物藥物開發中落後的部分原因在於 GPCR 的細胞外交互作用定位落後於人類基因體的其餘部分。因此，實施聚焦於 GPCR 的細胞外交互作用篩檢，以定位癌症免疫療法靶向受體的交互作用。觀察到 PD-L1 (程式性細胞死亡配體 1) 的一種新型受體，該受體稱為黏附 GPCR B1 (ADGRB1)。其次，將 ADGRB1 的交互作用針對人類基因體中的大多數單一跨膜受體進行定位，並觀察到與 ICOSLG (可誘導的 T 細胞共刺激配體) 的新型交互作用。這些資料證明了 GPCR 交互作用篩檢在定位新生物學及開發新的癌症治療干預途徑方面的潛力。

交互作用定位領域通常被稱為「交互組學」，其旨在理解細胞蛋白質/蛋白質交互作用。自 1989 年開發出酵母雙雜交篩檢開始 (Young, Biology of Reproduction, 58(2): 302-311, 1998)，交互作用定位已產生許多關於蛋白質交互作用網絡如何在生理條件下及在疾病中發揮作用的見解。最近，交互組學領域因背景特定的蛋白質網絡的全面定位而得到迅速增長 (Go 等人, Nature, 595: 120-124, 2021；Huttlin 等人, Cell, 184(11): 3022-3040, 2021)。定位蛋白質/蛋白質交互作用反應的主要挑戰之一是涉及嵌入細胞膜中的蛋白質。定義細胞外空間的交互作用網絡更具挑戰性，因為典型的短暫交互作用通常涉及轉譯後修飾，諸如半胱胺酸還原及醣基化 (Martinez-Martin, J. Immunol. Res, 2017: 2197615, 2017)。因此，細胞外蛋白質交互作用定位在交互組學領域已經落後，因為需要新技術推動該領域的發展。

開發細胞外交互作用技術的關鍵見解之一是認識到親和性是破譯短暫但生理相關的細胞外蛋白質交互作用的關鍵組成部分 (Gonzalez, Methods, 57(4): 448-458, 2012)。已開發出篩檢以利用親合性來定位人類基因體中大多數細胞外蛋白質的交互作用。例如，小兒麻痺病毒受體 (PVR) 與 TIGIT (T 細胞免疫球蛋白及 ITIM 域) 之交互作用的發現藉由篩檢作為帶有 Fc 標籤的二聚體的潛在蛋白質而實現 (Yu 等人, Nature Immunology, 10(1): 48-57, 2009)。微珠已用於多聚化配體並篩檢蛋白質微陣列以定位人類腺病毒之細胞外分子互動組 (Martinez-Martin 等人, Nature Communications, 7: 11473, 2016)。類似地，利用桿狀病毒作為一種將受體呈遞為多聚化探針以篩檢這些蛋白質微陣列的方法 (Tom 等人, Analytical Biochemistry, 479: 1-5, 2015)。帶有 Fc 標籤的細胞外蛋白質的大規模庫已被用於使用微珠篩檢交互作用 (Husain 等人, Mol. Cell. Proteomics, 18: 2310-2323, 2019)，且經過基因融合多聚化的配體用於基於親合性的細胞外交互交互作用篩檢 (Martinez-Martin 等人, Cell, 174(5): 1158-1171, 2018；Verschueren 等人, Cell, 182: 329-344.e19, 2020)。然而，儘管取得了這些成功，一個主要的細胞外蛋白質家族在交互組學篩檢中仍然難以處理：多跨膜受體 (MTMR)。

人類基因體編碼 5,000 多種與細胞外空間交互作用的受體及分泌蛋白。單跨膜受體涵蓋這些細胞外蛋白質中的 2,000 多種，而分泌蛋白則代表 600 多種 (Uhlén 等人, Science Signaling, 12(609), 2019)。剩餘不到 2,000 種細胞外蛋白質為 MTMR，其中 800 多種屬於 G 蛋白偶合受體 (GPCR) 超家族。GPCR 超家族具有針對其開發的成功的臨床療法的悠久歷史，FDA 批准的所有藥物的三分之一靶向這 800 種 GPCR 中之 100 多種 (Congreve 等人, Cell, 181(1): 81-91, 2020)。GPCR 超家族的其餘成員包括 400 多個嗅覺受體，儘管這些受體在嗅覺上皮中的表現大多受到限制。然而，不應將嗅覺受體排除在藥物開發的考慮之外，因為它們已被證明是生理學的重要驅動因素，並且在嗅覺受體在嗅覺上皮之外表現的組織疾病模型中失調 (Pronin 及 Slepak, The Journal of Biological Chemistry, 296: 100475, 2021)。GPCR 超家族在幾乎所有生理系統中都至關重要，並且是一個非常成功的藥物標靶，因為受體在質膜上表現，但它們的表現相對較低且僅限於特定細胞類型。

雖然質膜定位以及 GPCR 超家族的較低的受限表現使這些蛋白質成為藥物開發的理想標靶，但這些相同的特性為研究 GPCR 生物學帶來了獨特的挑戰。事實上，仍然有超過 100 個孤立 GPCR 具有未知的配體，其控制重要的生理功能 (Laschet 等人, Biochemical Pharmacology, 153: 62-74, 2018)。此外，GPCR 之交互作用定位已落後於其他細胞外蛋白質 (Dunn 等人, Pharmacological Reviews, 71(4): 503-519, 2019)。GPCR 在生物藥物開發中的代表性亦不足。雖然 GPCR 涵蓋 FDA 批准的藥物的 30% 以上，但 GPCR 超家族僅為 FDA 批准的生物藥物中之 2% 藥物的標靶 (Hutchings, Expert Opinion on Biological Therapy, 20(8); 925-935, 2020。生物開發可實現穩健的蛋白質交互作用破壞或增強、組織靶向和結合藥物遞送 (Lu 等人, Journal of Biomedical Science, 27(1): 1, 2020)。其次，可針對幾乎任何可用為抗原的別位位點開發複雜的藥效基團；這一潛力可加速新一代 GPCR 藥物類別的開發，諸如偏向促效劑或別位調節劑。因此，構建了一組聚焦於 GPCR 的工具，其允許實施交互作用定位及生物藥物表徵。

本文描述的第一種聚焦於 GPCR 的平台是一種細胞過表現系統，其利用配體多聚化來檢測細胞表面上的蛋白質/蛋白質交互作用。其次，將 GPCR 包裝到重組細胞外囊泡中 (Geeurickx 等人, Nat. Commun.,10: 1-12, 2019)，並根據最近發表的帶有 Fc 標籤的單跨膜受體細胞外域庫篩檢交互作用 (Verschueren 等人, Cell, 182: 329-344.e19, 2020)。使用這些互補的方法，可在人類基因體中的所有 GPCR 中篩檢孤立配體，並可以針對細胞外空間中的大多數蛋白質篩檢孤立 GPCR。 B. 採用完善的基於細胞的過表現交互作用篩檢，表明黏附受體 B1 (ADGRB1) 是 PD-L1 ( 程式性細胞死亡配體 1) 的新型受體

結合 DNASU 質體庫 (Seiler 等人, Nucleic Acids Research,42 (Database issue), D1253-1260)，在哺乳動物過表現載體中開發出一個全面的多跨膜受體庫，將通路供體載體中的多跨膜受體集合物選殖到 pT-Rex-DEST31 質體 (Invitrogen) 中。由此形成在細胞表面檢測到的 N 端 HIS 標籤 (圖 18A)。此外，還創建了一個聚焦於 G 蛋白偶合受體的 DNA 庫，其中包含 N 端 FLAG 標籤及 C 端 Venus。GPCR 集合物允許檢測低表現受體 (圖 18B)。總之，帶 HIS 標籤的 MTMR 集合物允許大部分無標記受體在細胞表面過表現 (圖 18C)，而 GPCR-Venus 集合物則允許檢測高於背景染色的低表現受體 (圖 18D)。

使用該綜合庫，使用高通量轉染和高容量成像篩檢出四種螢光標記的肽配體 (圖 23)。選擇 EGF 及 RSPO3，因為它們具有得到充分表徵的受體。PD-L1 及 PVR 與受體免疫球蛋白超家族的複雜網絡結合，並且是許多生物療法的標靶 (Andrews 等人, Nat Immunol, 20: 1425-1434, 2019)。EGF-647 僅結合作為轉染對照添加至各板中的對照 EGFR (圖 19A)。R-spondin 3 (RSPO3) 與 Avidity AVITAG™ (Avi tag) 融合，以允許使用 APC 標記的鏈黴親和素進行生物素化及四聚化。該四聚化 RSPO3 與其已知的 G 蛋白偶合受體 (富含白胺酸的重複序列 GPCR (LGR) 4 及 5) 結合 (圖 19B)。小兒麻痺病毒受體 (PVR) 的細胞外域被四聚化，並發現其僅與作為對照添加至篩檢中的對照單跨膜受體 CD226 結合 (圖 19C)。

當程式性細胞死亡配體 1 (PD-L1) 的細胞外域作為螢光四聚體進行篩檢時，其結合對照，亦結合黏附 GPCR B1 (ADGRB1) (圖 19D)。基於這一意外發現，開發出一種針對潛在的交互作用蛋白質家族定位 GPCR 的完整交互作用的方法。 C. ADGRB1 及富含白胺酸的 GPCR 的基於囊泡的交互作用定位

利用重組細胞外囊泡 (rEV) (Geeurickx 等人, Nat. Commun.,10: 1-12, 2019) 以便定位 G 蛋白偶合受體 (GPCR) 的交互作用。rEV 是藉由共同轉染所關注受體與來自 HIV 的 GAG 蛋白所產生的，如實例 1 中所述。GAG 刺激微囊泡及胞外體的產生 (Geeurickx 等人, Nature Protocols,16: 603-633, 2021)，其具有一致的包裝取向 (圖 20A) 及尺寸 (圖20B-20D)。GAG 共轉染增強了受體包裝到囊泡中 (圖20E 及圖 20F)，且 GPCR 有效地運輸至 rEV 中 (圖 20G)，如使用生物層干涉 (BLI) 所示。BLI 允許檢測相關曲線反轉的囊泡 (Cameron 等人, Octet® Potency Assay: Development, Qualification and Validation Strategies. Satorius Application Note, 2021)，以可靠地確定與 BLI 讀出中的 rEV 級顆粒的相關性。

將小兒麻痺病毒受體 (PVR) 及程式性細胞死亡配體 1 (PD-L1) 與螢光標記的 GAG 一起包裝到囊泡中，然後根據綜合多跨膜庫對這些 rEV 進行篩檢。與圖18A 至圖 18D 中所示的重組蛋白一樣，包裝到 rEV 中的 PVR 僅結合對照單跨膜受體 (圖 21A)，且 PD-L1 結合對照受體以及 ADGRB1 (圖 21B)。

接下來，對最近發表的 (Martinez-Martin 等人, Nature Communications, 7: 11473, 2016；Verschueren 等人, Cell, 182: 329-344.e19, 2020) 蛋白質的基於親合性的細胞外交互作用庫進行改編，以定位包裝到 rEV 中的 GPCR 的交互作用。簡言之，該庫包含哺乳動物表現載體中帶有 Fc 標籤的蛋白質的大量集合物，這些蛋白質帶有訊號序列以用於分泌到培養基中。轉染後，將條件培養基在蛋白質 A 包覆的白色平板上培育，從而從培養基中捕獲蛋白質，如上所述。對於該篩檢，各 GPCR 皆與 Rluc8 融合 (Loening 等人, Protein Engineering, Design & Selection, 19(9): 391-400, 2006)，以便快速、靈敏地檢測受體-配體交互作用。使用螢光素酶所產生的光檢測包裝到與蛋白質庫成員結合的 rEV 中的 GPCR。

針對融合至 Fc 的單跨膜受體細胞外域的集合物 (STM 庫) 篩檢 ADGRB1 (圖 21C)。確認了 ADGRB1 與 RTN4R 家族成員 (Chong 等人, Genome Biology, 19(1): 205, 2018) 以及 PD-L1 之間的交互作用。還發現了許多新型交互作用，包括 ICOSLG (一種與 PD-L1 相關的蛋白質) (表 15；Greenwald 等人, Annual Review of Immunology, 23: 515-548, 2005)。圖26A 至圖 26F 示出包含 ADGRB1、LGR4 或 LGR5 的 EV 與 STM 庫或融合至 Fc 的分泌蛋白庫結合的篩檢結果。在這些篩檢中鑑定出的新型交互作用如表 15 所示。表 15. 在篩檢中鑑定出的交互作用

ADGRB1	PD-L1
ICOSLG
DNER
CNTN6
LGR4	CLPS
EDIL3
IZUMO4
IZUMO1
BTNL3
CD93
CEACAM16
IL-6
LRRC4C
SCARF1
TRIL
LGR5	CLPS
EDIL3
IZUMO4
CD93
GPR125
IL6R
SCARF1
TRIL

D. 重組蛋白確認了發現的 ADGRB1 結合物

利用重組蛋白確認一些交互作用 (圖 22A)。將過表現融合至 Venus 的 ADGRB1 的細胞 (圖 22B) 用融合至 Fc 標籤的重組 PD-L1、ICOSLG 或 RTN4R 處理，並藉由染色 Fc 標籤觀察到穩健的結合。對於 ADGRB2 或 ADGRB3，未觀察到該結合 (圖24A-24C)。 E. 討論

G 蛋白偶合受體 (GPCR) 交互作用定位是一個強大但尚未開發的研究領域。在該實例中，修改兩種交互作用定位平台以適應 GPCR (圖 23)。第一種平台為基於細胞的平台，可用於發現孤立配體的新型受體。此處利用該基於細胞的平台發現一種先前不被重視的 PD-L1 受體，稱為黏附 GPCR B1 (ADGRB1)。其次，使用重組細胞外囊泡 (rEV) 中的 GPCR 實施基於親和性的交互作用篩檢，如上所述。通過這種方式，可根據潛在交互配偶體庫篩檢所關注 GPCR。使用該基於囊泡的平台，表明 ADGRB1 與 ICOSLG 結合。

ADGRB1 屬於包含 33 種黏附 GPCR 的家族，其共享顯著較長的 N 端。黏附 GPCR 被認為在高爾基體中自動水解該長細胞外域，但在質膜上保持複合在一起。配體結合後，大的細胞外域與七個跨膜域分離，剩餘的短柄活化七個跨膜域，其方式與蛋白酶活化的受體家族的方式相似 (Nijmeijer 等人, Biochemical Pharmacology, 114: 88-102, 2016)。黏附 GPCR 已被證明可活化 G 蛋白並補充抑制蛋白 (Kishore 等人, The Journal of Biological Chemistry, 291(7): 3385-3394)。ADGRB1 的大細胞外域與脂多醣及磷脂醯絲胺酸結合，據信受體活化驅動細菌細胞及凋亡細胞的吞噬 (Park 等人, Nature, 450(7168): 430-434, 2007；Das 等人, The FASEB Journal, 28(5): 2214-2224)。ADGRB1 在巨噬細胞上的表現先前得到證明 (Park 等人, Nature, 450(7168): 430-434, 2007)；然而，該觀察結果最近受到挑戰 (Hsiao 等人, Frontiers in Immunology, 10: 962, 2019)。ADGRB1 亦為一種已知的腫瘤抑制基因，在癌細胞中下調 (Zhu 等人, Cancer Cell, 33(6): 1004-1016e15, 2018)。

有趣的是，觀察到 ADGRB1 與 T 細胞活化的兩種經典配體 (PD-L1 及 ICOSLG) 結合。然而，已知這些配體對 T 細胞活化具有相反的作用，其中 PD-L1 抑制 T 細胞，而 ICOSLG 則活化這些細胞 (Greenwald 等人, Annual Review of Immunology, 23: 515-548, 2005)。腫瘤逃避 T 細胞的方式之一是藉由過表現 PD-L1，其驅動 T 細胞沉默，從而使腫瘤逃避免疫系統。事實上，PD-1/PD-L1 已成為生物藥物的標靶，以解除 T 細胞沉默，並且是一種被證明臨床有效的癌症免疫療法 (Lee 等人, Scientific Reports, 7(1): 5532, 2017)。ADGRB1 與 PD-L1 及 ICOSLG 的交互作用可以為藥物開發提供一條新的途徑，因為 PD-1/PD-L1 阻斷可能無效 (Lee 等人, Frontiers in Pharmacology, 12: 681320, 2021)。

一個懸而未決的問題是 ADGRB1 與 PD-L1 和 ICOSLG 的交互作用對傳訊的影響。難以在異源細胞株中開發基於 ADGRB1 的傳訊模型 (圖25A-25D)。最近，研究表明另一個黏附 GPCR 家族成員活化 G _αi以響應於 N 端結合，並且亦經過膽固醇處理，其直接與七個跨膜域結合 (Ping 等人, Nature, 589(7843), 620-626, 2021)。先前的研究已經表明，ADGRB1 在 HEK 細胞中未經截切 (Araç 等人, The EMBO Journal, 31(6): 1364-1378, 2012)，且通過稱為 ELMO 的非典型效應子的 ADGRB1 訊號亦如此 (Park 等人, Nature, 450(7168): 430-434, 2007)。ADGRB1 的活化可能僅在相關細胞株中或 活體內才有可能。

GPCR 是許多藥物開發項目的關鍵標靶。許多針對 GPCR 的小分子藥劑已成功進入臨床階段。然而，生物製劑等新藥形態在 GPCR 藥物開發領域落後於小分子。新形態，尤其是基於抗體的生物製劑，提供了一種穩健的方法靶向細胞外蛋白質交互作用並調節受體活化。本文開發出定位 GPCR 細胞外交互作用的方法，並發現了對癌症免疫療法有影響的新型交互作用。 F. 材料與方法 細胞培養基

將 HEK 293T 及 COS7 細胞維持在 DMEM + 10% FBS、10 mM HEPES pH 7.4 及青黴素-鏈黴素 (100 U/mL) 中。EXPI293F ^TM細胞在 EXPI293 ^TM表現培養基中培養，在 150 RPM 下振搖。 多跨膜受體庫產生

將受體選殖到 pT-Rex-DEST31 質體 (Invitrogen) 或 pRK 質體 (Genentech) 中，並對序列進行驗證。將 100 ng 受體 DNA (10 ng/µL，目標體積 10 µL/孔) 舖盤到 384 孔黑色 Aurora 微孔板 (型錄號碼 ABC2-312-1B-PDL) 的每個孔中。將 DNA 打印的 Aurora 板密封並儲存於 -20℃ 下，直至實驗當天。

在轉染當天，將 DNA 打印的 Aurora 板在室溫下解凍並旋轉沉降。將 20 µL Opti-MEM ^TM(Thermo Fisher，型錄號碼 11058021) 用 LIPOFECTAMINE ^TMLTX 按 1:0.0072 稀釋並用 PLUS ^TM試劑 (Thermo Fisher，型錄號碼 15338100) 按 1:0.0024 稀釋，將其添加至 384 孔板的每個孔中，並於 37℃ 及 5% CO ₂下培育 20 分鐘。然後，將 20 μL COS7 細胞 (在 DMEM + 10% FBS、HEPES 和 P/S 中稀釋為 150,000 個細胞/mL) 添加至各個孔中，並於 37℃ 及 5% CO ₂中培育 48 小時。 受體表現分析

48 小時後，藉由受體螢光驗證其表現。將細胞在 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 中於 37℃ 及 5% CO ₂下飢餓培養 45 分鐘。接下來，將兔抗 HIS 抗體 (Cell Signaling，型錄號碼 2365) 或小鼠抗 FLAG 抗體 (Sigma，型錄號碼 F3165) 用 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 按 1:1000 稀釋，並將細胞於 4℃ 下培育 45 分鐘。然後將細胞用 PBS + Ca/Mg 洗滌，並於室溫下在 4% PFA 中固定 20 分鐘，在 PBS + Ca/Mg 中再次洗滌，然後於室溫下用兔或小鼠 Alexa-647 二級抗體 (經 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 按 1:1000 稀釋) 進行染色。然後洗滌細胞，然後於室溫下用 1 μg/mL DAPI 染色 (Thermo Fisher，型錄號碼 62248) 20 分鐘，再次洗滌，並於 4℃ 下儲存在 PBS + Ca/Mg 中，直至成像當天。

藉由在配備 DAPI、GFP 及 Cy5 的預設過濾器的 IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare) 上使用 10 倍物鏡捕捉兩個像場來評估受體的表現。利用 IN Cell Analyzer 6000 Development 軟體繪製 DAPI、GFP 及 Cy5 通道的所關注區域，併計算對象總數以及整個像場內的像素密度。總體表現以 GFP 通道除以細胞總數 (DAPI 計數) 來表示。表面表現以抗體通道 (Cy5) 除以細胞總數來表示。 基於細胞的交互作用篩檢

與受體表現分析類似，在 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 中轉染後 48 小時，將細胞封閉。代替一級抗體，將細胞用稀釋於 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 中的 100 nM 四聚化配體於 4℃ 下處理 45 分鐘。四聚體的製備如先前所述 (Verschueren 等人, Cell, 182(2): 329-344.e19, 2020)，經微小修改。簡言之，計算鏈黴親和素-APC (Agilent, PJ27S) 及所關注生物素化蛋白質 (RSPO3 和 PVR 在內部產生，PD-L1 購自 Bio-Techne，型錄號碼 AVI156) 的總質量。分裝所需蛋白質的總體積，並分四步添加一定體積的鏈黴親和素，其間於室溫下培育 10 分鐘。經最終添加及培育後，將四聚體用 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 稀釋至最終濃度為 100 nM。對於 EGF-647，螢光蛋白購自 Thermo Fisher (型錄號碼 E35351)，並用 Opti-MEM ^TM+ 5% BSA 稀釋至 100 nM。然後將細胞用 PBS + Ca/Mg 洗滌，並於室溫下在 4% PFA 中固定 20 分鐘，再次洗滌，然後用 DAPI (Thermo Fisher，型錄號碼 62248) 染色，並於 4℃ 下儲存在 PBS + Ca/Mg 中，直至成像當天。

對於基於囊泡的交互作用篩檢，添加囊泡代替四聚化配體，並且 GAG 與 Neon Green 融合。

如上所述進行成像，以實施受體表現分析。 重組細胞外囊泡製備

將 100 mL EXPI293F ^TM細胞用 100 µg DNA 轉染，分為 50 µg GAG DNA 及 50 µg 受體。轉染後 7 天，將細胞旋轉沉降並經 0.2 微米過濾器過濾培養基。將蛋白酶抑制劑 (Roche) 添加至過濾後之培養基中，以 2,000 x g 的慢速離心 30 分鐘。接下來，將培養基以 100,000 x g 離心 90 分鐘。將囊泡於 PBS + Ca/Mg 中再組，並儲存至實驗當天。 電子顯微術

如本文所述，執行電子顯微鏡檢查。將囊泡之懸浮液在塗有聚乙烯醇縮甲醛及碳的 TEM 網格表面上吸附 15 分鐘。用蒸餾水短暫沖洗後，將該樣品用 EV 製劑淨化所用的 2% 磷鎢酸 (PTA) 染色 60 秒，然後風乾。然後將樣品用 PBS 洗滌 15 分鐘，用水洗滌 1 分鐘，然後用 1% 醋酸氧鈾鹽染色 1 分鐘，然後吸乾並風乾。使用 JEOL JEM-1400 透射電子顯微鏡 (TEM) 及 GATAN ULTRASCAN® 1000 CCD 相機以 5000 倍至 50000 倍的放大倍率進行成像。比例尺顯示在影像中。 NanoSight

將囊泡用乾淨的 PBS 稀釋，採集 NanoSight (Malvern Panalytical) 資料，並使用乾淨的 PBS 作為基線，對三次運行結果取平均值。 生物層干涉

將囊泡用 PBS 稀釋，並將 gD 抗體 (abcam，型錄號碼 ab6507) 及 FLAG 抗體 (Sigma，型錄號碼 F3165) 用 PBS 按 1:10 稀釋；將 TIGIT-Fc (Bio-techne 型錄號碼 7898-TGB) 稀釋至 100 µg/mL。分別使用 AMC 尖端 (Sartorius，型錄號碼 18-5088) 或 AHC 尖端 (型錄號碼 18-5060) 捕獲抗體或 Fc 標籤。 基於囊泡的交互作用篩檢

如上所述，進行基於囊泡的交互作用篩檢。對於對照蛋白質及後續實驗，將重組蛋白及抗體添加至白色 384 孔蛋白質 A 包覆的平板 (Thermo Fisher，型錄號碼 NCI15133) 的空孔中，並於 4℃ 下孵育至少 24 小時。 配體結合

對於配體結合，使用與交互作用篩檢相同的方案，不同之處在於所關注受體使用磷酸鈣轉染在 HEK 細胞中瞬時過表現，然後舖盤到 Aurora 成像板上。代替四聚化配體，將 Fc 融合蛋白 (BIO-TECHNE®，PD-L1 型錄號碼 AVI156，ICOSLG 型錄號碼 AVI165，及 RTN4R 型錄號碼 1208-NG) 以 10 µg/mL (每種二聚體約 70 nM) 的濃度在細胞上培育。然後使用融合至 Alexa-647 的抗人類 Fc 作為二級抗體，並在 IN Cell Analyzer 6000 上捕捉影像。實例 7. 在不同細胞株中使用基於 rEV 的 RDIMIS 進行細胞狀態分析

上述實例表明，rEV 可用於鑑定和表徵與所關注受體的交互作用。此外，鑑定出許多通常與 rEV 交互作用的結合配偶體 (參見例如實例 4)。這些交互作用可捕捉 rEV 的源細胞 (親代細胞) 狀態的快照，因為所關注受體及許多其他膜和細胞質蛋白似乎以與其在親代細胞中的表現水平成正比的含量併入 rEV。

因此，假設 rEV 可捕獲細胞表面蛋白 (例如，可在給定時間點捕獲細胞表面蛋白的代表性樣品)，因此 RDIMIS 可用於分析與具有不同細胞狀態的細胞相關的交互作用。具體而言，rEV 可用為與 rEV 親代細胞發生細胞交互作用的替代物，並可捕獲由於例如疾病特異性刺激、分化及細胞類型差異所引起的重要交互作用。該方法的一個優點是它不僅捕獲細胞表面蛋白質的聚集體結合行為 (包括複合物及復雜的交互作用動力學)，亦可捕獲依賴於非蛋白質組分 (如醣基化標記物及脂質) 的交互作用。方法

產生以下細胞株的表現囊泡出芽因子及 RDIMIS 讀出 (例如，接附於 RDIMIS 讀出的囊泡出芽因子，例如 gag-海腎 (Renilla) 螢光素酶 (gag-RLuc)) 的穩定細胞株，該細胞株包括但不限於：代表 T 細胞 (JURKAT)、B 細胞 (BJAB) 及單核球 (THP1) 的免疫細胞株；神經元細胞株；及纖維母細胞株。rEV 由這些細胞株產生，如實例 1 中所述。

細胞株及由此產生的 rEV 用於： 1.表徵來自代表不同細胞類型的不同細胞株的 rEV 的交互作用型態差異；及 2.表徵隨時間推移來自同一細胞株的 rEV 的交互作用型態 (例如，在添加刺激物前後、在誘導傳訊前後及/或誘導疾病相關狀態 (例如，免疫衰竭) 前後的時間點，以及分化途徑或型態中的兩個或更多時間點). 在一種方法中，在選擇的時間點 (例如在施加刺激後) 收集 rEV。在另一種方法中，修飾細胞株，使得出芽因子僅在選定的時間段內存在 (例如，表現)。可使用以下方法控制出芽因子的表現： (a) 在添加小分子 (例如，細胞滲透性小分子) 後減輕或抑制出芽因子表現的可誘導啟動子，例如 T-REX ^TM系統； (b) 小分子誘導的降解系統，其中蛋白質 (例如，出芽因子) 在誘導後迅速降解 (例如，TIR1 生長素可誘導的降解決定子 (AID) 系統)；或 (c) 小分子誘導的穩定係統，其中蛋白質 (例如，出芽因子) 包含降解域，且蛋白質在誘導時被保護以免於降解 (例如，Shield-1 – FKBP 系統)。

可進行構建體的整合，例如，藉由使用 CRISPR-Cas9 或基因體工程技術將構建體插入安全港基因座。可替代地，可使用隨機整合的方法，諸如 PiggyBac 轉位子系統 (SBI)。實例 8. 使用 EV 測量膜蛋白相關的酶活性

上述實例表明，EV 可用於在膜背景下顯示膜蛋白及膜相關蛋白。包括具有酶活性的蛋白質，諸如肽酶、蛋白酶及磷酸酶。可檢測並測定 EV 上的該等蛋白質的活性，從而允許使用通常設計用於重組蛋白的測定對膜內或膜上膜蛋白的酶促效應進行生化表徵。

在一種方法中，利用包含具有酶活性的蛋白質的 rEV 對膜蛋白進行酶催化測定。在另一種方法中，利用包含具有酶活性的蛋白質的 rEV 進行例如分子膠的藥物發現，其中肽酶、蛋白酶、磷酸酶及激酶可補充至同一 EV 上的另一種膜蛋白，或抑制特定的膜結合酶活性。 肽酶活性測定

作為概念驗證，測試能否在囊泡上檢測並測定羧肽酶 M (CPM) 的肽酶活性。全長(FL) 或 gD-GPI (gD) CPM 在囊泡中表現。

肽酶活性的測定方法如下。該測定改自製造商提供的使用重組人類羧肽酶 M 蛋白 (R&D SYSTEMS®) 的方案。 1. 稀釋 EV。添加 200 µL 測定緩衝劑，並添加下列更多試劑。 2. 將受質 Bz-Ala-Arg-OH (50 mM 儲備液) 用測定緩衝劑稀釋至 1 mM (126 µL，稀釋於 6300 µL 測定緩衝劑中)。 3. 將 150 μL EV 與 150 μL 1 mM 受質混合。製備僅含 150 μL 1 mM 受質的對照。 4. 反應於室溫下培育 10 分鐘。 5. 藉由添加 300 μL 15 mM o-PA 於含 0.1% (v/v) 2‑巰基乙醇的 0.2 M NaOH 中的溶液並混勻，以停止反應。(1260 µL 2M NaOH + 12.6 µL Bme + 507 µL o-PA + 10.8 mL 水) 6. 停止反應後，將 150 μL EV 添加至對照中。 7. 所有樣品皆於室溫下培育 10 分鐘。 8. 將 195 µL 經培育之樣品以三重複方式加載到板中。 9. 亦將剩餘 EV 溶液添加至板中，以確認不存在受質背景。 10. 在終點模式下，分別在 330 nm 及 450 nm (頂部讀數) 的激發及發射波長下讀取樣品。

測定結果如圖 27 所示。在表現 CPM 的 EV 上檢測到穩健的肽酶活性 (圖 27)。該活性顯著高於在未過表現 CPM 的 EV 中所觀察到的活性 (pRK EV；表現出背景水平的肽酶活性的載體對照)。與使用重組蛋白觀察到的肽酶活性相比，更易於檢測到該活性。 激酶活性測定

亦證明可在囊泡上檢測到激酶活性的跡象：如圖 28 所示，EPHA3 EV 與 EPHA3 配體 EFNA1-Fc 及 EFNA5-Fc 的共表現增強了在囊泡中檢測到的 EPHA3 磷酸化物質的量。將 EV 裂解並添加至樣品緩衝劑中，並在丙烯醯胺梯度凝膠上運行以分離蛋白質。然後用 EPHA3、磷特異性物質、微管蛋白抗體及一級抗體對它們進行印漬，並用螢光標記的二級抗體 (680 nm 及 800 nm LI-COR® 染料) 或抗人類抗體進行檢測，以檢測表現的各種蛋白質上的 Fc 區。然後在 LI-COR® 儀器上對印漬成像。將相同的樣品分別加載至 2 種不同的凝膠上，其分別對應於頂部及底部的影像。實例 9. 使用通用 EV 結合物進行囊泡純化

迄今為止，EV 純化的金標準是超速離心，這是一種耗時且繁瑣的方法。雖然有一些基於親和力的方法可用於純化特定 EV，但它們過髒、針對特定受體，或者設計適用的規模過小，無法用於 RDIMIS 篩檢及其他需要大量 EV 的應用。

如實例 4 所述，亦鑑定出通用囊泡結合物。這些通用囊泡結合物可用於直接從條件培養基中親和純化 EV。通用囊泡結合物已根據與本文所述的純重組 EV 結合的能力進行了排序 (表 9)，並且它們通常可用於純化人類 EV。在一種方法中，在管柱上重現上述實例中所述的結合條件。在一種方法中，管柱包含蛋白質 A 功能化珠粒 (例如，為蛋白質 A SEPHAROSE® 管柱)。使包含一種或多種經修飾以包含 Fc 區 (例如人類 Fc 區) 的排名居前的通用 EV 結合物 (表 9) 的條件培養基流過管柱，洗滌管柱，然後使包含 EV 的條件培養基流過管柱。然後使用適當的方法溶析 EV，例如苛刻的洗滌液 (如高鹽) 及/或特定配體 (如用於 SIGLEC 蛋白質家族的唾液酸聚醣)。必要時，可進行基於超速離心的快速淨化。

圖 1A為從細胞培養物中分離表現受體的細胞外囊泡 (EV) 的示意圖。以編碼所關注受體的質體及編碼與海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc) 融合的 HIV gag 蛋白的質體瞬時轉染 EXPI293F ^TM細胞。藉由離心及過濾將細胞及碎片與包含 EV 的上清液分離。使用 50% 蔗糖墊去除小蛋白質聚集體，並分離出小囊泡。圖 1B為一組負染色電子顯微照片，示出使用 (右圖) 及不使用 (左圖) 蔗糖墊步驟製備的 EV。在電子顯微術分析前，將 EV 製劑稀釋至相同的蛋白質濃度。箭頭指向樣品中的代表性 EV。圖 1C為一對圖，示出攜帶全長 (FL) PVR 蛋白 (左圖) 或包含 PVR 胞外域、醣蛋白 D (gD) 標籤及多醣磷脂肌醇 (GPI) 連接子 (gD-GPI) 的蛋白質 (右圖) 的粒徑分佈 (以 nm 為單位)，如使用奈米粒子追蹤分析所測量。每幅圖中示出五個重複品的結果。黑線代表平均值；灰線代表平均值的標準誤差。EV 的大小始終為約 120 nm。圖 2A為示出嵌入細胞質膜及 EV 膜中的跨膜蛋白的圖。圖 2B為示出 EV 表現的受體的兩種實驗設置的圖。左圖：嵌入細胞質膜及 EV 膜中的 HIV gag 蛋白及全長跨膜受體。右圖：HIV gag 蛋白及脂質錨定的胞外域，包含嵌入細胞質膜及 EV 膜中的 gD-GPI 標籤。圖 2C為示出用 HIV gag 蛋白 (包含 Gag) 轉化的親代細胞及未轉化的對照細胞 (無 Gag) 所產生的 20 nm 至 500 nm 大小範圍內的 EV 的粒子數的圖，如使用奈米粒子追蹤分析所測量。圖 2D為示出在 EV 製劑的 3 倍稀釋系列中 Rluc 的發光訊號圖，該 EV 製劑由親代細胞產生，該等細胞經編碼與 Rluc 融合的 HIV gag 蛋白的質體轉化。圖 2E為示出表現全長 PVR 的 EV 與表現 PVR 配體的哺乳動物細胞表面結合的示意圖，及一組示出與表現指定全長 PVR 配體的細胞表面結合的 EV 的顯微照片。EV 包含 gag-NeonGreen，綠色代表來自 EV 的直接螢光。哺乳動物細胞的 DNA 以藍色顯示。圖 2F為示出表現 PVR 胞外域 (帶有 gD-GPI 標籤) 的 EV 與表現 PVR 配體的哺乳動物細胞表面結合的示意圖，及一組示出與表現指定全長 PVR 配體的細胞表面結合的 EV 的顯微照片。EV 包含 gag-NeonGreen，綠色代表來自 EV 的直接螢光。哺乳動物細胞的 DNA 以藍色顯示。比例尺為 20 µm。圖 2G為示出生物層干涉 (BLI) 實驗的設計和結果的示意圖及圖片。CD226-Fc 或對照人類 IgG 接附於感測器。將感測器浸入包含表現全長 (FL) PVR 或 gD-GPI PVR 胞外域或單體 PVR 蛋白 (PVR 單體) 的 EV 的溶液中，並測量 BLI 訊號 (以 nm 為單位)。右圖為高於 0 nm 的訊號的放大圖。圖 3A為示出 RDIMIS ( Receptor- Display In Membranes Interaction Screen，膜交互作用篩檢中之受體顯示) 方案的示意圖。從表現所關注受體以及 gag-luc 的細胞的條件培養基中分離出 EV。表現為帶有 Fc 標籤的胞外域 (ECD-Fc) 單通道跨膜 (STM) 蛋白庫固定在平板上。使用半自動化工作流程，針對平板結合的 STM 蛋白集合物篩檢受體-EV。使用發光檢測與庫中交互胞外域結合的 EV。圖 3B為散佈圖，示出測試 PVR gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的兩次獨立 RDIMIS 篩檢 (重複 1 及重複 2) 的結果。圖 3C為散佈圖，示出針對 PVR gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試 (圖 3B 的重複 2) 及針對全長(FL) PVR EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試的結果。圖 4A為一組顯微照片，示出表現全長無標記受體 PD1、PD-L1、EPHA3、CD248、LRRC15、PVR 或 PVRL1 並用受體特異性抗體染色的全細胞溶胞產物 (細胞) 或 EV 的西方墨點法分析結果。提供抗微管蛋白 (α-Tub) 及抗肌動蛋白 (α-肌動蛋白) 染色作為對照。圖 4B為一組顯微照片，示出表現指定的帶有 gD-GPI 標籤的受體胞外域並用 gD 標籤 (α-gD) 特異性抗體染色的全細胞溶胞產物或 EV 的西方墨點法分析結果。提供抗微管蛋白 (α-Tub) 及抗肌動蛋白 (α-肌動蛋白) 染色作為對照。圖 4C為一組負染色電子顯微照片，示出表現 gD-GPI 的囊泡的選擇性抗 gD 免疫金標記。圖 4D為示出生物層干涉實驗的設計和結果的圖。抗 gD 抗體接附於感測器。將感測器與表現指定 gD-GPI 胞外域的 EV 共培育，並測量 BLI 訊號 (以 nm 為單位)。圖 5A為散佈圖，示出針對 PVR gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試及針對 PD-L1 gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試的結果。將篩檢結果彼此繪製，以區分篩檢結果之間針對特定受體的匹配結果 (靠近任一坐標軸) 與共同的通用囊泡結合子。標記各單獨篩檢中訊號高於 98% 分位數且特定篩檢中富集至少 4 倍的匹配結果。將其他匹配結果鑑定為篩檢之間共同的通用囊泡結合物。圖 5B為散佈圖，示出針對 CD80 gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試及針對 CD276 gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試的結果。受體特異性匹配結果位於坐標軸附近。標記各單獨篩檢中訊號高於 98% 分位數且特定篩檢中富集至少 4 倍的匹配結果。將其他匹配結果鑑定為篩檢之間共同的通用囊泡結合物。圖 5C為一組圖，示出本研究中針對 PVR、PD-L1、CD80 和 CD276 鑑定出的結合配偶體與 STRING、Bioplex 和 Biogrid 資料庫中列出的交互作用之間的重疊結果。對於 PD-L1/CD274，Bioplex 資料庫中不存在與 STM 庫成員的交互作用。未經實驗驗證的交互作用列於 CD276/B7-H3 的 STRING 中。圖 6A為散佈圖，示出 LRRC15 胞外域五聚體與 STM 蛋白庫之間交互作用的 AVEXIS 篩檢測試結果。在包含 CD248 胞外域的孔 (突出顯示) 中未觀察到高於背景的 LRRC15 五聚體結合。灰色點指示各板上的陽性對照孔，其中添加有五聚體儲備液但未滌除。圖 6B為一組圖，示出本文中使用 EV 中的 LRRC15 全長 (FL) 或 gD-GPI 胞外域所鑑定的匹配結果與 Bioplex 和 Biogrid 資料庫中呈現的那些結果之間的比較。STRING 資料庫中未顯示 LRRC15 與文庫中的 STM 蛋白之間存在有實驗證據的交互作用。圖 7A為散佈圖，示出 LRRC15 gD-GPI EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試結果。對這些結果與圖 3C 所示的 PVR 篩檢結果進行比較。標記各單獨篩檢中訊號高於 98% 分位數且特定篩檢中富集至少 4 倍的匹配結果。將其他匹配結果鑑定為篩檢之間共同的通用囊泡結合物。圖 7B為散佈圖，示出 LRRC15 全長 EV 與 STM 蛋白庫之間交互作用的 RDIMIS 篩檢測試結果。對這些結果與圖 3C 所示的 PVR 篩檢結果進行比較。標記各單獨篩檢中訊號高於 98% 分位數且特定篩檢中富集至少 4 倍的匹配結果。將其他匹配結果鑑定為篩檢之間共同的通用囊泡結合物。圖 8A為散佈圖，示出頭頸部鱗狀細胞癌的 LRRC15 (x 軸) 及 CD248 (y 軸) 的本體 RNA-seq 表現水平 (每百萬轉錄 (TPM))。各點表示單一患者樣品。右上方提供了史皮爾曼等級相關係數及顯著性值。圖 8B為散佈圖，示出浸潤性乳癌的 LRRC15 (x 軸) 及 CD248 (y 軸) 的本體 RNA-seq 表現水平 (每百萬轉錄 (TPM))。各點表示單一患者樣品。右上方提供了史皮爾曼等級相關係數及顯著性值。圖 8C是一對統一流形逼近與投影 (UMAP) 降維圖，示出來自頭頸癌患者的單細胞 RNA-seq 資料的非腫瘤細胞。細胞陰影為指定標記基因的表現水平 (左圖：LRRC15；右圖：CD248)。圖 9A為散佈圖，示出胰管腺癌的 LRRC15 (x 軸) 及 CD248 (y 軸) 的本體 RNA-seq 表現水平 (每百萬轉錄 (TPM)) (美國癌症基因體圖譜計畫 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 資料)。圖 9B為散佈圖，示出泌尿道上皮膀胱癌的 LRRC15 (x 軸) 及 CD248 (y 軸) 的本體 RNA-seq 表現水平 (每百萬轉錄 (TPM)) (美國癌症基因體圖譜計畫 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 資料)。圖 9C為一對 UMAP 降維圖，示出來自頭頸癌患者的單細胞 RNA-seq 資料的非腫瘤細胞。細胞陰影為指定標記基因的表現水平 (左圖： DCN癌症相關纖維母細胞；右圖： RGS5癌症相關外被細胞標記)。圖 10A為散佈圖，示出 CD248 胞外域五聚體與 STM 蛋白庫之間交互作用的 AVEXIS 篩檢測試結果。在包含 LRRC15 胞外域的孔 (突出顯示) 中未觀察到高於背景的 CD248 五聚體結合。灰色點指示各板上的陽性對照孔，其中添加有五聚體儲備液但未滌除。圖 10B為 SPR 晶片上 LRRC15-Fc 被蛋白質 A 捕獲並添加指定分析物後的表面電漿子共振 (SPR) 測定結果的圖。LRRC15 以 5 µg/mL (紅色線及綠色線) 或 50 µg/mL 的濃度加載。分析物以 400 nM 的濃度加載。圖 11A為示出 BLI 實驗的設計和結果的示意圖及圖片。CD248 以重組蛋白表示並固定在感測器上。使感測器與包含 LRRC15-Fc (500 nM) 的溶液或包含 LRRC15 全長或 gD-GPI LRRC15 (0.25 mg/ml) 的 EV 接觸，並測量 BLI 訊號 (nm)。圖 11B為示意圖及一組顯微照片，示出包含 gag-NeonGreen 及全長 (FL) LRRC15、gD-GPI LRRC15 (LRRC15-gD) 的 EV 或空載體對照與瞬時表現全長 CD248 或 gD-GPI CD248 的細胞的結合。圖 11C為示意圖及一組顯微照片，示出 CD248 (作為四聚化重組胞外域) 或空載體對照與瞬時表現全長 LRRC15 或 gD-GPI LRRC15 的細胞的結合。比例尺代表 20 µm。圖 11D為條形圖，示出圖 11B 中基於 NeonGreen 訊號位準的 EV 結合的定量結果 (三個獨立重複品的平均值 ± 標準誤差)。圖 12A為散佈圖，示出使用 AMPLEX ^TMRed 膽固醇測定套組 (Thermo Fisher) (膽固醇) 檢測的海腎 (Renilla) 螢光素酶螢光及膽固醇螢光的比較，結果顯示為從經 gag-Rluc 轉染的 EXPI293F ^TM細胞或未轉染之細胞收穫的 PD-L1 及 PVR gD-GPI EV 的稀釋系列的讀出。圖 12B為條形圖，示出在小規模 RDIMIS 篩檢中觀察到的海腎 (Rilla) 螢光素酶及 AMPLEX ^TMRed 膽固醇測定套組 (Thermo Fisher) 的相對訊號位準，其中列出的基因固定在孔中並使用 PD-L1 gD-GPI EV 探查。兩個讀出的結果皆標準化至相應的 PDCD1 訊號。圖 12C為散佈圖，示出使用膽固醇進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果，這些結果顯示為表現 gag-Rluc 的 EV (x 軸) 或從未轉染之細胞收穫的囊泡 (y 軸) 的讀出。圖 13A為一組顯微照片，示出表現受體 PVR、PD-L1、CD276、CD80 和 LRRC15 的全長 (FL) 或帶有 gD-GPI 標籤的胞外域並經 gD 標籤 (α-gD) 特異性抗體染色的 EV 的西方墨點法分析結果。還示出 α-肌動蛋白、α-PVR 及 α-LRRC15 染色。圖 13B為示出 BLI 實驗的設計和結果的示意圖及圖片。將生物素化 PD-L1 與鏈黴親和素 BLI 生物感測器共培育。然後將其與表現全長或 gD-GPI LRTM1 的 EV 或載體對照共培育，並測量 BLI 訊號 (以 nm 為單位)。圖 13C為一組顯微照片，示出結合至瞬時表現全長或帶有 gD-GPI 標籤的 PD-L1 的細胞表面的 EV。EV 包含全長或 gD-GPI LRTM1 或載體對照。EV 包含 gag-NeonGreen，綠色代表來自 EV 的直接螢光。哺乳動物細胞的 DNA 以藍色顯示。圖 13D為示出 BLI 實驗的設計和結果的示意圖及圖片。將生物素化 PD-L1 與鏈黴親和素 BLI 生物感測器共培育。然後在存在或不存在不同濃度之帶有 Fc 標籤的PD1 胞外域或人類 IgG 對照的情況下，將其與表現全長或 gD-GPI LRTM1 的 EV 或載體共培育，並測量 BLI 訊號 (以 nm 為單位)。圖 14A為散佈圖，示出使用包含 PVR gD-GPI 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 14B為散佈圖，示出使用包含 PD-L1 gD-GPI 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 14C為散佈圖，示出使用包含 CD80 gD-GPI 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 14D為散佈圖，示出使用包含 CD276 gD-GPI 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 14E為散佈圖，示出使用包含 LRRC15 gD-GPI 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 14F為散佈圖，示出使用包含全長 LRRC15 的 EV (Y 軸) 與源自經載體對照轉染的細胞的「空」EV (X 軸) 進行 RDIMIS 篩檢所得到的結果。圖 15為網絡圖，示出本文鑑定的通用囊泡結合物 (綠色框) 與 IgSF 分子互動組的高置信交互作用列表 (1) (藍色邊緣) 及來自 STRING 的交互作用的實驗和資料庫列表 (2) (紅色邊緣) 的整合，用於鑑定潛在的交互作用配偶體 (藍框)。框的高度代表來自 The Cell Atlas 的 HEK293 細胞中的標準化表現值 (3)，其用於估計 EV 親代細胞及 EV 本身中潛在結合配偶體的表現。圖 16A為一組散佈圖，示出執行的每次 RDIMIS 篩檢的相關性及相關係數。篩檢分幾批完成：1) PVR gD-GPI 重複 1，2) PVR gD-GPI 重複 2 及 PD-L1 gD-GPI，3) CD80 gD-GPI 及 CD26 gD-GPI，4) LRRC15 gD-GPI、LRRC15 FL 及 PVR FL，5) 囊泡控制 (無過表現的所關注受體的 EV)。圖 16B為一組散佈圖，示出 CD80 gD-GPI 與 PVR-FL 篩檢之間的相關性。示出通用囊泡結合物的兩個族群。下圖：x 軸的放大視圖。右圖：去除通用囊泡結合物後的相關性。圖 17A為示出用膽固醇結合物 Filipin III 破壞膜的 BLI 實驗的結果圖。將 CD248 單體加載到 NiNTA 生物感測器上，並與室溫下經 Filipin III 預處理 30 分鐘後的 LRRC15 gD-GPI EV 共培育。空囊泡或 Filipin III 顯示為陰性對照。圖 17B為示出用膽固醇結合物 Filipin III 破壞膜的 BLI 實驗的結果圖。將 CD248 單體加載到 NiNTA 生物感測器上，並與室溫下經 Filipin III 預處理 30 分鐘後的全長 LRRC15 EV 共培育。空囊泡或 Filipin III 顯示為陰性對照。圖 17C為示出圖 17A 的 EV 與抗 gD 抗體的結合的圖。圖 17D為示出用甲基-β-環糊精 (MβCD) 破壞膜的 BLI 實驗的結果圖。將 CD248 單體加載到 NiNTA 生物感測器上，並與室溫下經 Filipin III 預處理 30 分鐘後的 LRRC15 gD-GPI EV 共培育。空囊泡或 Filipin III 顯示為陰性對照。圖 17E為示出用 MβCD 破壞膜的 BLI 實驗的結果圖。將 CD248 單體加載到 NiNTA 生物感測器上，並與室溫下經 Filipin III 預處理 30 分鐘後的全長 LRRC15 EV 共培育。空囊泡或 Filipin III 顯示為陰性對照。圖 17F為示出圖 17D 的 EV 與抗 gD 抗體的結合的圖。圖 18A為示出在細胞上表現的＞500 個多跨膜受體的抗體表面染色水平 (a.u.) 的散佈圖，以及示出低表現受體 (DRD2) 及高表現受體 (S1PR1) 的代表性細胞表面染色的一對顯微照片。背景染色用線表示。圖 18B為散佈圖，示出使用抗 FLAG 抗體的表面染色水平 (a.u.) 及經 N 端 FLAG 標籤及 C 端 Venus 改造之＞400 G 蛋白偶合受體 (GPCR) 的 Venus 標籤的螢光 (X 軸；總受體 (a.u.))。插圖為顯微照片，示出低表現受體 (DRD2)、高表現受體 (S1PR1) 及極高表現之單跨膜受體 (EGFR) 的代表性細胞表面染色 (品紅) 及 Venus 螢光 (綠色)。背景染色藉由未轉染之細胞的訊號平均值確定，並由線表示。圖 18C為示出多跨膜 (MTMR) 受體庫的 1791 個成員的特徵的圓形圖。僅＞500 個成員具有細胞外 HIS 標籤，且僅有大約一半的受體表現出高於背景的染色。圖 18D為圖 18B 中具有低、中、高 FLAG 染色表現水平的 GPCR 比例的圓形圖。「中」受體表現被定義為背景訊號的十倍。圖 19A為示出 EGF-647 與多跨膜受體庫成員結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。EGF-647 僅與 EGFR 結合，將其印在各板上作為轉染對照。插圖為示出螢光配體的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 19B為示出 RSPO3 與多跨膜受體庫成員結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。RSPO3 與 LGR4 及 LGR5 結合。成像假影用 X 表示。插圖為示出螢光配體的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 19C為示出 PVR 與多跨膜受體庫成員結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。PVR 結合 CD226 (作為陽性對照添加的單通道跨膜受體)。插圖為示出螢光配體的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 19D為示出 PD-L1 與多跨膜受體庫成員結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。PD-L1 結合 PVR (黏附 G 蛋白偶合受體 B1 (ADGRB1)) 以及單通道跨膜受體 PD1、PDL2、CD80 及 EPHA3 (其作為陽性對照添加)。插圖為示出螢光配體的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 20A為包含帶標籤的多程跨膜受體的細胞外囊泡 (EV) 的示意圖。受體的胞外區在 EV 之外，胞內區在 EV 的內腔內。示出 FLAG 標籤及螢光標籤 (Luc) 的位置。圖 20B為示出 EV 的負染色電子顯微影像。圖 20C為示出來自經 PVR 及 GAG 轉染、僅經 PVR 轉染或未經轉染 (對照) 的細胞的 EV 的粒徑分佈 (以 nm 為單位) 及濃度 (10 ⁶個粒子/mL) 的圖，如使用 NanoSight 粒子追蹤所測量。圖 20D為示出圖 20C 的 EV 的平均大小 (nm)。圖 20E為示出評估抗 gD 抗體與源自經 PVR 及 GAG 轉染或僅經 PVR 轉染的細胞的 EV 或源自未轉染之細胞的 EV 的結合的 BLI 實驗的結果圖。圖 20F為示出評估 PVR 配體 TIGIT (TIGIT Fc) 與源自經 PVR 及 GAG 轉染或僅經 PVR 轉染的細胞的 EV 或源自未轉染之細胞的 EV 的結合的 BLI 實驗的結果圖。圖 20G為示出評估抗 FLAG 抗體與包含 G 蛋白偶合受體 (GPCR) ADGRB1、LGR4 及 LGR5 的 EV 的結合的 BLI 實驗的結果圖。GPCR 包含 N 端 FLAG 標籤。圖 21A為示出包含 PVR 的 EV 與多跨膜受體庫的成員和陽性對照的結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。PVR 結合陽性對照。成像假影用 X 表示。插圖為示出來自 GAG-neonGreen 融合的囊泡螢光的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 21B為示出包含 PD-L1 的 EV 與多跨膜受體庫的成員和陽性對照的結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。PVR 結合陽性對照及 ADGRB1。成像假影用 X 表示。插圖為示出來自 GAG-neonGreen 融合的囊泡螢光的顯微照片。示出 DAPI 染色。圖 21C為示出 ADGRB1 與包含 Fc 融合單跨膜受體 (STMR) 的細胞外域庫成員結合 (a.u.) 的篩檢結果的散佈圖。確認了與 RTN4R 及 PD-L1 之交互作用，並揭示了新的交互作用。圖 22A為示出重組蛋白 PD-L1-Fc、ICOSLG-Fc 及 RTN4R-Fc (皆與蛋白質 A 板結合) 與包含 ADGRB1 或 LGR4 的 EV 之結合的定量結果的條形圖。圖 22B為一組顯微照片，示出重組蛋白 PD-L1-Fc、ICOSLG-Fc 及 RTN4R-Fc 與表現融合至 Venus 的 ADGRB1 的 HEK 細胞之結合的測定結果。在合併影像中，DAPI 以藍色顯示；來自 ADGRB1 融合蛋白的 Venus 訊號以綠色顯示，Fc 標籤染色的訊號以品紅色顯示。共定位之綠色及品紅訊號以白色顯示。圖 23為 GPCR 篩檢平台設計的示意圖。綜合庫以 384 孔板形式採集。過表現質體之綜合集合物被印在 384 孔成像板上。將細胞反向轉染，然後用螢光配體處理並在高通量、高容量成像儀上進行分析。圖 24A為一組顯微照片，示出重組蛋白 PD-L1-Fc 與表現融合至 Venus 的 ADGRB1 的 HEK 細胞之結合的測定結果。在合併影像中，DAPI 以藍色顯示；來自 ADGRB1 融合蛋白的 Venus 訊號以綠色顯示，Fc 標籤染色的訊號以品紅色顯示。共定位之綠色及品紅訊號以白色顯示。所有對比度及亮度設置均與圖 22B 匹配。圖 24B為一組顯微照片，示出重組蛋白 ICOSLG-Fc 與表現融合至 Venus 的 ADGRB1 的 HEK 細胞之結合的測定結果。在合併影像中，DAPI 以藍色顯示；來自 ADGRB1 融合蛋白的 Venus 訊號以綠色顯示，Fc 標籤染色的訊號以品紅色顯示。共定位之綠色及品紅訊號以白色顯示。所有對比度及亮度設置均與圖 22B 匹配。圖 24C為一組顯微照片，示出重組蛋白 RTN4R-Fc 與表現融合至 Venus 的 ADGRB1 的 HEK 細胞之結合的測定結果。在合併影像中，DAPI 以藍色顯示；來自 ADGRB1 融合蛋白的 Venus 訊號以綠色顯示，Fc 標籤染色的訊號以品紅色顯示。共定位之綠色及品紅訊號以白色顯示。所有對比度及亮度設置均與圖 22B 匹配。圖 25A為示出 HEK 細胞中 β-抑制蛋白及 SH2 補充的生物發光能量轉移 (BRET) 測定結果的圖。未觀察到 ADGRB1 或 EphA3 活化對 PD-L1 的反應。圖 25B為示出處理 HEK 細胞後鈣感應 (GCaMP6s 螢光) 的圖。未觀察到 ADGRB1 或 EphA3 之下游對 PD-L1 的反應。圖 25C是示出處理 HEK 細胞後 cAMP 刺激 (藉由 GLOSENSOR ^TM評估) 的圖。未觀察到反應。圖 25D是示出處理 HEK 細胞後 cAMP 抑制的圖。未觀察到反應。圖 26A為示出包含 ADGRB1 的 EV 與分泌蛋白 Fc 庫成員之結合的篩檢結果的散佈圖。標記陽性對照 (抗 FLAG 抗體)。圖 26B為示出包含 ADGRB1 的 EV 與包含融合至 Fc 的單跨膜受體的細胞外域的庫成員 (STM 庫) 之結合的篩檢結果的散佈圖。確認了與 RTN4R 及 PD-L1 之結合，並鑑定出新的交互作用。標記新穎匹配結果。圖 26C為示出包含 LGR4 的 EV 與分泌蛋白 Fc 庫成員之結合的篩檢結果的散佈圖。標記陽性對照 (抗 FLAG 抗體)。圖 26D為示出包含 LGR4 的 EV 與 STM 庫成員之結合的篩檢結果的散佈圖。標記陽性對照 (RSPO3)。新穎的匹配結果以綠色顯示。圖 26E為示出包含 LGR5 的 EV 與分泌蛋白 Fc 庫成員之結合的篩檢結果的散佈圖。標記陽性對照 (抗 FLAG 抗體)。新穎的匹配結果以綠色顯示。圖 26F為示出包含 LGR5 的 EV 與 STM 庫成員之結合的篩檢結果的散佈圖。標記陽性對照 (抗 FLAG 抗體)。新穎的匹配結果以綠色顯示。共享的 LGR4 和 LGR5 匹配結果以藍色顯示。圖 27為示出羧肽酶 M (CPM) 活性測定結果的條形圖。CPM-FL：囊泡包含全長 CPM。CPMgD：囊泡包含 gD-GPI (gD) CPM。pRK EV：載體對照；僅 PBS：緩衝劑對照。圖 28為示出一對西方墨點法分析結果的一對顯微照片，顯示了在包含全長 EPHA3 (EPHA3-FL) 及 PDL1-Fc、EPHA3-Fc、EPHA3 配體 (EFNA1-Fc 及 EFNA5-Fc) 及全長 PDL1 的 EV 中檢測到的總 EPHA3 及磷酸化 EPHA3 物質 (pEPHA2/3/4 及 pEPHA3/4/5) 的水平。pRK EV：載體對照。

<![CDATA[<110>  美商建南德克公司 (GENENTECH, INC.)]]>
          <![CDATA[<120>  顯示細胞表面蛋白質的生物囊泡及其相關方法 ]]>
          <![CDATA[<130>  50474-231TW4]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/227,039]]>
          <![CDATA[<151>  2021-07-29]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/212,021]]>
          <![CDATA[<151>  2021-06-17]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/120,167]]>
          <![CDATA[<151>  2020-12-01]]>
          <![CDATA[<160>  1     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 第 3.5 版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  500]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類免疫缺乏病毒]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 
                      20                  25                  30          
          His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 
              50                  55                  60                  
          Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 
                      100                 105                 110         
          Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His 
              130                 135                 140                 
          Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 
                      180                 185                 190         
          Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 
                  195                 200                 205             
          Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys 
                      260                 265                 270         
          Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly 
                  275                 280                 285             
          Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 
              290                 295                 300                 
          Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala 
                          325                 330                 335     
          Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser 
                  355                 360                 365             
          Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg 
              370                 375                 380                 
          Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys 
                          405                 410                 415     
          Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 
                  435                 440                 445             
          Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg 
              450                 455                 460                 
          Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp 
                          485                 490                 495     
          Pro Ser Ser Gln 
                      500

Claims

一種鑑定蛋白質-蛋白質交互作用之方法，該方法包含： (a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物； (b) 將步驟 (a) 的該集合物與包含異源膜相關蛋白和膜出芽劑之生物囊泡 (BV) 在允許該異源膜相關蛋白與該標靶多肽中之至少一個標靶多肽結合的條件下接觸，其中該異源膜相關蛋白被以閾值水平或高於該閾值水平表現於該 BV 之表面上；且 (c) 檢測該異源膜相關蛋白與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定蛋白質-蛋白質交互作用。
如請求項 1 之方法，其中該標靶多肽中之一個或多個被固定至該一個或多個固體表面上的不同位置。
如請求項 1 或 2 之方法，其中檢測交互作用包含檢測該固體表面上的位置處的高於閾值水平的訊號。
如請求項 1 之方法，其中該膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該膜出芽劑進一步包含可檢測標記，且檢測交互作用包含檢測該固體表面上的位置處的高於閾值水平的該可檢測標記的水平。
如請求項 5 之方法，其中該可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶。
如請求項 6 之方法，其中該酶為海腎 (Renilla) 螢光素酶 (Rluc)，且該受質為 Rluc 受質。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該 BV 包含膜標記，且檢測交互作用包含檢測該固體表面上的位置處的高於閾值水平的該膜標記的水平。
如請求項 8 之方法，其中該膜標記為膽固醇標記。
如請求項 9 之方法，其中該膽固醇標記為 AMPLEX ^TMRed。
如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中該交互作用為短暫交互作用。
如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中該交互作用為低親和力交互作用。
如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該異源膜相關蛋白為全長蛋白。
如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物。
如請求項 14 之方法，其中該錨定物將該蛋白質片段栓繫至 BV 之膜的表面。
如請求項 14 或 15 之方法，其中該錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。
如請求項 14 至 16 中任一項之方法，其中該標籤可直接或間接地可視化。
如請求項 17 之方法，其中該標籤包含可使用抗體或抗體片段檢測的部分。
如請求項 17 或 18 之方法，其中該標籤為醣蛋白 D (gD) 多肽。
如請求項 14 至 19 中任一項之方法，其中該異源膜相關蛋白的該表現水平係使用生物層干涉 (BLI) 測定來確定。
如請求項 20 之方法，其中該標籤為 gD 多肽，使用抗 gD 抗體檢測該異源膜相關蛋白的表現，且如在 30℃ 使用該 BLI 測定所測量，該閾值水平為 1.5 nm 的偏移。
如請求項 17 之方法，其中該標籤包含螢光蛋白。
如請求項 1 至 22 中任一項之方法，其中該異源膜相關蛋白為跨膜受體或其片段。
如請求項 23 之方法，其中該受體為單通道跨膜 (STM) 受體。
如請求項 14 至 24 中任一項之方法，其中該蛋白質片段為細胞外域。
如請求項 1 至 25 中任一項之方法，其中該標靶多肽之集合物的每個成員是帶有 Fc 標籤的細胞外域，且其中該固體表面被蛋白質 A 包覆。
如請求項 26 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 25% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 27 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 50% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 28 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 75% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 29 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 90% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 30 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之所有蛋白質的該細胞外域。
一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中該異源膜相關蛋白存在於該 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑。
一種 BV，其包含 (a) 含有蛋白質片段、標籤及錨定物之異源膜相關蛋白，其中該異源膜相關蛋白存在於該 BV 的外面，及 (b) 膜出芽劑，該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾以表現該異源膜相關蛋白及該膜出芽劑的親代細胞，及 (ii) 從該親代細胞中分離該 BV。
如請求項 32 或 33 之 BV，其中該膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。
如請求項 32 至 34 中任一項之 BV，其中該錨定物將該蛋白質片段栓繫至 BV 之脂質膜的表面。
如請求項 32 至 35 中任一項之 BV，其中該錨定物為 GPI 多肽。
如請求項 32 至 36 中任一項之 BV，其中該標籤可直接或間接地可視化。
如請求項 37 之 BV，其中該標籤包含可使用抗體或抗體片段檢測的部分。
如請求項 37 或 38 之 BV，其中該標籤為 gD 多肽。
如請求項 37 之 BV，其中該標籤包含螢光蛋白。
如請求項 32 至 40 中任一項之 BV，其中該蛋白質片段為跨膜受體之細胞外域。
如請求項 41 之 BV，其中該跨膜受體為 STM 受體。
如請求項 32 至 42 中任一項之 BV，其中當與針對該標籤的抗體接觸時，如使用 BLI 測定所測量，該 BV 產生等於或高於閾值水平的偏移。
如請求項 43 之 BV，其中該標籤為 gD 多肽，該抗體為抗 gD 抗體，且如在 30℃ 使用 BLI 測定所測量，閾值水平為 1.5 nm 的偏移。
如請求項 32 至 44 中任一項之 BV，其中該膜出芽劑包含可檢測標記。
如請求項 45 之 BV，其中該可檢測標記為在受質存在下產生螢光訊號的酶。
如請求項 46 之 BV，其中該酶為 Rluc 且該受質為 Rluc 受質。
如請求項 32 至 47 中任一項之 BV，其中該 BV 包含膜標記。
如請求項 48 之 BV，其中該膜標記為膽固醇標記。
如請求項 49 之 BV，其中該膽固醇標記為 AMPLEX ^TMRed。
如請求項 32 至 50 中任一項之 BV，其中該 BV 係藉由哺乳動物親代細胞產生。
如請求項 51 之 BV，其中該 BV 為細胞外囊泡 (EV)。
如請求項 51 之 BV，其中該 BV 為胞外體或微囊泡。
如請求項 51 之 BV，其中該 BV 為病毒樣顆粒 (VLP)。
如請求項 33 至 54 中任一項之 BV，其中該親代細胞已用編碼該異源膜相關蛋白的質體及編碼該膜出芽劑的質體轉染。
一種鑑定表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 1 之蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質接觸，其中表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質的結合，其中相對於不存在該候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質之間交互作用的調節劑。
一種鑑定表 1 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 1 之該蛋白質與表 2 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質接觸，其中表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 1 之該蛋白質的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 1 之該蛋白質的下游活性之調節劑。
一種鑑定表 2 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 2 之該蛋白質與表 1 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 2 之該蛋白質與表 1 之該蛋白質接觸，其中表 1 之該蛋白質與表 2 之該蛋白質的交互作用被報導於表 3 中；及 (c) 測量表 2 之該蛋白質的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 2 之該蛋白質的下游活性之調節劑。
如請求項 56 之方法，其中如藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定、BLI 測定或酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。
如請求項 57 或 58 之方法，其中該調節劑為表 1 或表 2 之該蛋白質的下游活性之抑制劑。
如請求項 57 或 58 之方法，其中該調節劑為表 1 或表 2 之該蛋白質的下游活性之活化劑。
如請求項 57 或 58 之方法，其中該下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的減少。
如請求項 57 或 58 之方法，其中該下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的增加。
如請求項 56 至 63 中任一項之方法，其中該調節劑為小分子、抗體或其抗原結合片段、肽、模擬物、反義寡核苷酸或小干擾 RNA (siRNA)。
如請求項 64 之方法，其中該抗原結合片段為雙-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域。
如請求項 64 或 65 之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合表 1 之該蛋白質。
如請求項 64 或 65 之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合表 2 之該蛋白質。
如請求項 56 至 67 中任一項之方法，其中表 1 之該蛋白質為 LRRC15。
如請求項 68 之方法，其中表 2 之該蛋白質為 TEM1。
如請求項 68 或 69 之方法，其中該下游活性為腫瘤生長。
如請求項 70 之方法，其中腫瘤生長在該調節劑的存在下減少。
如請求項 71 之方法，其中如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。
如請求項 68 至 72 中任一項之方法，其中該調節劑為靶向 LRRC15 的抗體或其抗原結合片段。
如請求項 68 至 72 中任一項之方法，其中該調節劑為靶向 TEM1 的抗體或其抗原結合片段。
一種鑑定 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 與 TEM1 的結合，其中相對於不存在該候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 LRRC15 與 TEM1 之間交互作用的調節劑。
一種鑑定 LRRC15 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 LRRC15 與 TEM1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 LRRC15 與 TEM1 接觸；及 (c) 測量 LRRC15 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 LRRC15 的下游活性之調節劑。
一種鑑定 TEM1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 TEM1 與 LRRC15 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 TEM1 與 LRRC15 接觸；及 (c) 測量 TEM1 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 TEM1 的下游活性之調節劑。
如請求項 75 之方法，其中如藉由 SPR 測定、BLI 測定或 ELISA 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。
如請求項 76 或 77 之方法，其中該下游活性為腫瘤生長。
如請求項 79 之方法，其中腫瘤生長在該調節劑的存在下減少。
如請求項 80 之方法，其中如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。
一種鑑定具有改變的結合型態的生物囊泡 (BV) 之方法，該方法包含： (a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物； (b) 使步驟 (a) 的該集合物與所關注 BV 接觸； (c) 檢測該所關注 BV 與至少一個標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定交互作用型態；及 (d) 將該所關注 BV 的該交互作用型態與對照 BV 的交互作用型態進行比較，其中依該所關注 BV 的該交互作用型態與該對照 BV 的該交互作用型態之間的差異鑑定該所關注 BV 為具有改變的結合型態的 BV。
如請求項 82 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 25% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 83 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 50% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 84 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 75% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 85 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 90% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 86 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之所有蛋白質的該細胞外域。
如請求項 82 至 87 中任一項之方法，其中該所關注 BV 為工程化 BV。
如請求項 82 至 87 中任一項之方法，其中該所關注 BV 源自來自受試者之樣品。
如請求項 89 之方法，其中該所關注 BV 及該對照 BV 源自不同組織或不同細胞類型。
如請求項 89 之方法，其中該所關注 BV 源自患病組織且該對照 BV 源自健康組織。
一種鑑定表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 5 之蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質接觸，其中表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質的結合，其中相對於不存在該候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質之間交互作用的調節劑。
一種鑑定表 5 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 5 之該蛋白質與表 6 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質接觸，其中表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 5 之該蛋白質的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 5 之該蛋白質的下游活性之調節劑。
一種鑑定表 6 之蛋白質的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許表 6 之該蛋白質與表 5 之蛋白質結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使表 6 之該蛋白質與表 5 之該蛋白質接觸，其中表 5 之該蛋白質與表 6 之該蛋白質的交互作用被報導於表 7 中；及 (c) 測量表 6 之該蛋白質的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為表 6 之該蛋白質的下游活性之調節劑。
如請求項 92 之方法，其中如藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定、BLI 測定或酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。
如請求項 93 或 94 之方法，其中該調節劑為表 5 或表 6 之該蛋白質的下游活性之抑制劑。
如請求項 93 或 94 之方法，其中該調節劑為表 5 或表 6 之該蛋白質的下游活性之活化劑。
如請求項 93 或 94 之方法，其中該下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的減少。
如請求項 93 或 94 之方法，其中該下游活性的變化為該下游活性的量、強度或持續時間的增加。
如請求項 92 至 99 中任一項之方法，其中該調節劑為小分子、抗體或其抗原結合片段、肽、模擬物、反義寡核苷酸或小干擾 RNA (siRNA)。
如請求項 100 之方法，其中該抗原結合片段為雙-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab') ₂、雙抗體 (diabody)、線性抗體、scFv、ScFab、VH 域或 VHH 域。
如請求項 100 或 101 之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合表 5 之該蛋白質。
如請求項 100 或 101 之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合表 6 之該蛋白質。
如請求項 92 至 103 中任一項之方法，其中表 5 之該蛋白質為 ADGRB1。
如請求項 104 之方法，其中表 6 之該蛋白質為 PD-L1。
如請求項 104 或 105 之方法，其中該下游活性為腫瘤生長。
如請求項 106 之方法，其中腫瘤生長在該調節劑的存在下減少。
如請求項 107 之方法，其中如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。
如請求項 104 至 108 中任一項之方法，其中該調節劑為靶向 PD-L1 的抗體或其抗原結合片段。
如請求項 104 之方法，其中表 6 之該蛋白質為 ICOSLG。
如請求項 110 之方法，其中該下游活性為 T 細胞活化。
如請求項 111 之方法，其中 T 細胞活化在該調節劑的存在下增加。
如請求項 112 之方法，其中 T 細胞活化增加至少 20%。
如請求項 110 至 113 中任一項之方法，其中該調節劑為靶向 ICOSLG 的抗體或其抗原結合片段。
如請求項 104 至 113 中任一項之方法，其中該調節劑為靶向 ADGRB1 的抗體或其抗原結合片段。
一種鑑定 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在該候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 PD-L1 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。
一種鑑定 PD-L1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 PD-L1 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 PD-L1 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 PD-L1 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 PD-L1 的下游活性之調節劑。
一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 ADGRB1 與 PD-L1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 PD-L1 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ADGRB1 的下游活性之調節劑。
如請求項 116 之方法，其中如藉由 SPR 測定、BLI 測定或 ELISA 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。
如請求項 117 或 118 之方法，其中該下游活性為腫瘤生長。
如請求項 120 之方法，其中腫瘤生長在該調節劑的存在下減少。
如請求項 121 之方法，其中如在腫瘤生長測定中所測量，腫瘤生長減少至少 20%。
一種鑑定 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 與 ADGRB1 的結合，其中相對於不存在該候選調節劑時的結合，依該候選調節劑存在下的結合的增加或減少鑑定該候選調節劑為 ICOSLG 與 ADGRB1 之間交互作用的調節劑。
一種鑑定 ICOSLG 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 ICOSLG 與 ADGRB1 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 ICOSLG 與 ADGRB1 接觸；及 (c) 測量 ICOSLG 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ICOSLG 的下游活性之調節劑。
一種鑑定 ADGRB1 的下游活性之調節劑之方法，該方法包含： (a) 提供候選調節劑； (b) 在允許 ADGRB1 與 ICOSLG 結合的條件下，在存在或不存在該候選調節劑的情況下使 ADGRB1 與 ICOSLG 接觸；及 (c) 測量 ADGRB1 的下游活性，其中相對於不存在該候選調節劑時的下游活性，依存在該候選調節劑時該下游活性的變化鑑定該候選調節劑為該 ADGRB1 的下游活性之調節劑。
如請求項 123 之方法，其中如藉由 SPR 測定、BLI 測定或 ELISA 所測量，結合的增加或減少為至少 70%。
如請求項 124 或 125 之方法，其中該下游活性為 T 細胞活化。
如請求項 126 之方法，其中 T 細胞活化在該調節劑的存在下減少。
如請求項 127 之方法，其中 T 細胞活化增加至少 20%。
一種表徵細胞株之交互作用型態的方法，該方法包含： (a) 修飾該細胞株以包含膜出芽劑；及 (b) 表徵該細胞株所產生之生物囊泡 (BV) 的交互作用型態。
一種表徵已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態之方法，該方法包含表徵該細胞株所產生之 BV 的交互作用型態。
一種鑑定細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含： (a) 修飾該細胞株以包含膜出芽劑； (b) 表徵由該細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態； (c) 表徵由該細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較在該第一時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態與在該第二時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態，其中依在該第一時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態與在該第二時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。
一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的細胞株之交互作用型態的變化之方法，該方法包含： (a) 表徵由該細胞株在第一時間點所產生之 BV 的交互作用型態； (b) 表徵由該細胞株在第二時間點所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較在該第一時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態與在該第二時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態，其中依在該第一時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態與在該第二時間點所產生之該 BV 的該交互作用型態之間的差異鑑定該細胞株之該交互作用型態的變化。
如請求項 130 至 133 中任一項之方法，其中該細胞株為哺乳動物細胞株。
如請求項 134 之方法，其中該哺乳動物細胞株為免疫細胞株、神經元細胞株或纖維母細胞株。
如請求項 135 之方法，其中該免疫細胞株包含 T 細胞、B 細胞或單核球中之一種或多種。
如請求項 132 至 136 中任一項之方法，其中該方法包含在該第一時間點之後和該第二時間點之前將該細胞株暴露於刺激中。
如請求項 137 之方法，其中該刺激為誘導傳訊的條件或藥劑。
如請求項 137 之方法，其中該刺激為誘導疾病相關狀態的條件或藥劑。
如請求項 139 之方法，其中該細胞株為免疫細胞株且該疾病相關狀態為免疫衰竭。
如請求項 137 之方法，其中該刺激為誘導分化的條件或藥劑。
如請求項 132 至 141 中任一項之方法，其中該方法進一步包含表徵該細胞株在一個或多個額外時間點所產生之 BV 的交互作用型態。
一種鑑定兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含： (a) 修飾該等細胞株中之各者以包含膜出芽劑； (b) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態； (c) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (d) 比較該第一細胞株所產生之 BV 的該交互作用型態與該第二細胞株所產生之 BV 的該交互作用型態，其中依在該第一細胞株所產生之該 BV 的該交互作用型態與該第二細胞株所產生之該 BV 的該交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。
一種鑑定已被修飾為包含膜出芽劑的兩種細胞株之交互作用型態的差異之方法，該方法包含： (a) 表徵第一細胞株所產生之 BV 的交互作用型態； (b) 表徵第二細胞株所產生之 BV 的交互作用型態；及 (c) 比較該第一細胞株所產生之 BV 的該交互作用型態與該第二細胞株所產生之 BV 的該交互作用型態，其中依該第一細胞株所產生之該 BV 的該交互作用型態與該第二細胞株所產生之該 BV 的該交互作用型態之間的差異鑑定兩種細胞株的表面蛋白型態的差異。
如請求項 130 至 144 中任一項之方法，其中該膜出芽劑的表現是可誘導的。
如請求項 130 至 145 中任一項之方法，其中表徵該 BV 的該交互作用型態包含確定該 BV 上一種或多種所關注膜相關蛋白的水平。
如請求項 130 至 146 中任一項之方法，其中表徵該 BV 的該交互作用型態包含確定該 BV 上一種或多種所關注受體的水平。
如請求項 130 至 147 中任一項之方法，其中使用包含以下的方法來表徵該 BV 的該交互作用型態： (a) 提供固定在一個或多個固體表面上的標靶多肽的集合物； (b) 將步驟 (a) 中的該標靶多肽之集合物與該 BV 接觸；及 (c) 檢測該 BV 與該標靶多肽之集合物中的至少一種標靶多肽之間的交互作用，從而鑑定交互作用型態。
如請求項 148 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 25% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 149 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 50% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 150 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 75% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 151 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之至少 90% 的蛋白質的該細胞外域。
如請求項 152 之方法，其中該標靶多肽之集合物包含表 4 之所有蛋白質的該細胞外域。
如請求項 130 至 153 中任一項之方法，其中該方法進一步包含表徵該 BV 的細胞質蛋白型態。
如請求項 130 至 154 中任一項之方法，其中該膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。
一種包含異源膜出芽劑之 BV，其中該 BV 藉由包含以下之方法產生：(i) 提供已被修飾為在可誘導控制下表現該膜出芽劑的親代細胞株；(ii) 誘導該膜出芽劑之表現，及 (iii) 從該親代細胞株中分離該 BV。
如請求項 156 之 BV，其中該膜出芽劑選自由以下所組成之群組：HIV gag 蛋白、Acyl.Hrs、ARRDC1 及 ARF6。
如請求項 156 或 157 之 BV，其中該親代細胞株為哺乳動物細胞株。
如請求項 158 之 BV，其中該 BV 為細胞外囊泡 (EV)。
一種評估膜相關蛋白的酶活性之方法，該方法包含對包含該蛋白質的 BV 進行酶活性測定。
如請求項 160 之方法，其中該膜相關蛋白為肽酶，且該酶活性測定為肽酶活性測定。
如請求項 160 之方法，其中該膜相關蛋白為蛋白酶，且該酶活性測定為蛋白酶活性測定。
如請求項 160 之方法，其中該膜相關蛋白為激酶且該酶活性測定為激酶活性測定。
如請求項 160 之方法，其中該膜相關蛋白為磷酸酶且該酶活性測定為磷酸酶活性測定。
如請求項 160 至 164 中任一項之方法，其中該膜相關蛋白為該 BV 來源之親代細胞的內源蛋白。
如請求項 160 至 164 中任一項之方法，其中該膜相關蛋白為該 BV 來源之親代細胞的異源蛋白。
如請求項 166 之方法，其中該異源膜相關蛋白為全長蛋白。
如請求項 166 之方法，其中該異源膜相關蛋白包含蛋白質片段、標籤及錨定物。
如請求項 168 之方法，其中該錨定物將該蛋白質片段栓繫至該 BV 之膜的表面。
如請求項 168 或 169 之方法，其中該錨定物為醣基磷脂醯肌醇 (GPI) 多肽。
一種從培養基或從來自受試者的樣品中純化 BV 之方法，該方法包含使 BV 與包含表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種的固體表面接觸。
如請求項 171 之方法，其中該來自受試者的樣品為尿液樣品、血液樣品或經消化的組織樣品。
如請求項 171 或 172 之方法，其中該固體表面為包含蛋白質 A 功能化珠粒的管柱，且該方法包含使包含該表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種的條件培養基流過該管柱，其中該表 8 或表 9 之蛋白質中之一種或多種已被修飾為包含 Fc 區。
如請求項 173 之方法，其中該方法進一步包含使包含該 BV 的該培養基流過該管柱。
如請求項 174 之方法，其中該方法進一步包含溶析該 BV。