JPS62206447A - ヒトインタ−フエロン−βの微量定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はモノクローナル抗体を利用したサンドイッチ方
式によるヒトインターフェロン−βの免疫測定法の改良
に関する。

〔従来の技術〕

血清などに含まれる微量のヒトインターフェロン−βを
測定しようとする場合には、高感度でかつ特異性の高い
測定法が要求される。抗原抗体反応を利用した免疫測定
法はかかる目的に合致した測定法として知られている。

この免疫測定法には競合法と、サンドイッチ法に代表さ
れる非競合法とがある。競合法では、被測定物質である
抗原もしくは抗体を含む測定試料液と予め標識化した既
知濃度の被測定物質とを混合し、これに抗体もしくは抗
原を加え抗原抗体結合物を形成させる。この結合に関与
した被測定物質と標識化した被測定物質との比率を測定
することによって、被測定物質の含有量を算出すること
ができる。

一方すンドインチ法２では、まず第一抗体を同相化し、
これに被測定物質である抗原を含む測定試料液を接触さ
せて抗原を固相化した第一抗体に結合させ、同相を液相
から分離する。ついで固相上の第一抗体に結合した被測
定物質である抗原に標識化したもしくは標識化してない
第二抗体を抗原抗体反応によって結合させ、結合した第
二抗体の量を測定すれば被測定物質である抗原の量を知
ることができる。

サンドイッチ法ではこのように第一抗体と抗原とを結合
させた後液相を除いているので、ついで行われる第二抗
体との反応に測定試料液中の妨害物質が持ち込まれるの
を防ぐことができ、好感度の測定が期待できる。

サンドイッチ法による免疫測定法をさらに高感度で信頼
度の高いものにするためには、第一抗体を固相化した時
に第一抗体の抗原に対する結合能が低下することのない
ように第一抗体と支持体との選択を行い固相化手段を選
ぶこと、抗原と極めて高い特異性でかつ確実な結合を可
能ならしめるように第一抗体および第二抗体を選択する
こと、第二抗体を標識化した時に第二抗体の抗原に対す
る結合能が低下せずかつ高い特異性を損なわないような
標識方法を選ぶことが重要である。

ヒトインターフェロン−βと選択的に反応する抗体を用
意するという問題に関しては、近年細胞融合法によって
特定の抗原決定部位に対するモノクローナル抗体を得る
ことが可能になってきた。（例えば、Ｒｏｇｅｒ　Ｈ，
Ｋｅｎｎｅｔ４ｈｏｍａｓ　Ｊ。

Ｍｃｋｅａｒｎ＋Ｋａｔｈｌｅｅｎ　Ｂ、Ｂｅｃｈｔｏ
ｌら３　　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：八　Ｎｅｗ　　Ｄｉｍｅｎｓ
ｉｏｎ　　ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ−”　Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　　Ｙ
ｏｒＫ及びＬｏｎｄｏｎ　、　１９８０参照。）このモ
ノクローナル抗体を用いれば極めて特異的に抗原決定基
を識別することが可能で、構造の似かよった物質が混在
していても上記のサンドイッチ方式による免疫測定法で
ヒトインターフェロン−βのみを測定することができる
。しかしながら従来のサンドイッチ方式免疫測定法によ
るヒトインターフェロン−β定量法では生物活性を保持
したヒトインターフェロン−β分子のみを極めて特異的
に定量できるような免疫測定法までには至っていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ヒトインターフェロン−βは一般にその特異な立体構造
により生物活性を保持し、また抗体との反応においても
その立体構造は極めて重要な因子である。サンドイッチ
式免疫測定法によるヒトインターフェロン−βの定量で
は、第一抗体に結合したヒトインターフェロン−βに第
二抗体が結合し、その第二抗体結合量がそのままヒトイ
ンターフェロン−βとして反映される。

従って、第二抗体とヒトインターフェロン−βとの反応
が確実に１対１でなければ精度の高い定量は望めず、さ
らに生物活性を保持したヒトインターフェロン−β分子
の識別定量にとっても問題となる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記の問題点に関し鋭意検討を重ねた結果
、生物活性を保持したヒトインターフェロン−βを十分
に高感度で定量できる免疫測定が可能であることを見い
出して本発明に到達した。

すなわち本発明は、サンドイッチ方式の免疫測定法によ
るヒトインターフェロン−βの微量定量法において、第
一抗体が動物のヒトインターフェロン＝β感作抗血清か
ら得られるポリクローナル抗体または抗ヒトインターフ
ェロン−βモノクローナル抗体であり、第二抗体が抗ヒ
トインターフェロン−βモノクローナル抗体であること
を特徴とするヒトインターフェロン−βの微量定量法で
ある。

本発明に適用されるヒトインターフェロン−βとしては
、ヒト正常二倍体細胞が産生ずる天然型ヒトインターフ
ェロン−βも、遺伝子組換え技術を用いてヒトインター
フェロン−β構造遺伝子を組み込んだ大腸菌、酵母など
の微生物またはハムスター、サルなどの動物細胞により
産生される遺伝子組換え型ヒトインターフェロン−βも
含まれる。

本発明において第二抗体あるいは第一抗体として用いら
れるモノクローナル抗体は、例えば公知の細胞融合法（
前記の文献を参照）に従って取得されるモノクローナル
抗体産生細胞に産生させることによって得られる。すな
わち、ヒトインターフェロン−βによって感作されたマ
ウス、ラット等の牌細胞と無限の増殖能を有するミエロ
ーマ細胞とを融合させて、抗体産生能と増殖能とを併せ
持ったマウス、ラット等のハイブリドーマを取得し、つ
いでクローニングによって目的とするモノクローナル抗
体産生細胞が得られる。感作するヒトインターフェロン
−βは天然型でも遺伝子組換え型でも良い。

モノクローナル抗体が、ハイブリドーマを腹水型として
増殖して得られるマウス等の腹水由来である場合は、こ
れをタンパク質濃度５〜５００μｇ　／　ｍ　Ｉ！程度
に適当に希釈して用いれば十分であるが、もち論腹水か
ら免疫グロブリン分画を精製して用いることもできる。

ハイブリドーマをｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養してモノ
クローナル抗体を採取する場合は、腹水に比べてタンパ
ク成分中のモノクローナル抗体の純度が低すぎることが
多いので、その場合はｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養上清から硫
安分別沈澱、プロティン＝Ａカラムあるいはヒトインタ
ーフェロン−βをリガンドとしたアフィニティーカラム
（抗原カラム）等を用いて免疫グロブリン分画として精
製濃縮する必要がある。この場合はハイブリドーマの培
養に使用される生血清成分由来の牛の免疫グロブリンが
混入することもあるが実用上それで十分である。最近、
無血清培地が色々考案されているので（例えば、Ｔ、　
Ｈ，Ｃｈａｎｇら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３９　（１９８０）、３６９−３７
５参照）、もしそのような培地で培養できるハイブリド
ーマであれば純度の高いモノクローナル抗体が得られる
ので便利である。本発明では、第二抗体に用いる抗ヒト
インターフェロン−βモノクローナル抗体は好ましくは
特開昭５９−１４４７９６号公報記載のハイブリドーマ
ＩＨ１２株より得られるものが望ましい。

本発明において第二抗体として用いられるモノクローナ
ル抗体は、免疫グロブリン分画にまで精製後、公知のペ
プシン処理法（Ｙ　、　Ｈａｍａｇｕｃｈｉ　ら（１９
７９）、Ｊ、Ｂｒｏｃｈｅｍ、８５．１２８９−１３０
０）に従ってＦｃ部分を切除し、還元開裂して得られる
Ｆａｂ’部分を用いることが好ましい（Ｓ、Ｙｏｓｈｉ
ｔａｋｅら（１９７９）、５ｃａｄ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、１０．８ｌ−８６）。

一方、第一抗体として用いられる動物のヒトインターフ
ェロン−β感作抗血清から得られるポリクローナル抗体
は、マウス、モルモット、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ、ウマ、等の動物を常法によりヒトインターフェロン
−βを含む標品（純品である必要はない）で免疫して得
たコンベンショナル抗血清を、好ましくは常法により免
疫グロブリン分画として精製濃縮して用いる。

また、第一抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合
は、第二抗体と異なる抗原決定基を認識するモノクロー
ナル抗体を含有するものを調製し、適用することが好ま
しいが、第二抗体と同一のモノクローナル抗体も適用可
能である。

モノクローナル抗体を用いてサンドイッチ方式の免疫測
定系を樹立しようとするときには、一種類のモノクロー
ナル抗体は一つの抗原決定基を認識し、しかも通常−抗
原分子上には同一抗原決定基は一個しかないことから、
原則として抗原をサンドイッチする第一抗体と第二抗体
とは異なる抗原決定基を認識する異なるモノクローナル
抗体でなければならない。従って第一抗体として第二抗
体と同一のモノクローナル抗体を使用する場合は、本来
はヒトインターフェロン−βをサンドイッチすることは
できない。

しかしながら、本発明では抗原抗体反応時に通常は共存
させるツイーン−２０、ツイーン−８０のような界面活
性剤を共存させないという特殊な条件下で行なうことに
より、ヒトインターフェロン−β分子を会合させること
ができるため、サンドイッチが可能になる。

同一のモノクローナル抗体を用いるこの方法は、ヒトイ
ンターフェロン−β分子の会合状態を調べるために利用
することもできる。また逆に、ツイーン−２０を共存さ
せるとヒトインターフェロン−β分子は会合しないため
、特定のモノクローナル抗体を第二抗体として、種々の
モノクローナル抗体を第一抗体として使用し、ヒトイン
ターフェロン−β分子をサンドイッチできるか否かによ
り第一抗体の抗原認識部位が第二抗体と異なるか同一か
判定することもできる。

本発明の定量法は上述の第一抗体および第二抗体を用い
通常のサンドイッチ方式による免疫測定法に従って実施
される（「酵素免疫測定法」（医学書院、１９７８）、
ｒ続うジオイムノアッセイ」　（講談社、１９７９）な
どを参照）。

すなわち主な手順は次のとおりである。

（Ａ）被測定物質であるヒトインターフェロン−βに対
する第一抗体を担体上に固相化する。

担体としてはサンドイッチ方式による免疫測定法におい
て通常使用されるものであればいずれであっても用いる
ことができる。たとえば、イムノアッセイ用プレートと
して市販されているマイクロプレートやプラスチックビ
ーズあるいはプラスチックをコートした鉄ビーズ等、ガ
ラスピーズ、プラスチックチューブ、ペーパーディスク
、架橋デキストラン粒子、架橋アガロース粒子等を例示
することができる。これらの担体に第一抗体を固相化す
る方法としては、用いる担体に応じて物理的吸着や化学
結合などの方法が適宜選択される。

（Ｂ）固相化した第一抗体に測定試料を接触させ被測定
物質であるヒトインターフェロン−βを抗原抗体反応に
より第一抗体に結合させる。

接触条件（温度、時間など）は適宜決定される。

（Ｃ）標識化したもしくは標識化してない第二抗体を接
触させ、抗原抗体反応により第二抗体を第一抗体に結合
したヒトインターフェロン−βに結合させる。これによ
ってヒトインターフェロン−βは第一抗体と第二抗体と
にサンドイッチされる。接触条件（温度、時間など）は
適宜決定される。

標識は酵素、ラジオアイソトープあるいは螢光試薬等で
常法により行う。例えば酵素としてはアルカリフォスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等
が汎用され、ラジオアイソトープとしてはヨウ素−１２
５が多く用いられる。これらの実験手技は成書に詳しく
解説されているので、目的に応じた標識抗体を調製する
方法を知ることは容易である（例えば、石川、河合、宮
井ら編、“酵素免疫測定法”医学書院、１９７８、東京
；　Ｂ、Ｂ、Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳ。

Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉら編”５ｅｌｅｃｔｅｄｌ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕＩａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ″Ｗ、ＨｏＦｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐ：１９
８０Ｓａｎ　　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　　；　　八、Ｋａ
ｗａｍｕｒａ編、　”　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ａｎｄ　
　ｔｈｅｉｒ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ。

ｎｓ”第２版、Ｕｎｉｖ、Ｔｏｋｙｏ　Ｐｒｅｓｓ、　
１９７７、Ｔｏｋｙ。

等参照）。

（Ｄ）第一抗体と第二抗体とにサンドイッチされたヒト
インターフェロン−βを第二抗体の量を測定することに
よって定量する。例えば、酵素で標識した第二抗体を用
いた場合には、酵素基質を加えて酵素反応による基質の
分解を比色測定する。既知濃度のヒトインターフェロン
−βを用いて検量線を作っておけば目的とする試料の濃
度を知ることができる。

また、第二抗体を直接標識する以外に、ヒトインターフ
ェロン−βに結合した第二抗体を免疫測定することによ
って間接的にヒトインターフェロンーβを測定すること
も勿論可能である。

例えば、第一抗体がウサギあるいはヤギ等のコンベンシ
ョナル抗体であって、第二抗体として標識していないマ
ウスモノクローナル抗体を用いた場合には、第二抗体の
結合量を知る手段としては第二抗体で用いたマウスの免
疫グロブリンと結合できる市販の酵素標識抗体を用いる
か、あるいはビオチン化モノクローナル抗体を反応させ
、それをさらにアビジン化酵素で検出するという方法が
ある。このような間接測定法を用いると直接標識第二抗
体で測定するよりも増巾されて測定感度が高くなる利点
がある。

〔発明の効果〕

本発明は、活性を保持したヒトインターフェロン−βを
高感度で定量できるため、活性分子のみを測定しようと
する場合に特に有用である。

本発明では種々のモノクローナル抗体の抗原決定部位識
別も可能である。すなわち、第一および第二抗体に異な
る抗ヒトインターフェロン−βモノクローナル抗体を用
い、両抗体がヒトインターフェロン−β分子をサンドイ
ッチできるか否かにより、両抗体が同じ抗原決定部位を
もつかどうか評価できることである。

また、第一および第二抗体に同一モノクローナル抗体を
用いた場合には、抗原抗体反応時に特殊な溶媒条件下に
することによりヒトインターフェロン−β分子をサンド
イッチすることができる。従って、ヒトインターフェロ
ン−β分子の会合状態解析に同一モノクローナル抗体に
よるサンドイッチ式免疫測定法が有効な手段となり得る
。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ 大腸菌が産生ずるヒトインターフェロン−β（以下、ヒ
１−ＩＮＦ−βと略す）を精製し、ウサギに感作して得
た抗血清から硫安沈澱により免疫グロブリン分画を得、
さらにこれを抗原−アフイゲル−１０カラムで精製した
免疫グロブリン分画を０．０５χＮａＮ＋含有ＰＢＳで
５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈し、その０．１　
ｍｌずつを市販の免疫測定用９６穴イムノマイクロプレ
ートの各ウェルに入れ、４℃で１晩コーテイングした。

次いで、０．０５χツイーン２０を含むＰＢＳ（以下、
ツイーン−ＰＢＳと略す）で１回マイクロプレートの各
ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡ含有ツイーンーＰＢＳを０
．２５ｍ１／ウェル加え、プラスチック表面のタンパク
質結合部位をＢＳＡでブロックした。

ブロッキング後、ツイーン−ＰＢＳで前記と同様に洗浄
し、測定サンプルとして天然型のヒトＩＦＮ−β精製品
及び大腸菌が産生ずるヒトＩＦＮ−βの精製品をそれぞ
れ０．１χＢＳＡ。

０．０５Ｘ　”フィー７２０．０．１　ＭＩＪ　７酸緩
衛液（ＰＨ７）　（Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ）で希釈
した０、５６〜２５ｍｇ／　ｍｌの溶液として０．１ｍ
ｌ／ウェル加え、３７℃で２時間保温して第一抗体にヒ
）ＩＦＮ−βを結合させた。

洗浄後、上記ヒトＩＦＮ−βに対するモノクローナル抗
体（ＩＨ１２）（特開昭５９−１４４７９６号公報参照
）から上記ウサギ抗血清同様、硫安沈澱、抗原−アフイ
ゲル−１０カラムによる精製を行い、さらにペプシン処
理によるＦｃ部分切除、そして還元開裂後単離されたＦ
ａｂ’部分をＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）
スクシンイミドを用いて西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼと架橋結合させた標識抗体の一定量（０，０１〜１
μｇ）を八５ｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液として各ウェル
に０．１ｍＪずつ加え、３７℃で２時間保温してヒ）Ｉ
ＦＮ−βと結合させた。

ツイーンＰＢＳで３回洗浄後、結合した第二抗体のペル
オキシダーゼ活性を過酸化水素の共存下Ｏ−フェニレン
ジアミンを基質としてｐＨ５のクエン酸−リン酸緩衛液
中で反応させ、生成物の４９０ｎｍの吸光度をインター
フェロンのイムノリーダーを用いて測定した。参考とし
て大腸菌が産生ずるマウスＩＦＮ−β、ヒ）ＩＦＮ−ｒ
を被検物質として同様の方法により測定した。これらの
測定値を表１に示した。

表　１　ヒ）ＩＦＮ−βの酵素免疫測定表１の結果で明
きらかなように、本測定系はヒトＩＦＮ−β以外のもの
に対しては全く反応せず、モノクローナル抗体（ＩＨ１
２）を第二抗体として用いているための特異性が十分に
生かされ、かつヒ）ＩＦＮ−β自身は非常に高感度で測
定されている。なお本測定にはヒトＩＦＮ−β精製品を
用いているが、ヒト血清アルブミン７．５ｍｇ／ｍｌ溶
液、ウサギ血清、大腸菌抽出液中のヒトＴＦＮ−β定量
にも支障がない。

実施例２ 大腸菌産生ヒ）ＩＦＮ−β精製品を６０℃熱処理を施し
、その一定時間後の各試料を実施例１と同様の手順で測
定し、ＦＬ細胞／ＶＳＶＯ系での抗ウイルス活性測定値
と比較し、表２の結果を得た。

表２　大腸菌産生ヒ）ＩＦＮ−β６０℃熱処理試料９の
酵素免疫測定および抗ウイルス活性測定 ＊２０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋
４０χエチレングリコール（ｐ　ｈ　７）中での試料を
６０℃熱処理したもの。

＊＊本測定では既知濃度の大腸菌産生ヒ）ＩＦＮ−βに
よる検量線から適宜希釈した各試料を測定し、その濃度
を算出した。

表２の結果で明らかなように本測定系はヒトＩＦＮ−β
の抗ウィルス活性との高い相関性を示しており、第二抗
体で用いたモノクローナル抗体（ＩＨ１２）のもつ抗原
認識に対する高い特異性が現れた結果である。第二抗体
のモノクローナル抗体の選定により失活ＩＦＮ分子のみ
を定量する免疫測定系の確立も可能である。

実施例３ 大腸菌産生ヒ）ＩＦＮ−β精製試料（２５ｎ’ｇ／ｍ１
）を、第一抗体を変える以外は、実施例１と同様の手順
で測定を行った。第一抗体にはヒ）ＩＦＮ−βウサギポ
リクローナル抗体および抗ヒ１−ＩＦＮ−βマウスモノ
クローナル抗体２種（ＧＩＥ７およびＩＨ１２）を用い
、表３の結果を得た。

抗ヒトＩＦＮ−βマウスモノクローナル抗体（ＧＩＥ７
）はヒトインターフェロン−βを抗原としてマウスを免
疫し、その免疫肺細胞とマウスミエローマ細胞とを公知
の方法により融合させ、得られたハイブリドーマ（Ｇ　
Ｉ　Ｅ　７株）により産生されたものである。

なお、抗体と抗原との反応時における０、　０５χツイ
ーン２０の有無も比較した。

表３　酵素免疫測定系における第一抗体の比較表３の結
果から本測定系は０．０５χツイーン２０共存下、第一
抗体に第二抗体と同じモノクローナル抗体（ＩＨＩ２）
を用いると反応しない。このことから種々のモノクロー
ナル抗体を第一抗体として用い、ヒ）ＩＦＮ−β反応性
を調べることにより第一抗体の抗原認識部位が第二抗体
と同一かどうか判定可能であり、モノクローナル抗体の
評価につながる。また同一モノクローナル抗体でツイー
ン２０非共存下の系では、反応が起こっており、これは
ヒトインターフェロン−β分子の会合変化による。従っ
て、同一モノクローナル抗体を第一および第二抗体とし
て用いることによりヒトインターフェロン−β分子の会
合状態を調べることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）サンドイッチ方式の免疫測定法によるヒトインタ
   ーフェロン−βの微量定量法において、第一抗体が動物
   のヒトインターフェロン−β感作抗血清から得られるポ
   リクローナル抗体または抗ヒトインターフェロン−βモ
   ノクローナル抗体であり、第二抗体が抗ヒトインターフ
   ェロン−βモノクローナル抗体であることを特徴とする
   ヒトインターフェロン−βの微量定量法。