KR101545228B1 - 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 이용한 말라카이트 그린의 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 말라카이트 그린 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 앱타머는 말라카이트 그린에 특이적으로 결합함으로써, 말라카이트 그린에 높은 친화도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 {Nucleic acid aptamer specifically binding to malachite green}
본 발명은 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 이용한 말라카이트 그린의 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 말라카이트 그린 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다.
말라카이트 그린 (malachite green)은 아닐린 그린, 벤즈알데히드 그린, 빅토리아 그린B, 차이나 그린이라고도 하며, 밝은 청록색의 염기성 트리페닐메탄계 염료의 일종이다. 말라카이트 그린은 주로 가죽, 모직, 면, 견, 황마, 종이, 기타 섬유 등의 염색에 산업적으로 사용되기 때문에 매우 다양한 성분으로 많은 양이 생산되고 있다. 염색용도로 쓰인 말라카이트 그린의 약 10~15% 정도가 염색폐수로 방출되고 있다. 이 외에 잉크, 레이크의 제조 원료로도 사용되고 화학분석용 시약이나 지시약의 용도로도 사용된다. 말라카이트 그린은 염료로 개발되었으나 염료로 사용되는 이외에도 세균과 곰팡이균에 대한 항균효과가 있는 것으로 알려져 수산물 양식시 물곰팡이속(Saprolegnia) 곰팡이균의 발생을 억제하는데 사용되었으며, 특히 연어와 송어의 수정난에 기생하는 수생균을 치료하는데 효과가 탁월하여 1949년부터 전 세계적으로 연어와 송어 양식장에서 항균제로 많이 사용되어왔다. 그러나 최근에 와서 미국(1991년), 유럽(2002년), 일본(2003년)에서는 발암성물질로 알려져 식용 어류에 대한 사용을 금지하였다. 우리나라는 2000년부터 식용 어류에 대해 사용을 금지하였으나 대사물질에 대한 안전성 및 유효성에 문제가 있는 것으로 확인된 2008년부터 식품의약품안전청 고시 제 2008-51호를 통해 모든 식품에서 말라카이트 그린은 검출되어서는 안되는 물질로 관리하고 있다.
말라카이트 그린은 간암 촉진자로서 작용하며 활성산소를 형성하는 것으로 알려져 있다. 또한, 말라카이트 그린이 SHE(Syrian hamster embryo) 세포에 처리된 경우 대조군 대비 처리시간과 처리농도가 증가함에 따라 아폽토시스(apoptosis)를 유발하여, 아폽토시스에 의해 종양 형성을 촉진하는 유전자로 알려진 p53과 bcl-2가 말라카이트 그린 노출시 과발현되는 것으로 보고되었다. 아울러, cdk4와 cdc2 유전자도 말라카이트 그린에 의해 발현이 증가하는 것으로 보고되었다. 이 외에도 말라카이트그린은 세포주기에도 영향을 주어 G0/G1기 와 G2/M기를 정지시키는 것으로 보고되었다. 또한, 수생동물의 체내에서 대사되어 형성되는 것으로 알려진 류코말라카이트 그린 (leucomalachite green)은 생체내 유전독성 (in vivo genotoxicant)으로 인체 내에 돌연변이 및 암을 유발하는 것으로 보고되었다.
앱타머는 특정 타깃에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 표적에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며, in vitro에서 합성이 가능하기 때문에 동물에게 항원을 주입하여 항체를 생산하는 번거로운 공정을 생략할 수 있어 비용 면에서 훨씬 우위에 있고, 타깃 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생체 분자나 환경 호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타깃에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서로 이용하기 위하여 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 기존의 앱타머 개발의 목표는 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 신약 개발에 사용하기 위해 단백질 관련 질병의 표적물질을 대상으로 하는 연구가 대부분이었다.
기존의 잔류항생제 검출방법은 잔류 항생제가 녹아있는 성분에 따라 각기 다른 시험용액을 조제하여 잔류항생제를 추출, 정제하여 액체크로마토그래피로 정량하는 방법이었다. 기존의 방법은 녹인 물질에 따른 시험법도 소수이고, 시험용액을 각기 조제하는 것도 번거로웠다. 또한 추출, 정제 과정 중에 검출물질의 손실이 있을 수도 있으므로 정확한 정량이 어려웠다. 이러한 잔류의약품, 항생제 및 환경호르몬 등과 같은 저분자 유해물질 결합 특이적 앱타머들은 상수원 및 하천에 잔류하는 시료뿐만 아니라 인체 등 생체 내에서의 잔류 유해물질 검출 및 진단과 같은 의료 기술로서 적용할 수 있는데 비하여 기존의 잔류항생제 검출 방법은 오직 식품이나 물에만 적합한 방법이 제시되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 말라카이트 그린에 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 핵산 앱타머를 개발하였다. 또한, 말라카이트 그린에 특이적으로 결합 가능한 핵산 앱타머를 포함하는 조성물을 제조하여 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 양상은 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공하는 것이다.
또한 본 발명 일 양상은 상기 핵산 앱타머를 이용한 말라카이트 그린의 검출 방법, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 말라카이트 그린 검출용 조성물 및 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 CAGGGGGC, GGGTGG 및 ACATAGA로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 핵산 앱타머는, 높은 친화성으로 타겟 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 이때, 상기 앱타머가 RNA인 경우에는, 염기서열에 있어서 T는 U로 인식될 수 있다.
본 발명에 있어서, 말라카이트 그린 (Malachite green, 4-[(4-dimethylaminophenyl)phenyl-methyl]-N,N-dimethylaniline)은 트라이페닐메테인계 염기성 염료로서 화학식이 C23H25ClN2이며 몰질량은 364.911 g/mol이다. 상기 말라카이트 그린은 자연으로부터 수득되거나, 화학적 합성 또는 재조합 방법으로 수득할 수 있으며, 이를 제한하지 않는다. 또한, 상기 말라카이트 그린은 이의 염 또는 유도체를 포함한다.
상기 앱타머는 CAGGGGGC, GGGTGG 또는 ACATAGA의 모티프를 1 이상 포함하며, 바람직하게는 서열번호 9 내지 13중 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 핵산 앱타머를 구성하는 총 뉴클레오티드의 수는 15~200nts일 수 있으며, 바람직하게는 15~80nts인 것일 수 있다 총 뉴클레오티드의 수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고 생체 내 안정성도 높으며 독성도 낮게 된다. 아울러, 상기 핵산 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 리보오스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기 (예:-O-CH3), -O-아실기 (예, -O-CHO), 아미노기 (예, -NH2)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다.
또한, 상기 앱타머는 상기 앱타머를 구성하는 핵산서열과 90 % 이상 100 % 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 90 %이상 100 %미만의 상동성을 가지는 핵산서열이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90 %이상 100 %미만의 서열에 공통성이 있는 것으로서, 말라카이트 그린에 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 포함하는, 말라카이트 그린 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 핵산 앱타머는 말라카이트 그린에 특이적으로 결합함으로써, 말라카이트 그린에 높은 친화도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, 말라카이트 그린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 시료는 타겟물질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석을 수행할 수 있는 조성물로서, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료일 수 있다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함할 수 있다.
상기 첨가되는 핵산 앱타머는 0.1 nM 내지 100 nM일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 nM 내지 10 nM, 더욱 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 핵산 앱타머를 포함하는, 말라카이트 그린 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 앱타머는 말라카이트 그린에 특이적으로 결합함으로써, 말라카이트 그린에 높은 친화도를 나타내는바, 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1은 MG-BSA 컨쥬게이트를 이용한 SELEX로 말라카이트 그린 (MG)에 대한 앱타머를 선발한 도이다. ssDNA의 회수율 (%) = (MG-BSA 컨쥬케이트로 코팅된 웰에서 용출된 ssDNA의 양)/ (MG-BSA 컨쥬케이트로 코팅된 웰에 적용된 ssDNA의 양).
도 2는 말라카이트 그린에 대한 앱타머의 결합특성을 나타낸 도이다. (A) 선발된 MG4, MG5, MG6, MG9, 및 MG12의 결합 어세이 결과를 나타낸 도이다. ssDNA 라이브러리가 음성 대조군으로 사용되었다. (B) ELAA (enzyme-linked aptamer assay)를 이용한 포화곡선 및 해리 상수 (Kd)의 결정을 나타낸 도이다.
도 3은 5개의 선발된 앱타머의 예상되는 2차 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 간접적 경합 (ic) ELAA의 결과를 나타낸 도이다. (A) 다양한 농도 ( 5, 및 50 nM)의 앱타머 MG4을 이용한 ic-ELAA에 따른 MG의 검정곡선을 나타낸 도이다. (B) 5 nM의 앱타머 MG4를 이용한 경합 곡선을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시약 및 장치
말라카이트 그린 (malachite green, MG)의 염산염, 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA), 1,1-카르보닐디이미다졸, 홀스래디쉬 페록시다아제 (horseradish peroxidase, HRP), 3,30,5,50-테트라메틸벤지딘 (3,30,5,50-tetramethylbenzidine, TMB) 액체 기질, 계난백으로부터의 알부민 (OVA) 및 완충액 구성 성분을 Sigma (USA)사로부터 구매하였다. MG-BSA 컨쥬게이트는 Glory Science (USA)사로부터 구매하고, HRP-스트렙타비딘 컨쥬게이트는 Thermo Scientific (France)에서 구매하였다. ssDNA 랜덤 라이브러리, 프라이머 (aptF, aptR, aptRBioT) 및 비오틴화된 (biotinylated) 앱타머는 Bioneer (Korea)사에서 합성하였다. Taq DNA 중합효소 및 dNTP는 GeneAll (Korea)로부터 구매하였다.
ELAA (enzyme-linked aptamer assay)는 Maxisorp 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (polystyrene microtiter plates) (NUNC, Denmark)에서 수행하였다. 효소 활성은 450 nm에서 Spectra max plus 384 (Molecular Device, USA)를 이용하여 검출하였다. PCR 증폭은 자동화된 DNA thermocycler (AxyGen, USA) 내에서 수행하였다. ssDNA 또는 dsDNA의 농도는 Nanodrop (ASP-2680, ACTgene Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.
실시예 2: 변형된 ELAA를 이용한 MG에 대한 특이적 앱타머의 선발 및 시퀀싱
MG에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선발하기 위하여, 랜덤 ssDNA 라이브러리40 랜덤 뉴클레오타이드를 포함하고 불변 프라이머 어닐링 부분: 5'- CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG-3' (서열번호 1)로 측면화 된 (flanked) 랜덤 ssDNA 라이브러리를 초기 풀 (initial pool)로 사용하였다. 하기의 프라이머는 앱타머의 선발 과정에서 선발된 ssDNA의 증폭에 사용되었다: aptF 5'-CGTACGGAATTCGCTAGC-3' (서열번호 2), aptR 5'-CACGTGGAGCTCGGATCC-3' (서열번호 3), 및 aptRBioT(5 비오틴된 aptR과 동일). 사용에 앞서, 10 uM의 랜덤 DNA 라이브러리 풀을 100 ㎕의 결합 완충액 (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7.2)에 용해시키고 10 분 동안 95 ℃에서 변성 (denature)시켰으며, 5 분 동안 4 ℃에서 신속하게 냉각시키고 5분 동안 실온에 배치하였다.
MG를 검출하는 앱타머의 선발은 MG-BSA 컨쥬게이트를 이용한 변형된 SELEX 방법으로 수행하였다.
먼저, 50 mM 탄산염 완충액에서 pH 9.6 조건에서, 코팅단계에서 MG-BSA 컨쥬게이트 또는 BSA를 마이크로타이터 플레이트의 웰에 흡착시켰다. 코팅 부피는 100㎕/웰의 10 ㎍/ml의 MG-BSA 컨쥬게이트 또는 BSA 용액의 등가이며, 플레이트는 4 ℃에서 밤새 배양시켰다. 배양된 플레이트를 200 ㎕/웰의 1 % (w/v) 37 ℃에서 60분간 결합 완충액에서 제조된 BSA 용액으로 도포하였다. 그 뒤, BSA에 비특이적 결합할 수 있는 후보자들을 제거하기 위하여 변성된 DNA 라이브러리 풀을 BSA-코팅된 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 ssDNA를 수집하여 MG-BSA 코팅된 웰에 첨가하였다. 웰을 37 ℃에서 60분 동안 배양한 후, 결합되지 않거나 약하게 결합된 ssDNA를 0.01 % Tween-20를 포함하는 PBS (PBST)를 이용한 3번의 세척단계로 제거하였다. MG-BSA로 코팅된 웰에 결합된 ssDNA를 100㎕의 20 mM NaOH에서 10분간 실온에서 완만한 교반으로 ssDNA를 회수하였다. 이 과정은 결합된 ssDNA를 용출하기 위하여 2회 실시되었다. 용출된 ssDNA를 에탄올 침전법을 이용하여 침전시키고, ssDNA를 10 ㎕의 증류수에 용해시켰다. 용출된 ssDNA 분획은 PCR (1 사이클은 95 ℃에서 5분 동안, 35 사이클은 95 ℃에서 30초 동안, 52 ℃에서 30 초 동안, 72 ℃에서 30초 동안, 및 1 사이클은 72 ℃에서 5분 동안)로 비오틴화된 역방향 프라이머 (aptRBioT)를 이용하여 증폭하였다. 이는 Dynabeads 스트렙타비딘 M-280에서의 알칼리 변성법 (alkali denaturation)을 이용한 앱타머 가닥의 후속 정제를 가능하게 하였다. 선발 라운드의 각 단계에서의 ssDNA의 양은 Nanodrop 기기를 이용하여 측정하였다. 12 라운드 후, ssDNA는 변형되지 않은 프라이머 (aptF 및 aptR)로 증폭시키고, 선발된 ssDNA의 PCR 생성물을 TOPO PCRII 플라스미드 (Invitrogen)로 복제하였다. 11개의 후보자 중 5개의 앱타머 서열정보를 확인하였다.
SELEX의 과정을 확인하기 위하여, ssDNA의 MG에 대한 결합 친화도를 각 라운드마다 확인하였다. 이는 MG에 결합하는 ssDNA의 회수율로 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, MG에 결합하는 ssDNA의 회수율은 2번째 라운드까지는 거의 변화가 없는 반면, 10라운드까지 서서히 증가하였다. 이는 10라운드에서 18.7 %까지 증가하지만, 그 후의 증가는 나타나지 않았다. 이 결과는 MG-BSA로 코팅된 웰의 결합 부위의 포화에 기인한 것일 수 있다.
서열 분석에 근거하여, 11개의 클론 중 5개의 앱타머가 확인되었으며, MG 결합에 대하여 스크리닝하였다. 이러한 앱타머를 MG4, MG5, MG6, MG9, 및 MG12으로 디자인하였으며, 그 서열번호 및 서열정보는 아래와 같다.
앱타머 서열정보 서열번호
MG4 CGTACGGAATTCGCTAGCGGCAGGGGGCAGATAGGGGTGGGCTAAGCGGCAACGGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG 서열번호 4
MG5 CGTACGGAATTCGCTAGCCACATAGAACGCTTCACGACTGGTCTCCACCGCTGCCCGTGGATCCGAGCTCCACGTG 서열번호 5
MG6 CGTACGGAATTCGCTAGCGGCGGGGGACGTGCAGGGTGCCGACTGGGTGGTCATCGGTGGATCCGAGCTCCACGTG 서열번호 6
MG9 CGTACGGAATTCGCTAGCCACATAGACGGTGTCGCTCTGCTCAATACCGCCCCGGTGTGGATCCGAGCTCCACGTG 서열번호 7
MG12 CGTACGGAATTCGCTAGCCGACATAGAGCTGAGGGCTTTCCACGCATCTCTCCGTCGTGGATCCGAGCTCCACGTG 서열번호 8
도 2A에 나타난 바와 같이, 2개의 앱타머 (MG4 및 MG6)가 MG에 대하여 좋은 결합 친화도를 나타내었다.
ClustalW를 이용한 5개의 앱타머의 가변적인 40-뉴클레오티드 (N40) 위치에 대한 서열을 분석하였으며 그 결과는 아래 표 2에 나타내었다.
앱타머 서열번호 서열번호
MG4 GGCAGGGGGCAGATAGGGGTGGGCTAAGCGGCAACGGCGT 서열번호 9
MG5 CACATAGAACGCTTCACGACTGGTCTCCACCGCTGCCCGT 서열번호 10
MG6 GGCGGGGGACGTGCAGGGTGCCGACTGGGTGGTCATCGGT 서열번호 11
MG9 CACATAGACGGTGTCGCTCTGCTCAATACCGCCCCGGTGT 서열번호 12
MG12 CGACATAGAGCTGAGGGCTTTCCACGCATCTCTCCGTCGT 서열번호 13
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 앱타머가 보존된 서열 (CAGGGGGC, GGGTGG 또는 ACATAGA) 을 포함함을 알 수 있다.
이 5개의 앱타머들의 이차구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 특정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 앱타머의 보존된 서열은 2차 구조의 줄기 또는 고리 위치에 존재하였다. 앱타머가 N40 보존된 서열을 갖고 있음에도 불구하고 앱타머 간의 2차 구조가 상이하였다. 또한 각 앱타머는 MG에 대하여 매우 상이한 결합 친화도를 나타내었다. 이러한 사실은 보존된 서열 모티프의 특정 위치 및 이차구조가 MG의 인식 및 결합을 결정할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 선발된 앱타머의 MG 에 대한 결합 특성 확인
선발된 앱타머의 MG에 대한 결합 친화도를 비교하기 위하여 ELAA 방법을 수행하였다.
선발된 앱타머를 비오틴을 함유하도록 합성하고, 각각의 MG에 대한 결합 특성을 실험하였다. 먼저, 앱타머를 90 ℃로 5분간 가열하고, 4 ℃에서 5분간 냉각하고, 실온에 10분간 배치시켰다. 그 다음, 5 nM의 각 앱타머를 1% (w/v) OVA 용액으로 블로킹된 마이크로타이터 플레이트의 BSA 또는 MG-BSA가 코팅된 웰에 37 ℃ 에서 60 분간 배양하였다. 그 다음, 플레이트를 60분간 37 ℃에서 배양하고, PBST로 세척하였다. 최종 단계는 100 ㎕ TMB 용액을 첨가하고 30분 후 450 nm에서 흡광도를 측정하는 것이었다. (100 ㎕/웰의 1 N H2SO4를 첨가하여 담금질 (quenching) 후). 각 단계는 반복되는 교반에서 수행하였고 빛을 차단하였다. 어세이는 5회 실시하였다.
MG와 앱타머 간의 상호작용에서의 최적의 조건을 결정하기 위하여 여러 농도 (1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍/ml)의 MG-BSA 컨쥬게이트를 다양한 농도의 비오틴화된 앱타머에 적용하였다. 포화된 코팅 웰을 5 ㎍/ml의 MG-BSA로 결정하였다. 스트렙타비딘-HRP 농도는 0.5 ㎍/ml로 고정하였다. 또한, 선발된 앱타머가 BSA에도 결합하는지 확인하기 위하여, BSA-코팅된 플레이트를 이용하여 상기와 동일한 조건 하에서 실험을 수행하였다.
도 2A는 선택된 앱타머의 결합 어세이 결과이다. ssDNA 라이브러리는 음성대조군으로 사용하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 앱타머는 BSA에 결합하지 않았다. 결합 어세이는 앱타머 농도의 범위 (1-100 nM)에 대한 일정한 양의 MG-BSA를 이용하여 수행하였다.
앱타머 MG4 및 MG6의 해리상수 (Kd)를 결정하였다. 결합 반응은 상기 결합 어세이와 동일한 방법을 사용하였으며, 다만, 비오딘화된 앱타머는 증가된 양(1-100 nM)을 사용하였다. MG-결합된 앱타머는 흡광도 측정 및 이에 해당하는 결합 퍼센트 (%)로의 전환으로 결정하였다. 값은 아래와 같다. % (A/A100) = (A/A100)×100, 여기서 A는 1 nM 내지 100 nM 앱타머의 흡광도 값이고, A100는 25 nM의 앱타머 MG4의 흡광도 값이다. Kd 는 비선형 회귀 분석으로 계산하였다.
도 2B는 ELAA를 이용하여 포화곡선 및 해리상수의 결정을 나타낸 도이다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 2개 앱타머 (MG4 및 MG6)의 해리상수는 나노몰 (nanomolar) 범위 (각각 11.3 및 16.6 nM)였다. 낮은 Kd 값에 기인하여 앱타머 MG4을 이후의 MG 검출에 사용하였다.
실시예 4: 간접적 경합 ELAA ( indirect competitive ELAA , ic - ELAA )를 이용한 MG 의 검출
경합 어세이에서, 앱타머의 작용 농도 (working concentration) 및 고정화된 항원은 표적 분자에 대한 앱타머의 민감도에 유의적인 결정요인이다. 본 명세서에서의 ic-ELAA는 고정화된 MG-BSA 컨쥬게이트 및 경합자 (MG) 및 앱타머의 농도에 의존한다.
간접적 경합 (indirect competitive, ic) 어세이를 위하여, 비-표지된 MG 및 상기와 동일한 농도의 앱타머를 첨가하였다. 용액을 결합 완충액 내에서 준비하고, MG-BSA 코팅된 웰에서 60 분간 경합하였다. 결합 반응 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP (0.5 ㎍/mL)을 웰에 첨가하였다. 다음, 플레이트를 60분간 37 ℃에서 배양한 다음, PBST로 3회 세척하였다. ic-ELAA에서의 흡광도 값은 하기와 같은 실험 억제 값 (A/A0)으로 전환하였다: % (A/A0) = (A/A0)×100, 여기서 A는 경합 어세이에서의 흡광도 값이며 A0는 비경합 어세이에서의 흡광도 값이다.
도 4A는 다양한 농도 (5, 50 nM)의 앱타머 MG4를 이용한 간접적 경합 ELAA에서의 MG에 대한 검정곡선 (Calibration curve)이다. 2개의 앱타머 MG3의 농도 (5, 50 nM)를 MG 검출 감도를 분석하기 위하여 사용하였다. 또한, 멀티웰 플레이트 상의 MG-BSA 코팅 농도는 상기 결합 어세이와 동일하였다. 도 4A에 나타난 바와 같이, 앱타머의 5 nM이 최적의 감도 및 재현가능한 흡광도를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 앱타머의 농도가 감소할수록 감도가 높아진다는 것을 나타낸다. 또한, 도 4B는 5 nM의 앱타머 MG4 및 5 ㎍/ml의 멀티웰 플레이트를 코팅하는 MG-BSA의 조건 하에서의 완충액에서의 용량반응곡선을 나타낸다. 도 4B에 나타난 바와 같이, 완충액 중 앱타머 MG3의 검출한계 (limit of detection, LOD)는 13.6 ㎍/L였다.
<110> Hoseo University Academic Cooperation Foundation <120> Nucleic acid aptamer specifically binding to malachite green <130> 1-5 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer annealing site <400> 1 cgtacggaat tcgctagcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptF <400> 2 cgtacggaat tcgctagc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptR <400> 3 cacgtggagc tcggatcc 18 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG4 <400> 4 cgtacggaat tcgctagcgg cagggggcag ataggggtgg gctaagcggc aacggcgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG5 <400> 5 cgtacggaat tcgctagcca catagaacgc ttcacgactg gtctccaccg ctgcccgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG6 <400> 6 cgtacggaat tcgctagcgg cgggggacgt gcagggtgcc gactgggtgg tcatcggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG9 <400> 7 cgtacggaat tcgctagcca catagacggt gtcgctctgc tcaataccgc cccggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG12 <400> 8 cgtacggaat tcgctagccg acatagagct gagggctttc cacgcatctc tccgtcgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG4 N40 nucleotide <400> 9 ggcagggggc agataggggt gggctaagcg gcaacggcgt 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG5 N40 nucleotide <400> 10 cacatagaac gcttcacgac tggtctccac cgctgcccgt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG6 N40 nucleotide <400> 11 ggcgggggac gtgcagggtg ccgactgggt ggtcatcggt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG9 N40 nucleotide <400> 12 cacatagacg gtgtcgctct gctcaatacc gccccggtgt 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer MG12 N40 nucleotide <400> 13 cgacatagag ctgagggctt tccacgcatc tctccgtcgt 40

Claims (8)

  1. CAGGGGGC, GGGTGG 및 ACATAGA로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 모티프를 포함하는, 말라카이트 그린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머로서, 상기 앱타머는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 앱타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1의 핵산 앱타머를 포함하는, 말라카이트 그린 검출용 조성물.
  5. (a) 청구항 1의 핵산 앱타머를 시료에 첨가하는 단계;
    (b) 시료내에 존재하는 말라카이트 그린과 앱타머를 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 말라카이트 그린-앱타머 결합체를 검출하는 단계;를 포함하는 말라카이트 그린의 검출 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 첨가되는 핵산 앱타머는 0.1 nM 내지 100 nM인 것을 특징으로 하는, 말라카이트 그린의 검출 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 시료는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 액체; 토양; 공기; 식품; 폐기물; 동물 내장조직; 및 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀 및 코로 이루어진 군으로부터 선택된 동물 조직;으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말라카이트 그린의 검출 방법.
  8. 청구항 1의 핵산 앱타머를 포함하는, 말라카이트 그린 검출용 키트.
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