JPH05203649A - 磁性粒子回収装置およびそれを用いた検体濃縮方法 - Google Patents
磁性粒子回収装置およびそれを用いた検体濃縮方法Info
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- JPH05203649A JPH05203649A JP27775692A JP27775692A JPH05203649A JP H05203649 A JPH05203649 A JP H05203649A JP 27775692 A JP27775692 A JP 27775692A JP 27775692 A JP27775692 A JP 27775692A JP H05203649 A JPH05203649 A JP H05203649A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 測定対象物を特異的に収集する装置、および
それを用いた希薄検体中の測定対象物を濃縮する方法を
提供する。 【構成】 本装置は、永久磁石の位置を変えることによ
り金属片の励磁、消磁を制御し、磁性粒子の回収を行う
装置である。高価な電磁石や電源、スイッチ等が不要で
ある為、安価であり構造が簡単である。又本方法は測定
対象物に特異的に反応する抗体又は抗原を結合させた磁
性粒子を用い、検体中の希薄に測定対象物を捕捉した後
磁場をかけて測定対象物を捕捉した前記磁性粒子を回収
することができるため、ＨＣＭＶのような希薄な測定対
象物の測定に有効である。
それを用いた希薄検体中の測定対象物を濃縮する方法を
提供する。 【構成】 本装置は、永久磁石の位置を変えることによ
り金属片の励磁、消磁を制御し、磁性粒子の回収を行う
装置である。高価な電磁石や電源、スイッチ等が不要で
ある為、安価であり構造が簡単である。又本方法は測定
対象物に特異的に反応する抗体又は抗原を結合させた磁
性粒子を用い、検体中の希薄に測定対象物を捕捉した後
磁場をかけて測定対象物を捕捉した前記磁性粒子を回収
することができるため、ＨＣＭＶのような希薄な測定対
象物の測定に有効である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は磁性粒子を用いる免疫測
定用検体磁性粒子回収装置及び該装置を用いた検体の測
定方法に関する。
定用検体磁性粒子回収装置及び該装置を用いた検体の測
定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】尿などの測定対象物の濃度が希薄な検体
を用いて免疫測定を行なうにあたっては検体を濃縮する
ことが好ましい。しかしながら、一般に免疫測定の対象
となる物質は熱又はｐＨなどの変化に鋭敏に反応し、変
性してしまう。その為、検体を濃縮することはほとんど
行なわれず、細胞培養法によるウィルス分離等、２〜４
週間の時間をかける検査が行なわれている他、僅かに減
圧濃縮法、ロ紙等に塗布することによる濃縮方法が採用
されているのみである。
を用いて免疫測定を行なうにあたっては検体を濃縮する
ことが好ましい。しかしながら、一般に免疫測定の対象
となる物質は熱又はｐＨなどの変化に鋭敏に反応し、変
性してしまう。その為、検体を濃縮することはほとんど
行なわれず、細胞培養法によるウィルス分離等、２〜４
週間の時間をかける検査が行なわれている他、僅かに減
圧濃縮法、ロ紙等に塗布することによる濃縮方法が採用
されているのみである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】尿などの測定対象物の
濃度が希薄な検体を濃縮し、測定対象物の濃度を高くし
た上で免疫測定を行なう事ができれば、測定に要する時
間が短かくなるばかりか、細心の注意を必要とされた測
定操作が安定し、測定結果の信頼性を高くすることがで
きる。しかしながら、一般に検体中には測定対象物以外
に様々な物質が含まれており、検体それ自体を濃縮する
と、測定対象物以外の前記物質まで濃縮され、これらの
物質が測定時にノイズとなって現れたり、反応系に悪影
響を及ぼす原因となることがあるため測定対象物のみを
選択的に濃縮し、短時間で信頼性の高い測定結果が得ら
れる測定方法が望まれている。
濃度が希薄な検体を濃縮し、測定対象物の濃度を高くし
た上で免疫測定を行なう事ができれば、測定に要する時
間が短かくなるばかりか、細心の注意を必要とされた測
定操作が安定し、測定結果の信頼性を高くすることがで
きる。しかしながら、一般に検体中には測定対象物以外
に様々な物質が含まれており、検体それ自体を濃縮する
と、測定対象物以外の前記物質まで濃縮され、これらの
物質が測定時にノイズとなって現れたり、反応系に悪影
響を及ぼす原因となることがあるため測定対象物のみを
選択的に濃縮し、短時間で信頼性の高い測定結果が得ら
れる測定方法が望まれている。
【０００４】例えば、臨床上特に移植患者等の免疫抑制
状態の患者に於いては、１０4 −１０1 ＰＦＵ／ｍｌの
ヒトサイトメガロウィルス（以下ＨＣＭＶと記す。）が
排泄され、移植後の悪性化（ＨＣＭＶ肺炎等）の指標に
尿中ＨＣＭＶの検出は有用とされている。しかし、従来
のプレート上でのＥＬＩＳＡは１０3 ＰＦＵ／ｍｌが限
界であり、臨床応用を行うには至っていない。
状態の患者に於いては、１０4 −１０1 ＰＦＵ／ｍｌの
ヒトサイトメガロウィルス（以下ＨＣＭＶと記す。）が
排泄され、移植後の悪性化（ＨＣＭＶ肺炎等）の指標に
尿中ＨＣＭＶの検出は有用とされている。しかし、従来
のプレート上でのＥＬＩＳＡは１０3 ＰＦＵ／ｍｌが限
界であり、臨床応用を行うには至っていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、測定対象
物に特異的に反応する抗体又は抗原を結合させた磁性粒
子を用い、検体中の希薄な測定対象物を十分に捕捉した
後、磁場をかけて測定対象物を捕捉した前記磁性粒子を
回収することにより、上記の問題を解決し、測定対象物
のみを濃縮し、迅速且つ安定した測定を行ない得ること
を見出した。本発明によれば、測定対象物を捕捉した抗
体又は抗原を結合した磁性粒子は、非磁性材料で成形さ
れたシリンダーに検体と共に吸引される途中、外部から
永久磁石により励磁された金属片に吸着し回収される。
回収された前記磁性粒子は、捕捉した測定対象物に応じ
た測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法、プローブ
アッセイ法を用いて測定する事ができる。
物に特異的に反応する抗体又は抗原を結合させた磁性粒
子を用い、検体中の希薄な測定対象物を十分に捕捉した
後、磁場をかけて測定対象物を捕捉した前記磁性粒子を
回収することにより、上記の問題を解決し、測定対象物
のみを濃縮し、迅速且つ安定した測定を行ない得ること
を見出した。本発明によれば、測定対象物を捕捉した抗
体又は抗原を結合した磁性粒子は、非磁性材料で成形さ
れたシリンダーに検体と共に吸引される途中、外部から
永久磁石により励磁された金属片に吸着し回収される。
回収された前記磁性粒子は、捕捉した測定対象物に応じ
た測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法、プローブ
アッセイ法を用いて測定する事ができる。
【０００６】以下図に基づいてより詳細に説明する。図
１は本発明装置の縦断面図、図２は永久磁石を保持する
ためのホルダーの斜視図である。これらの図において本
発明装置は、金属片７が充填されたプラスチック等の非
磁性材料で成形された容器６の上に、永久磁石４を保持
するための強磁性材料以外の材料で成形されたホルダー
を装着し、該ホルダーは非磁性材料で形成されたシリン
ダー２と鉄等の強磁性材料で成形されたリング３を介し
て連結され、シリンダー２には非磁性材料で形成された
プランジャー１が装着されてなる構造を有する。
１は本発明装置の縦断面図、図２は永久磁石を保持する
ためのホルダーの斜視図である。これらの図において本
発明装置は、金属片７が充填されたプラスチック等の非
磁性材料で成形された容器６の上に、永久磁石４を保持
するための強磁性材料以外の材料で成形されたホルダー
を装着し、該ホルダーは非磁性材料で形成されたシリン
ダー２と鉄等の強磁性材料で成形されたリング３を介し
て連結され、シリンダー２には非磁性材料で形成された
プランジャー１が装着されてなる構造を有する。
【０００７】更に、本発明装置を用いた検体濃縮方法及
び回収された磁性粒子を用いた測定方法について説明す
る。検体の濃縮を行なうにあたっては、濃縮後に行なう
測定方法に応じて界面活性剤等を用いて測定対象物を断
片に破砕する。その後、測定対象物に特異的に反応する
抗体又は抗原を結合させた磁性粒子を加え、抗原抗体反
応を行なう。
び回収された磁性粒子を用いた測定方法について説明す
る。検体の濃縮を行なうにあたっては、濃縮後に行なう
測定方法に応じて界面活性剤等を用いて測定対象物を断
片に破砕する。その後、測定対象物に特異的に反応する
抗体又は抗原を結合させた磁性粒子を加え、抗原抗体反
応を行なう。
【０００８】本発明装置のホルダー５を位置１に配置
し、検体を吸引する。この時測定対象物を捕捉した磁性
粒子も共に吸引され、ホルダーに保持された永久磁石４
により励磁された金属片７に吸着する。プランジャー１
を操作する事により検体の吸引、排出を繰り返し、検体
に加えた磁性粒子を金属片７に吸着させ、全て回収す
る。
し、検体を吸引する。この時測定対象物を捕捉した磁性
粒子も共に吸引され、ホルダーに保持された永久磁石４
により励磁された金属片７に吸着する。プランジャー１
を操作する事により検体の吸引、排出を繰り返し、検体
に加えた磁性粒子を金属片７に吸着させ、全て回収す
る。
【０００９】回収された磁性粒子を適宜緩衝液等で洗浄
した後、少量の緩衝液等を吸引し、ホルダー５を位置２
に配置する。この時ホルダー５に保持された永久磁石９
と鉄等の強磁性材料で成形されたリングの吸引力によ
り、ホルダー５は位置２に保持される。位置２では、金
属片７を貫通する磁束が減少するため、磁力を失なった
金属片７は測定対象物を結合した磁性粒子を溶液中に放
出する。この事により固相に担持された形態で測定対象
物のみが濃縮された溶液を得る。
した後、少量の緩衝液等を吸引し、ホルダー５を位置２
に配置する。この時ホルダー５に保持された永久磁石９
と鉄等の強磁性材料で成形されたリングの吸引力によ
り、ホルダー５は位置２に保持される。位置２では、金
属片７を貫通する磁束が減少するため、磁力を失なった
金属片７は測定対象物を結合した磁性粒子を溶液中に放
出する。この事により固相に担持された形態で測定対象
物のみが濃縮された溶液を得る。
【００１０】回収された前記濃縮された溶液は、測定対
象物が既に固相に担持されているので、免疫化学的測定
方法、ＰＣＲ法、プローブアッセイ法等を用いる分子生
物学的測定方法に供する事ができる。
象物が既に固相に担持されているので、免疫化学的測定
方法、ＰＣＲ法、プローブアッセイ法等を用いる分子生
物学的測定方法に供する事ができる。
【００１１】本発明における免疫化学的測定法として
は、酵素免疫測定法を採用することができる。これらの
測定法は、標識を用いる免疫測定法であって、サンドイ
ッチ法あるいは競争法により、目的とする抗原あるいは
抗体を測定することができる。
は、酵素免疫測定法を採用することができる。これらの
測定法は、標識を用いる免疫測定法であって、サンドイ
ッチ法あるいは競争法により、目的とする抗原あるいは
抗体を測定することができる。
【００１２】本発明における酵素免疫測定は、既に一次
抗体との反応が終了しているため、酵素標識された２次
抗体を加え、１０分〜３時間反応させ行うものである。
実施の際の反応温度は４℃〜４０℃であり、好ましくは
２５℃〜３８℃である。未反応酵素標識抗体を洗浄後、
固相に結合した抗体結合酵素の量を酵素基質を加え活性
を測定することにより検体のリガンドの量を定量するこ
とができる。
抗体との反応が終了しているため、酵素標識された２次
抗体を加え、１０分〜３時間反応させ行うものである。
実施の際の反応温度は４℃〜４０℃であり、好ましくは
２５℃〜３８℃である。未反応酵素標識抗体を洗浄後、
固相に結合した抗体結合酵素の量を酵素基質を加え活性
を測定することにより検体のリガンドの量を定量するこ
とができる。
【００１３】本方法において用いることのできる酵素
は、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどであ
る。この際基質は、用いる酵素に適したものを用いるこ
とはいうまでもなく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−
Ｈ2 Ｏ2 （パーオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート
（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−
β−ｏ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−
ｏ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼ用）などを使
用することができる。
は、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどであ
る。この際基質は、用いる酵素に適したものを用いるこ
とはいうまでもなく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−
Ｈ2 Ｏ2 （パーオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニル
ホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート
（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−
β−ｏ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−
ｏ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼ用）などを使
用することができる。
【００１４】測定は、室温〜４０℃で１分〜１８時間反
応させ、生じた発色、蛍光あるいは、発光量を測定する
ことにより行うものである。他に測定は、４℃〜４０℃
の範囲で加温しながら行う所謂レート法を採用すること
もできる。
応させ、生じた発色、蛍光あるいは、発光量を測定する
ことにより行うものである。他に測定は、４℃〜４０℃
の範囲で加温しながら行う所謂レート法を採用すること
もできる。
【００１５】また本発明の測定法は、イソルミノールや
アクリジンエステルなどをラベルした化学発光測定法、
フルオレッセンやロードダミンをラベルした蛍光免疫測
定法で行うこともできる。この際、ラベル体の標識は活
性化エステル法やイソシアネート法を採用することによ
り容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」（医学
書院、１９８７年）参照）。
アクリジンエステルなどをラベルした化学発光測定法、
フルオレッセンやロードダミンをラベルした蛍光免疫測
定法で行うこともできる。この際、ラベル体の標識は活
性化エステル法やイソシアネート法を採用することによ
り容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」（医学
書院、１９８７年）参照）。
【００１６】本発明におけるＰＣＲ法を用いた測定方法
は、捕捉したウィルスを界面活性剤等で破壊して得られ
たＤＮＡ又はＲＮＡ抽出溶液を検体として用い、目的と
なるＤＮＡ又はＲＮＡ配列と相補的な配列を有するプラ
イマーと重合試薬を加え、所定量の配列が生成するまで
必要なだけ繰り返して増幅し、電気泳動等の検出方法を
もってウィルスの測定を行なうものである。プローブア
ッセイ法では各種の標識プライマーを用いて増幅を行な
い、目的の配列を測定することができる。
は、捕捉したウィルスを界面活性剤等で破壊して得られ
たＤＮＡ又はＲＮＡ抽出溶液を検体として用い、目的と
なるＤＮＡ又はＲＮＡ配列と相補的な配列を有するプラ
イマーと重合試薬を加え、所定量の配列が生成するまで
必要なだけ繰り返して増幅し、電気泳動等の検出方法を
もってウィルスの測定を行なうものである。プローブア
ッセイ法では各種の標識プライマーを用いて増幅を行な
い、目的の配列を測定することができる。
【００１７】
【作用】本発明は非磁性材料で成形されたプランジャー
とシリンダーに非磁性材料で成形された容器が鉄製リン
グを介して連結され、該容器は複数の金属片が充填され
ている。又該シリンダーと該容器の連結部位に永久磁石
を保持するリング状のホルダーが鉄片に磁場をかける位
置と、鉄片の磁場を消す位置の２つの位置をとることが
できるように装着されていることからなる磁性粒子回収
装置である。この装置は、測定対象物の濃度が希薄な検
体の濃縮に用いることができ、酵素免疫測定法、ＰＣＲ
法等の測定方法に応用することができる。
とシリンダーに非磁性材料で成形された容器が鉄製リン
グを介して連結され、該容器は複数の金属片が充填され
ている。又該シリンダーと該容器の連結部位に永久磁石
を保持するリング状のホルダーが鉄片に磁場をかける位
置と、鉄片の磁場を消す位置の２つの位置をとることが
できるように装着されていることからなる磁性粒子回収
装置である。この装置は、測定対象物の濃度が希薄な検
体の濃縮に用いることができ、酵素免疫測定法、ＰＣＲ
法等の測定方法に応用することができる。
【００１８】
（実施例１）図１において、鉄球７を内包するプラスチ
ック製の容器６の上に永久磁石４が保持された真鍮製の
ホルダー５を装着し、該ホルダーはプラスチックで成形
されたシリンダー２と鉄製のリング３を介して連結さ
れ、シリンダー２にはプラスチックで形成されたプラン
ジャー１が装着されている。
ック製の容器６の上に永久磁石４が保持された真鍮製の
ホルダー５を装着し、該ホルダーはプラスチックで成形
されたシリンダー２と鉄製のリング３を介して連結さ
れ、シリンダー２にはプラスチックで形成されたプラン
ジャー１が装着されている。
【００１９】上記の構造を有する本発明装置で検体を吸
引する。ここで検体には予めリガンドに特異的に反応す
る抗体又は抗原が結合した磁性粒子を所定量加え、抗原
抗体反応を行ない、測定対象物を磁性粒子に捕捉してお
く。
引する。ここで検体には予めリガンドに特異的に反応す
る抗体又は抗原が結合した磁性粒子を所定量加え、抗原
抗体反応を行ない、測定対象物を磁性粒子に捕捉してお
く。
【００２０】次にホルダー５を位置１に配置し検体を吸
引すると、リガンドを捕捉した磁性粒子も共に吸引さ
れ、ホルダーに保持された永久磁石４により励磁された
鉄球７に吸着する。プランジャー１により検体の吸引、
排出を数回繰り返し、検体に加えた磁性粒子を全て回収
する。更に緩衝液等を用いて同様の操作を繰り返し、回
収された磁性粒子を洗浄した後、少量の緩衝液を吸引す
る。この状態でホルダーを位置２に配置する。この位置
では、永久磁石と鉄製リングの吸引力により、ホルダー
は位置２を保持される。位置２では、金属片７を貫通す
る磁束が減少するため、磁力を失なった鉄球７は測定対
象物を捕捉した磁性粒子を溶液中に放出することによ
り、測定対象物であるリガンドのみが濃縮された溶液を
得る。
引すると、リガンドを捕捉した磁性粒子も共に吸引さ
れ、ホルダーに保持された永久磁石４により励磁された
鉄球７に吸着する。プランジャー１により検体の吸引、
排出を数回繰り返し、検体に加えた磁性粒子を全て回収
する。更に緩衝液等を用いて同様の操作を繰り返し、回
収された磁性粒子を洗浄した後、少量の緩衝液を吸引す
る。この状態でホルダーを位置２に配置する。この位置
では、永久磁石と鉄製リングの吸引力により、ホルダー
は位置２を保持される。位置２では、金属片７を貫通す
る磁束が減少するため、磁力を失なった鉄球７は測定対
象物を捕捉した磁性粒子を溶液中に放出することによ
り、測定対象物であるリガンドのみが濃縮された溶液を
得る。
【００２１】（実施例２）カルボキシル化磁性粒子は、
予め超音波洗浄機（バット型、日本精機製作所製）を用
いて蒸留水で６０秒ずつ５回洗浄した。日本ペイント社
製磁性被覆粒子（核の平均粒径０．３μｍのポリスチレ
ン製）５ｇに３−アミノプロピルトリエトキシシラン５
０ｍｌを加え、更に氷酢酸３０ｍｌを添加し、室温下３
時間反応し、洗浄後、無水グルタル酸を反応させること
により得られる。氷酢酸は氷冷下撹拌しながら滴下し、
洗浄は蒸留水、メタノール、蒸留水で各々３回ずつ洗浄
し更に、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で３００ｍｌ
ずつ５回洗浄した。無水グルタル酸との反応は、粒子の
５ｗｔ％（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液）１００ｍ
ｌに無水グルタル酸２．８５ｇを加え、１０分間反応さ
せた。反応終了後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で
３００ｍｌずつ３回洗浄し、更に蒸留水で５回洗浄し、
これをカルボキシル化磁性粒子として用いた。
予め超音波洗浄機（バット型、日本精機製作所製）を用
いて蒸留水で６０秒ずつ５回洗浄した。日本ペイント社
製磁性被覆粒子（核の平均粒径０．３μｍのポリスチレ
ン製）５ｇに３−アミノプロピルトリエトキシシラン５
０ｍｌを加え、更に氷酢酸３０ｍｌを添加し、室温下３
時間反応し、洗浄後、無水グルタル酸を反応させること
により得られる。氷酢酸は氷冷下撹拌しながら滴下し、
洗浄は蒸留水、メタノール、蒸留水で各々３回ずつ洗浄
し更に、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で３００ｍｌ
ずつ５回洗浄した。無水グルタル酸との反応は、粒子の
５ｗｔ％（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液）１００ｍ
ｌに無水グルタル酸２．８５ｇを加え、１０分間反応さ
せた。反応終了後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で
３００ｍｌずつ３回洗浄し、更に蒸留水で５回洗浄し、
これをカルボキシル化磁性粒子として用いた。
【００２２】（実施例３）２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）５ｍｌに実施例２で調製したカルボキシル化磁
性粒子５０ｍｇを分散させ、これに水溶性カルボジイミ
ド２０ｍｇ加えた。室温で５分間反応させた後、上清を
除去し、マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧ溶液（１ｍｇ／ｍｌ，
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．５）２ｍｌを加え、エ
ンドオーバーエンドミキサーで撹拌した。１時間後この
粒子を２％ＢＳＡ溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
０．１５ＭＮａＣｌ，０．１％ＮａＮ3 ，ｐＨ７．２）
で４回洗浄した後、２％ＢＳＡ溶液２ｍｌ中で一晩分散
し、更に２％ＢＳＡ溶液で洗浄し、これを同じＢＳＡ溶
液に分散させ、マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧ結合カルボキシ
ル化磁性粒子とした。
４．５）５ｍｌに実施例２で調製したカルボキシル化磁
性粒子５０ｍｇを分散させ、これに水溶性カルボジイミ
ド２０ｍｇ加えた。室温で５分間反応させた後、上清を
除去し、マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧ溶液（１ｍｇ／ｍｌ，
５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．５）２ｍｌを加え、エ
ンドオーバーエンドミキサーで撹拌した。１時間後この
粒子を２％ＢＳＡ溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
０．１５ＭＮａＣｌ，０．１％ＮａＮ3 ，ｐＨ７．２）
で４回洗浄した後、２％ＢＳＡ溶液２ｍｌ中で一晩分散
し、更に２％ＢＳＡ溶液で洗浄し、これを同じＢＳＡ溶
液に分散させ、マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧ結合カルボキシ
ル化磁性粒子とした。
【００２３】（実施例４）培養により得たＨＣＭＶ抗原
（１０6 ＰＦＵ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡ用標準検体
及びＰＣＲ用標準検体を調製した。ＥＬＩＳＡ用標準検
体は、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で１０1 〜１０5 ＰＦＵ／ｍｌになるよ
う希釈し、室温で３０分間反応させて用いた。ＰＣＲ用
標準検体は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０1 〜１
０5 ＰＦＵ／ｍｌになるよう希釈して用いた。
（１０6 ＰＦＵ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡ用標準検体
及びＰＣＲ用標準検体を調製した。ＥＬＩＳＡ用標準検
体は、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で１０1 〜１０5 ＰＦＵ／ｍｌになるよ
う希釈し、室温で３０分間反応させて用いた。ＰＣＲ用
標準検体は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０1 〜１
０5 ＰＦＵ／ｍｌになるよう希釈して用いた。
【００２４】（実施例５）マイクロプレートにマウス抗
ＨＣＭＶＩｇＧを１００ｍｇ／ｍｌとなるように０．１
Ｍ炭酸緩衝液で希釈し、各ウエルに１００μｌづつ分注
し、１０℃で一晩放置した。この後、洗浄緩衝液（０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．２））で３回洗浄し、３％ＢＳＡを含む０．１
Ｍ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各ウエルに２００μ
ｌづつ分注し、室温にて２時間放置し、ブロッキングを
行なった。これを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ
用プレートとした。
ＨＣＭＶＩｇＧを１００ｍｇ／ｍｌとなるように０．１
Ｍ炭酸緩衝液で希釈し、各ウエルに１００μｌづつ分注
し、１０℃で一晩放置した。この後、洗浄緩衝液（０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．２））で３回洗浄し、３％ＢＳＡを含む０．１
Ｍ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各ウエルに２００μ
ｌづつ分注し、室温にて２時間放置し、ブロッキングを
行なった。これを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ
用プレートとした。
【００２５】実施例４で調製した標準検体を１０1 ＰＦ
Ｕ／ｍｌ、１０2 ＰＦＵ／ｍｌ、１０3 ＰＦＵ／ｍｌ、
１０4 ＰＦＵ／ｍｌの濃度に調製し、前記ＥＬＩＳＡ用
プレートのウエルに各々１００μｌづつ加え、３７℃で
１時間放置した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、パーオキシ
ダーゼ標識マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧを１００μｌ加え、
３７℃で１時間反応させた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、
０．５ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン及び０．０
２％過酸化水素を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
５．０）より成る基質液１００μｌを加え、室温で３０
分間放置した。４Ｎ硫酸１００ｍｌを加え、反応を停止
させ比色計（モレキュラーデバイス社製）で４９０ｎｍ
の波長で測定した。結果を図３に示す。
Ｕ／ｍｌ、１０2 ＰＦＵ／ｍｌ、１０3 ＰＦＵ／ｍｌ、
１０4 ＰＦＵ／ｍｌの濃度に調製し、前記ＥＬＩＳＡ用
プレートのウエルに各々１００μｌづつ加え、３７℃で
１時間放置した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、パーオキシ
ダーゼ標識マウス抗ＨＣＭＶＩｇＧを１００μｌ加え、
３７℃で１時間反応させた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、
０．５ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン及び０．０
２％過酸化水素を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
５．０）より成る基質液１００μｌを加え、室温で３０
分間放置した。４Ｎ硫酸１００ｍｌを加え、反応を停止
させ比色計（モレキュラーデバイス社製）で４９０ｎｍ
の波長で測定した。結果を図３に示す。
【００２６】（実施例６）実施例４で調製した標準検体
２ｍｌに最終濃度２％となる様にＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０を加え、室温で３時間撹拌した。次に実施例３で調製
した磁性粒子を１％含む分散液を１０／μｌ加え、室温
で一晩撹拌し、この後、実施例１と同様を以って磁性粒
子を回収した。
２ｍｌに最終濃度２％となる様にＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０を加え、室温で３時間撹拌した。次に実施例３で調製
した磁性粒子を１％含む分散液を１０／μｌ加え、室温
で一晩撹拌し、この後、実施例１と同様を以って磁性粒
子を回収した。
【００２７】磁性粒子の回収にあたっては、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液を用いて３回洗浄し、回収し
た。この後パーオキシダーゼ標識抗体（０．３μｇ／ｍ
ｌ）２５０μｌを加え、室温で２時間撹拌し、実施例５
と同様に集磁、洗浄を５回行ない、０．５ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含
む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）よりなる基質
液２００μｌを加え室温で３０分間放置した後４Ｎ硫酸
２００μｌを加え反応を停止し、比色計（モレキュラー
デバイス社製）で４９０ｎｍの波長を測定した。結果を
図３に示す。
Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液を用いて３回洗浄し、回収し
た。この後パーオキシダーゼ標識抗体（０．３μｇ／ｍ
ｌ）２５０μｌを加え、室温で２時間撹拌し、実施例５
と同様に集磁、洗浄を５回行ない、０．５ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含
む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）よりなる基質
液２００μｌを加え室温で３０分間放置した後４Ｎ硫酸
２００μｌを加え反応を停止し、比色計（モレキュラー
デバイス社製）で４９０ｎｍの波長を測定した。結果を
図３に示す。
【００２８】（実施例７）実施例４で調製した標準検体
２ｍｌに実施例３で調製した磁性粒子を１％含む分散液
１０μｌを加え、室温で一晩撹拌し、この後、実施例１
と同様の操作を以て磁性粒子を回収した。
２ｍｌに実施例３で調製した磁性粒子を１％含む分散液
１０μｌを加え、室温で一晩撹拌し、この後、実施例１
と同様の操作を以て磁性粒子を回収した。
【００２９】磁性粒子の回収にあたっては、リン酸緩衝
液を洗浄液として用い、４回洗浄し回収した。この後
０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス−塩酸緩
衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１μＭ ＭｇＣｌ
2 、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、ｐＨ９．８）１００μｌ
に懸濁し、３７℃で１０分間放置した。この懸濁液を３
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、上清液を分
取し、更に９４℃で１０分間熱処理し、ＤＮＡ抽出液と
した。
液を洗浄液として用い、４回洗浄し回収した。この後
０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス−塩酸緩
衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１μＭ ＭｇＣｌ
2 、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、ｐＨ９．８）１００μｌ
に懸濁し、３７℃で１０分間放置した。この懸濁液を３
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない、上清液を分
取し、更に９４℃で１０分間熱処理し、ＤＮＡ抽出液と
した。
【００３０】前記ＤＮＡ抽出液５μｌに、ｄ−ヌクレオ
チドトリホスフェート（ｄＡＴＰ．ｄＣＴＰ．ｄＧＴ
Ｐ．ｄＴＴＰ）を各々２００μＭ、プライマー１及びプ
ライマー２（Ｄｅｍｍｌｅｒ，Ｇ，Ｔ．，ｅｔａｌ，
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８，１１７７（１９
８８））各１０μＭ、Ｔａｇポリメラーゼ２．５ｕ、
０．０１％ゼラチンを含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、５０ｍＭｋｃｌ、１．５ｍＭＭｇ
Ｃｌ2 、ｐＨ８．３）よりなる反応液２５μｌを加え、
変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５５℃、１
分）、伸長反応（７２℃、１分）を１サイクルとして、
４０サイクルの反応を繰り返し、目的配列の増幅を行な
った。
チドトリホスフェート（ｄＡＴＰ．ｄＣＴＰ．ｄＧＴ
Ｐ．ｄＴＴＰ）を各々２００μＭ、プライマー１及びプ
ライマー２（Ｄｅｍｍｌｅｒ，Ｇ，Ｔ．，ｅｔａｌ，
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８，１１７７（１９
８８））各１０μＭ、Ｔａｇポリメラーゼ２．５ｕ、
０．０１％ゼラチンを含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、５０ｍＭｋｃｌ、１．５ｍＭＭｇ
Ｃｌ2 、ｐＨ８．３）よりなる反応液２５μｌを加え、
変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５５℃、１
分）、伸長反応（７２℃、１分）を１サイクルとして、
４０サイクルの反応を繰り返し、目的配列の増幅を行な
った。
【００３１】増幅が終了した反応液を５％アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行
ない、目的の４３５ｂｐのバンドを測定した。結果を図
４に示す。
ドゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行
ない、目的の４３５ｂｐのバンドを測定した。結果を図
４に示す。
【００３２】
【発明の効果】本発明の装置は永久磁石の位置を変える
ことにより鉄片の励磁、消磁を制御している。従って、
高価な電磁石や電源、スイッチ等が不要であり、安価で
簡単な構造にすることができる。又本発明装置を用いる
ことにより、測定対象物が希薄な検体から、他の物を濃
縮することなく測定対象物のみを濃縮することができ
る。本装置を免疫測定に応用することにより、ノイズが
少なく安定したデータが得られること、測定試薬の感度
を上げることなく高感度の測定を行なうことなどが可能
である。従って、測定が困難であったＨＣＭＶ等の測定
を容易に行なうことができる。
ことにより鉄片の励磁、消磁を制御している。従って、
高価な電磁石や電源、スイッチ等が不要であり、安価で
簡単な構造にすることができる。又本発明装置を用いる
ことにより、測定対象物が希薄な検体から、他の物を濃
縮することなく測定対象物のみを濃縮することができ
る。本装置を免疫測定に応用することにより、ノイズが
少なく安定したデータが得られること、測定試薬の感度
を上げることなく高感度の測定を行なうことなどが可能
である。従って、測定が困難であったＨＣＭＶ等の測定
を容易に行なうことができる。
【図１】本発明装置の断面図である。
【図２】永久磁石を保持するホルダーの斜視図である。
【図３】ＨＣＭＶの２ｓｔｅｐ法とＥＬＩＳＡ法による
測定結果を示す図である。
測定結果を示す図である。
【図４】ＨＣＭＶのＰＣＲ法による測定結果を示す図で
ある。
ある。
１ プランジャー ２ シリンダー ３ 鉄製リング ４ 永久磁石 ５ ホルダー ６ 容器 ７ 鉄片
Claims (6)
- 【請求項１】 非磁性材料で成形されたシリンダーと、
複数の鉄片を予め充填した非磁性材料で成形された容器
と、永久磁石からなる磁性粒子回収装置。 - 【請求項２】 永久磁石がシリンダーと容器の結合部位
に２つの位置をとることができるように装着されている
ことを特徴とする請求項１に記載の磁性粒子回収装置。 - 【請求項３】 永久磁石が常磁性材料で成形されたリン
グ状のホルダーに保持されていることを特徴とする請求
項２に記載の磁性粒子回収装置。 - 【請求項４】 磁性粒子に抗体又は抗原を結合させ、請
求項１に記載の磁性粒子回収装置を用いる検体濃縮方
法。 - 【請求項５】 磁性粒子に抗体又は抗原を結合させ、請
求項４に記載の検体濃縮方法を用いる免疫化学的測定方
法。 - 【請求項６】 磁性粒子に抗体又は抗原を結合させ、請
求項４に記載の検体濃縮方法を用いるＰＣＲ測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27775692A JPH05203649A (ja) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | 磁性粒子回収装置およびそれを用いた検体濃縮方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27045991 | 1991-09-24 | ||
| JP3-270459 | 1991-09-24 | ||
| JP27775692A JPH05203649A (ja) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | 磁性粒子回収装置およびそれを用いた検体濃縮方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05203649A true JPH05203649A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=26549224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27775692A Pending JPH05203649A (ja) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | 磁性粒子回収装置およびそれを用いた検体濃縮方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05203649A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011059076A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 磁性試薬、磁性試薬キット、磁性担体処理方法およびその処理装置 |
| CN103769385A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 三星电机株式会社 | 磁性纳米颗粒的清洁设备以及磁性纳米颗粒的清洁方法 |
| CN115430471A (zh) * | 2018-09-05 | 2022-12-06 | 英雄科学有限公司 | 微粒测试的设备及方法 |
| US11577238B2 (en) | 2017-03-02 | 2023-02-14 | Hero Scientific Ltd. | Testing for particulates |
| US11885722B2 (en) | 2021-01-06 | 2024-01-30 | Hero Scientific Ltd. | Filtration sampling devices |
-
1992
- 1992-09-24 JP JP27775692A patent/JPH05203649A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011059076A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 磁性試薬、磁性試薬キット、磁性担体処理方法およびその処理装置 |
| JP5752042B2 (ja) * | 2009-11-13 | 2015-07-22 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 磁性試薬、磁性試薬キット、磁性担体処理方法およびその処理装置 |
| US9694368B2 (en) | 2009-11-13 | 2017-07-04 | Universal Bio Research Co., Ltd. | Magnetic reagent, magnetic reagent kit, method for treating magnetic carriers, and treatment device therefor |
| CN103769385A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 三星电机株式会社 | 磁性纳米颗粒的清洁设备以及磁性纳米颗粒的清洁方法 |
| US11577238B2 (en) | 2017-03-02 | 2023-02-14 | Hero Scientific Ltd. | Testing for particulates |
| US11890614B2 (en) | 2017-03-02 | 2024-02-06 | Hero Scientific Ltd. | Testing for particulates |
| CN115430471A (zh) * | 2018-09-05 | 2022-12-06 | 英雄科学有限公司 | 微粒测试的设备及方法 |
| US11680877B2 (en) | 2018-09-05 | 2023-06-20 | Hero Scientific Ltd. | Testing for particulates |
| US11885722B2 (en) | 2021-01-06 | 2024-01-30 | Hero Scientific Ltd. | Filtration sampling devices |
| US11921018B2 (en) | 2021-01-06 | 2024-03-05 | Hero Scientific Ltd. | Filtration sampling devices |
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