CN109374891A - 基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统及方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统及方法，包括：用以对待测者血液中细胞外囊泡进行加热的加热单元；设置在所述加热单元一侧的样品仓室单元；设置在所述样品仓室单元一侧的信号处理单元，所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，并通过量化和采用无加权和/或有加权模型对相应的光参量进行计算，获取单一种类蛋白表达强度。本发明通过使用适体或抗体对患者血液细胞中的细胞外囊泡进行光标记，并使用检测单元对光标记中的光参量进行检测和处理，通过量化光参量并通过采用无加权和/或有加权模型对相应光参量进行计算，能够快速准确的得出细胞外囊泡的表达蛋白强度，检测精度高。

Description

基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统及方法
技术领域
本发明涉及癌症诊断技术领域，尤其涉及一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统及方法。
背景技术
前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。前列腺癌在早期通常无症状，随着肿瘤的发展，前列腺癌引起的症状可概括为：压迫症状和转移症状两大类；其中压迫症状表现为：逐渐增大的前列腺腺体压迫尿道可引起进行性排尿困难，表现为尿线细、射程短、尿流缓慢、尿流中断、尿后滴沥、排尿不尽、排尿费力，此外，还有尿频、尿急、夜尿增多、甚至尿失禁；肿瘤压迫直肠可引起大便困难或肠梗阻，也可压迫输精管引起射精缺乏，压迫神经引起会阴部疼痛，并可向坐骨神经放射。转移症状表现为：前列腺癌可侵及膀胱、精囊、血管神经束，引起血尿、血精、阳痿；盆腔淋巴结转移可引起双下肢水肿。前列腺癌常易发生骨转移，引起骨痛或病理性骨折、截瘫；前列腺癌也可侵及骨髓引起贫血或全血象减少。
现有技术中对前列腺癌检测主要有三种：前列腺穿刺活检术、直肠指检和前列腺特异性抗原测试。
其中，前列腺穿刺活检术通过对患者前列腺部位使用穿刺以获得前列腺组织，是确诊前列腺癌的重要手段；包括穿刺途径有经会阴、经直肠两种，可用于检测直肠指诊(DRE)触及硬结，怀疑肿瘤、B超发现前列腺低回声结节或MRI发现异常信号，怀疑肿瘤、血清前列腺特异性抗原(PSA)>4ng/ml、PSA在4.0～10.0ng/ml，f/tPSA异常或PSAD值异常等前列腺相关症状。其中，纳入前列腺穿刺的标准一般是血液生化检测PSA(前列腺特异抗原)浓度大于4纳克每毫升、直肠指检阳性、前列腺超声或MRI阳性，然而上述标准通常特异性较低，导致有大量接受穿刺患者最终诊断为阴性。由于前列腺穿刺为侵入式诊断且较为昂贵，大量穿刺阴性结果导致不必要的医疗负担；患者痛苦且在术后需要进行护理，步骤繁多；甚至在检测后患者会得感染、血尿、便血等穿刺副作用，也使得PSA与直肠指诊在前列腺癌筛查中的价值大打折扣；且穿刺活检只能应用于对前列腺的检测，无法对其他器官使用，适用范围低。当前急需同时具有高灵敏度与特异度且非侵入式技术区分满足传统前列腺穿刺表征人群中真正具有前列腺癌患者于阴性患者。
直肠指检是用于检查前列腺异常的替代程序，但这种检验受无法评估整个腺体和在一定程度上肿瘤大小的限制。
前列腺特异性抗原(PSA)测试目前被用于前列腺癌筛查，然而，这种测定遭受许多缺点，包括高百分比的假阳性结果。PSA在诊断时还无法区别侵袭性或更缓慢生长的癌症，从而导致过度治疗。最近，已经建议放弃这一程序，特别是在老年男性中。
中国专利公开号：CN1656231公开了一种分析样品中非复合形式的前列腺特异抗原以改进前列腺癌检测的方法，其提供了用于检测和确定前列腺癌存在的试验方法。试验能够在游离PSA与总PSA的比例显著高的男人群体中检测前列腺癌。试验还能够在少量总PSA，即范围为2-4ng/ml的男人群体中检测前列腺癌。根据本发明的一个实施方案，试验包括下列步骤：(a)确定来自患者的生物样品中所含的总PSA的量，(b)确定同一样品中游离PSA的量，并且计算游离PSA与总PSA的比例，(c)确定同一样品中的pPSA的量，(d)确定同一样品中BPSA的量，(e)确定同一样品中inPSA的量，以及(f)基于总PSA的水平和游离PSA，通过将inPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量与患者中前列腺癌的存在相关。由此可见，所述检测方法存在以下问题：
第一、所述检测方法在进行检测时需要确定个体生物样品中所含的总PSA的量，以及游离PSA的总量并计算游离PSA与总PSA的比例，在此过程中需要进行大量的样本采集，检测周期长。
第二、所述检测方法在上述比例计算完成后还需通过将inPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量与个体中前列腺癌的存在相关；在此过程中，在采集大量样本的同时，还需对采集到的样本进行多次计算，且计算过程繁琐。
第三、所述检测方法使用的样品液体仅限于血清、血液或血浆，无法使用上述三种样品液体以外的物质，在检测时有局限性。
第四、在对大量数据进行处理时，会出现偏差，并导致所述检测方法精度降低
由于缺乏准确可行且易操作的分析方法，使得目前在分析不同细胞外囊泡表达蛋白质的微小差别上仍面临挑战，发展简单可靠的细胞外囊泡表达蛋白的分析方法对肿瘤早期诊断非常重要。
因此，迫切需要更具特异性和更准确的前列腺癌检测方法，以助于早期诊断和选择最合适的治疗干预。早期检测会显著降低前列腺癌的死亡率，这使得改善的诊断和愈预后方法成为重要的目标。
发明内容
为此，本发明提供一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌测检测系统及方法，用以克服现有技术中检测方法由于检测参量的局限性导致检测精度低的问题。
一方面，本发明提供一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，包括：
用以对待测者血液中的细胞外囊泡进行加热的加热单元；
设置在所述加热单元一侧，用以装载细胞外囊泡的样品仓室单元，所述样品仓室单元内细胞外囊泡中对前列腺癌有高表达的表达蛋白能够与适体或抗体发生特异性结合而标记光信号，在所述加热单元对所述样品仓室单元加热后，所述样品仓室单元内产生热泳效应及对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内温度较低的一侧；
设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，用以放大和反射光信号的信号放大单元，所述信号放大单元会将光信号反射至指定位置；
设置在所述样品仓室单元一侧，用以对放大后的光信号进行采集和计算的信号处理单元，所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，并通过量化光参量及采用无加权和/或有加权模型对相应的光信号参量判定，获取单例细胞外囊泡中对前列腺癌有高表达的表达蛋白的表达强度。
进一步地，所述化学发光的过程为：先将带有发光催化物的适体或抗体与细胞外囊泡一同孵育，通过特异性结合将发光催化物标记在细胞外囊泡表面上，并向其添加发光底物，通过发光催化物催化发光底物而使其达到激发状态，并在转化为基态过程中释放光能以使细胞外囊泡表面标记光信号。
进一步地，所述信号处理单元中计算细胞外囊泡表达蛋白强度的加权求和方法包括：
步骤a：将蛋白的加权表达强度设为因变量Y，将信号处理单元测得的细胞外囊泡标志物光参量设为自变量X，则细胞外囊泡上不同标志物的光参量按照测量顺序设为：X1，X2，...，Xk；
步骤b：由于加权表达强度Y与光参量X呈线性关系，此时进行如下计算：
Y＝β0+β1X1+β2X2+...+βkXk+ε (1)
其中，β0，β1，β2，...，βk为回归参数，ε为随机误差项；
步骤c：对所述步骤b中的式(1)和光参量X做出基本假定以保证在对数据进行加权求和时参数估计、统计检验和置信区间估计的有效性；
步骤d：当所述式(1)和光参量X满足所述假定时，对所述式(1)两边取期望，得：
E(Y|X1,X2...Xk)＝β0+β1X1+β2X2+...+βkXk (2)
其中，E(Y|X1，X2，...，Xk)表示在给定光参量Xi的条件下蛋白加权加权表达强度Y的条件均值；
步骤e：对所述式(1)取期望完成后，根据光参量X给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时得到蛋白加权加权表达强度Y相应的估计值：
上述式(3)为E(Y|X1，X2，...，Xk)的点估计值；
步骤f：当所述式(1)和光参量X满足所述步骤c中的假定时，通过最小二乘得到参数估计，此时假设
在所述式(4)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(5)中的方程组进行求解，得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权加权表达强度Y。
进一步地，所述步骤a中的光参量为光亮度L、光强度C、吸光度A或光频率λ中的一种或多种。
进一步地，所述步骤c中对所述式(1)和光参量X做出的基本假定包括：
假定c1：随机误差项ε的概率分布具有零均值，E(ε)＝0；
假定c2：随机误差项ε的概率分布对于不同的自变量表现值，具有同方差，ε的方差不随着Xij的变化而变化，D(ε)＝σ2；
假定c3：随机误差项ε不存在自相关，cov(εi，εj)＝0；
假定c4：εi与任一解释变量Xi不相关，cov(εi，Xi)＝0；
假定c5：自变量X之间不存在完全共线性；
其中，上述假定c1-c4与一元回归分析的假定相同，所述假定c5用以针对解释变量。
进一步地，所述信号处理单元中计算细胞外囊泡表达蛋白总丰度的加权求和方法包括：
步骤a：将细胞外囊泡表达蛋白总丰度设为因变量M，细胞外囊泡标志物的光参量设为自变量D，则根据检测的表达蛋白顺序分别将测得的光参量设为：D1,D2,...,Dk；
步骤b：由于不同种类表达蛋白在不同患者间的丰度均不相同，需根据不同种类的表达蛋白设置对应的权重系数α1,α2,...αk，则所述细胞外囊泡表达蛋白总丰度M可通过下式求得：
M＝α1D1+α2D2+...+αkDk (6)
步骤c：确定测定癌症种类的总数量N，并确定各种类表达蛋白在所述癌症种类数量中具有高表达的个数n1,n2,...nk，则各表达蛋白在癌症中具有高表达的比例为：
步骤d：对所述步骤a中各表达蛋白光参量D取平均值并对光参量D求方差：
步骤f：根据所述步骤c和步骤d中得出的数据对对权重系数α进行确定：
步骤g：权重系数α确定后，根据步骤b中公式求得细胞外囊泡表达蛋白总丰度：
进一步地，所述样品仓室单元设置在所述加热单元一侧，在所述样品仓室单元内部装有样品液体用以装载所述细胞外囊泡和适体或抗体，包括：
设置在所述加热单元一侧且为透明材质，用以吸收所述加热单元热量的第一导热面；
设置在所述第一导热面下方且为透明材质，用以吸收所述加热单元热量的第二导热面，其中第二导热面的导热性高于第一导热面的导热性；
设置在所述第一导热面与第二导热面之间且在中心开设有通孔，用以装载所述样品液体的垫片。
进一步地，所述信号放大单元设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，用以放大细胞外囊泡表面的光信号，包括：
设置在所述第二导热面远离所述加热单元的一侧，用以观察光信号的物镜；
设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧并与所述物镜呈一定夹角，用以反射光标记的采集反光镜；
设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧并与所述物镜呈一定夹角，用以反射光源的放大反光镜；
设置在所述放大反光镜一侧，用以为光标记提供放大光源的观测光源。
进一步地，所述信号采集单元根据检测系统需要检测的光参量，为CCD相机、照度计、分光计、单色器、sCMOS、EMCCD、PMT中的一种或多种。
另一方面，本发明提供一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测方法，其特征在于，包括：
获取患者血样作为样品液体，并将其中的细胞外囊泡与带有光标记的适体或抗体一同孵育，通过适体或抗体与细胞外囊泡表面对前列腺癌有高表达的表达蛋白进行特异性结合，以将细胞外囊泡表面标记上光信号；
将孵育后的细胞外囊泡放入样品仓室单元，并对样品仓室单元加热以产生热泳效应和对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内的低温一侧，以放大细胞外囊泡上的光信号，通过对至少一种光信号参量进行计算以将光信号转换成对应的具体单一种类数值；
检测完成后，重复上述步骤，使用不同种类的适体或抗体对细胞外囊泡中的多种对前列腺癌有高表达的表达蛋白分别进行标记和检测，得到细胞外囊泡中多种表达蛋白的数值组；
将上述对不同光参量求出的对应数值组带入加权模型和/或无加权模型对相应光参量进行计算，获取细胞外囊泡蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度以及表达蛋白总丰度，通过结合三种数值得出细胞外囊泡的SUM表达图，并根据SUM表达图对待测者是否患有前列腺癌做出判定。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，通过使用适体或抗体对患者血液细胞外囊泡表面对前列腺癌有高表达的表达蛋白进行光标记，并使用检测单元对光标记中光的物理参量进行检测和处理，通过分析光参量能够快速准确的得出细胞外囊泡对前列腺癌有高表达的表达蛋白加权表达强度，检测精度高。尤其是，本发明通过采用多种物理参量的聚积检测，而非直接通过生物反应检测，检测过程更加简便及易操作，样本用量小，并且，通过物理参量的聚积检测，相比生物反应检测，其检测量的表达更容易量化，能够对待测者是否患有前列腺癌进行清晰判定。尤其，本发明对于细胞外囊泡对前列腺癌有高表达的表达蛋白的检测、及光度的参量化，基于加权模型和/或无加权求和模型的计算方式获取，然后根据标准的蛋白质标志物浓度与光某种参量的标准函数关系，来确定癌变程度。如，通过对光强度C、光亮度L、光频率λ、特定波长吸光度A下的样本浓度等光特性检测物理量进行判定。并且，在基于同一抗体或适体的检测过程中，通过对多种物理参量的检测及计算，相互比较，选取最优的物理参量的表达来确定最终的癌变结果。
尤其，本发明采用化学发光和热泳效应、对流相结合的光聚积方式，通过与细胞外囊泡结合的适体或抗体中的发光催化物催化而达到激发状态，并在转化为基态过程中释放光能以使细胞外囊泡表面标记光信号，在检测时，所述发光催化物能够保持较长时间发光。
尤其，本发明由于通过加权模型和/或无加权求和模型的计算方式，通过对多种细胞外囊泡表达蛋白的量化精准计算，能够准确确定癌变程度。
进一步地，本发明样品仓室单元设有透明材质的第一导热面和第二导热面，通过对其内部的样品液体加热使细胞外囊泡产生热泳效应并向低温处移动，同时，温度升高后样品液体会产生热对流并使细胞外囊泡聚积在指定位置，以此放大细胞外囊泡的光信号，这样，在对光参量进行检测的时候能够更加准确的观测到细胞外囊泡光参量的具体数值，进一步提高了所述检测系统的检测精度。尤其，通过该种方式，可以同时采集多种光物理参量，如，对光强度C、光亮度L、光频率λ、特定波长吸光度A等参量的检测。
进一步地，本发明所述检测系统使用热泳效应和热对流效应聚积细胞外囊泡，因此，所述检测系统对所述样品仓室单元的尺寸没有具体限制。所述样品仓室单元中的样品液体用于装载细胞外囊泡和适体或抗体并能够使其产生热泳效应和对流，因此本检测系统在样品液体的选择上不作具体限制，只要所述样品液体能够在热对流效应下带动细胞外囊泡移动并聚积即可。进一步地，所述细胞外囊泡与适体或抗体通过特异性结合的方式连接在一起，这样，光标记能够稳固的链接在细胞外囊泡上，在细胞外囊泡聚积时，也能够更加准确地将细胞外囊泡的光参量观测出来，进一步提高了所述检测系统的检测精度。细胞外囊泡在热泳效应下受到的力与其直径平方成正比，而与细胞外囊泡数量无关，因此，在检测时只需要少量的血样即可完成，对于细胞外囊泡仅需0.1微升的样本用量，并且无需对样品进行前置处理。
进一步地，所述样品仓室单元在被加热时，只要所述第一导热面和第二导热面之间存在温差，就能够使样品仓室单元内产生热泳效应和热对流并将带有光标记的细胞外囊泡聚积至指定位置。所述检测系统中仅需对聚积的细胞外囊泡光参量进行检测，无需使用其他特殊仪器，在不影响检测系统检测精度的情况下，节约了检测装置的成本。
进一步地，所述检测系统中设有数据采集单元，其能够从采集到的蛋白表达图谱中提取指定的光参量，并将其带入加权模型和/或无加权求和模型模型中以计算细胞外囊泡表达蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度，通过将直观的图像转换为具体的数字，进一步提高了所述检测系统的检测精度。
进一步地，所述检测系统能够针对不同癌症中高表达蛋白选择对应的适体或抗体对其进行标记，以此测得对应表达蛋白的丰度图谱并计算出表达强度，这样，所述检测系统不仅能够对前列腺癌症进行检测，同时还能对其他癌症进行快速而准确地检测，如：肺癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、皮肤癌、肾癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫癌、阴道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌、喉癌、输卵管癌、肾母细胞癌、淋巴癌、胆管癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母细胞瘤、滋养层细胞瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、胆脂瘤、软骨肉瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经瘤、横纹肌肉瘤。
附图说明
图1为本发明基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统的结构图；
图2为本发明基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前列腺癌检测系统的结构图；
图3为本发明利用单色器检测细胞外囊泡样本吸光度的原理图；
图4为本发明基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统检测前列腺癌患者的外泌体表达蛋白丰度图谱；
图5为本发明使用基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前列腺癌检测系统检测前列腺癌患者的外泌体表达蛋白丰度图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
系统实施例一
本发明实施例为基于热泳细胞外囊泡的前列腺癌检测系统，请参阅图1所示，其为本发明基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌症检测系统的结构示意图，本实施例的系统包括加热单元1、样品仓室单元2、信号放大单元3和信号处理单元4，其中，所述加热单元1设置在所述样品仓室单元2的上方，用以对所述样品仓室单元2内的样品加热；所述样品仓室单元2内装有样品液体，用以装载细胞外囊泡和带有荧光标记的适体；所述信号放大单元3设置在所述样品仓室单元2下方，用以放大所述荧光标记的荧光信号，所述信号处理单元4设置在所述信号放大单元3侧面，用以采集和记录所述放大后的荧光信号，并对荧光信号的光亮度、光强度和光波长参数中的一种或几种进行或获取，同时使用加权和无加权求和对待测样品细胞外囊泡进行癌症病变程度的检测。
具体而言，在基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌症检测系统工作前，先将细胞外囊泡和带有荧光标记的适体放入样品仓室单元2，通过适体与细胞外囊泡表面的一种对前列腺癌有高表达的表达蛋白进行特异性结合，以将荧光标记在细胞外囊泡上。标记完成后，所述加热单元1开始对样品仓室单元2加热，样品仓室单元2受热后，其内部的样品液体开始产生热泳效应并发生对流，并将被标记的细胞外囊泡聚集在指定位置；聚集完成后，信号放大单元3会向细胞外囊泡聚集的位置发射对比光源，信号处理单元4会采集聚集的细胞外囊泡的相关信息，并对其进行相应的分析，通过光的光亮度L、光强度C、波长λ参数中的一种或几种获取，采取加权和无加权求和的方式进行癌症病变程度进行判断。本领域的技术人员可以理解的是，本实施例基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统不仅可用于对细胞外囊泡进行聚集和检测，也可对细胞外囊泡或其他种类的微纳生物粒子进行检测，只要满足所述基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌症检测系统能够达到其指定的工作状态即可。
请继续参阅图1所示，本发明实施例加热单元1为一激光加热器，其设置在所述样品仓室单元2上方，用以对所述样品仓室单元2内部的样品液体进行加热，以在其内部产生圆形的加热区域。当细胞外囊泡被标记完成后，所述加热单元1对所述样品仓室单元2内部的样品液体进行加热，以将细胞外囊泡聚集起来。可以理解的是，所述加热单元1的加热方式并不仅限于激光照射，且激光照射的方向和功率的选择本实施例均不作具体限制，只要满足所述加热单元1能够使所述样品仓室单元2内部产生温差以汇聚细胞外囊泡即可。
请继续参阅图1所示，本发明实施例所述样品仓室单元2设置在所述加热单元1下方，用以盛装含有细胞外囊泡和适体的样品液体，包括第一导热面21、第二导热面22和垫片23；其中所述垫片23设置在所述第一导热面21下方并与其相接触，用以盛装样品液体，所述第二导热面22设置在所述垫片23下方，用以与所述第一导热面21一同将所述垫片23内部的样品液体密封。当所述加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热时，激光会依次穿过所述第一导热面21和第二导热面22并对其进行加热，由于样品液体受热升温，在加热后所述细胞外囊泡温度也会升高，此时细胞外囊泡会产生热泳效应并向温度较低的第一导热面21和第二导热面22方向移动，由于所述第一导热面21与第二导热面22的导热性不同，在加热后所述第一导热面21加热点处的温度会高于第二导热面22加热点处的温度并使样品液体产生温度差，样品液体从而在样品仓室单元2中沿低温处向高温处方向产生热对流，使样品中细胞外囊泡迁移并聚积到所述第二导热面22处。可以理解的是，本实施例所述样品仓室单元2可以设置在所述加热单元1的下方、上方、左方或右方，只要所述加热单元1能够对所述样品仓室单元2加热而使其内部的样品液体升高温度即可。
具体而言，本发明所述第一导热面21为玻璃片，其设置在所述垫片23上方，用以密封所述垫片23内部的样品液体并与所述加热单元1一同对样品液体加热。当所述加热单元1的激光穿过所述第一导热面21时，其会对所述第一导热面21的中心处进行加热，并提高加热处的温度，温度提高后，所述第一导热面21会将热量传递至所述垫片23中的样品液体，并使样品液体产生对流，以聚积细胞外囊泡。可以理解的是，所述第一导热面21的材料可以为玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、蓝宝石或其他种类的透明材料，只要满足所述第一导热面21能够受热升温即可。
具体而言，本发明所述第二导热面22为导热性高于所述第一导热面21的玻璃片，其设置在所述垫片23下方，用以密封所述垫片23内部的样品液体并与所述加热单元1一同对样品液体加热。当所述加热单元1的激光穿过所述第二导热面22时，其会对所述第二导热面22的中心处进行加热，并提高加热处的温度，温度提高后，所述第二导热面22会将热量传递至所述垫片23中的样品液体，由于所述第二导热面22的导热性高于所述第一导热面21，在所述加热单元1加热完成后，所述第二导热面22的温度会小于所述第一导热面21的温度，在所述垫片23内产生温差，并使样品液体产生对流，以聚积细胞外囊泡。可以理解的是，所述第二导热面22的材料可以为玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、蓝宝石或其他种类的透明材料，只要满足所述第二导热面22能够受热升温且其温度低于样品液体中心温度即可。
具体而言，所述垫片23为一设有通孔的圆片，其设置在所述第一导热面21和第二导热面22之间，用以装载样品液体和聚积细胞外囊泡。当所述加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热时，加热激光的焦点会位于所述垫片内部的样品液体处，通过对样品液体加热使样品液体内部的细胞外囊泡产生热泳效应并向所述第二导热面22聚集，同时因为所述第一导热面21和第二导热面22之间的温差，样品液体开始产生对流并将细胞外囊泡聚集在所述第二导热面22的激光照射处。可以理解的是，所述垫片23中的样品液体材质可以为血浆、血清或任意形式的血液或其处理加工的衍生样本，只要满足所述样品液体能够装载细胞外囊泡和适体并能够使其产生热泳效应和对流即可。
请继续参阅图1所示，本发明实施例所述信号放大单元3设置在所述样品仓室单元2下方，用以照射所述第二导热面22中聚集的细胞外囊泡并将所述细胞外囊泡中的荧光信号放大，包括物镜31、采集反光镜32、放大反光镜33和观测光源34。其中，所述物镜31设置在所述第二导热面22下方，用以收集所述带有荧光标记细胞外囊泡的荧光信号，所述采集反光镜32设置在所述目镜31下方，用以将放大的荧光信号反射给所述信号处理单元4，所述放大反光镜33设置在所述采集反光镜32下方，用以将所述观测光源34中的光线反射至所述物镜31中，所述观测光源34设置在所述放大反射镜33右侧，用以提供放大荧光信号的光线。当所述信号放大单元开始工作时，所述观测光源34发射光线，通过所述放大反光镜33反射至所述物镜31，所述物镜31将光线照射至所述第二导热面22中的细胞外囊泡聚集处，并以此放大外所述细胞外囊泡的荧光信号，放大完成后，所述信号处理单元4会使用所述采集反光镜32采集所述放大后的荧光信号，以此完成荧光信号的采集和处理。可以理解的是，所述信号放大单元3可以设置在所述样品仓室单元2的上方、下方、左方或右方，只要满足其能够对样品仓室内的荧光信号进行采集即可。
具体而言，本发明所述物镜31设置在所述第二导热面22细胞外囊泡聚集处的下方，用以收集所述细胞外囊泡中的荧光信号，当所述观测光源34的光线照射至物镜31时，物镜31会将光线照射至所述第二导热面22上，以此放大所述细胞外囊泡上的荧光信号。可以理解的是，所述物镜31的种类本实施例不作具体限制，只要满足所述物镜31能够达到其指定的工作状态即可。
具体而言，本发明实施例所述采集反光镜32为一平面镜，其设置在所述物镜31下方并与物镜31呈45°夹角，用以反射所述放大后的荧光信号。当所述细胞外囊泡的荧光信号被放大后，所述采集反光镜32将荧光标记反射至所述信号处理单元4，以完成荧光信号的采集。可以理解的是，所述采集反光镜32的尺寸本实施例不作具体限制，只要满足所述采集反光镜32能够将荧光信号完整的反射至所述信号采集单元即可。
请继续参阅图1所示，本发明实施例所述信号处理单元4包括一CCD相机，其设置在所述采集反光镜32右侧，用以采集所述细胞外囊泡的荧光信号。当所述荧光信号被放大后，所述采集反光镜32会将放大后的荧光信号反射至所述信号处理单元4中，所述信号处理单元4对荧光信号进行采集和整理，形成单次检测的图谱，可以理解的是，信号处理单元4可以包括CDD相机，也可以为任何能够探测荧光信号的仪器，只要所述信号处理单元4能够通过所述信号放大单元3对带有荧光标记的细胞外囊泡进行拍照，获取信息即可。当然，所述信号处理单元4可以位于所述信号放大单元3的左侧、右侧、上侧或下侧，只要满足所述信号处理单元4能够通过信号放大单元3采集和处理荧光信号即可。
本系统实施例检测系统在对待测者是否患有前列腺癌进行检测时通过先将荧光标记与适体相连,再将适体与待测样品细胞外囊泡一同孵育以将细胞外囊泡标上荧光标记，操作简单，易于执行，在使用本系统对多个待测者进行检测时，患者仅需要提供少量血样，就能够对患者的病情进行快速的诊断。
系统实施例二
本发明实施例为基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前列腺癌检测系统，作为本发明的优选实施例，请参阅图2所示，其为本发明实施例基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前列腺癌检测系统的结构示意图，本实施例的系统包括加热单元1、样品仓室单元2和信号处理单元4，该上述单元与上述实施例一相同。
与上述实施例一不同的是，本发明的光标记采用化学发光标记方法，在使用基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统前，先将细胞外囊泡待测样品与标记有发光催化物的抗体一同孵育，发光催化物可以为酶，通过抗体与细胞外囊泡表达蛋白特异性结合将细胞外囊泡标记酶，标记完成后，将孵育完成的样本放入所述样品仓室单元2，并向所述样品仓室单元内部加入发光底物，酶催化发光底物并使其达到激发态，并在转化成基态时释放光能。
当所述基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前列腺癌检测系统开始工作时，所述加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热，使其内部的细胞外囊泡产生热泳效应而开始向温度低的一面移动，同时所述样品仓室单元的两侧温度不同使所述样品仓室单元2内部开始产生对流，并将细胞外囊泡聚积在指定位置，聚积完成后，所述信号采集单元3开始对细胞外囊泡的光信号进行采集，并得出所述细胞外囊泡表面表达蛋白的丰度图谱。请继续参阅图2所示，本发明实施例所述信号处理单元4设置在所述样品仓室单元2下方，用以对所述聚集的细胞外囊泡进行观测和采集。
具体而言，在本实施例利用化学发光的细胞外囊泡检测体系中，所述标记酶可以为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)或其他种类的标记酶；所述发光底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼)、异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼)或其他种类的衍生物，只要满足所述标记酶能够与细胞外囊泡发生反应并粘在细胞外囊泡表面，且所述发光底物能够与所述标记酶发生反应并发出光亮即可。
本实施例与上述实检测系统施例一相比，加热单元1、样品仓室单元2的结构、原理和工作功能均相同，但由于本实施例使用化学反应产生的光对细胞外囊泡进行标记，在对前列腺癌有高表达的表达蛋白进行标记完后细胞外囊泡表面会保持有长时间的高亮光信号，因此本实施例不使用所述放大反光镜33和观测光源34对光信号进行放大也可对细胞外囊泡的光信号进行准确地观测和采集。
本实施例检测系统在检测时先将抗体与细胞外囊泡一同孵育并使其互相连接，孵育完成后将细胞外囊泡与发光底物一同放入所述样品仓室单元2中，通过抗体中发光催化物催化发光底物使其达到激发态，并在其转化成基态时释放光能以此在细胞外囊泡表面标记光信号，同时，本实施例所述的化学反应为催化反应，发光催化物作为催化剂能够一直催化发光底物发生反应并持续产生光亮，这样，在检测时，所述细胞外囊泡能够保持长时间发光。
进一步地，由于光信号能够长时间维持，故而无需对光信号进行二次放大，在采集光信号时，相比于所述系统实施例一，本实施例只需一次就能对光信号进行清晰准确的采集，节约了系统的检测时间，提高了检测效率。
进一步地，在检测时，将标记完成的细胞外囊泡从孵育容器中转移到装有样品液体的样品仓室单元2中，这样一来，就排除了多余抗体中的发光催化物与发光底物催化而发生反应并一同发光的现象，使得所述基于热泳细胞外囊泡利用化学检测的癌症检测系统在对细胞外囊泡进行检测时，在具有所述基于热泳细胞外囊泡检测的癌症检测系统优点的基础上，拥有高度的准确性。
基于上述两种实施例而言，对于细胞外囊泡的光度的检测、及参量化，基于加权和无加权求和的计算方式获取，然后根据标准的蛋白质标志物浓度与光某种参量的标准函数关系，来确定癌变程度。如，通过对光强度、光亮度、光频率、特定波长吸光度下的样本浓度等光特性检测物理量进行判定。
下面通过实施例进行说明。
作为较优的一实施例，本实施例中的光参量X采用光亮度L，此时所述检测系统中的采集器选用CCD相机，在对光亮度进行测量时，通过使用CCD相机对细胞外囊泡集合后发出的光进行拍摄，以得出细胞外囊泡光信号的单个图谱，在测量完成后，对单个表达蛋白的多个测量结果，可以使用光亮度对照表将各图谱中的光亮度L从图像转换成具体数值L1,L2...Lk，并以此作为自变量X带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权加权表达强度Y进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权加权表达强度Y。
此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度YL为：
YL＝β0+β1L1+β2L2+...+βkLk+ε (10)
对上述式(10)进行假定后，对两边取期望，可得：
E(YL|L1,L2...Lk)＝β0+β1L1+β2L2+...+βkLk (11)
对所述式(10)取期望完成后，根据光亮度L给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时可以得到蛋白加权表达强度YL相应的估计值：
此时使用最小二乘得到参数估计：
在所述式(13)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(14)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权表达强度YL。
求出参数的估计值和蛋白加权表达强度YL后，根据表达蛋白种类和各类蛋白的加权表达强度YL。
经过计算可以得出，在使用光亮度L作为光参量X进行计算时，测得的光图谱能够较为直观的表达细胞外囊泡表达蛋白的丰度，在计算时也比较简便，测量周期短。
作为较优的一实施例，本实施例中，采用光强度C而非光亮度L进行测量，此时检测系统中使用的采集器选用照度计(或称勒克斯计)测定细胞外囊泡光信号中的光强度C。其中，照度计是把光能直接转换成电能的光电元件。当光线射到硒光电池表面时，入射光透过金属薄膜到达半导体硒层和金属薄膜的分界面上，在界面上产生光电效应。产生的光生电流的大小与光电池受光表面上的照度有一定的比例关系。这时如果接上外电路，就会有电流通过，电流值从以勒克斯(Lx)为刻度的微安表上指示出来。
通过使用照度计对多例细胞外囊泡中某一种类表达蛋白光标记的光强度进行测量后，会得到对某一种类表达蛋白的光亮度C1,C2...Ck，并以此作为自变量X带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权表达强度YC进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度YC。
此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度YC为：
YC＝β0+β1C1+β2C2+...+βkCk+ε (15)
对上述式(15)进行假定后，对两边取期望，可得：
E(YC|C1,C2...Ck)＝β0+β1C1+β2C2+...+βkCk (16)
对所述式(15)取期望完成后，根据光强度C给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时可以得到蛋白加权表达强度YC相应的估计值：
此时使用最小二乘得到参数估计：
在所述式(18)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(19)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权表达强度YC。
求出参数的估计值和蛋白加权表达强度YC后，根据表达蛋白种类和各类蛋白的加权表达强度YC。
在使用光强度C作为光参量X进行计算时，在测量光图谱时具有较高的抗干扰性，求得的细胞外囊泡加权表达强度YC相对准确；
作为较优的另一实施例，本实施例中，采用光频率ν而非光亮度L、光强度C进行测量，此时所述检测系统中选用的采集器为分光计，在对细胞外囊泡光信号进行测量时，通过所述分光计对某一种类表达蛋白中每例细胞外囊泡光信号的波长λ1,λ2...λk，得到光波长的数据后，根据公式λν＝c＝299792458(m/s)计算出各光信号所对应的光频率值ν1,ν2...νk，计算完成后将其作为自变量X带入所述加权求和模型中对所述某一种类蛋白加权表达强度Yν进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度Yν。
此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度Yν为：
Yν＝β0+β1ν1+β2ν2+...+βkνk+ε (20)
对上述式(20)进行假定后，对两边取期望，可得：
E(Yν|ν1,ν2...νk)＝β0+β1ν1+β2ν2+...+βkνk (21)
对所述式(20)取期望完成后，根据光强度ν给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时可以得到蛋白加权表达强度Yν相应的估计值：
此时使用最小二乘得到参数估计：
在所述式(23)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(24)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权表达强度Yν。
在使用光频率ν作为光参量X进行计算时，能够将测得的光图谱进行准确的数字转换，求得的细胞外囊泡表达强度Yν值准确度最高。
作为较优的另一实施例，本实施例中，采用细胞外囊泡样本浓度H而非光亮度L、光强度C或光频率ν进行测量，此时所述检测系统中选用的采集器为单色器，其中利用所述单色器测量吸光度的原理如图3所示，所述单色器包括光源5、单色仪6、调整孔7、玻璃管8、光敏电阻9、放大器10和输出屏11；当光源5发出指定光强度的光亮并照射至所述单色仪6时，单色仪6会将光信号的光线分散成不同波长的单色光；此时对所述调整孔7进行调节，使450nm波长的单色光穿过并将其他波长的单色光挡住；所述玻璃管8中装有待检测的细胞外囊泡样本，当所述450nm波长的单色光穿过玻璃管8时，细胞外囊泡样本会吸收450nm波长单色光的部分光强度；被吸收后的单色光会照射至光敏电阻9上，并将光强度转换成电阻；所述光敏电阻9经过所述放大器10放大，被输送至输出屏11上，以将吸收后单色光的光强度显示在屏幕上。得到吸收后光强度，并结合吸收前光强度，即可计算出细胞外囊泡样本的吸光度A。
在对细胞外囊泡光信号进行测量前，通过测定一系列已知浓度的蛋白质标志物条件下在450nm波长下的吸光度作为参考，得到浓度与吸光度之间的特定函数关系，此时，通过所述单色器分别对未知浓度的每例细胞外囊泡测出光信号在450nm波长处的吸光度A1,A2...Ak，得到光信号吸光度的数据后，根据所述函数关系计算出各例吸光度所对应的浓度H1,H2...Hk，计算完成后将其作为自变量X带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权表达强度YH进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度YH。
此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度YH为：
YH＝β0+β1H1+β2H2+...+βkHk+ε (25)
对上述式(25)进行假定后，对两边取期望，可得：
E(YH|H1,H2...Hk)＝β0+β1H1+β2H2+...+βkHk (26)
对所述式(25)取期望完成后，根据光强度ν给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时可以得到蛋白加权表达强度Yν相应的估计值：
此时使用最小二乘得到参数估计：
在所述式(28)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(29)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权表达强度YH。
在使用细胞外囊泡样本浓度H作为光参量X进行计算时，能够将测得的光图谱进行准确的数字转换，求得的细胞外囊泡加权表达强度YH准确度最高。
下面选取10例前列腺癌患者，先通过常规检测方法对患者进行检测以得出各患者体内各表达蛋白的实际加权表达强度Y0，并分别使用上述四种测量方法分别对各患者内个表达蛋白的加权表达强度进行测量，得出表达蛋白测量强度YL,YC,Yν,YH，通过以下公式求出各表达蛋白测量强度YL,YC,Yν,YH与表达蛋白实际强度Y0的偏差值з，以判断上述四种方法的检测准确度：
其中，本实施例检测的细胞外囊泡标志物中，CD9、CD63和CD81三种细胞外囊泡普遍具有较高表达的蛋白，所以在检测时选用上述三种表达蛋白以对上述四种方法的检测准确度进行对比，对比结果如表1所示：
表1
根据表1可以得出，相对于其他两种方法，在使用光强度C细胞外囊泡样本浓度H作为自变量X对患者细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y进行检测和计算时，得出的偏差值相对较高，测量精准度低；而在选用光亮度L和光频率ν作为自变量X对患者细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y进行检测和计算时，得出的偏差值明显低于光强度偏差值зC，所以，相对于光强度C和细胞外囊泡样本浓度H，本实施例会从光亮度L和光频率ν中选用一种参量作为加权求和模型中的自变量X。
然而，在使用光频率ν作为所述自变量X进行计算时，使用的数据数值非常庞大，这样，在测定蛋白加权加权表达强度Y前会消耗大量的时间，同时在数据整理完成后，使用加权求和模型对整理出的光频率数据进行运算时，由于整理得出的光频率ν数值同样庞大，因此也需要大量的运算才能得出所述细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y，整个过程会耗费大量的时间和运算，因此，在偏差值相似的情况下，本实施例选用在数据处理过程中相对简便的光亮度L作为加权求和模型的自变量X。
具体而言，本检测系统中对细胞外囊泡表达蛋白丰度的加权求和方法包括：
步骤a：将细胞外囊泡表达蛋白总丰度设为因变量M，某种标志物的的光参量设为自变量D，则根据检测的表达蛋白顺序分别将测得的光参量设为：D1,D2,...,Dk；
步骤b：由于不同种类表达蛋白在不同患者间的丰度均不相同，因此需根据不同种类的表达蛋白设置对应的权重系数α1,α2,...αk，则所述细胞外囊泡表达蛋白总丰度M可通过下式求得：
M＝α1D1+α2D2+...+αkDk (6)
步骤c：确定测定癌症种类的总数量N，并确定各种类表达蛋白在所述癌症种类数量中具有高表达的个数n1,n2,...nk，则各表达蛋白在癌症中具有高表达的比例为：
步骤d：对所述步骤a中各表达蛋白光参量D取平均值并对光参量D求方差：
步骤f：根据所述步骤c和步骤d中得出的数据对对权重系数α进行确定：
步骤g：权重系数α确定后，即可根据步骤b中公式即可求得细胞外囊泡表达蛋白总丰度：
其中，所述光参量选用光亮度L。
实施例1
研究表明，几乎所有物种的细胞均能分泌细胞外囊泡，根据来源不同，细胞外囊泡可分为三类：外泌体、微泡和凋亡小体，其中，外泌体包含了复杂脂质、RNA和蛋白质。
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中并被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，外泌体所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。
综上所述，本实施例选用外泌体作为检测样本对患者前列腺是否癌变进行检测，包括以下步骤：
步骤1：获取待测者血样作为样品液体，并将其中的细胞外囊泡与带有荧光标记的适体一同孵育培养，使带有荧光标记的适体与外泌体表面的表达蛋白进行特异性结合，以此将外泌体表面标记上荧光；
步骤2：将所述步骤1中孵育完成的外泌体放入所述样品仓室单元2中；
步骤3：当所述外泌体添加完成后，使用加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热，并将激光的焦点设置在样品仓室单元2内部的样品液体上，加热后，样品液体中的外泌体会产生热泳效应，并向低温区域移动；同时，所述样品液体受热膨胀产生浮力，从而在所述样品仓室单元2内产生对流，对流的方向从周围指向样品仓室单元2的加热区域，将周围的外泌体汇聚在样品仓室单元2的低温一侧；
步骤4：当所述外泌体聚积完成后，使用所述信号采集单元4对聚积的外泌体的荧光信号进行采集，采集完成后使用所述信号放大单元3对所述聚积外泌体进行进行光照，光照完成后使用所述信号采集单元4对所述聚积外泌体的荧光信号进行二次采集；
步骤5：采集完成后，通过将照射前后采集的荧光信号参量化并相减，以得出外泌体中单个表达蛋白的丰度；
步骤6：检测完成后，重复步骤1-步骤5，使用不同种类的适体对所述外泌体中的多种表达蛋白进行标记和检测，得到所述外泌体中多种表达蛋白的丰度图谱；
步骤7：结合所述步骤6中外泌体表达蛋白图谱中的对照表将蛋白图谱中各荧光度转换成数据并利用加权和无加权求和求出待测样品中外泌体表达蛋白的加权表达强度YL、表达蛋白丰度M以及无加权表达强度∑L，并根据三种数值得出外泌体SUM表达图；
步骤8：根据所述步骤6中得出的外泌体表达蛋白图谱和所述步骤7中的外泌体SUM表达图作出癌变判定。
其中，本实施例所述适体选择的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。
所述SELEX技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，混合液中存在靶物质与核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而适配子(Adaptorprotein)即与靶物质有高亲和力的DNA或RNA从非常大的随机文库中分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从P摩尔到n摩尔，最后占据库的大多数(>90％左右)。具有库容量大、适应范围广泛、高分辨率、高亲和力、筛选过程相对简便、快速、经济、实用性以及适配子体积小的特点。
具体而言，本实施例的荧光标记适体为40碱基的单链DNA，在样品液体中的线团直径小于5纳米，而外泌体直径为30-150纳米；
具体而言，本实施例的外泌体样品为细胞培养基上清，样品的孵育条件均为：2小时孵育时间、适体浓度0.1微摩尔每升、孵育温度室温。
具体而言，本实施例所述加热单元采用1480nm波长的红外激光用于样品加热，功率为200毫瓦，焦点出激光光斑直径约200微米。在本实施例中，激光从上至下照射，样品仓室单元的上导热面采用明材质，如玻璃、PMMA、PDMS，下导热面采用导热性更好的蓝宝石，在底面形成低温区使外泌体热泳汇聚于底面。上导热面的厚度为1mm，下导热面的厚度为1mm，中间垫片以及样品仓室单元的高度均为240mm。
当适体识别外泌体表达蛋白并与之结合时，适体上的荧光标记跟随外泌体被汇聚于激光光点下方的样品仓室单元底部区域，并产生增强荧光信号；当适体未识别外泌体表达蛋白时，游离的适体由于尺寸小不能汇聚，信号不增强。
本实施例中，发光基团Cy5激发/发射波长为649/666nm，荧光信号被与光显微镜连接的CCD记录。通过CCD记录激光照射前后的荧光信号，通过分析激光照射前后的荧光信号，得出外泌体表面表达蛋白的丰度。
本实施例检测的标志物包含外泌体标志物(外泌体上携带上的蛋白)：CD9、CD63和CD81三种外泌体普遍具有较高表达的蛋白；以及癌症相关并在外泌体表面表达的蛋白标志物：EpCAM、PTK7、HepG2、HER2、PSA、PSMA、CA125、EGFR、MUC-1、CD133、CD24、CEA和CD30。对上述标志物的外泌体检测，分析其表达分布。
本实施例收集2014年3月至2018年3月在某医院泌尿外科接受前列腺穿刺的患者。纳入标准包括：
(1)具备前列腺穿刺指征(PSA>4纳克每毫升、直肠指检阳性、前列腺超声或MRI阳性)；
(2)PSA<20纳克每毫升。
排除标准包括：
(1)活检前3个月内诊断为细菌性急性前列腺炎；
(2)活检前12个月内服用5仪还原酶抑制剂、合成代谢类固醇或抗雄激素药物；
(3)活检前6周内接受过直肠指检、前列腺穿刺检查或病理诊断为前列腺特殊类型肿瘤(如肉瘤、小细胞癌)。
共50例患者符合纳入和排除标准，包括15例前列腺癌患者、10例癌前病变患者与前列腺炎患者以及25例具有正常前列腺组织的患者。
将穿刺患者血清与核酸适体共同孵育，使用16种不同核酸适体对血清样品中外泌体16种表达蛋白(CD9、CD63、CD81、PTK7、EpCAM、HepG2、HER2、PSA、CA125、PSMA、EGFR、MUC-1、CD133、CD24、CEA、CD30)的丰度进行检测。采用的外泌体操作方法，以及激光器、样品仓室单元及显微镜和CCD相机均相同。检测结果如图4所示，其中1-15号为前列腺癌患者，16-25号为前列腺癌前病变和前列腺炎患者，26-50号为具有正常前列腺组织的患者。
根据图4可知，所有穿刺患者血清外泌体均含有CD9、CD63、CD81蛋白表达，且前列腺癌患者的表达高于癌前病变与前列腺炎患者的表达，癌前病变患者与前列腺炎患者的表达高于正常组织患者的表达，表达差异的显著性具有统计学意义(P<0.05)。且癌症相关标志物EpCAM,PTK7,HepG2,HER2,PSA,PSMA,CA125,EGFR,MUC-1,CD133,CD24,CEA,CD30与外泌体标志物CD9、CD63、CD81蛋白在不同类型患者间的表达也具有差异，前列腺癌患者的表达高于癌前病变与前列腺炎患者的表达，癌前病变与前列腺炎患者的表达高于正常组织患者的表达，表达差异的显著性具有统计学意义(P<0.05)。
然而，由于患者外泌体表面标志物表达量具有高度异质性，难以通过单一种类标志物有效地将前列腺癌患者与非癌症患者进行区分。
但通过将检测标志物的表达量进行加权和无加权求和后，能够获得良好的诊断效力。将本实施例外泌体上不同标志物的荧光亮度按照测量顺序设为L1,L2,...Lk作为自变量带入所述计算细胞外囊泡表面某一表达蛋白强度的加权求和模型中，如式(10)所示，此时，对上述式(10)进行假定后，对两边取期望，可得式(11)，并根据荧光亮度L给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值通过式(12)可以得到蛋白加权表达强度YL相应的估计值；此时使用最小二乘对式(12)进行参数估计，可得出式(13)在所述式(13)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到式(14)，对式(14)进行求解后，即可得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权表达强度YL。求出参数的估计值和蛋白加权表达强度YL后，根据表达蛋白种类和各类蛋白的加权表达强度YL。
将本实施例外泌体上不同标志物的荧光亮度按照测量顺序设为L1,L2,...Lk作为自变量带入所述计算细胞外囊泡表达蛋白丰度的加权求和模型中，如式(6)所示，同时，使用式(7)对所述荧光亮度L1,L2,...Lk求方差σ2，并将检测癌症总数N和某一种类表达蛋白在所述癌症种类数量中具有高表达的个数n1,n2,...nk与所述方差σ2一同带入式(8)中以确定各加权系数α1,α2,...αk，确定后利用式(6)求出外泌体某一种类表达蛋白总丰度M。
将本实施例外泌体上不同标志物的荧光亮度按照测量顺序设为L1,L2,...Lk作为自变量带入无加权求和中，求得以荧光亮度L为参量的外泌体某一种类表达蛋白的无加权表达强度∑L＝L1+L2+...+Lk。
结合各类蛋白的加权表达强度YL、外泌体某一种类表达蛋白总丰度M以及无加权表达强度∑L作出待测样品的外泌体SUM表达图。
对SUM以及外泌体某一种类表达蛋白总丰度M绘制待测者工作特征曲线(ROC)，计算曲线下面积(Auc)并以此评估本实施例检测系统的诊断效力。
经计算，在本实施例的50例穿刺患者中，利用ROC诊断前列腺癌的AUC为0.9521，由此可得，本实施例所述检系统拥有良好的诊断效力。
实施例2
本实施例选用外泌体作为检测样本对患者前列腺是否癌变进行检测，包括以下步骤：
步骤1：获取待测者血样作为样品液体，并将其中的细胞外囊泡与带有发光催化物的抗体一同孵育培养，以将抗体标记在外泌体上；
步骤2：将孵育后的外泌体样品放入所述样品仓室单元2，并加入发光底物，使发光催化剂催化发光底物而使其达到激发状态，并在转化为基态过程中释放光能，以使外泌体带有光标记；
步骤3：使用加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热，并将激光的焦点设置在样品仓室单元2内部的样品液体上，加热后，样品液体中的外泌体会产生热泳效应，并向低温区域移动；同时，所述样品液体受热膨胀产生浮力，从而在所述样品仓室单元2内产生对流，对流的方向从周围指向样品仓室单元2的加热区域，将周围的外泌体汇聚在样品仓室单元2的低温一侧；
步骤4：利用所述信号处理单元4获取外泌体聚积后放大的光信号，通过分析光信号，得出外泌体单个表达蛋白的丰度图；
步骤5：检测完成后，重复步骤1-步骤4，使用不同种类的抗体对所述外泌体中的多种表达蛋白进行标记和检测，得到所述外泌体中多种表达蛋白的丰度图谱；
步骤6：结合所述步骤5中外泌体表达蛋白图谱中的对照表将蛋白图谱中各光度转换成数据并利用加权和无加权求和求出待测样品中外泌体表达蛋白的加权表达强度YL、表达蛋白丰度M以及无加权表达强度∑L，并根据三种数值得出外泌体SUM表达图；
步骤7：根据所述步骤5中得出的外泌体表达蛋白图谱和所述步骤6中的外泌体SUM表达图作出癌变判定。
化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光催化物经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光催化物直接标记在抗原或抗体上,或酶作用于发光底物。
对当前热泳系统，本实施例选用外泌体上待检测标志物作为抗原，抗体的作用由核酸适体实现，酶则链接在核酸适体上，发光底物在检测前加入至样本即可。综上所述，本实施例所述抗体上的发光催化物选用鲁米诺，发光底物选用过氧化氢。
具体而言，本实施例样品的孵育条件、系统中各部件材质的选用以及所述加热单元1的加热参数和方向均与所述实施例1中的条件相同。
本实施例检测的标志物包含外泌体标志物(外泌体上携带上的蛋白)：CD9、CD63和CD81三种外泌体普遍具有较高表达的蛋白；以及癌症相关并在外泌体表面表达的蛋白标志物：EpCAM、PTK7、HepG2、HER2、PSA、PSMA、CA125、EGFR、MUC-1、CD133、CD24、CEA和CD30。对上述标志物的外泌体检测，分析其表达分布。
选50例前列腺癌患者进行检测，使用16种不同核酸适体对血清样品中外泌体16种表达蛋白的丰度进行检测。检测结果如图5所示。
根据图5可知，所有穿刺患者血清外泌体均含有CD9、CD63、CD81蛋白表达，且癌症相关标志物EpCAM,PTK7,HepG2,HER2,PSA,PSMA,CA125,EGFR,MUC-1,CD133,CD24,CEA,CD30与外泌体标志物CD9、CD63、CD81蛋白在不同患者间的表达也具有差异。
然而，由于患者外泌体表面标志物表达量具有高度异质性，难以通过单一种类标志物有效地将前列腺癌患者与非癌症患者进行区分。
但通过将检测标志物的表达量进行加权和无加权求和后，能够获得良好的诊断效力。
将本实施例外泌体上不同标志物的光亮度按照测量顺序设为L1,L2,...Lk进行加权求和以及无加权求和，并结合各类蛋白的加权表达强度YL、外泌体某一种类表达蛋白总丰度M以及无加权表达强度∑L作出待测样品的外泌体SUM表达图。其中，本实施例的加权求和计算方法以及无加权求和计算方法均与所述实施例1中的计算方法相同。
对SUM以及外泌体某一种类表达蛋白总丰度M绘制待测者工作特征曲线(ROC)，计算曲线下面积(Auc)并以此评估本实施例检测系统的诊断效力。
经计算，在本实施例的50例穿刺患者中，利用ROC诊断前列腺癌的AUC为0.9631，由此可得，本实施例所述检系统拥有良好的诊断效力。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，包括：
用以对待测者血液中的细胞外囊泡进行加热的加热单元；
设置在所述加热单元一侧，用以装载细胞外囊泡的样品仓室单元，所述样品仓室单元内细胞外囊泡中对前列腺癌有高表达的表达蛋白能够与适体或抗体发生特异性结合而标记光信号，在所述加热单元对所述样品仓室单元加热后，所述样品仓室单元内产生热泳效应及对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内温度较低的一侧；
设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，用以放大和反射光信号的信号放大单元，所述信号放大单元会将光信号反射至指定位置；
设置在所述样品仓室单元一侧，用以对放大后的光信号进行采集和计算的信号处理单元，所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，并通过量化光参量及采用无加权和/或有加权模型对相应的光信号参量判定，获取单例细胞外囊泡中对前列腺癌有高表达的表达蛋白的表达强度。
2.根据权利要求1所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述化学发光的过程为：先将带有发光催化物的适体或抗体与细胞外囊泡一同孵育，通过特异性结合将发光催化物标记在细胞外囊泡表面上，并向其添加发光底物，通过发光催化物催化发光底物而使其达到激发状态，并在转化为基态过程中释放光能以使细胞外囊泡表面标记光信号。
3.根据权利要求1或2所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述信号处理单元中计算细胞外囊泡表达蛋白强度的加权求和方法包括：
步骤a：将蛋白的加权表达强度设为因变量Y，将信号处理单元测得的细胞外囊泡标志物光参量设为自变量X，则细胞外囊泡上不同标志物的光参量按照测量顺序设为：X1，X2，...，Xk；
步骤b：由于加权表达强度Y与光参量X呈线性关系，此时进行如下计算：
Y＝β0+β1X1+β2X2+...+βkXk+ε (1)
其中，β0，β1，β2，...，βk为回归参数，ε为随机误差项；
步骤c：对所述步骤b中的式(1)和光参量X做出基本假定以保证在对数据进行加权求和时参数估计、统计检验和置信区间估计的有效性；
步骤d：当所述式(1)和光参量X满足所述假定时，对所述式(1)两边取期望，得：
E(Y|X1,X2...Xk)＝β0+β1X1+β2X2+...+βkXk (2)
其中，E(Y|X1，X2，...，Xk)表示在给定光参量Xi的条件下蛋白加权加权表达强度Y的条件均值；
步骤e：对所述式(1)取期望完成后，根据光参量X给出回归参数β0，β1，β2，...，βk相应的估计值此时得到蛋白加权加权表达强度Y相应的估计值：
上述式(3)为E(Y|X1，X2，...，Xk)的点估计值；
步骤f：当所述式(1)和光参量X满足所述步骤c中的假定时，通过最小二乘得到参数估计，此时假设
在所述式(4)中分别对求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：
对上述式(5)中的方程组进行求解，得到回归参数β0，β1，β2，...，βk的估计值和蛋白加权加权表达强度Y。
4.根据权利要求3所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述步骤a中的光参量为光亮度L、光强度C、吸光度A或光频率λ中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述步骤c中对所述式(1)和光参量X做出的基本假定包括：
假定c1：随机误差项ε的概率分布具有零均值，E(ε)＝0；
假定c2：随机误差项ε的概率分布对于不同的自变量表现值，具有同方差，ε的方差不随着Xij的变化而变化，D(ε)＝σ2；
假定c3：随机误差项ε不存在自相关，cov(εi，εj)＝0；
假定c4：εi与任一解释变量Xi不相关，cov(εi，Xi)＝0；
假定c5：自变量X之间不存在完全共线性；
其中，上述假定c1-c4与一元回归分析的假定相同，所述假定c5用以针对解释变量。
6.根据权利要求1或2所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述信号处理单元中计算细胞外囊泡表达蛋白总丰度的加权求和方法包括：
步骤a：将细胞外囊泡表达蛋白总丰度设为因变量M，细胞外囊泡标志物的光参量设为自变量D，则根据检测的表达蛋白顺序分别将测得的光参量设为：
D1,D2,...,Dk；
步骤b：由于不同种类表达蛋白在不同患者间的丰度均不相同，需根据不同种类的表达蛋白设置对应的权重系数α1,α2,...αk，则所述细胞外囊泡表达蛋白总丰度M可通过下式求得：
M＝α1D1+α2D2+...+αkDk (6)
步骤c：确定测定癌症种类的总数量N，并确定各种类表达蛋白在所述癌症种类数量中具有高表达的个数n1,n2,...nk，则各表达蛋白在癌症中具有高表达的比例为：
步骤d：对所述步骤a中各表达蛋白光参量D取平均值并对光参量D求方差：
步骤f：根据所述步骤c和步骤d中得出的数据对对权重系数α进行确定：
步骤g：权重系数α确定后，根据步骤b中公式求得细胞外囊泡表达蛋白总丰度：
7.根据权利要求1所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述样品仓室单元设置在所述加热单元一侧，在所述样品仓室单元内部装有样品液体用以装载所述细胞外囊泡和适体或抗体，包括：
设置在所述加热单元一侧且为透明材质，用以吸收所述加热单元热量的第一导热面；
设置在所述第一导热面下方且为透明材质，用以吸收所述加热单元热量的第二导热面，其中第二导热面的导热性高于第一导热面的导热性；
设置在所述第一导热面与第二导热面之间且在中心开设有通孔，用以装载所述样品液体的垫片。
8.根据权利要求1所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测系统，其特征在于，所述信号放大单元设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，用以放大细胞外囊泡表面的光信号，包括：
设置在所述第二导热面远离所述加热单元的一侧，用以观察光信号的物镜；
设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧并与所述物镜呈一定夹角，用以反射光标记的采集反光镜；
设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧并与所述物镜呈一定夹角，用以反射光源的放大反光镜；
设置在所述放大反光镜一侧，用以为光标记提供放大光源的观测光源。
9.根据权利要求1所述的基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测方法，其特征在于，所述信号采集单元根据检测系统需要检测的光参量，为CCD相机、照度计、分光计、单色器、sCMOS、EMCCD、PMT中的一种或多种。
10.一种基于热泳细胞外囊泡检测的前列腺癌检测方法，其特征在于，包括：
获取患者血样作为样品液体，并将其中的细胞外囊泡与带有光标记的适体或抗体一同孵育，通过适体或抗体与细胞外囊泡表面对前列腺癌有高表达的表达蛋白进行特异性结合，以将细胞外囊泡表面标记上光信号；
将孵育后的细胞外囊泡放入样品仓室单元，并对样品仓室单元加热以产生热泳效应和对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内的低温一侧，以放大细胞外囊泡上的光信号，通过对至少一种光信号参量进行计算以将光信号转换成对应的具体单一种类数值；
检测完成后，重复上述步骤，使用不同种类的适体或抗体对细胞外囊泡中的多种对前列腺癌有高表达的表达蛋白分别进行标记和检测，得到细胞外囊泡中多种表达蛋白的数值组；
将上述对不同光参量求出的对应数值组带入加权模型和/或无加权模型对相应光参量进行计算，获取细胞外囊泡蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度以及表达蛋白总丰度，通过结合三种数值得出细胞外囊泡的SUM表达图，并根据SUM表达图对待测者是否患有前列腺癌做出判定。
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