CN108519482A - 一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器 - Google Patents

一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器。本发明包括信号标记物、磁珠‑适配体复合材料；以及电解池、三电极测量装置、基于单片机STM8L的测量与分析系统；信号标记物包括连接有MUC1核酸适配体的标记物，以及连接有HER‑2核酸适配体的标记物。采用多金属离子标签标记不同的乳腺癌肿瘤标志物的核酸适配体代替传统的蛋白质类抗体，实现了多种乳腺癌肿瘤标志物的同时联合检测，降低了检测成本。采用核酸适配体替代蛋白质抗体，减少了对于检测环境的要求。同时提高了信号标记物的储存时长。

Description

一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器
技术领域
本发明属于重金属检测和生物医学检测技术领域，涉及一种基于多种金属离子标签标记核酸适配体的多种乳腺癌肿瘤标志物的同时检测，用于对乳腺癌早期诊断提供帮助。
背景技术
一直以来，癌症都是威胁人类生命的杀手。研究表明，早期癌症的治愈率高达八成。但是癌症的种类多达200种，大部分癌症在早期并没有明显的症状，多数癌症患者发现时往往已经错过了最佳的治疗时机。对于女性来说，乳腺癌是最常见的癌症，并且是第二大导致死亡的疾病。而且超过九成都是由于癌细胞的转移。因此，早期乳腺癌的检测就显得尤为重要。但是同其他癌症一样，乳腺癌的早期发现较为困难，并且预后复发的概率并不低，传统的检测方法难以在早期发现。
随着科学技术的发展，肿瘤标志物的出现使得研究人员找到了另一种检测癌症的方法。在肿瘤形成的早期，血液中的相关肿瘤标志物随之也出现变化。这些标志物的出现、消失或者是浓度上的改变都可以对肿瘤进行直观的预测。但是传统的检测方法对肿瘤标志物的检测都需要昂贵的试纸和专业的操作人员，费时费力费财，不能大规模地推广到基层医院。而且在乳腺癌的诊断中，单一的肿瘤标志物难以帮助医生做出准确的诊断，因此需要多种癌症标志物联合检测，而这恰恰是传统单肿瘤标志物检测方法的不足之处。比如酶联免疫吸附法采用酶作为标志物，在对被检测物进行定量分析时采用酶对底物的催化效率作为衡量参数。此参数只能衡量标志物的量，而不能衡量标志物的种类。若采用不同的酶作为标志物则需要多次测量。
上述提及的传统生物免疫检测方法都采用了抗原-抗体作为基本原理，这导致了对于检测环境的要求比较严格，在pH、温度、离子浓度方面都有比较严格的要求，限制了其发展。
发明内容
为了解决乳腺癌诊断中多肿瘤标志物联合检测，降低检测环境要求等问题，本发明提供了一种基于多种重金属离子标记的核酸适配体代替传统抗体的检测思路，可以实现对多种乳腺癌肿瘤标志物实现同时检测，具有操作简便、检测快速等特点。
本发明采取的技术方案为：
一种低功耗癌症检测仪器包括信号标记物、磁珠-适配体复合材料；以及电解池、三电极测量装置、基于单片机STM8L的测量与分析系统；
所述的信号标记物包括连接有MUC1核酸适配体的标记物，以及连接有HER-2核酸适配体的标记物；上述两种标记物均以石墨烯与纳米金复合材料作为载体，载体表面吸附有包裹重金属离子的去铁铁蛋白，同时通过双巯基的烷烃链分别连接乳腺癌肿瘤标志物MUC1和HER-2的核酸适配体；
此处的两种肿瘤标记物对应的重金属离子不相同，必须为唯一标志。
所述的磁珠-适配体复合材料是外表面包裹有硅层的磁珠，且在磁珠修饰有MUC1和HER-2的核酸适配体。
所述的电解池包括反应池、设置在反应池内的微型搅拌装置、电解液；电解液包括醋酸-醋酸钠缓冲溶液、以及处理后的待检测物；搅拌装置用于在检测的富集阶段对溶液进行搅拌。
所述的三电极测量装置的参比电极采用饱和甘汞电极，对电极采用铂丝电极，工作电极采用石墨烯-Nafion-纳米金修饰的玻碳电极；三电极分别通过电路与测量与分析系统连接。
所述的基于单片机STM8L的测量与分析系统用于获取处理后的待检测物中含有的重金属离子含量，并以此分析出对应肿瘤标志物的浓度。此处技术属于常规技术，故不详解。
连接有MUC1或HER-2核酸适配体的标记物的制备过程如下：
(1)将去铁蛋白加入到醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再分别加入不同的重金属离子A/B，得到去铁蛋白/重金属离子A混合物或去铁蛋白/重金属离子B混合物；在上述混合物中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，离心，超滤得到包含有重金属离子A或B的去铁蛋白。该蛋白在酸性条件下会释放其包裹的重金属离子。
作为优选，所述的两个标记物中的重金属离子A、B分别为Pb2+离子、Cd2+离子。
(2)将氧化石墨烯溶解于去离子水中，超声使其充分分散；向石墨烯分散液中先后加入氯金酸与氢氧化钠，超声、离心得到石墨烯-纳米金复合物；最后使用双巯基的烷烃链修饰石墨烯-纳米金复合物后备用。
(3)分别取上述修饰后石墨烯-纳米金复合物用去离子水稀释到(0.5-1)mg·mL-1，加入HER2核酸适配体或MUC1核酸适配体摇晃均匀，轻微震荡1-2h后，适配体结合在石墨烯-纳米金材料表面。离心除去未结合的适配体，用去离子水溶解沉淀得到分别修饰HER2或MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料。
(3)将步骤(1)包裹有重金属离子A或B的脱铁蛋白加入上述步骤(3)分别修饰HER2或MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料溶液，轻微震荡1-2h得到重金属离子修饰的适配体。
处理后的待检测物的处理过程如下：
将待检测血液样品加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入磁珠-适配体复合材料缓慢摇晃，再加入两种信号标记物，缓慢摇晃20-40min后利用磁吸附出带有磁珠的物质；然后将上述带有磁珠的物质用pH＝7.4的PBS溶液清洗，去除未反应的标记物，得到最终所需的处理后的待检测物。
上述带有磁珠的物质包括反应后的信号标记物-肿瘤标志物-磁珠适配体夹心结构物质，以及未反应的磁珠-适配体复合材料。
石墨烯-Nafion-纳米金修饰的玻碳电极的制备过程：
(1)将石墨烯-DMF溶液加入乙醇溶液中，超声10-20min；然后加入Nafion(全氟磺酸型)聚合物溶液，超声5-10min；再加入HAuCl，得到石墨烯-Nafion-HAuCl溶液；
(2)、将玻碳电极打磨至光滑，在用氮气吹干。
(3)、取石墨烯-Nafion-HAuCl溶液滴涂到玻碳电极表面，在红外灯下烘干。
(4)、将电极在0.5M NaCl溶液中进行循环伏安扫描(-1.3V～0.8V，10个循环)。
本发明具有的有益效果如下：
1.采用多金属离子标签标记不同的乳腺癌肿瘤标志物的核酸适配体代替传统的蛋白质类抗体，实现了多种乳腺癌肿瘤标志物的同时联合检测，降低了检测成本。
2.采用核酸适配体替代蛋白质抗体，减少了对于检测环境的要求。同时提高了信号标记物的储存时长。
3.核酸适配体结构固定，相比于蛋白质抗体更加适合大规模产业化生产。
附图说明
图1是本发明的总体流程图；
图2是本发明肿瘤标志物检测仪器的总体原理图；
图3是本发明样品处理合成信号标记物的原理图；
图4是本发明样品处理标记物纳米修饰的原理图；
图5是本发明检测流程图；
图6a为检测的溶出伏安图；b为MUC1浓度与峰电流大小的线性回归分析；c为HER2浓度与峰电流大小的线性回归分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1：连接有MUC1核酸适配体的标记物的制备过程如下：
(1)将10uL去铁蛋白加入到4mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再分别加入50uL浓度为(1-1.5)g·L-1重金属离子Pb2+，得到去铁蛋白/重金属离子Pb2+混合物；在上述混合物中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，离心，超滤得到包含有重金属离子Pb2+的去铁蛋白。该蛋白在酸性条件下会释放其包裹的重金属离子Pb2+。
(2)将氧化石墨烯溶解于去离子水中制备成(0.5-1)mg·mL-1的分散液；向石墨烯分散液中快速先后加入体积比为1:1氯金酸(5mM)与氢氧化钠(1mg·mL-1)各(0.2-0.5)mL，超声(2-2.5)小时、离心10-15分钟得到石墨烯-纳米金复合物；最后使用双巯基的烷烃链修饰石墨烯-纳米金复合物后备用。
(3)分别取上述修饰后石墨烯-纳米金复合物用去离子水稀释到(0.5-1)mg·mL-1，加入MUC1核酸适配体摇晃均匀，轻微震荡1-2h后，适配体结合在石墨烯-纳米金材料表面。离心除去未结合的适配体，用去离子水溶解沉淀得到修饰有MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料。
(4)将步骤(1)包裹有重金属离子Pb2+的脱铁蛋白加入上述步骤(3)修饰有MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料溶液，轻微震荡1-2h得到重金属离子修饰的适配体。
实施例2：连接有HER-2核酸适配体的标记物的制备过程如下：
(1)将10uL去铁蛋白加入到4mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再分别加入50uL浓度为(1-1.5)g·L-1重金属离子Cd2+，得到去铁蛋白/重金属离子Cd2+混合物；在上述混合物中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，离心，超滤得到包含有重金属离子Cd2+的去铁蛋白。该蛋白在酸性条件下会释放其包裹的重金属离子。
(2)将氧化石墨烯溶解于去离子水中制备成(0.5-1)mg·mL-1的分散液；向石墨烯分散液中快速先后加入体积比为1:1氯金酸(5mM)与氢氧化钠(1mg·mL-1)各(0.2-0.5)mL，超声(2-2.5)小时、离心10-15分钟得到石墨烯-纳米金复合物；最后使用双巯基的烷烃链修饰石墨烯-纳米金复合物后备用。
(3)分别取上述修饰后石墨烯-纳米金复合物用去离子水稀释到(0.5-1)mg·mL-1，加入HER2核酸适配体摇晃均匀，轻微震荡1-2h后，适配体结合在石墨烯-纳米金材料表面。离心除去未结合的适配体，用去离子水溶解沉淀得到修饰有HER-2核酸适配体的石墨烯-纳米金材料。
(4)将步骤(1)包裹有重金属离子Cd2+的脱铁蛋白加入上述步骤(3)修饰有HER-2核酸适配体的石墨烯-纳米金材料溶液，轻微震荡1-2h得到重金属离子Cd2+修饰的HER-2核酸适配体。
实施例3：制备磁珠-适配体复合材料：外表面包裹有硅层的磁珠，且在磁珠修饰有MUC1和HER-2的核酸适配体，可通过购买获取。
实施例4：石墨烯-Nafion-纳米金修饰的玻碳电极的制备过程：
(1)将石墨烯-DMF溶液加入乙醇溶液中配置成(0.5-1)mg·mL-1的溶液，超声10-20min；然后加入Nafion(全氟磺酸型)聚合物溶液，使其在体系中的质量分数为0.1％，超声5-10min；再加入HAuCl使其浓度为7.5mM，得到石墨烯-Nafion-HAuCl溶液；
(2)、将玻碳电极打磨至光滑，在用氮气吹干。
(3)、取6uL石墨烯-Nafion-HAuCl溶液滴涂到玻碳电极表面，在红外灯下烘干。
(4)、将电极在0.5M NaCl溶液中进行循环伏安扫描(-1.3V～0.8V，10个循环)
实施例5：基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器的实现过程(采用标准加入法测量)：
(1)将正常血液样本加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，同时滴加适量HER2与MUC1样品，使溶液中的两种肿瘤标志物浓度在(1–5)ng·mL-1，加入实施例3磁珠-适配体复合材料缓慢摇晃，再加入实施例1、2两种信号标记物，缓慢摇晃20-40min后利用磁吸附出带有磁珠的物质；然后将上述带有磁珠的物质用pH＝7.4的PBS溶液清洗，去除未反应的标记物，得到最终所需的处理后的待检测物。
(2)将步骤(1)得到的处理后的待检测物加入到10mLpH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，搅拌10min后吸附出磁珠。将三电极伸入至剩余电解液中，三电极分别通过电路与测量与分析系统连接。其中检测的富集阶段设置在反应池内的微型搅拌装置开启，搅拌的速率由主控芯片STM8L控制。
上述三电极的参比电极采用饱和甘汞电极，对电极采用铂丝电极，工作电极采用实施例4得到的石墨烯-Nafion-纳米金修饰的玻碳电极；
(3)启动肿瘤标志物检测仪器，系统自动完成重金属离子检测的富集、溶出、计算峰电流等步骤。随后根据同一批次对标准溶液测量的拟合函数计算出肿瘤标志物的浓度,结果如附图6所示。
图1所示为发明的总体结构，该检测仪样品预处理和检测系统两部分。样品处理的功能是对样品中的待检测的肿瘤标志物进行重金属离子的信号标记，使肿瘤标志物浓度与标记的重金属离子浓度呈现一个线性的关系；检测系统的功能是对重金属离子的浓度进行检测，并通过拟合函数计算出各个肿瘤标志物的浓度。
图2所示为肿瘤标志物检测仪器的总体原理图，包括电解池、三电极测量装置、基于单片机STM8L的测量与分析系统。
所述的基于单片机STM8L的测量与分析系统包括STM8L核心处理器、测量信号发生器、AD7705信号采集芯片、AMOLED显示屏。
所述的STM8L核心处理器采用STM8L152C6T6低功耗8位嵌入式处理器，用于控制微型搅拌装置启动、测量信号和采集信号、对信号分析计算以及将测量计算结果显示在显示屏上。
所述的测量信号发生装置包括电源转换、上下限电压设置、循环伏安信号发生器、方波叠加器、恒电位仪。
所述电源转换装置用于将+5V直流电源转化为±5V和±2.5V直流电压。装置采用金升阳A0505-2W的DC-DC转换电源，将电池或外接的+5V直流电源转化为±5V电源。采用LM317和LM337分别将±5V直流电压转化为±2.5V直流电压。
所述循环伏安信号发生器用于产生循环伏安法检测时所用到的三角波信号。装置采用AD8617ARZ高性能运算放大器构成两个电压跟随器、电压换向器、积分电路。第一个电压跟随器连接外部DAC产生的积分电压用于提高积分电压的稳定性。电压换向器由上述AD8169运算放大器和一个继电器构成，用于改变被积分电压的极性：负的积分电压通过积分电路后产生三角波上升段的电压部分；正的积分信号通过积分电路后产生三角波下降段的电压部分。两个电压的无缝对接构成了循环伏安法测量中施加在工作电极和对电极之间的电压信号。该部分产生的三角波频率(即循环伏安法中的的扫描速度)可以通过改变积分电路中积分电容、前置电阻或者积分电压改变。
所述上下限电压设置用于设定循环伏安法的扫描区间。装置采用X9C104S数字电位器、运算放大器TL082、电压比较器LM393和触发器74LS74构成上下限电压设置模块用于产生电压换向信号。两片数字电位器通过STM8L单片机的控制产生循环伏安法扫描区间上下限的电压。数字电位器的输出电压分别连接到运算放大器构成的电压跟随器以稳定输出电压。上下限电压与电压比较器的连接为：上限电压连接电压比较器1的同向端，下限电压连接电压比较器2的反向端，电压比较器1的反向端和电压比较器2的同向端短接并连接到循环伏安信号发生器的输出端。电压比较器1的输出端连接触发器74LS74的PR1，电压比较器2的输出端连接触发器的CLR1。触发器D1、CLK1接地。输出端Q接STM8L的IO口用于对产生的三角波计数；输出端接电压换向器的继电器控制端用于对积分电压的极性控制。
所述方波叠加器用于差分脉冲伏安法和方波伏安法检测时叠加的方波信号，并且可以设定起始扫描电位。该装置采用AD8617ARZ高性能运算放大器构成加法电路和反向电路。所需叠加的电压信号串联一个1K欧姆的电阻后接入运算放大器的反向端，通过主控芯片控制继电器的通断确定电压信号是否接入电路。
所述恒电位仪作为检测系统的核心，采用AD8619ARZ集成运算放大器共有四个单独的运算放大器分别编号1，2，3，4。运算放大器1和2构成电压跟随器分别连接参比电极和三角波电压。运算放大器3的输出端接铂丝对电极，同向端接地，反向端与运算放大器1和2的输出端相连。运算放大器4的同向端接地，反向端接工作电极，同时，反向端接一100K欧姆的电阻用于将极化电流转换成可由模数转换电路测量的电压信号。
信号采集采用ADC7705高精度双路模数转换器，同时采集加载到对电极-工作电极之间的电压和工作电极上的极化电流。将其对应发送到STM8L控制芯片。
图3是本发明样品处理合成信号标记物的原理图；
图4是样品处理标记物纳米修饰的原理图。将氧化石墨烯溶解于去离子水中，超声之后加入氯金酸和氢氧化钠，反应后超声、离心得到石墨烯-纳米金复合物。随后使用双巯基的烷烃链修饰石墨烯-纳米金复合物。碱性条件下将信号标记物脱铁蛋白和乳腺癌肿瘤标志物MUC1和HER-2的适配体分别修饰到对应的石墨烯-纳米金复合物上。
图5为整个检测的流程图。首先合成纳米磁珠，并在磁珠上同时修饰MUC1和HER-2的适配体。随后将磁珠加入到含有待检测血液样本的缓冲溶液中，同时加入石墨烯-纳米金的信号标记物。若环境中存在相关抗原，则抗原与适配体之间会产生特异性识别形成“三明治”夹心结构。随后将磁珠通过磁场从溶液中分离出来，放入去离子水中清洗掉多余的标记物。将上述磁珠放入pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，去铁蛋白结构会再次打开，释放出Pb2+和Cd2+。通过对这两种离子做阳极溶出伏安法分析得到各自的浓度，即可得到对应的肿瘤标志物的浓度。
图6为检测结果，测量重金属峰电流与标志物浓度在0–20ng·mL-1范围内成正比，两者标志物的线性方程分别为：
IpMUC1＝0.0227CMUC1–0.039,R2＝0.98
IpHER2＝0.0336CHER2–0.11,R2＝0.95
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于包括信号标记物、磁珠-适配体复合材料；以及电解池、三电极测量装置、基于单片机STM8L的测量与分析系统；
所述的信号标记物包括连接有MUC1核酸适配体的标记物，以及连接有HER-2核酸适配体的标记物；上述两种标记物均以石墨烯与纳米金复合材料作为载体，载体表面吸附有包裹作为唯一标志重金属离子的去铁铁蛋白，同时通过双巯基的烷烃链分别连接乳腺癌肿瘤标志物MUC1或HER-2的核酸适配体；
此处的两种肿瘤标记物对应的重金属离子不相同；
所述的磁珠-适配体复合材料是外表面包裹有硅层的磁珠，且在磁珠修饰有MUC1和HER-2的核酸适配体；
所述的电解池包括反应池、电解液；电解液包括处理后的待检测物。
2.如权利要求1所述的一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于所述的三电极测量装置的参比电极采用饱和甘汞电极，对电极采用铂丝电极，工作电极采用石墨烯-Nafion-纳米金修饰的玻碳电极；三电极分别通过电路和测量与分析系统连接。
3.如权利要求1所述的一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于所述的基于单片机STM8L的测量与分析系统用于获取处理后的待检测物中含有的重金属离子含量，并以此分析出对应肿瘤标志物的浓度。
4.如权利要求1所述的一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于连接有MUC1或HER-2核酸适配体的标记物的制备过程如下：
将去铁蛋白加入到醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再分别加入不同的重金属离子A/B，得到去铁蛋白/重金属离子A混合物或去铁蛋白/重金属离子B混合物；在上述混合物中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，离心，超滤得到包含有重金属离子A或B的去铁蛋白；
(2)将氧化石墨烯溶解于去离子水中，超声使其充分分散；向石墨烯分散液中先后加入氯金酸与氢氧化钠，超声、离心得到石墨烯-纳米金复合物；最后使用双巯基的烷烃链修饰石墨烯-纳米金复合物后备用；
(3)分别取上述修饰后石墨烯-纳米金复合物用去离子水稀释到(0.5-1)mg·mL-1，加入HER2核酸适配体或MUC1核酸适配体摇晃均匀，轻微震荡1-2h后，适配体结合在石墨烯-纳米金材料表面；离心除去未结合的适配体，用去离子水溶解沉淀得到分别修饰HER2或MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料；
(3)将步骤(1)包裹有重金属离子A或B的脱铁蛋白加入上述步骤(3)分别修饰HER2或MUC1核酸适配体的石墨烯-纳米金材料溶液，轻微震荡1-2h得到重金属离子修饰的适配体。
5.如权利要求4所述的一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于所述的两个标记物中的重金属离子A、B分别为Pb2+离子、Cd2+离子。
6.如权利要求1所述的一种基于核酸适配体的多乳腺癌肿瘤标志物联合检测仪器，其特征在于处理后的待检测物的处理过程如下：
将待检测血液样品加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入磁珠-适配体复合材料缓慢摇晃，再加入两种信号标记物，缓慢摇晃20-40min后利用磁吸附出带有磁珠的物质；然后将上述带有磁珠的物质用pH＝7.4的PBS溶液清洗，去除未反应的标记物，得到最终所需的处理后的待检测物；
上述带有磁珠的物质包括反应后的信号标记物-肿瘤标志物-磁珠适配体夹心结构物质，以及未反应的磁珠-适配体复合材料。
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