CN107245488A - 一种检测黄曲霉素b1的试纸条及方法 - Google Patents

一种检测黄曲霉素b1的试纸条及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种发卡式单链DNA，由a、b、c三段串联组成，其中，b段为黄曲霉素B1的适配体序列，a段可与c段互补，a段包含3‑30个核苷酸。本发明还提供了一种检测黄曲霉素B1的试纸条、该试纸条的用途及一种检测样品中黄曲霉毒素B1的方法。本发明发卡式单链DNA及试纸条及方法可以准确检测黄曲霉素B1，灵敏度和特异性高、适用性广，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。

Description

一种检测黄曲霉素B1的试纸条及方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉素B1的试纸条及方法。
背景技术
黄曲霉素B1(AFB1)是由黄曲霉和寄生曲霉等所产品的一种次生代谢物，其进入人体或者动物体内后，会导致急、慢性毒性，严重时，会导致人体或动物体发生癌变或畸变。近年来，黄曲霉素B1(AFB1)超标现象频繁的出现在各种食品、药品中，对人的健康构成严重威胁。
目前，检测AFB1的方法有很多，常用的有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、色谱质谱联用法、酶联免疫吸附法等。这类方法要么检测仪器和成本昂贵，要么存在操作不便、检测时间长等问题。
适配体(aptamer)为一种人工合成的单链的DNA或RNA序列，对特定的靶分子(如小分子，蛋白质等)具有很高的特异性，被认为是一种化学抗体。AFB1的特异性适配体于2012年被加拿大的Neoventures Biotechnology Inc公司首次报道。之后，基于适配体构建的AFB1的检测方法就越来越引起关注。目前，利用AFB1适配体建立的AFB1试纸条的检测方法有胶体金层析法、侧向层析定量法等，但灵敏度普遍较低。
公开为CN 105784990A的专利申请公开了一种利用适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条及检测方法，检测黄曲霉毒素B1的灵敏度为0.5ng/ml，仍需进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉素B1的试纸条及方法。
本发明提供了一种发卡式单链DNA，由a、b、c三段串联组成，其中，b段为黄曲霉素B1的适配体序列，a段可与c段互补，a段包含3-30个核苷酸。
其中，b段的序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，由a、b、c三段串联组成的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了上述DNA在制备检测黄曲霉素B1的试剂或试纸中的用途。
本发明还提供了一种用于检测黄曲霉素B1的试纸条，它包括上述DNA。
其中，它还包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。
其中，如图2(1)所示，试纸条包括样品吸收垫、标记物结合垫、反应膜和吸水纸垫、底板，反应膜上有检测区和质控区，标记物结合垫包被有标记探针，所述标记探针为荧光团标记的上述DNA；
检测区包被有检测探针，所述检测探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其由二段串联组成；一段为SEQ ID NO.3所示的序列，另一段为SEQ ID NO.1所述序列的非互补链，包含0-50个核苷酸；
质控区包被有质控探针，所述质控探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其与黄曲霉素B1的适配体序列互补；
优选地，
所述荧光团为荧光微球、胶体金，量子点，荧光蛋白，鲁米诺，Cy5；
所述检测探针为生物素标记的SEQ ID NO.4所示序列；
所述质控探针为生物素标记的EQ ID NO.5所示序列；
其中，所述生物素还偶联了链霉亲和素。
本发明还提供了上述试纸条的制备方法，步骤如下：
(1)取样品吸收垫、吸水纸垫，备用；
(2)合成上述标记探针，将其包被在标记物结合垫上，备用；
(3)制备反应膜：合成上述检测探针、质控探针；分别将链霉亲和素与检测探针、质控探针上的生物素偶联后，包被在反应膜上形成检测区、质控区，备用；
(4)依次将样品吸收垫、步骤(2)得到的标记物结合垫、步骤(3)制备的反应膜、吸水纸垫固定在底板上，即可。
包被方式为滴加，手动划线，喷涂，浸泡等方式。
所述底板的材料为PVC。
本发明还提供了上述试纸条在检测黄曲霉毒素B1中的用途。
本发明还提供了一种检测样品中黄曲霉毒素B1的方法，步骤如下：
(1)样品前处理；
(2)用上述试纸条进行检测；
(3)对检测结果进行分析，即可。
本发明AFB1试纸条检测待测样品中AFB1的原理：当待测样本中不含AFB1(见图2，(2)所示)，标记物结合垫处的标记探针随着层析方向向右移动，由于标记探针中的DNA分子发夹处的序列2(SEQ ID No.2)已经与序列3(SEQ ID No.3)形成双链，不会与反应膜的检测区的序列4(SEQ ID No.4)互补结合，因此在检测区不会出现亮线。当标记探针层析到质控区，标记探针中的AFB1适配体则会与质控区的序列5(SEQ ID No.5)互补结合，因此在质控区会出现亮线；当待测样本中含有AFB1(见图2，(3)所示)，AFB1先与标记物结合垫处的标记探针中的AFB1适配体结合，同时，标记探针中的DNA分子发夹的双链部分被打开，AFB1与标记探针形成的复合物层析到反应膜的检测区时，标记探针中的序列2(SEQ ID No.2)与检测区的序列4(SEQ ID No.4)互补结合，导致标记探针形成的复合物在检测区被捕获，从而检测区出现亮线。而过量未反应的标记探针层析到质控区处，被质控区的序列5(SEQ IDNo.5)捕获，从而质控区也出现亮线。待测样本中AFB1的含量越高，结合所述试纸条标记物结合垫处的标记探针的量就越多，未结合的标记探针就越少，检测区荧光信号T值就越大，对应的荧光信号的T/C值也就越大。根据T/C值，通过标准曲线方程就可以检测样本中的AFB1的含量。
一般检测AFB1的侧向层析方法均需要用载体蛋白，通过竞争法实现对AFB1的检测。本发明人通过设计特定的荧光团标记的核酸序列，建立了一种检测区信号从‘无’到‘有’的检测AFB1的试纸条及方法。
本发明发卡式单链DNA可以用于制备检测黄曲霉素B1的试纸条，使用本发明试纸条及方法可以准确检测黄曲霉素B1，灵敏度高达0.05ng/mL，灵敏度和特异性高、适用性广，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为荧光微球标记的DNA分子发夹的结构式图。
图2为本发明试纸条及方法的检测原理示意图。
图3为稀释AFB1标准品得到的AFB1的浓度梯度样本的检测结果。
图4为不同浓度的AFB1与荧光信号T/C值的标准曲线图。
图5为零浓度校准品与0.1ng/mL的标准品-T/C值的线性拟合曲线图。
图6为本发明试纸条及方法的特异性检测图。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。本发明所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1本发明AFB1试纸条及制备方法
一、试纸条的组成
本发明检测黄曲霉素B1的试纸条，如图2(1)所示。
试纸条包含底板，及依次固定在底板上的样品吸收垫、标记物结合垫、反应膜和吸水纸垫，反应膜上有检测区(T)和质控区(C)，试纸条由塑料卡壳包装。
其中，标记物结合垫包被有标记探针，标记探针为荧光团标记的SEQ ID NO.6所示序列；荧光团可以是荧光微球、胶体金，量子点，荧光蛋白，鲁米诺或Cy5；
检测区包被有检测探针，检测探针为链霉亲和素偶联生物素标记的SEQ ID NO.4所示序列；
质控区包被有质控探针，质控探针为链霉亲和素偶联生物素标记的SEQ ID NO.5所示序列。
二、试纸条的制备方法
本发明中所有序列均是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，生物素标记也是由该公司直接完成。
(一)标记探针、检测探针和质控探针的合成
1、标记探针的合成
标记探针为荧光微球标记的DNA分子发夹，见图1。荧光微球标记DNA分子发夹是通过碳二亚胺法实现的。
DNA分子发夹是由AFB1适配体(序列见SEQ ID No.1)构成的‘环’，以及两段互补序列(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)构成的‘茎’组成的；AFB1适配体与样品中的AFB1结合后，会导致‘茎’的部分被打开。
DNA分子发夹的核苷酸序列如下(SEQ ID No.6)：
5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTT-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-AAAAAAAA-3’。
AFB1适配体(SEQ ID NO.1)
GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA
SEQ ID NO.2：TTT TTT TT
SEQ ID NO.3：AAA AAA AA
2、检测探针的合成
检测探针为生物素标记的序列4(SEQ ID No.4)核苷酸序列，在AFB1适配体与样品中的AFB1结合导致‘茎’的部分被打开后，检测探针中的序列4(SEQ ID No.4)可以与标记探针中的序列2(SEQ ID No.2)段互补，从而实现检测区捕获荧光团。
SEQ ID NO.4AAA AAA AAA AAA
3、质控探针的合成
质控探针为生物素标记的AFB1适配体的互补单链挂核苷酸序列，可以与标记探针中的DNA分子的‘环’通过碱基互补结合。质控探针中的AFB1适配体的互补单链寡核苷酸序列为：
5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TACCC-AAC-3’
SEQ ID NO.5：
TGT GGG CCT AGC GAA GGG CAC GAG ACA CAG AGA GAC AAC ACG TAC CCA AC
(二)制备AFB1试纸条
1、标记物结合垫的制备
通过碳二亚胺法，在DNA分子发夹上偶联荧光微球，得到偶联物标记探针。然后利用喷金划膜仪(购自杭州峰航科技)，将标记探针喷涂在标记物结合垫上(怀远县通成纸制品有限公司，金标垫8955)，(包被浓度为0.5μM)，得到包被标记探针的标记物结合垫；
2、反应膜的制备
反应膜包括检测区(T)和质控区(C)。所用膜为Millipore 135的硝酸纤维素膜。
通过链霉亲和素与检测探针上的生物素反应，然后利用喷金划膜仪，将检测探针包被在反应膜上形成检测区，包被浓度为1μM。
链霉亲和素与质控探针上的生物素反应，然后利用喷金划膜仪，将质控探针包被在反应膜上形成质控区，包被浓度为1μM。
3、试纸条的制备
试纸条由样品吸收垫(怀远县通成纸制品有限公司，通用垫8975)、上述步骤1制备的包被标记探针的标记物结合垫、上述步骤2制备的反应膜、吸水纸垫依次按照顺序黏贴在PVC底板(怀远县通成纸制品有限公司，42PVC胶板)上，其顺序参照附图2(1)所示。
4、试纸条的卡壳组装
将步骤3制备得到的试纸条手动组装塑料卡壳(青岛广达森塑胶有限公司)，然后用压壳机压紧，得到成品的试纸条。
实施例2本发明AFB1试纸条的使用方法
一、使用本发明试纸条检测样品中是否存在AFB1
取待测样本100μL，从试纸条的样品滴加处加样，10分钟后，将滴加了待测样本的试纸条放入荧光测试仪FA50(深圳锦瑞生物科技股份有限公司)中，进行检测，当待测样本中不含AFB1，检测区不会出现亮线，质控区会出现亮线；当待测样本中含有AFB1，检测区出现亮线，质控区也出现亮线。待测样本中AFB1的含量越高，检测区出现亮线，质控区也出现亮线。
如果使用的荧光团的发射波长在人肉眼可见光的范围内(390～780nm)，例如胶体金，亮线可通过直接肉眼观察：如果使用的荧光团的发射波长不在人肉眼可见光的范围内，则需要使用荧光测试仪检测亮线。
二、使用本发明试纸条检测样品中AFB1含量
1、取AFB1的标准品，配制浓度梯度的系列样本(用水或生理盐水稀释配制)；
2、将配制的AFB1的标准品的每一个样本，分别取100uL，然后分别滴加到实施例1制备的试纸条的样品吸收垫上；10分钟后，将滴加了标准品的试纸条依次放入荧光测试仪FA50(深圳锦瑞生物科技股份有限公司)中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度，然后将检测区的荧光信号强度(T)比上质控区的荧光信号强度(C)，得到T/C值。根据每个样本的浓度与该浓度对应的荧光信号的T/C值，制作曲线并拟合线性方程，得到标准曲线方程。结果见图3-4。
3、将待测样本代替标准品溶液，用上述试纸条做相同过程的检测。记录该待测样本的检测区和质控区的荧光信号比值T/C，根据步骤2中的标准曲线方程，计算得到待测样本中AFB1的含量。
对待测样本的说明：待测样本可以是液体样本或固体样本。
液体样本：可以牛奶、口服液等，如果是高浓度液体样本，则需要进行样本稀释，用样本稀释液(如生理盐水，磷酸盐缓冲液)进行稀释，至AFB1检测的线性范围内。对于未知样本，直接测试时，根据得到的T/C值，通过线性方程来计算该未知样本的浓度，如果计算结果接近或超过线性范围的上限(本专利的AFB1的线性范围上限为50ng/mL)，则需要稀释样本进一步确定该未知样本浓度。稀释时，可以做10倍，100倍，甚至1000倍不同倍数的稀释确保稀释后的浓度在线性范围内。
固体样本：需要进行前处理过程，包括消解、萃取、稀释等。以花生粕为例，测定过程如下：称取1g花生粕，加入4mL正己烷和5mL70％的甲醇水溶液进行消解，离心后取下层液体1mL，加入9mL生理盐水进行萃取。然后取100μL样本滴加测试。如果样本超过了线性范围，则需要进一步稀释，直至稀释后的浓度在线性范围内，稀释时可以用生理盐水或者磷酸盐溶液。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明试纸条及方法的特异性检测
配制浓度为10ng/mL的AFB1、1000ng/mL的黄曲霉素M1(AFM1)、1000ng/mL的黄曲霉素G1(AFG1)、1000ng/mL的黄曲霉素B2(AFB2)、1000ng/mL的赭曲霉素A(OTA)、1000ng/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)，以及1000ng/mL的呕吐霉素(DON)溶液和空白样品，用实施例1制备的试纸条分别进行测定，用荧光检测仪FA50分别测定每个样本检测区和质控区处的荧光强度，结果见图6。
结果表明，6种干扰物(AFM1，AFG1，AFB2，OTA，ZEN，DON)虽然使用量为AFB1浓度的100倍，但得到的T/C值跟空白样品的T/C值相当；而相对它们1％浓度的AFB1得到的T/C值明显比空白样品大的多。
可见，本发明试纸条及方法，检测结果与样品的实际情况一致，说明本发明试纸条及方法具有良好的特异性，可以准确检测黄曲霉素B1。
试验例2、本发明试纸条及方法的灵敏度检测
灵敏度计算方法参照《GB/T 26124-2011临床化学体外诊断试剂(盒)》中给定的灵敏度计算方法进行，方法如下：
重复测定零浓度标准品(即样本稀释液，如生理盐水)20次，得出20次测量结果的T/C值，计算其平均值(CM)和标准差(SD)，得出CM+2SD所对应的T/C值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度(即0.1ng/mL)-T/C值结果进行两点回归拟合得出一次方程(见图5)，将CM+2SD所对应的T/C值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为检测灵敏度。根据此方法，得到所述方法的检测灵敏度为0.05ng/mL。
可见，本发明试纸条可以检测到0.05ng/mL的低浓度黄曲霉素B1，灵敏度高。
试验例3本发明试纸条及方法在牛奶AFB1检测中的应用
1、标准曲线的绘制
配制不同浓度的AFB1标准品水溶液，用实施例1制备的试纸条分别进行测定，用荧光检测仪FA50分别测定检测区和质控区的荧光强度，结果见图3。可见，随着AFB1浓度的增加，检测区处荧光强度与质控区的荧光强度的比值逐渐增强。利用T/C值，绘制检测AFB1的标准曲线见图4。得到标准曲线方程：Y＝0.05962X+0.07598，R2＝0.9922，其中Y为T/C，X为样本浓度值。
结果显示，在AFB1标准品的浓度在0.1～50ng/mL范围内，T/C值与标准品的浓度有很好的线性关系，R2为0.9922。
可见，本发明试纸条在线性范围具有良好的线性关系，R2>0.99，说明本发明试纸条能够准确的计量检测样本中的AFB1浓度。
2、样本的测定
取某品牌牛奶1mL，加入9mL pH7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后，将样品溶液分成两份，一份通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行检测,另外一份用上述制作的AFB1试纸条进行检测。
3、检测结果
液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法检测得到该品牌牛奶样本中AFB1的含量为12.5ng/mL。
通过AFB1试纸条测试得到的T/C值为0.1537，根据步骤1中的标准方程，以及稀释倍数，计算得到该牛奶样本中的AFB1的含量为13.04ng/mL，这一结果与LC-MS法误差低于10％。
可见，本发明试剂条及方法对黄曲霉素B1检测的结果与液相色谱-质谱联用法相当，说明本发明试剂条及方法可准确检测黄曲霉素B1。
综上，本发明试纸条及方法可以准确检测黄曲霉素B1，灵敏度和特异性高、适用性广，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山火炬职业技术学院
赵, 斌
<120> 一种检测黄曲霉素B1的试纸条及方法
<130> GY149-17P1211
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> AFB1适配体序列
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 检测探针的序列
<400> 2
aaaaaaaaaa aa 12
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 质控探针的引物
<400> 3
tgtgggccta gcgaagggca cgagacacag agagacaaca cgtacccaac 50
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> DNA分子发夹的核苷酸序列
<400> 4
ttttttttgt tgggcacgtg ttgtctctct gtgtctcgtg cccttcgcta ggcccacaaa 60
aaaaaa 66

Claims (10)

1.一种发卡式单链DNA，其特征在于：由a、b、c三段串联组成，其中，b段为黄曲霉素B1的适配体序列，a段可与c段互补，a段包含3-30个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于：b段的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于：由a、b、c三段串联组成的序列如SEQ IDNO.6所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的DNA在制备检测黄曲霉素B1的试剂或试纸中的用途。
5.一种用于检测黄曲霉素B1的试纸条，其特征在于：它包括权利要求1-3任意一项所述的DNA。
6.根据权利要求5所述的试纸条，其特征在于：它还包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。
7.一种检测黄曲霉素B1的试纸条，它包括样品吸收垫、标记物结合垫、反应膜和吸水纸垫、底板，反应膜上有检测区和质控区，其特征在于：
标记物结合垫包被有标记探针，所述标记探针为荧光团标记的权利要求1-3任意一项所述的DNA；
检测区包被有检测探针，所述检测探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其由二段串联组成；一段为SEQ ID NO.3所示的序列，另一段为SEQ ID NO.1所述序列的非互补链，包含0-50个核苷酸；
质控区包被有质控探针，所述质控探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其与黄曲霉素B1的适配体序列互补；
优选地，
所述荧光团为荧光微球、胶体金，量子点，荧光蛋白，鲁米诺，Cy5；
所述检测探针为生物素标记的SEQ ID NO.4所示序列；
所述质控探针为生物素标记的EQ ID NO.5所示序列；
其中，所述生物素还偶联了链霉亲和素。
8.权利要求5-7任意一项所述试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取样品吸收垫、吸水纸垫，备用；
(2)合成权利要求7所述的标记探针，将其包被在标记物结合垫上，备用；
(3)制备反应膜：合成权利要求7所述的检测探针、质控探针；分别将链霉亲和素与检测探针、质控探针上的生物素偶联后，包被在反应膜上形成检测区、质控区，备用；
(4)依次将样品吸收垫、步骤(2)得到的标记物结合垫、步骤(3)制备的反应膜、吸水纸垫固定在底板上，即可。
9.权利要求5-7任意一项所述试纸条在检测黄曲霉毒素B1中的用途。
10.一种检测样品中黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样品前处理；
(2)用权利要求5-7任一项所述的试纸条进行检测；
(3)对检测结果进行分析，即可。
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