KR101726213B1 - 카나마이신 검출용 핵산 압타머 - Google Patents

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윤문영
하나름
정인필
김상헌
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한양대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 항생제의 일종인 카나마이신 검출용 핵산 압타머에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 압타머는 구조적으로 안정하여 반감기가 길고 인공적인 합성이 용이하며, 각 염기 서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여 여러 방법을 이용하여 표적 물질을 검출할 수 있다. 본 발명의 카나마이신 검출용 핵산 압타머, 조성물, 검출 키트 또는 검출 방법을 이용하는 경우, 카나마이신을 높은 민감도로 간편하게 검출할 수 있다.

Description

카나마이신 검출용 핵산 압타머{Nucleotide Aptamer for Use in Detection of Kanamycin}
본 발명은 항생제의 일종인 카나마이신 검출용 핵산 압타머에 관한 것이다.
항생제의 사용 목적은 병원성 세균의 활동을 저해하거나 화학물질로써 사멸 또는 대사 경로에 이상을 일으키거나 발육에 필요한 단백질 합성 등을 저해하여 질병을 치료하거나 예방하는데 있다. 축산 환경에 대한 항생제의 급여는 유해 미생물이 배제된 분변을 유도하여 축사의 환경오염을 방지하고 인수공통 전염 병원지를 청결케하며 축산물이 보다 청결하게 생산되도록 도울 수 있는 효과가 있다. 그렇지만 항생제 오남용은 큰 부작용을 낳고 있는데, 그 부작용은 가축의 병원성 균에 대한 내성균 생성으로 축산물 잔류와 인간으로의 전이 등이다. 축산물의 생산성을 증대시키고 질병을 치료하기 위해 사료 첨가제로 사용되는 항생제가 반추가축의 위 내 미생물 성상에 변화를 주고, 세포 내에 침착되어 축산물로 잔류되며 이를 다시 인간이 섭취함으로써 인수공통 전염병의 감염률이 높아지고 각종 부작용(구토, 두통, 발진, 쇼크, 청각장애, 신장 기능 약화, 간 장애, 위장관 출혈 및 위궤양 등)의 위험에 노출됨으로써 인간의 건강에도 위협을 주게 된다.
유럽연합(European Union) 의회는 1998년 사료 첨가물에 관한 유럽의회 규정(Council Directive)을 개정하여 그 동안 사료 첨가용으로 허용되어 광범위하게 사용되었던 항생제 중 일부의 사용을 금지하였다. 이는 기존에 사용되어 오던 항생제에 대한 재평가의 필요성이 제기되었으며 항생제 내성의 심각성과 약품 개발과 대량생산에 있어서의 문제점, 항생제 자체의 화학물질이 체내 유전자에 미치는 영향이나 잔류 등의 문제가 심각하다는 것을 시사하는 것이다. 이렇듯 항생제의 오남용은 인체에 미치는 다양한 부작용과 항생제 내성을 갖는 슈퍼박테리아의 출현을 유도하므로 적합한 양의 항생제의 바른 용법이 대단히 중요시되고 있으며, 시장에서 배포 또는 판매 전에 농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)을 초과하는 항생제의 잔류를 포함하는 식품인지 아닌지 확인하여야 한다. 식품에서 항생제의 잔류 초과량이 심각한 문제를 발생시키기 때문에, 보다 믿을만하고, 정확한, 쉬운 탐지 시스템이 요구된다.
카나마이신(Kanamycin)은 아미노글리코사이드 계열의 항생물질 (Aminoglycoside antibiotics)로서 다양한 감염의 치료용으로 사용되고 있다. 아미노글리코사이드 계열 항생물질은 그람 음성(Gram negative) 세균의 외막에 있는 포린(porine)이라는 구멍 단백 통로를 통하여 세포질 주위 공간으로 이동하며, 이후 능동적인 운반에 의하여 세포 내로 이동한다. 카나마이신은 원핵세포의 리보솜의 30s 서브유닛과 상호작용하여 오역(mistranslation)을 유도하고 전좌(translocation)를 막음으로써 단백질 합성을 억제하여 살균작용을 나타낸다. 대부분 그람 음성균에 항균력이 좋지만 혐기성 세균에는 항균력이 없으며, 경구 투여시 위장관에서의 흡수가 거의 일어나지 않고, 콩팥의 독성화 및 이(耳)독성(청력 손실) 등의 심각한 부작용을 초래하기 때문에 신장 기능이 저하된 환자에게는 혈중 농도를 측정해가면서 주의해서 투여해야 한다.
압타머 (Aptamer)는 저분자 탐침으로써 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이(20~60 뉴클레오티드)의 단일가닥 핵산(DNA 혹은 RNA) 조각을 뜻한다. 압타머의 개발은 SELEX라는 방법을 통해 생체 외(In Vitro)에서 이루어진다. SELEX는 'Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment'의 약자로서 이 방법을 이용하여 특정 분자에 높은 결합력을 갖는 핵산 압타머를 얻게 된다. 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다. (1) 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 가능하다. (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있다. (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높다. (4) 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 독소 등에 대한 압타머의 개발이 가능하다. (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하다. (6) 생체 내 면역반응을 거의 일으키지 않는다.
카나마이신 검출을 위한 종래 기술로서 대한민국 특허 출원 제10-2013-0068734호가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 항생제의 일종인 카나마이신을 검출할 수 있는 핵산 압타머 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소정의 서열을 포함하는 핵산 압타머가 카나마이신에 대한 결합력을 가짐을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 카나마이신 검출용 핵산 압타머를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 카나마이신 검출용 조성물을 이용하는 카나마이신 검출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5 서열, 제7 서열 및 제9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 카나마이신 검출용 핵산 압타머를 제공한다.
본 발명자들은 항생제의 일종인 카나마이신을 검출할 수 있는 핵산 압타머 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소정의 서열을 포함하는 핵산 압타머가 카나마이신에 대한 결합력을 가짐을 규명하였다.
본 발명의 카나마이신은 아미노글리코사이드 계열의 항생물질 (Aminoglycoside antibiotics)로서 다양한 감염의 치료용으로 사용되고 있다. 아미노글리코사이드 계열 항생물질은 그람 음성(Gram negative) 세균의 외막에 있는 포린(porine)이라는 구멍 단백 통로를 통하여 세포질 주위 공간으로 이동하며, 이후 능동적인 운반에 의하여 세포 내로 이동한다. 카나마이신은 원핵세포의 리보솜의 30s 서브유닛과 상호작용하여 오역(mistranslation)을 유도하고 전좌(translocation)를 막음으로써 단백질 합성을 억제하여 살균작용을 나타낸다. 대부분 그람 음성균에 항균력이 좋지만 혐기성 세균에는 항균력이 없으며, 경구 투여시 위장관에서의 흡수가 거의 일어나지 않고, 콩팥의 독성화 및 이(耳)독성(청력 손실) 등의 심각한 부작용을 초래한다. 이러한 문제를 예방하고자 카나마이신을 사전 검출하기 위해, 본 발명자들은 카나마이신에 대한 결합력을 갖는 소정의 서열의 핵산 압타머 프로브를 개발하였다.
본 발명의 "핵산 압타머"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 변형체를 의미한다. 본 발명의 핵산 압타머는 단일가닥 DNA, RNA 등의 형태로 제공되며, 본 발명의 서열목록 제5서열, 제7서열 및 제9서열을 비롯한 제1 내지 제4서열, 제6서열 및 제8서열은 DNA 압타머 서열을 나타내고, 상기 DNA 압타머의 핵산 염기 서열 중 티미딘이 우라실로 대체된 RNA 압타머 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
본 명세서 상의 용어 "핵산"은 "뉴클레오타이드"로도 기재할 수 있으며, 동일한 의미를 갖고, 데옥시리보 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 핵산 압타머의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 핵산 압타머는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 압타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 압타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 압타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 압타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
SELEX는 무작위 서열(randomized sequences)로 구성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀(pool) 또는 라이브러리를 필요로 한다. 본 발명에서의 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 100개 미만의 핵산을 포함하는 핵산 중합체를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 풀은 100% 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열이 무작위 서열 부위에 포함된 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 5' 및/또는 3'말단이 올리고뉴클레오타이드 풀의 모든 분자에서 공유되는 서열로 구성될 수 있는 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열을 포함하는 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레이타이드 풀은 바람직하게는 무작위 서열 부분뿐 만 아니라 효과적인 복제를 위해 필수적인 고정된 서열(fixed sequences)을 포함한다. 초기 풀의 올리고뉴클레오타이드는 고정된 5'및 3' 말단 서열을 포함하는데 그 내부에 대략 20-50개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 30개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된 라이브러리를 이용하였으며, 서열 증폭 과정에서 상기 뉴클레오타이드 서열 길이는 변화될 수 있다. 무작위 뉴클레오타이드는 화학적 합성 및 무작위로 절단된 세포 내 핵산으로부터 선택함으로써 생산할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 소정의 길이의 무작위 서열 부분을 포함하고, 리보뉴클레오타이드 및/또는 디옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 변형 또는 변형되지 않은 자연형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그일 수 있다(U.S. Patent No. 5,958,691; U. S. Patent No. 5,660,985; U.S. Patent No. 5,958,691; U.S. Patent No. 5,698, 687; U.S. Patent No. 5,817, 635; U.S. Patent No. 5,672,695, 및 PCT Publication WO 92/07065). 무작위 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-연결 뉴클레오타이드로부터 합성할 수 있다(Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986), Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578(1986)). 또한, 무작위 올리고뉴클레오타이드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 액체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다(Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557(1977), Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449(1978)).
본 발명의 일 구현예에 있어서, (a) 본 발명의 제5 서열의 5' 말단에 서열목록 제10 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-10 개의 염기로 이루어진 제1 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, (b) 본 발명의 제5 서열의 3' 말단에, 서열목록 제11 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12개 염기로 이루어진 제2 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, 또는 (c) 본 발명의 제1 및 제2 연장 서열이 각각 제5 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 추가적으로 더 결합된다. 본 발명의 제5 서열의 5' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제1 연장 서열은 서열목록 제10 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-10 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-C-3', 5'-CC-3', 5'-TCC-3', 5'-ATCC-3', 5'-GATCC-3', 5'-GGATCC-3', 5'-CGGATCC-3', 5'-GCGGATCC-3', 5'-TGCGGATCC-3', 또는 5'-ATGCGGATCC-3'이다. 또한, 본 발명의 제5 서열의 3' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제2 연장 서열은 서열목록 제11 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-C-3', 5'-CT-3', 5'-CTG-3', 5'-CTGG-3', 5'-CTGGT-3', 5'-CTGGTT-3', 5'-CTGGTTT-3', 5'-CTGGTTTG-3', 5'-CTGGTTTGC-3', 5'-CTGGTTTGCA-3', 5'-CTGGTTTGCAC-3', 또는 5'-CTGGTTTGCACC-3'이다. 상술한 제1 연장 서열 및 제2 연장 서열은 반드시 택일적으로 결합되어야 하는 것은 아니고, 제1 연장 서열 및 제2 연장 서열이 각각 서열목록 제5 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 결합되는 것이 가능하다. 즉 본 발명의 제5 서열은 5' 말단 또는 3' 말단 방향으로 택일적으로 연장되는 것도 가능하고, 5' 말단 및 3' 말단이 모두 연장되는 것도 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상술한 핵산 압타머는 서열목록 제4 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제4 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제5 서열의 핵산 압타머의 5' 말단에 제10 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합되고, 3' 말단에 제11 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (b) 본 발명의 제4 서열의 3' 말단에, 서열목록 제12 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-15개 염기로 이루어진 제3 연장 서열이 추가적으로 더 결합된다.
본 발명의 제4 서열의 3' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제3 연장 서열은 서열목록 제10 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-15 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-G-3', 5'-GC-3', 5'-GCG-3', 5'-GCGC-3', 5'-GCGCG-3', 5'-GCGCGA-3', 5'-GCGCGAA-3', 5'-GCGCGAAG-3', 5'-GCGCGAAGC-3', 5'-GCGCGAAGCT-3', 5'-GCGCGAAGCTT-3', 5'-GCGCGAAGCTTG-3', 5'-GCGCGAAGCTTGC-3', 5'-GCGCGAAGCTTGCG-3', 또는 5'-GCGCGAAGCTTGCGC-3'이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 압타머는 서열목록 제1 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제1 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제4 서열의 핵산 압타머의 3' 말단에 제12 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 제1 서열로 이루어진 핵산 압타머는 도 3에 나타낸 압타머 1로서, 도3에 나타낸 바와 같은 안정한 구조를 가지며, 압타머 1의 "RP"로 표시한 역방향 프라이머 결합 부위를 절단한 것이 서열목록 제4서열로 표시되는 압타머 1-1이고, 이의 말단 스템-루프 구조만이 남도록 절단한 것이 서열목록 제 5서열로 표시되는 압타머 1-2이다. 본 발명자들은 압타머 1 서열의 안정한 구조 중 스템-루프 부분 서열인 서열목록 제5 서열 만을 이용하는 경우에도, 카나마이신에 대한 결합력이 우수하게 유지된다는 것을 규명하였고(참조: 도 4), 서열목록 제5 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 상술한 바와 같은 추가적인 서열들이 더욱 결합된 서열들의 경우에도 카나마이신에 대한 결합력을 갖는다는 것을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (a) 본 발명의 제7 서열의 5' 말단에 서열목록 제13 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-8 개의 염기로 이루어진 제4 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, (b) 본 발명의 제7 서열의 3' 말단에, 서열목록 제14 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12개 염기로 이루어진 제5 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, 또는 (c) 본 발명의 제4 및 제5 연장 서열이 각각 제7 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 추가적으로 더 결합된다.
본 발명의 제7 서열의 5' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제4 연장 서열은 서열목록 제13 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-8 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-G-3', 5'-CG-3', 5'-GCG-3', 5'-AGCG-3', 5'-AAGCG-3', 5'-GAAGCG-3', 5'-GGAAGCG-3', 또는 5'-CGGAAGCG-3'이다. 또한, 본 발명의 제7 서열의 3' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제5 연장 서열은 서열목록 제14 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-C-3', 5'-CG-3', 5'-CGA-3', 5'-CGAA-3', 5'-CGAAG-3', 5'-CGAAGC-3', 5'-CGAAGCT-3', 5'-CGAAGCTT-3', 5'-CGAAGCTTG-3', 5'-CGAAGCTTGC-3', 5'-CGAAGCTTGCG-3', 또는 5'-CGAAGCTTGCGC-3'이다. 상술한 제4 연장 서열 및 제5 연장 서열은 반드시 택일적으로 결합되어야 하는 것은 아니고, 제4 연장 서열 및 제5 연장 서열이 각각 서열목록 제7 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 결합되는 것이 가능하다. 즉 본 발명의 제7 서열은 5' 말단 또는 3' 말단 방향으로 택일적으로 연장되는 것도 가능하고, 5' 말단 및 3' 말단이 모두 연장되는 것도 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상술한 핵산 압타머는 서열목록 제6 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제6 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제7 서열의 핵산 압타머의 5' 말단에 제13 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합되고, 3' 말단에 제14 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (b) 본 발명의 제6 서열의 5' 말단에, 서열목록 제15 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-21개 염기로 이루어진 제6 연장 서열이 추가적으로 더 결합된다.
본 발명의 제6 서열의 5' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제6 연장 서열은 서열목록 제15 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-21 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-CAA-3', 5'-CCAA-3', 5'-ACCAA-3', 5'-GACCAA-3', 5'-CGACCAA-3', 5'-GCGACCAA-3', 5'-CGCGACCAA-3', 5'-GCGCGACCAA-3', 5'-CGCGCGACCAA-3', 5'-CCGCGCGACCAA-3', 5'-CCCGCGCGACCAA-3', 5'-TCCCGCGCGACCAA-3', 5'-ATCCCGCGCGACCAA-3', 5'-GATCCCGCGCGACCAA-3', 5'-GGATCCCGCGCGACCAA-3', 5'-CGGATCCCGCGCGACCAA-3', 5'-GCGGATCCCGCGCGACCAA-3', 5'-TGCGGATCCCGCGCGACCAA-3', 또는 5'-ATGCGGATCCCGCGCGACCAA-3'이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 압타머는 서열목록 제2 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제2 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제6 서열의 핵산 압타머의 5' 말단에 제15 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 제2 서열로 이루어진 핵산 압타머는 도 3에 나타낸 압타머 2로서, 도3에 나타낸 바와 같은 안정한 구조를 가지며, 압타머 2의 "FP"로 표시한 정방향 프라이머 결합 부위를 절단하고 추가적으로 5' 말단의 5'-GACCAA-3' 서열을 추가적으로 제거한 것이 서열목록 제6 서열로 표시되는 압타머 2-1이고, 이의 말단 스템-루프 구조만이 남도록 절단한 것이 서열목록 제7 서열로 표시되는 압타머 2-2이다. 본 발명자들은 압타머 2 서열의 안정한 구조 중 스템-루프 부분 서열인 서열목록 제7 서열 만을 이용하는 경우에도, 카나마이신에 대한 결합력이 우수하게 유지된다는 것을 규명하였고(참조: 도 4), 서열목록 제7 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 상술한 바와 같은 추가적인 서열들이 더욱 결합된 서열들의 경우에도 카나마이신에 대한 결합력을 갖는다는 것을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (a) 본 발명의 제9 서열의 5' 말단에 서열목록 제16 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-13 개의 염기로 이루어진 제7 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, (b) 본 발명의 제9 서열의 3' 말단에, 서열목록 제17 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12개 염기로 이루어진 제8 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, 또는 (c) 본 발명의 제7 및 제8 연장 서열이 각각 제9 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 추가적으로 더 결합된다.
본 발명의 제9 서열의 5' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제7 연장 서열은 서열목록 제16 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-13 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-G-3', 5'-CG-3', 5'-GCG-3', 5'-AGCG-3', 5'-AAGCG-3', 5'-GAAGCG-3', 5'-GGAAGCG-3', 5'-CGGAAGCG-3', 5'-ACGGAAGCG-3', 5'-AACGGAAGCG-3', 5'-CAACGGAAGCG-3', 5'-CCAACGGAAGCG-3' 또는 5'-ACCAACGGAAGCG-3'이다. 또한, 본 발명의 제9 서열의 3' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제8 연장 서열은 서열목록 제17 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-C-3', 5'-CG-3', 5'-CGA-3', 5'-CGAA-3', 5'-CGAAG-3', 5'-CGAAGC-3', 5'-CGAAGCT-3', 5'-CGAAGCTT-3', 5'-CGAAGCTTG-3', 5'-CGAAGCTTGC-3', 5'-CGAAGCTTGCG-3' 또는 5'-CGAAGCTTGCGC-3'이다. 상술한 제7 연장 서열 및 제8 연장 서열은 반드시 택일적으로 결합되어야 하는 것은 아니고, 제7 연장 서열 및 제8 연장 서열이 각각 서열목록 제9 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 결합되는 것이 가능하다. 즉 본 발명의 제9 서열은 5' 말단 또는 3' 말단 방향으로 택일적으로 연장되는 것도 가능하고, 5' 말단 및 3' 말단이 모두 연장되는 것도 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상술한 핵산 압타머는 서열목록 제8 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제8 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제9 서열의 핵산 압타머의 5' 말단에 제16 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합되고, 3' 말단에 제17 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (b) 본 발명의 제8 서열의 5' 말단에, 서열목록 제18 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-15개 염기로 이루어진 제9 연장 서열이 추가적으로 더 결합된다.
본 발명의 제8 서열의 5' 말단에 추가적으로 더 결합될 수 있는 제9 연장 서열은 서열목록 제18 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-15 개의 염기로 이루어진 서열로서, 구체적으로 예를 들면, 5'-C-3', 5'-GC-3', 5'-CGC-3', 5'-GCGC-3', 5'-CGCGC-3', 5'-CCGCGC-3', 5'-CCCGCGC-3', 5'-TCCCGCGC-3', 5'-ATCCCGCGC-3', 5'-GATCCCGCGC-3', 5'-GGATCCCGCGC-3', 5'-CGGATCCCGCGC-3', 5'-GCGGATCCCGCGC-3', 5'-TGCGGATCCCGCGC-3', 또는 5'-ATGCGGATCCCGCGC-3'이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 압타머는 서열목록 제3 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제3 서열로 이루어진 핵산 압타머는 서열목록 제8 서열의 핵산 압타머의 5' 말단에 제18 서열의 핵산 서열이 추가적으로 결합된 핵산 압타머이다.
본 발명의 제3 서열로 이루어진 핵산 압타머는 도 3에 나타낸 압타머 3으로서, 도 3에 나타낸 바와 같은 안정한 구조를 가지며, 압타머 3의 "FP"로 표시한 정방향 프라이머 결합 부위를 절단한 것이 서열목록 제8 서열로 표시되는 압타머 3-1이고, 이의 말단 스템-루프 구조만이 남도록 절단한 것이 서열목록 제9 서열로 표시되는 압타머 3-2이다. 본 발명자들은 압타머 3 서열의 안정한 구조 중 스템-루프 부분 서열인 서열목록 제9 서열 만을 이용하는 경우에도, 카나마이신에 대한 결합력이 우수하게 유지된다는 것을 규명하였고(참조: 도 4), 서열목록 제9 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 상술한 바와 같은 추가적인 서열들이 더욱 결합된 서열들의 경우에도 카나마이신에 대한 결합력을 갖는다는 것을 규명하였다.
본 발명의 상술한 핵산 압타머들은 DNA 압타머 서열을 나타내고, 상기 DNA 압타머의 핵산 서열 중 티미딘이 우라실로 대체된 RNA 압타머 서열을 이용하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 핵산 압타머는 상술한 핵산 서열들과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명의 카나마이신 검출용 조성물은 상술한 핵산 압타머 외에도 핵산 압타머의 안정적인 보관 및 보존을 위한 당업계에 공지된 담체 및/또는 보존제, 안정제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 압타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것이다. 핵산 압타머에 검출 가능한 표지를 부착시킴으로써, 타겟과 핵산 압타머의 결합 여부 및 결합 정도를 용이하게 관찰 및 측정 가능하다. 상기 검출 가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있고, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기 화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기 또는 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광 물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다. 또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다. 상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 핵산 압타머가, 예를 들어 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 유리 슬라이드 등의 지지체 상에 고정화되어 이용될 수 있다. 지지체의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 지지체의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 다만, 프로브가 고정된 후에는 배경신호 감소를 위해, 잔여 작용기를 블록킹시키는 처리를 통해 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브 또는 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일 또는 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 카나마이신 검출 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 다른 일 양태로서 상술한 카나마이신 검출용 조성물을 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a) 이후 상기 조성물과 대상 시료의 결합 신호를 측정하는 단계.
본 발명의 "대상 시료"는 카나마이신의 검출 여부 판단의 대상이 되는 객체를 의미하고, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 예를 들어, 항생제 이용의 대상이 되는 다양한 농·축산물 제품으로부터 카나마이신을 검출하는데 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단계 (b)에서의 결합 신호 측정은 사용된 검출 신호의 특성에 따라 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있고, 대조군에 비하여 증가된 신호를 보이는지 여부를 판단하여 카나마이신의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 카나마이신 검출용 핵산 압타머를 제공한다.
(b) 본 발명은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 상술한 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출 키트를 제공한다.
(d) 본 발명은 상술한 카나마이신 검출용 조성물을 이용하는 카나마이신 검출 방법을 제공한다.
(e) 본 발명의 핵산 압타머는 구조적으로 안정하여 반감기가 길고 인공적인 합성이 용이하며, 각 염기 서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여 여러 방법을 이용하여 표적 물질을 검출할 수 있다.
도 1은 카나마이신 검출용 압타머 발굴을 위한 타겟 물질의 고정화 및 이의 확인 결과를 나타낸다. NOS 그룹이 코팅된 플레이트의 작용기와 카나마이신의 1차 아민 사이의 아마이드 결합 형성을 통하여 타겟 항생물질을 고정시켰다. 도 1의 (A)는 1차 아민을 갖지 않는 6개의 타이민으로 이루어진 신호 검출용 DNA 프로브의 포화농도를 바이오틴-스트렙트아비딘 결합으로 측정한 결과 25 nM의 신호 검출용 DNA 프로브 포화농도를 결정하였다. 도 1의 (B)는 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 다양한 농도의 카나마이신을 고정시킨 후 25 nM 신호 검출용 DNA 프로브를 각각 처리하여 감소하는 신호를 측정하였다. NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정되는 카나마이신의 포화농도는 500 μM 로 결정하였다.
도 2는 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 카나마이신을 고정시킨 후 진행하는 SELEX 모식도 및 비대칭 PCR을 통한 단일핵산 증폭 결과를 나타낸다. 플레이트에 고정된 카나마이신에 랜덤 단일핵산 DNA 라이브러리를 일정 조건동안 반응시킨 후 세척 과정을 통한 결합하지 않은 핵산을 제거하고, 용출과정을 통하여 카나마이신 특이적 결합 핵산을 선별하였다. 선별된 용출 산물은 비대칭 PCR 방법을 통해 단일핵산을 증폭시켰다. M은 25/100 bp DNA 마커, 1-4는 비대칭 PCR 산물을 나타낸다.
도 3은 카나마이신에 특이적으로 결합하는 압타머의 2차 구조 분석 결과를 나타낸다. M-fold 프로그램을 통해 SELEX 과정을 통해 발굴한 3가지 압타머 및 특정 서열을 절단한 변형 압타머의 구조 분석을 진행하였다. FP는 정방향 프라이머 결합 부위, RP는 역방향 프라이머 결합 부위를 나타낸다.
도 4는 주요 잔류 항생물질인 카나마이신에 결합하는 압타머의 결합력(Kd) 분석 결과를 나타낸다. 상기에서 선별한 3종 및 각각의 변형 압타머 5'지역에 Biotin 물질을 라벨링하여 결합력을 분석하였다. 압타머의 결합력(Kd)은 대부분 나노몰라 농도(nM) 수준으로 카나마이신에 결합하는 것을 확인하였다.
도 5는 발굴한 압타머의 특이도 분석 결과를 나타낸다. 카나마이신과 동일 계열에 속하는 항생제인 스트렙토마이신, 디하이드로스트렙토마이신과 다른 계열에 속하는 항생제인 앰피실린, 테트라싸이클린에 대한 압타머의 결합을 통하여 특이도를 분석하였다. 본 발명에서 발굴한 3종의 압타머 및 각 유도체(1 μM) 모두 카나마이신에 특이적인 결합을 갖는 것을 확인하였다.
도 6은 혈청 수준에서의 발굴한 압타머의 특이도 분석 결과를 나타낸다. 소혈청알부민(BSA), 소혈청(BS), 토끼혈청(RS)과 본 발명에서 발굴한 압타머 2와 그 외의 각 유도체(1 μM) 사이의 특이도를 분석하였다. 각 압타머 유도체 모두 혈청 수준에서도 타겟 물질에 대한 결합 특이도를 나타내었다.
도 7은 발굴한 압타머의 카나마이신 검출한계 분석 결과를 나타낸다. 본 발명에서 발굴한 압타머 유도체들의 카나마이신 검출한계를 분석한 결과 6.25-50 nM(3.6-28.8 ng/ml) 범위의 카나마이신의 검출이 가능하였다. 이러한 수치는 식약처에서 고시한 식육 중 잔류 항생물질 허용치인 100 ng/ml 보다 훨씬 더 낮은 값으로 본 발명에서 개발한 압타머의 높은 민감도를 통하여 극미량의 카나마이신을 검출 가능함을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 카나마이신 항생제의 고정 및 이의 확인
가축 도축 전 존재하는 주요 잔류 항생물질의 하나인 카나마이신 검출용 압타머를 스크리닝 하기 위해서 타겟 물질인 카나마이신을 NOS(N-oxysuccinimide) 그룹이 코팅된 플레이트에 고정하는 작업을 진행하였다. NOS(N-oxysuccinimide) 그룹은 약알칼리 조건에서 1차 아민과 반응함으로써 아마이드 결합을 형성하는 특이적인 작용기이다. 카나마이신에는 다수의 1차 아민기가 존재하기 때문에 약알칼리 조건에서 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 카나마이신을 처리하여 2시간 반응시킴으로써 플레이트 위에 아마이드 결합 형성을 통하여 카나마이신을 고정시킬 수 있다.
먼저 플레이트에 고정된 카나마이신을 확인하고자 신호 검출용 DNA 프로브를 합성하였다. 신호 검출용 DNA 프로브는 1차 아민을 갖지 않는 핵산 염기인 타이민(Thymine, T) 6개로 이루어지도록 제작하였다. 신호 검출용 DNA 프로브는 5' 말단에는 바이오틴(Biotin)을 라벨링함으로써, 겨자무과산화수소(Horseradish peroxidase)가 연결된 스트렙트아비딘(Streptavidin-HRP)에 의한 발색 신호를 보고자 하였고, 3' 말단에는 1차 아민기로 변형시킴으로써 NOS 그룹과의 반응을 유도하고자 하였다. 타이민에는 1차 아민기가 없으므로, 신호 검출용 DNA 프로브는 방향성을 갖으며 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정될 수 있다.
신호 검출용 DNA 프로브 : 5'-비오틴-TTTTTT-NH2-3'
NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 신호 검출용 DNA 프로브를 농도별로 희석시켜 약알칼리 조건에서 2 시간 반응시킨 후 바이오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 이용하여 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정된 신호 검출용 DNA 프로브의 포화 농도를 결정하였다. 좀 더 구체적으로, 다양한 농도의 신호 검출용 DNA 프로브를 pH 8.5 조건에서 클리어 바텀(clear bottom) NOS-코팅된(coated) 96 웰 플레이트에 2시간 동안 고정시킨 후 세척용액 1X PBST (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0.1 % Tween-20 in dH2O, pH 8.5)으로 3번 세척해 준 뒤, 스트렙트아비딘 (Streptavidin-HRP)를 1시간동안 반응시켜 주었다. 세척용액으로 다시 5번 씻어낸 후 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. NOS 그룹이 코팅된 웰(well)에 고정된 신호 검출용 DNA 프로브 농도에 따른 신호 강도를 450 nm에서 측정하였고, 도 1(A)에서 보는 바와 같이 25 nM의 신호 검출용 DNA 프로브를 처리하였을 때 각 NOS 그룹이 코팅된 웰(well)에 포화된 것을 확인하였다.
NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정되는 카나마이신의 포화 농도를 결정하고자 카나마이신을 다양한 농도별로 희석시켜 약알칼리조건에서 2시간 반응시킨 후 신호 검출용 DNA 프로브를 처리 후 바이오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 이용하여 카나마이신의 포화농도를 결정하였다. 좀 더 구체적으로, 다양한 농도의 카나마이신을 pH 8.5 조건에서 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 2시간 동안 고정시킨 후 세척용액으로 3번 세척해 준 뒤, 포화농도인 25 nM의 신호 검출용 DNA 프로브를 처리하여 플레이트 웰의 비어있는 NOS 그룹과 신호 검출용 DNA 프로브의 1차 아민기가 반응할 수 있도록 하였다. 세척 용액으로 5번 씻어낸 후, 스트렙트아비딘을 1시간 반응시키고 세척 용액으로 다시 7번 씻어낸 후 TMB 기질 용액을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 카나마이신이 많이 존재할수록, 각 well에 반응할 수 있는 NOS 그룹이 적게 존재하여, 신호 강도가 감소하는 것을 확인하였고, 도 1(B)에서 보는 바와 같이 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 포화되는 카나마이신 농도는 500 nM임을 확인하였다.
실시예 2: 카나마이신에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 스크리닝
대략 7.2 × 1014개의 서로 다른 DNA 서열들로 구성된 랜덤 단일가닥 DNA 라이브러리(Bioneer, Deajeon, Korea)로부터 가축 도축 전 주요 잔류 항생제인 카나마이신에 특이적으로 결합할 수 있는 단일가닥 DNA 압타머를 SELEX 방법에 의해 선별하였다. 상기 실시예 1의 방법을 이용하여 카나마이신 고정 시킨 후, 이에 대한 특이적 결합 압타머를 발굴하기 위해서는, 가장 먼저 랜덤 DNA 라이브러리가 필요하다. 이를 위해 총 60개 염기에서 30개는 랜덤으로 구성된 염기서열((N)30)을 포함한 단일가닥 DNA 라이브러리(5'-ATGCGGATCCCGCGC(N)30GCGCGAAGCTTGCGC-3')를 이용하였다. 주형(template) DNA 라이브러리를 증폭시키기 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하고 합성하였다.
정방향 프라이머 : 5'-ATGCGGATCCCGCGC-3' (BamH I)
역방향 프라이머 : 5'-GCGCAAGCTTCGCGC-3' (Hind III)
단일가닥 DNA 만을 얻기 위해 100 uM의 정방향 프라이머, 10 μM의 역방향 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR로 주형 DNA 라이브러리를 증폭시켰다. PCR 산물은 2.5 % 아가로즈 겔에 전기영동하여 산물을 육안으로 확인하였다. PCR 수행 후 단일가닥 DNA 라이브러리를 분리하기 위하여 Crush and Soak 방법을 이용하였다. PCR 산물을 12 % 네이티브 겔에 전기영동하여 이중가닥과 단일가닥 DNA를 분리하였다. 전기영동 후 EtBr로 DNA를 염색 후 단일가닥 DNA 밴드를 절단한 후, 절단된 겔을 크러쉬 소크 버퍼(Crush and Soak buffer) (500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)에 분쇄하여 단일가닥 DNA를 추출하였다. 추출물을 원심분리하여 고형 겔을 분리 후 에탄올 침전 등을 통하여 정제 후 UV/Vis 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용하여 정량하여 SELEX에 사용하였다. 단일가닥 DNA 라이브러리를 이용하여 카나마이신에 특이적으로 결합하는 압타머를 스크리닝하기 위하여 SELEX 과정을 수행하였다. 항생제와 같은 저분자 물질에 대한 압타머를 스크리닝하기 위한 방법으로는 타겟 물질에 존재하는 1차 아민기와 결합할 수 있는 특정 작용기를 갖는 비드(Bead)를 이용한 방법이 많이 사용되었지만, 본 발명에서는 기존의 SELEX 방법에서 변형된 방법으로 NOS 그룹이 코팅된 플레이트를 이용하여 타겟 항생물질을 고정하였다. 카나마이신에 존재하는 1차 아민과 NOS 그룹이 반응하여 아마이드 결합의 형성으로 카나마이신을 플레이트 위에 고정하였고, 반응하지 않고 남아 있는 NOS 그룹에 의한 영향을 막고자 1차 아민을 갖고 있는 저분자 화합물인 트리스(Tris)를 이용하여 블록킹(Blocking)을 시켜주었다. 이 후 단일가닥 DNA 라이브러리를 처리하여 카나마이신과 결합시키고 세척 과정을 거친 후, 염기성 용액인 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 카나마이신과 결합한 단일가닥 DNA 라이브러리를 용출하였다. 각 라운드의 용출물은 비대칭 PCR을 통해 증폭하였고 12% 네이티브 DNA 전기영동을 통하여 카나마이신에 결합하는 DNA 서열만을 얻고 다음 라운드를 진행하였다(참조: 도 2). 이 때 카나마이신과 단일핵산 DNA를 결합시킬 때 버퍼 조성, 결합 시간 등의 결합조건 변화를 통하여(참조: 표 1) 극한 조건에서도 카나마이신에 높은 결합력으로 결합할 것으로 예상되는 ssDNA를 확보하였다.
6 라운드 과정에서는 ssDNA의 비특이적 결합을 최소화하기 위해서 블록킹 물질로 사용한 트리스에 결합하는 ssDNA를 제거함으로써 더욱 특이도를 증가시키고자 하였다. 또한 7 라운드에서는 다른 계열의 항생제인 테트라싸이클린(Tetracycycline)과 결합하는 ssDNA를 제거하였다. 카나마이신 대신에 테르라싸이클린을 고정시킨 후, 테트라싸이클린과 결합하지 않은 ssDNA를 분리하여 다음 단계에 사용함으로써 발굴한 압타머의 특이도를 증가시켰다. 최종 9라운드의 SELEX 과정을 통해 얻은 ssDNA의 서열을 분석하고자 클로닝 과정을 진행하였다. 동일한 농도의 프라이머를 사용하여 ssDNA를 dsDNA로 증폭 후 서열 분석을 위해 T7 프로모터를 갖고 있는 박테리아 발현용 벡터인 pET 28a 벡터에 삽입하고자 하였다. 제한효소는 각각 BamHⅠ과 HindⅢ를 선택하여 처리하였으며, 발현 벡터에 유전자 서열의 삽입을 위해 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 유전자를 확보하였다. 카나마이신에 대한 총 9번의 선별 및 증폭 과정을 통하여 최종적으로 3개의 ssDNA 압타머를 선별하였다. 전체 60 mer 길이의 네이티브(native) 형태의 압타머를 각 프라이머 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조 중심으로 절단하여 변형시켰고 이들 전체 구조 및 변형된 압타머의 염기서열은 하기 표 2와 같으며 M-fold 프로그램을 이용하여 각 압타머의 2차구조를 예측하였다(참조: 도 3).
실시예 3: 압타머 서열과 카나마이신과의 결합력 분석
상기 실시예 2에서 찾은 염기서열의 카나마이신에 대한 결합력을 알아보기 위해 압타머를 기반으로 한 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 카나마이신에 결합하는 압타머 3종 및 각 압타머의 변형 형태에 대한 결합력 분석을 하였다. 측정을 위해 압타머 서열 5'말단에 바이오틴(Biotin)을 합성 하였다. 카나마이신이 고정된 NOS 그룹이 코팅된 플레이트(NOS 코팅된 96 웰 플레이트, Corning)에 네이티브 형태 및 변형된 압타머를 농도별로 희석시켜 넣어주고 바이오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 이용하여 대상물질과 결합한 압타머의 양을 측정하였다. 좀 더 구체적으로, 카나마이신(500 nM/웰)을 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정시킨 후 세척용액 1X PBST(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0.1% Tween-20 in dH2O, pH 8.5)으로 3번 세척해 준 뒤, 카나마이신이 결합되지 않은 부분을 메우기 위해 1 M 트리스(Tris)를 넣어 블록킹(Blocking)하였다. 1시간 후 5번 세척해준 뒤 압타머를 넣고 2시간 동안 카나마이신과의 결합반응을 시켰다. 7번의 세척과정을 거치고, 스트렙트아비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 1시간동안 반응시켜 주었다. 세척용액으로 다시 10번 씻어낸 후 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. 이 전체 과정을 압타머를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 명명하고 이 실험의 결과로 얻는 Kd(Dissociation constant) 값은 각 웰의 고정된 카나마이신에 반응시킨 압타머의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다. 도 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 압타머는 나노몰-마이크로몰(Nano molarity, nM-Micro molarity, μM) 수준의 결합력을 보여주고 있다.
실시예 4: 압타머의 타 항생제와의 특이도 분석
상기 실시예 2에서 찾은 염기서열의 특이도를 알아보기 위해 압타머를 기반으로 한 효소면역측정법(Aptamer based ELISA)을 이용하여 발굴한 압타머와 카나마이신과 같은 계열의 항생제인 스트렙토마이신(Streptomycin), 디하이드로스트렙토마이신(Dihydrosrtreptomycin), 다른 계열 항생제인 앰피실린(Ampicillin), 테트라싸이클린(Tetracycline)의 결합력을 통하여 특이도를 분석하였다. 측정 방법은 상기 실시예 3의 방법과 동일하며, 항생제를 고정시키는 단계에서 서로 다른 항생제들을 각각 고정시킨 후, 블록킹 과정을 거치고, 다양한 농도의 압타머를 처리하여 특이도 분석을 진행하였다. 도 5는 1 μM 농도의 압타머를 처리하였을 때의 특이도를 보여주며, 도 5에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 압타머는 모두 카나마아신에 높은 결합력과 특이적으로 잘 결합하는 것을 확인하였다. 카나마이신과 구조가 유사한 스트렙토마이신, 디하이드로스트렙토마이신에 대해서도 특이도를 나타냄으로써 아미노글리코사이드 계열 항생제 중에서 카나마이신을 구별하여 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한 구조가 크게 다른 타 계열의 항생제인 앰피실린과 테트라싸이클린에 대해서는 아주 약한 결합을 확인하였다.
실시예 5: 압타머의 혈청 수준에서의 특이도 분석
본 발명은 가축 도축 전에 잔류하는 카나마이신을 검출하기 위한 것으로서, 도축 전 혈액 샘플에 존재하는 카나마이신을 특이적으로 검출할 수 있는 압타머를 발굴하기 위한 것이다. 이에 상기 실시예 4와 같이 다른 항생제에 대한 특이도 뿐만 아니라 혈액 샘플과 유사한 혈청 수준에서의 특이도도 분석하였다. 혈청 수준에서의 특이도 분석은 BSA(Bovine serum albumin, 소혈청알부민), BS(Bovine serum, 소혈청), RS(Rabbit serum, 토끼혈청)에 대하여 진행하였다. 실험 방법은 상기 실시예 3에서의 방법과 같으며 BSA, BS, RS를 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정시킨 후 압타머의 특이도를 분석하였다. 1 μM의 동일 농도의 압타머를 처리하였을 때 소혈청알부민에 결합하는 압타머의 양은 매우 적었으며, 소혈청 및 토끼 혈청에 대한 결합도 카나마이신 항생제와의 결합에 비하면 큰 차이를 나타내는 것을 확인함으로써 압타머가 타겟 항생제에 대하여 높은 특이도를 갖는 것을 확인하였다(참조: 도 6).
실시예 6: 검출한계 분석
본 발명은 낮은 검출 한계까지 카나마이신 검출이 가능한 압타머를 발굴하는 것으로, 상기 실시예 2에서 개발한 압타머를 프라이머 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 중심으로 변형시킨 각 압타머에 대한 카나마이신 검출 능력을 분석하였다. 실험 방법은 상기 실시예 3에서의 방법과 같으며 좀 더 구체적으로 언급하면, 약알칼리 pH 조건의 PBS 용액을 이용하여 다양한 농도의 카나마이신을 희석시킨 후 NOS 그룹이 코팅된 플레이트에 고정 후, 1 M 트리스(Tris)를 이용하여 반응하지 않은 NOS 그룹을 블록킹해주었다. 상기 실시예 3에서 측정한 결합력의 2배되는 농도의 각 변형된 압타머를 각각 처리 후, 본 압타머를 이용해 검출 가능한 농도를 선형 그래프화하여 분석하였다(참조: 도 7). 대부분의 압타머를 이용한 카나마이신 검출한계는 6.25 ~ 50 nM 수준으로, 이는 약 3.6-28.8 ng/ml의 카나마이신이 검출 가능한 수치이며, 이러한 수치는 식약처에서 고시한 식육 중 대표 잔류항생물질의 국내 허용 기준치인 100 ng/ml 보다 더 낮은 수준으로, 극미량의 카나마이신도 검출 가능함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (18)

  1. 서열목록 제9 서열의 염기 서열로 이루어진 카나마이신 검출용 핵산 압타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, (a) 상기 제9 서열의 5' 말단에 서열목록 제16 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-13 개의 염기로 이루어진 제7 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, (b) 상기 제9 서열의 3' 말단에, 서열목록 제17 서열로 나타낸 염기 서열의 5' 말단의 첫 번째 염기로부터 3' 말단 방향의 1-12개 염기로 이루어진 제8 연장 서열이 추가적으로 더 결합되거나, 또는 (c) 상기 제7 및 제8 연장 서열이 각각 제9 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 추가적으로 더 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 핵산 압타머는 서열목록 제8 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  12. 제 11 항에 있어서, (b) 상기 제8 서열의 5' 말단에, 서열목록 제18 서열로 나타낸 염기 서열의 3' 말단의 첫 번째 염기로부터 5' 말단 방향의 1-15개 염기로 이루어진 제9 연장 서열이 추가적으로 더 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 핵산 압타머는 서열목록 제3 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
  14. 제 1 항 및 제 10 항 내지 제13 항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 카나마이신 검출용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 핵산 압타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기 화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 1 항 및 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 핵산 압타머를 포함하는 카나마이신 검출 키트.
  18. 다음 단계를 포함하는 카나마이신 검출 방법:
    (a) 제 14 항의 조성물을 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a) 이후 상기 조성물과 대상 시료의 결합 신호를 측정하는 단계.
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